ES2317163T3 - Procedimiento y composiciones para caracterizar una enzima de un sistema reactivo de oxidoreduccion. - Google Patents

Procedimiento y composiciones para caracterizar una enzima de un sistema reactivo de oxidoreduccion. Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para caracterizar una enzima de un sistema reactivo redox que comprende: (a)aplicar una muestra que comprende una primera enzima de un sistema reactivo redox y una cantidad conocida de un sustrato de enzima a una célula electroquímica que comprende una composición de reactivo libre de enzimas que comprende un mediador de dicho sistema reactivo redox y (b)detectar una señal eléctrica producida por dicha célula.

Description

Procedimiento y composiciones para caracterizar una enzima de un sistema reactivo de oxidoreducción.
Introducción Antecedentes
La detección de analitos en fluidos o muestras fisiológicos, por ejemplo, sangre o productos derivados de la sangre, es de importancia siempre creciente en la sociedad de hoy en día. Los ensayos de detección de analitos encuentran su utilización en una variedad de aplicaciones, incluyendo pruebas en un laboratorio clínico, pruebas domiciliarias, etc., donde los resultados de dichas pruebas desempeñan un papel prominente en la diagnosis y gestión de una variedad de afecciones. Los analitos de interés incluyen la glucosa para la gestión de la diabetes, el colesterol, y similares. Como respuesta a esta importancia creciente de la detección de analitos, se han desarrollado una variedad de protocolos y dispositivos de detección de analitos tanto para un uso clínico como domiciliario.
Un tipo de procedimiento que se emplea para la detección de analitos es un procedimiento electroquímico. En dichos procedimientos, se coloca una muestra de líquido acuoso en una zona de reacción en una célula electroquímica que comprende al menos dos electrodos, a saber, un electrodo de referencia y otro de trabajo. Se permite que el componente que ha de ser analizado reaccione directamente con un electrodo, o directamente o indirectamente con un reactivo redox para formar una sustancia susceptible de ser oxidada (o susceptible de reducción) en una cantidad correspondiente a la concentración del componente que ha de ser analizado, o sea, el analito. Luego se estima la cantidad de la sustancia susceptible de ser oxidada (o susceptible de reducción) presente de manera electroquímica y relacionada con la cantidad de analito presente en la muestra inicial.
En muchos de dichos enfoques electroquímicos a la detección de analitos, se emplea un sistema de producción de señal de oxidación de analitos que comprende un componente de enzima y un componente mediador, en el que el componente de enzima oxida el analito de interés y luego transfiere un electrón a un mediador que, a su vez, transfiere el electrón a un electrodo en la célula electroquímica, generando de ese modo una señal eléctrica de la que se puede determinar la concentración de analito.
Al diseñar los ensayos y sistemas electroquímicos de detección de analitos, es deseable emplear una enzima específica para analitos. Por ejemplo, para la determinación de glucosa, la forma soluble de la glucosa dehidrogenasa (en lo sucesivo llamada s-GDH) dependiente de la quinona de pirroloquinolina (PQQ) es una enzima que puede ser empleada en un sistema de producción de señal de oxidación de glucosa. La s-GDH es un aceptor pobre de electrones y es, por lo tanto, insensible de manera beneficiosa a la presencia de oxígeno en las muestras de fluido.
Sin embargo, una desventaja de la s-GDH que se da de forma natural o de "tipo salvaje" es que oxida no solo la glucosa, sino también otros azúcares reductores incluyendo la maltosa, la galactosa, la lactosa, la manosa, la xilosa, y la ribosa. La reactividad de la s-GDH hacia los azúcares distintos de la glucosa puede, en algunos casos, afectar a la precisión de la determinación de los niveles de glucosa en sangre en algunos pacientes diabéticos. Por ejemplo, los pacientes sometidos a diálisis peritoneal tratados con icodextrina (un polímero de glucosa) pueden contener niveles altos de maltosa en su sangre.
Esta falta de especificidad de la s-GDH ha llevado a un esfuerzo para mejorar la especificidad de la s-GDH al generar formas "mutantes" de la enzima, por ejemplo, donde se han llevado a cabo una o más sustituciones de aminoácido. Sin embargo, antes de que puedan ser empleadas dichas enzimas "alteradas", deben ser probadas para determinar su idoneidad para ser usadas en ensayos de detección de analitos.
Aunque requieren mucho tiempo, han sido utilizados ensayos espectrofotométricos para determinar la actividad de la s-GDH, pero solo son utilizados en condiciones limitantes de las enzimas. En la patente U.S. 6.103.509 y en la solicitud de patente europea nº EP 1 176 202 A1 se describe un ensayo espectrofotométrico que utiliza 2,6-diclorofenolindofenol (DCIP) y metosulfato de fenacina (PMS) como mediadores artificiales.
Sin embargo, las típicas tiras reactivas comerciales de glucosa que utilizan s-GDH no utilizan condiciones limitantes de enzimas porque la enzima está presente en exceso para garantizar un rendimiento a largo plazo de la tira. Las proteínas recombinantes, por ejemplo, las formas mutantes de s-GDH, únicamente se producen normalmente en pequeñas cantidades. Probar la reactividad de estas formas mutantes de s-GDH implica hacer tiras revestidas con enzimas y probar cada lote de tiras con sangre total o plasma enriquecido con glucosa y cada azúcar posible interferente (o sea, reductor) en múltiples concentraciones. La producción de tiras reactivas revestidas con cada forma mutante de s-GDH requiere grandes cantidades de cada mutante, exige mucho tiempo y mucho trabajo y requiere que los técnicos prueben las tiras con sangre o plasma humano, posibles riesgos biológicos.
En consecuencia, se necesita un ensayo rápido y barato que sea limitante de sustratos para determinar si la producción en masa de una enzima mutante en particular, por ejemplo, la s-GDH, está justificada debido a su especificidad mejorada de la glucosa sobre la s-GDH de tipo salvaje. Este ensayo también debería ser aplicable a muestras que no contengan sangre enriquecida con glucosa o azúcares interferentes más que a muestras de sangre total o plasma enriquecido con azúcares reductores. Por lo tanto, aún se necesita en el campo un procedimiento que sea rápido y sencillo de utilizar para determinar la especificidad hacia los carbohidratos de las formas mutantes de s-GDH que utilizan pequeñas cantidades de enzima y que modele condiciones limitantes de sustratos en una tira reactiva típica basada en electroquímica para medir un analito (por ejemplo, glucosa) en una muestra de fluido (por ejemplo, sangre total o plasma). Además, también se desea un procedimiento rápido y sencillo para medir la actividad de la enzima.
Bibliografía relevante
Los documentos de patentes U.S.: 5.484.708; 5.723.284; 5.834.224; 5.942.102; 5.912.199; 5.997.817; 6.059.946; 6.083.710; 6.103.509; 6.121.009; 6.134.461; 6.179.979; 6.193.973; 6.231.531; 6.284.125; 6.340.428; 6.444.115 y 6.716.577; al igual que otros documentos de patentes: US 2003/0104595; WO 99/49307; WO 97/18465; WO 01/57510; WO 01/57238; WO 02/48707; WO 02/50609; WO 02/06788; EP0969097; EP1176202; JP091403378A; y GB 2 304 628.
Resumen de la invención
Se proporcionan los procedimientos y composiciones para caracterizar una enzima de un sistema reactivo redox. Al poner en práctica los presentes procedimientos, se aplica una muestra que incluye una enzima de un sistema reactivo redox y una cantidad conocida de sustrato a una célula electroquímica que incluye una composición de reactivo libre de enzimas que tiene un mediador de sistema reactivo redox. También se proporcionan las tiras reactivas electroquímicas que incluyen las presentes células electroquímicas, y los sistemas y kits que incluyen las mismas. La presente invención encuentra un uso en una variedad de distintas aplicaciones, incluyendo aplicaciones de caracterización de sistema reactivo redox.
Breve descripción de las figuras
Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención al hacer referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la invención, y los dibujos adjuntos, en los que:
La Fig. 1 es un diagrama de flujo que ilustra una secuencia de pasos en un proceso conforme a una realización ejemplar de la presente invención para probar formas mutantes de s-GDH;
las Figuras 2A y 2B son vistas despiezada y superior, respectivamente, de una tira reactiva como puede ser utilizada en los procesos ejemplares conforme a la presente invención;
la Fig. 3 es un diagrama de flujo que ilustra una secuencia de pasos en un proceso conforme a una realización ejemplar de la presente invención para medir la actividad de s-GDH de tipo salvaje y mutantes de la misma;
la Fig. 4 es un gráfico que muestra la tendencia absoluta de la s-GDH de tipo salvaje y dos formas mutantes de s-GDH (Asn452Thr y Asp167Glu) a un control que no contiene ningún azúcar interferente como una función de la concentración de xilosa que utiliza una tira reactiva convencional revestida con enzimas;
la Fig. 5 es un gráfico que muestra la respuesta como una función de la concentración de azúcar para una tira reactiva convencional revestida con enzimas en las que la enzima es s-GDH de tipo salvaje;
la Fig. 6 es un gráfico que muestra la respuesta como una función de la concentración de azúcar utilizando s-GDH de tipo salvaje en un proceso conforme a la presente invención;
la Fig. 7 es un gráfico que muestra la respuesta como una función de la concentración de azúcar utilizando una forma mutante de s-GDH, Asn452Thr, en un proceso conforme a la presente invención;
la Fig. 8 es un gráfico que muestra la respuesta como una función de la concentración de azúcar utilizando una forma mutante de s-GDH, Asp167Glu, en un proceso conforme a la presente invención;
la Fig. 9 es un gráfico que muestra una curva estándar para s-GDH de tipo salvaje obtenido en un proceso conforme a la presente invención;
la Fig. 10 es un gráfico que muestra la curva estándar ilustrada en la Fig. 9 como un trazado de doble recíproco.
Descripción de las realizaciones específicas
Se proporcionan los procedimientos y composiciones para caracterizar una enzima de un sistema reactivo redox. Al poner en práctica los presentes procedimientos, se aplica una muestra que incluye una enzima de un sistema reactivo redox y una cantidad conocida de sustrato a una célula electroquímica que incluye una composición de reactivo libre de enzimas que tiene un mediador de sistema reactivo redox. También se proporcionan tiras reactivas electroquímicas que incluyen las presentes células electroquímicas, y los sistemas y kits que incluyen las mismas. La presente invención encuentra su uso en una variedad de distintas aplicaciones, incluyendo aplicaciones de caracterización de sistema reactivo redox.
El alcance de la presente invención será establecido por las reivindicaciones adjuntas.
En esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias plurales, a no ser que el contexto indique claramente lo contrario. A no ser que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende normalmente una persona de de dominio normal de la técnica a la que pertenece esta invención.
Donde se proporciona un rango de valores, se comprende que cada valor que interviene, a la décima de la unidad del límite inferior a no ser que el contexto dicte claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese rango, y cualquier otro valor declarado o que interviene en ese rango, está incluido en la invención. Los límites superior e inferior de estos rangos más pequeños pueden estar incluidos independientemente en los rangos más pequeños, y están también incluidos en la invención, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el rango declarado. Donde el rango declarado incluye uno de los límites, o ambos, los rangos excluyen a cualquiera de esos límites incluidos, o ambos, y también están incluidos en la invención.
A no ser que se definan de otra forma, los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que puede entender una persona de dominio normal de la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque esta invención se puede utilizar en la práctica o probar con cualquier procedimiento, dispositivo y material similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, se describen ahora los procedimientos, los dispositivos y los materiales preferidos.
Todas las publicaciones mencionadas en el presente documento están incorporadas aquí por referencia con el propósito de describir y revelar las líneas, los vectores y las metodologías de las células, que están descritos en las publicaciones, que pueden ser utilizadas en conexión con la invención descrita ahora.
Como se ha resumido anteriormente, la presente invención proporciona procedimientos y composiciones para caracterizar una enzima. Al describir adicionalmente la presente invención, se reseñan primero los presentes procedimientos y las aplicaciones específicas representativas de la misma con mayor detalle, seguidos de un repaso de las composiciones y sistemas representativos que encuentran su uso al poner en práctica los presentes procedimientos.
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Procedimientos
Como se ha resumido anteriormente, la presente invención proporciona procedimientos para caracterizar una enzima. Con caracterizar una enzima se quiere decir determinar una característica o un parámetro de la enzima. La característica puede ser una característica que es inherente a la enzima, por ejemplo, su selectividad de sustrato, o una característica que, al menos en parte, depende de su entorno, como la concentración de la enzima en un medio fluido dado, la actividad de una enzima en un medio fluido dado, etc. Por supuesto, la característica puede ser un producto tanto de factores inherentes como del entorno. Las características representativas específicas que pueden ser determinadas utilizando los procedimientos de la presente invención están descritas con mayor detalle a continuación.
Los procedimientos incluyen aplicar una enzima de sistema reactivo redox que contiene una muestra a una célula electroquímica y detectar una señal eléctrica generada por la célula, en la que la señal detectada es empleada luego para caracterizar la enzima de sistema reactivo redox en la muestra.
Una característica de ciertas realizaciones representativas es que la muestra que entra en contacto con la célula electroquímica incluye una enzima de un sistema reactivo redox y una cantidad conocida de un sustrato de enzima, mientras que la célula electroquímica a la que se aplica la muestra incluye una composición de reactivo libre de enzimas que incluye un componente mediador del sistema reactivo redox del que es un miembro la enzima de la muestra. Se describirán ahora la muestra y los componentes de la célula electroquímica empleados en estas realizaciones de los presentes procedimientos por separado con mayor detalle.
Muestra
La muestra que está en contacto con la célula electroquímica al poner en práctica los presentes procedimientos es una que incluye una enzima de un sistema reactivo redox y una cantidad conocida de un sustrato o al menos un sustrato potencial para la enzima, o sea, un sustrato de enzima.
Enzima
El componente de enzima de la muestra, en muchas realizaciones, es una enzima o una pluralidad de enzimas que trabajan en concierto para oxidar un analito de interés. En otras palabras, el miembro de enzima puede estar formado de una única enzima oxidante de analito o una colección de dos o más enzimas que trabajan en concierto para oxidar un analito dado de interés, permitiendo la generación de una señal electroquímica en una célula electroquímica, como se describe a continuación. Las enzimas de interés incluyen oxidasas, dehidrogenasas, lipasas, quinasas, diaforasas, quinoproteínas y similares. Las enzimas representativas más específicas de interés incluyen, sin estar limitadas por ellas: glucosa oxidasa, glucosa dehidrogenasa, colesterol esterasa, colesterol oxidasa, lipoproteína lipasa, glicerol quinasa, glicerol-3-fosfato oxidasa, lactato oxidasa, lactato dehidrogenasa, piruvato oxidasa, alcohol oxidasa, bilirrubina oxidasa, uricasa y similares. En ciertas realizaciones de interés, la enzima es una glucosa dehidrogenasa, tal como una s-GDH o un mutante de la misma, como se describe con mayor detalle a continuación.
En ciertas realizaciones, el componente de enzima puede estar presente en una concentración que varía entre aproximadamente 35 hasta aproximadamente 450, normalmente desde aproximadamente 80 hasta aproximadamente 270 \muM.
Sustrato de enzima
La muestra empleada en los presentes procedimientos también incluye una cantidad conocida de un sustrato de enzima. El sustrato de enzima puede ser un sustrato conocido para la enzima presente en la muestra o un sustrato candidato para la enzima presente en la muestra. Por ejemplo, donde la enzima es una glucosa dehidrogenasa, el sustrato en la muestra puede ser glucosa (que se sabe que es un sustrato para la enzima) u otro azúcar, por ejemplo, la maltosa, que se sabe que también es un sustrato para la enzima o bien se sospecha que es un sustrato para la enzima. Por cantidad conocida se quiere decir que la muestra tiene una cantidad o concentración definida o predeterminada de sustrato. En ciertas realizaciones, la concentración del sustrato de la enzima en la muestra varía desde aproximadamente 0 hasta aproximadamente 50 mM (aproximadamente 0 hasta aproximadamente 900 mg/dL), normalmente desde aproximadamente 0 hasta aproximadamente 45 mM (aproximadamente 0 hasta aproximadamente 810 mg/dL). En ciertas realizaciones cuando el sustrato de enzima está definidamente presente, la concentración del sustrato de enzima en la muestra varía desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 50 mM (por ejemplo, desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 900 mg/dL), normalmente desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 45 mM (por ejemplo, desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 810 mg/dL).
Coenzima
En ciertas realizaciones, la muestra de medio fluido también incluye una coenzima, que activa el componente de enzima. Un ejemplo de una coenzima de interés es la quinona de pirroloquinolina (PQQ). Otros cofactores de interés incluyen, sin estar limitadas por ellos: dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD), dinucleótido de flavina adenina (FAD), citocromo, y similares, dependiendo del tipo de enzima aplicada al reactivo de prueba. En ciertas realizaciones, la concentración de cualquier coenzima puede variar desde aproximadamente 60 hasta aproximadamente 670 \muM, normalmente desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 430 \muM.
Cofactor de enzima
En ciertas realizaciones, las muestras incluyen además uno o más cofactores de enzima. Los cofactores de enzima de interés incluyen cationes metálicos divalentes, por ejemplo, Ca^{2+}, Mg^{2+}, etc. La concentración de cualquier cofactor puede variar desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 5 mM.
Célula electroquímica
Como se ha resumido anteriormente, al poner en práctica los presentes procedimientos la muestra se aplica a una célula electroquímica que incluye una composición de reactivo libre de enzimas. Se conocen una variedad de distintos tipos de configuración de célula electroquímica, incluyendo aquellas descritas en los documentos de patentes U.S.: 5.723.284; 5.834.224; 5.942.102; 5.972.199; 5.997.817; 6.083.710; 6.121.009; 6.134.461; 6.193.873; y 6.716.577; al igual que en otros documentos de patentes: WO 99/49307; WO 97/18465; WO 01/57510; WO 01/57238; WO 02/48707; WO 02/50609; EP 0 969 097A2 y GB 2 304 628. Cualquiera de estas u otras células electroquímicas conocidas a los expertos en la técnica pueden ser modificadas para incorporar las presentes composiciones.
La célula electroquímica de la presente invención está presente en una tira reactiva electroquímica. En las Figuras 2A y 2B se proporciona una representación de la tira reactiva electroquímica conforme a la presente invención. La Figura 2A proporciona una vista ampliada de la tira reactiva electroquímica que está formada por un electrodo de trabajo y un electrodo de referencia separados por una capa separadora que tiene un sección vaciada que define la zona o área de reacción en la tira montada, en la que estos elementos están descritos adicionalmente a continuación. La Figura 2B muestra la misma tira reactiva de forma montada. Cada uno de los diversos componentes serán descritos ahora con mayor detalle a continuación.
Electrodos
Las presentes tiras reactivas electroquímicas que comprenden las composiciones de reactivo incluyen un electrodo de trabajo y un electrodo de referencia. Normalmente, los electrodos de trabajo y de referencia están configurados en forma de tiras rectangulares alargadas. Típicamente, la longitud de los electrodos varía desde aproximadamente 1,9 hasta aproximadamente 4,5 cm, normalmente desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 2,8 cm. La anchura de los electrodos varía desde aproximadamente 0,38 hasta aproximadamente 0,76 cm, normalmente desde aproximadamente 0,51 hasta aproximadamente 0,67 cm. Los electrodos de referencia tienen típicamente un grosor que varía desde aproximadamente 10 hasta 100 nm y normalmente desde aproximadamente 18 hasta aproximadamente 22 nm. En ciertas realizaciones, la longitud de uno de los electrodos es menor que la longitud del otro electrodo, en las que en ciertas realizaciones es aproximadamente 0,32 cm más corto.
Los electrodos de trabajo y de referencia están caracterizados además porque al menos la superficie de los electrodos que da a la zona de reacción en la tira es de un material conductor, por ejemplo, un metal u otro material conductor, en la que los materiales representativos de interés incluyen, sin estar limitadas por ellos: paladio, oro, platino, plata, iridio, carbono, impurezas de óxido de estaño, acero inoxidable y similares. En ciertas realizaciones, el material conductor es oro o paladio. Aunque en principio el electrodo completo puede estar hecho del material conductor, cada uno de los electrodos está formado normalmente de un material de soporte inerte en cuya superficie hay presente una capa fina del componente de material conductor del electrodo. Se puede emplear cualquier material de soporte inerte conveniente en los presentes electrodos, en los que normalmente el material es un material rígido que es capaz de proporcionar un soporte estructural al electrodo y, sucesivamente, a la tira reactiva electroquímica en su conjunto. Los materiales adecuados que se pueden emplear sustrato de soporte incluyen plásticos, por ejemplo PET, PETG, poliimida, policarbonato, poliestireno, silicio, cerámica, vidrio y similares.
Capa separadora
Una característica de las presentes tiras reactivas electroquímicas es que los electrodos de trabajo y de referencia como se han descrito anteriormente están frente por frente y están separados solo por una pequeña distancia, de forma que la distancia entre el electrodo de trabajo y el de referencia en la zona o área de reacción de la tira reactiva electroquímica es extremadamente pequeña. Esta separación mínima de los electrodos de trabajo y de referencia en las presentes tiras reactivas es un resultado de la presencia de una capa separadora fina colocada o interpuesta entre los electrodos de trabajo y de referencia. El grosor de esta capa separadora varía normalmente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 500 \mum, normalmente desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 200 \mum. La capa separadora está cortada de forma que se proporciona una zona o área de reacción con al menos un puerto de entrada hasta dentro de la zona de reacción, y normalmente también un puerto de salida fuera de la zona de reacción. En las Figuras 2A y 2B se puede ver una configuración representativa de una capa separadora. Aunque la capa separadora está mostrada en estas figuras como que tiene una corte circular de área de reacción con respiraderos o puertos de entrada y salida laterales, son posibles otras configuraciones, por ejemplo, áreas de reacción con forma cuadrada, oval, triangular, rectangular, irregular, etc. La capa separadora puede estar fabricada de cualquier material conveniente, en la que los materiales adecuados representativos incluyen PET, PETG, poliimida, policarbonato y similares, en la que las superficies de la capa separadora pueden ser tratadas de forma que sean adhesivas con respecto a sus electrodos respectivos y mantengan de ese modo la estructura de la tira reactiva electroquímica. De interés particular es el uso de una tira adhesiva de doble cara troquelada como la capa separadora.
Zona de reacción
Las presentes tiras reactivas electroquímicas incluyen una zona o área de reacción que está definida por el electrodo de trabajo, el electrodo de referencia y la capa separadora, en la que estos elementos han sido descritos anteriormente. Específicamente, los electrodos de trabajo y de referencia definen la parte superior e inferior del área de reacción, mientras que la capa separadora define las paredes del área de reacción. El volumen del área de reacción es de al menos aproximadamente 0,1 \mul, normalmente al menos aproximadamente 1 \mul y más normalmente al menos aproximadamente 1,5 \mul, en el que el volumen puede ser tan grande como 10 \mul o más. Como se ha mencionado anteriormente, el área de reacción incluye normalmente al menos un puerto de entrada, y en muchas realizaciones también incluye un puerto de salida. El área de corte transversal de los puertos de entrada y de salida puede variar siempre que sea lo suficientemente grande como para proporcionar una entrada o salida efectiva de fluido desde el área de reacción, pero normalmente varía desde aproximadamente 9 \times 10^{-5} hasta aproximadamente 5 \times 10^{-3} cm^{2}, normalmente desde aproximadamente 5 \times 10^{-4} hasta aproximadamente 2,5 \times 10^{-3} cm^{2}.
Composición de reactivo libre de enzimas
En la zona de reacción hay presente una formulación de reactivo libre de enzimas, en la que la formulación de reactivo está presente normalmente en un formato seco. Por libre de enzimas se quiere decir que la formulación no incluye al menos la enzima de sistema reactivo redox que está presente en la muestra que ha de ser sometida a ensayo en la célula electroquímica. Como tal, si la muestra que ha de ser aplicada a la célula electroquímica incluye una glucosa dehidrogenasa, la formulación de reactivo presente en la célula electroquímica no incluye una glucosa dehidrogenasa, y en muchas realizaciones no incluye ninguna enzima.
Una característica de las formulaciones de reactivo libres de enzimas presentes en las células electroquímicas es la presencia de un mediador redox, que puede comprender uno o más agentes mediadores. El mediador actúa como un intermediario que facilita la transferencia de electrones desde la enzima (que ha tomado uno o más electrones del analito durante la oxidación del analito) hasta el electrodo. Se pueden utilizar una variedad de distintos agentes mediadores conocidos en la técnica, incluyendo ferricianuro, etosulfato de fenacina, metosulfato de fenacina, fenilenodiamina, N,N,N',N'-tetrametil fenilenodiamina, metosulfato de 1-metoxi-fenacina, 2,5-dimetil-1,4-benzoquinona, 2,6-dimetil-1,4-benzoquinona, 2,5-dicloro-1,4-benzoquinona, derivados de ferroceno, complejos de bipiridilo de osmio, complejos de rutenio y similares. En las realizaciones representativas, el mediador redox es ferricianuro.
Otro componente de la composición de reactivo es un componente tampón mediador estabilizador. Los presentes componentes tampón mediadores estabilizadores pueden estar formados de uno o más, por ejemplo, dos, tres, cuatro o más, agentes tampón distintos, en los que el componente tampón estabiliza el mediador durante el almacenaje de la composición en forma seca, de manera que se reduce poco o nada del mediador antes de su uso, por ejemplo, durante su almacenaje.
En una realización, los agentes tampón son ácidos policarboxílicos. Por ácidos policarboxílicos se quiere decir que los agentes tampón incluyen dos o más mitades funcionales de ácido carboxílico, en el que el número de distintas mitades funcionales de ácido carboxílico puede variar desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 10, por ejemplo, desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 8, incluyendo desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 6. Los grupos o mitades funcionales de ácido carboxílico de los presentes agentes tampón pueden estar fijados a un número de distintas estructuras, incluyendo estructuras alifáticas, alicíclicas, aromáticas y heterocíclicas. La presencia de más de un grupo de ácido carboxílico puede tener el efecto beneficioso de proporcionar al menos un valor pKa para el tampón en el rango deseado. Los ácidos policarboxílicos específicos de interés incluyen, sin estar limitados a ellos: el ácido melítico, el ácido citracónico, el ácido maleico, y similares, etc.
Donde la composición de reactivo es una formulación seca de reactivo, por ejemplo, como puede estar presente en una tira reactiva electroquímica como se describe con mayor detalle a continuación, la cantidad de componente tampón presente en la composición seca varía típicamente desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 40,00, normalmente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10% peso/peso.
La composición de reactivo puede incluir además uno o más de los siguientes componentes adicionales: un agente humectante, un estabilizador de detergente, un modificador de viscosidad o combinaciones de los mismos.
Se puede añadir un agente humectante, en algunas realizaciones en combinación con un detergente, a la composición de reactivo para facilitar un revestimiento uniforme de la composición de reactivo sobre la tira reactiva electroquímica. También se pueden utilizar una pluralidad de uno o más de la combinación de agentes. Los agentes utilizados pueden mejorar la disolución de los reactivos de ensayo al igual que mejorar las propiedades de absorción de una tira de relleno capital. Los agentes incluyen los conocidos en la técnica, por ejemplo, polímeros, agentes antiespumantes y agentes tensoactivos. Los tipos representativos de tensoactivos/detergentes de interés incluyen, tampón: Triton, Macol, Tetronic, Silwet, Zonyl y Pluronic. Los agentes adecuados incluyen materiales Pluronic que son copolímeros en bloque de óxido de polietileno y óxido de polipropileno. Ejemplos de materiales Pluronic incluyen el Pluronic P103, que tiene buenas propiedades humectantes, y el Pluronic F87 Prill, que tiene buenas propiedades detergentes. Tanto el Pluronic P103 como el F87 Prill también tienen una temperatura de cristalización superior a 80ºC, lo que es deseable, dado que esta propiedad evita un cambio de fase en la composición durante el proceso de secado.
También pueden añadirse estabilizadores a la composición de reactivo para ayudar a estabilizar la enzima y evitar la desnaturalización de la proteína. El estabilizador también puede ayudar a estabilizar el estado redox del mediador, en particular, del mediador oxidado redox. Ejemplos de agentes estabilizadores incluyen, sin estar limitados a ellos: carbohidratos (por ejemplo, sacarosa, trehalosa, manitol y lactosa), aminoácidos, proteínas (como la BSA y la albúmina) y compuestos orgánicos como el EDTA y similares.
También se pueden añadir modificadores de viscosidad al reactivo para modificar la reología líquida del reactivo. Ejemplos de dichos agentes incluyen el ácido poli(acrílico), el alcohol de poli(vinilo), el dextrano, la BSA y similares.
Procedimientos
Para poner en práctica los presentes procedimientos, el primer paso es introducir una cantidad de medio fluido o de muestra en la zona de reacción de una célula electroquímica, por ejemplo, de una tira reactiva electroquímica. El periodo de tiempo entre la preparación de la muestra y la aplicación a la zona de reacción puede variar, pero en ciertas realizaciones representativas varía desde aproximadamente 30 segundos hasta aproximadamente 8 horas, como desde aproximadamente 5 minutos hasta aproximadamente 60 minutos. La cantidad de muestra que se introduce en la zona de reacción de la célula electroquímica puede variar, pero normalmente varía desde aproximadamente 0,05 hasta aproximadamente 10 \mul, normalmente desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 1,6 \mul. La muestra puede ser introducida en la zona de reacción utilizando cualquier protocolo conveniente, en el que la muestra puede ser inyectada en la zona de reacción, se permite que sea absorbida en la zona de reacción, y similares, como convenga.
Después de la aplicación de la muestra a la zona de reacción, se lleva a cabo una medición electroquímica utilizando los electrodos de referencia y de trabajo. La medición electroquímica que se toma puede variar dependiendo de la naturaleza particular del ensayo y del dispositivo con el que se emplea la tira reactiva electroquímica, por ejemplo, dependiendo de si el ensayo es culombimétrico, amperométrico o potenciométrico. Normalmente, la medida electroquímica medirá la carga (culombimétrico), la corriente (amperométrico) o el potencial (potenciométrico), normalmente en un periodo de tiempo dado después de la introducción de la muestra en la zona de reacción. Los procedimientos para realizar la medición electroquímica descrita anteriormente se describen adicionalmente en las patentes U.S. n^{os}: 4.224.125; 4.545.382; y 5.266.179; al igual que en WO 97/18465; WO 99/49307.
Después de la detección de la señal electroquímica generada en la zona de reacción como se ha descrito anteriormente, la señal se emplea para caracterizar la enzima de la muestra de alguna forma, por ejemplo, para determinar la especificidad de la enzima hacia el sustrato, para determinar la concentración de la enzima en la muestra aplicada en la célula, etc., en la que estas dos aplicaciones representativas están descritas con mayor detalle a continuación. En ciertas realizaciones, los pasos de medición de la señal electroquímica y los pasos de caracterización de la enzima, como se han descrito anteriormente, los lleva a cabo de manera automática un dispositivo diseñado para trabajar con la tira reactiva para llevar a cabo dichos pasos después de la aplicación de una muestra en la célula electroquímica. En la patente U.S. nº 6.193.873 se describe adicionalmente un dispositivo de lectura representativo para poner en práctica de manera automática al menos algunos de estos pasos.
Utilidad
Como se ha indicado anteriormente, los presentes procedimientos encuentran su uso en una variedad de distintas aplicaciones, en las que las aplicaciones representativas en las que los presentes procedimientos encuentran su uso son aplicaciones de caracterización de enzimas, como se ha descrito anteriormente.
Una primera aplicación representativa de caracterización de enzima que se puede lograr con los presentes procedimientos es determinar la especificidad de una primera enzima hacia el sustrato o el analito al compararse con una o más enzimas adicionales; por ejemplo, la especificidad de una glucosa dehidrogenasa mutante para glucosa según se compara con otros azúcares reductores, por ejemplo, la maltosa, en la que la especificidad se determina con respecto a una segunda glucosa dehidrogenasa, por ejemplo, dehidrogenasa de tipo salvaje.
Al poner en práctica estas aplicaciones representativas de la presente invención, se prepara un conjunto de muestras de fluido que incluye al menos enzimas primera y segunda combinadas con sustratos de enzima primero y segundo y cada muestra preparada se prueba individualmente en una célula electroquímica. Por probar individualmente se quiere decir que cada muestra del conjunto se prueba en su propia célula electroquímica o en una aparte.
En algunas de estas realizaciones, el conjunto de muestras que se prepara y que luego se aplica individualmente a una célula electroquímica conforme a los presentes procedimientos incluye al menos:
(i)
una muestra que contiene una enzima de sistema reactivo redox y una primera concentración conocida de un primer sustrato de enzima;
(ii)
una muestra que contiene la primera enzima de sistema reactivo redox y una primera concentración conocida de un segundo sustrato de enzima;
(iii)
una muestra que contiene una segunda enzima de sistema reactivo redox y dicha primera concentración conocida del primer sustrato de enzima; y
(iv)
una muestra que contiene una segunda enzima de sistema reactivo redox y dicha primera concentración conocida del segundo sustrato de enzima.
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En ciertas realizaciones, el ensayo de especificidad incluye probar cada una de las enzimas a distintas concentraciones de los sustratos primero y segundo de enzima, por ejemplo, a una pluralidad de distintas concentraciones de las enzimas primera y segunda. En dichas realizaciones, se preparan y se prueban al menos las siguientes muestras adicionales:
(i)
una muestra que contiene la primera enzima de sistema reactivo redox y una segunda concentración conocida del primer sustrato de enzima;
(ii)
una muestra que contiene la primera enzima de sistema reactivo redox y una segunda concentración conocida del segundo sustrato de enzima;
(iii)
una muestra que contiene la segunda enzima de sistema reactivo redox y la segunda concentración conocida del primer sustrato de enzima; y
(iv)
una muestra que contiene la segunda enzima de sistema reactivo redox y la segunda concentración conocida del segundo sustrato de enzima.
\vskip1.000000\baselineskip
Una realización representativa de estas aplicaciones es la evaluación de distintas enzimas s-GDH con respecto a la especificidad de sustrato, o sea, la capacidad de emplear glucosa pero no azúcares reductores competidores como un sustrato. Esta realización se ilustra adicionalmente en la Fig. 1. La Fig. 1 es un diagrama de flujo de un proceso 100 para probar s-GDH de formas de tipo salvaje y mutantes conforme a una realización ejemplar de la presente invención. El proceso 100 incluye proporcionar una célula electroquímica, como se expone en el paso 110. Se proporciona una célula electroquímica típica tal como la que puede ser utilizada con los procesos conforme a la presente invención en forma de una tira reactiva 200, como se muestra en las vistas ampliada y superior en las FIGURAS 2A y 2B, respectivamente. La tira reactiva 200 incluye un electrodo 202 de trabajo y un electrodo 204 de referencia separados mediante una capa separadora 206. El electrodo 202 de trabajo incluye una banda de reactivo seco 208 que incluye un mediador de tampón, un tensoactivo y un agente estabilizador. La capa separadora 206 incluye una sección vaciada que define la zona de reacción en la célula electroquímica 210 en la tira montada.
Como se ha reseñado anteriormente, los materiales adecuados para el electrodo 204 de referencia incluyen los enumerados anteriormente para el electrodo 202 de trabajo. El material para el electrodo 204 de referencia en un formato opuesto de electrodo es normalmente paladio u oro. En un formato de célula electroquímica en el que los electrodos son coplanares, el electrodo 204 de referencia es normalmente de carbono.
El electrodo 204 de referencia está normalmente revestido con un estabilizador que contiene una mitad de sulfuro en su estructura molecular. El revestimiento también puede incluir un grupo hidrófilo y un separador entre la mitad que contiene sulfuro y el grupo hidrófilo. Ejemplos de compuestos útiles en los revestimientos del electrodo 204 de referencia incluyen, sin estar limitados a ellos, el ácido sulfónico 2-mercaptoetano, el 2-mercaptoetanol, la 2-mercaptoetilamina, el ácido 3-mercaptopropriónico, el tiofeno, el 4-carboxitiofeno, la cisteína, la homocisteína y la cistina. El electrodo 204 de referencia está compuesto normalmente de oro revestido con ácido sulfónico 2-mercaptoetano.
El reactivo seco 208 puede usarse de revestimiento en el electrodo 208 de trabajo mediante el recubrimiento realizado mediante ranura como se describe en la solicitud de patente europea EP 1324038A2, cuya revelación está incorporada en el presente documento por referencia. Otros procedimientos para revestir con un reactivo incluyen, sin estar limitados a ellos, la inyección de tinta y el revestimiento mediante percutores.
La capa separadora 206 está cortada de forma que se proporciona una zona de reacción con al menos un puerto de entrada en la zona de reacción y normalmente un puerto de salida fuera de la zona de reacción. En las FIGURAS 2A y 2B se muestra que la capa separadora 206 tiene un corte circular de área de reacción con respiraderos laterales de entrada y de salida. Otras configuraciones del área de reacción incluyen, sin estar limitadas a ellas, áreas de reacción con forma cuadrada, oval, triangular, rectangular e irregular. La capa separadora 206 puede estar fabricada de cualquier material adecuado incluyendo, sin estar limitado ellos, PET, PETG, poliimida y policarbonato, con lo que las superficies de la capa separadora 206 pueden ser tratadas para que sean así adhesivas. La capa separadora 206 es normalmente un adhesivo de doble cara troquelado.
El mediador puede ser ferricianuro; etosulfato de fenacina; metosulfato de fenacina; fenilenodiamina; N,N,N',N'-tetrametil fenilenodiamina; metosulfato de 1-metoxi-fenacina; 2,5-dimetil-1,4-benzoquinona; 2,6-dimetil-1,4-benzoquinona; 2,5-dicloro-1,4-benzoquinona; derivados de ferroceno; complejos de bipiridilo de osmio; complejos de rutenio; o similares. Los agentes tampón adecuados tienen poca afinidad, si es que la tienen, hacia los cationes divalentes de metal (por ejemplo, Ca2+) y pueden ser de citraconato, citrato, málico, maleico, fosfato, tampones de Good o similares. Además, la solución tampón puede contener tensoactivos o agentes humectantes que incluyen Triton, Macol, Tetronic, Silwet, Zonyl o Pluronic; y los agentes estabilizadores incluyen la sacarosa, la trehalosa o el manitol. En la realización preferida el mediador es ferricianuro, el tampón es el citraconato, el tensoactivo es Pluronic, y el agente estabilizador es la sacarosa.
A continuación, como se expone en el paso 120 en el proceso 100, se mezcla s-GDH de tipo salvaje o al menos una forma mutante de la misma en una solución tampón con una coenzima, un cofactor y concentraciones variables de un primer azúcar reductor (por ejemplo, la glucosa). El primer azúcar reductor puede ser, sin estar limitada a ellas, glucosa, galactosa, maltosa, xilosa o lactosa. La coenzima puede ser PQQ y el cofactor puede ser calcio.
La s-GDH empleada en el proceso conforme a la presente invención, incluyendo el proceso 100 y 300 (véase más abajo), puede ser cualquier forma nativa o mutante de s-GDH en la que se ha hecho al menos una modificación en la secuencia de aminoácido de la enzima nativa, pero no está limitada a llevar a cabo una o más sustituciones o eliminaciones de aminoácido para mejorar la especificidad de la glucosa. Se pueden utilizar las técnicas conocidas por los expertos en la técnica para llevar a cabo estas modificaciones a la s-GDH y se exponen en la patente U.S. nº 6.103.509 y en la solicitud de patente europea nº EP 1 176 202 A1 mencionadas anteriormente, en las que los procedimientos generales para hacer mutantes de una enzima de tipo salvaje son perfectamente conocidos por los expertos en la técnica.
Como se ha expuesto en el paso 130 de la Fig. 1, se añaden las soluciones de enzima/azúcar cada una en células electroquímicas distintas que contienen un mediador tampón, un agente tensoactivo y un agente estabilizador. A continuación, se mide la respuesta de corriente y se traza como una función de la concentración de azúcar, como se expone en los pasos 140. Mantener a la solución de enzima/azúcar separada del mediador antes de medir la respuesta de corriente es beneficioso debido a la rápida tasa de reacción entre la enzima y el mediador. Si se mezclan la enzima y el mediador antes de añadir la solución a la célula electroquímica, la reacción estará completa o cerca de estar completa antes de que se pueda medir la respuesta de corriente. Se repiten entonces los pasos 110 hasta 140 para al menos un azúcar reductor adicional y al menos una forma mutante de s-GDH adicional, como se expone en el paso 150 (véanse los Ejemplos 2-4). El al menos un azúcar reductor adicional puede ser, sin estar limitado a ellas, la galactosa, la maltosa, la xilosa o la lactosa. A continuación, se selecciona una forma mutante de s-GDH con una respuesta reducida al al menos un azúcar adicional, como se expone en los pasos 160 y 170.
De esta forma, se puede determinar fácilmente la especificidad de la s-GDH mutante con respecto a la s-GDH de tipo salvaje.
En otra aplicación representativa, los presentes procedimientos se emplean para determinar la concentración o la actividad de una enzima en una muestra de fluido. Al poner en práctica estos procedimientos, se aplica una muestra de fluido que contiene una cantidad desconocida de enzima y una cantidad conocida de sustrato a una célula electroquímica. Después de la aplicación, se utiliza la señal eléctrica detectada para determinar la concentración de analito en la muestra aplicada, por ejemplo, al comparar dicha señal eléctrica detectada con una referencia.
La Fig. 3 es un diagrama de flujo que ilustra una secuencia de pasos en un proceso 300 conforme a la presente invención para medir la actividad de s-GDH de tipo salvaje y mutantes de la misma en una muestra. El proceso 300 incluye proporcionar una célula electroquímica que contiene un mediador secado en tampón con un tensoactivo y un estabilizador, como se expone en el paso 310. A continuación, se mezclan concentraciones crecientes de s-GDH de tipo salvaje o una forma mutante de s-GDH con una cantidad constante de glucosa, como se expone en el paso 320. Entonces se añade cada muestra de enzima/glucosa a una célula electroquímica distinta, como se expone en el paso 330. Como se expone en el paso 340, se mide la respuesta de corriente para cada muestra y la respuesta se traza como una función de la concentración de enzimas para crear una curva estándar, que se puede emplear como referencia en los pasos subsiguientes. A continuación, se repiten los pasos 310 hasta 340 para al menos un lote adicional de s-GDH de tipo salvaje o de forma mutante, como se expone en el paso 350. Como se expone en el paso 360, entonces se lee la concentración de enzimas de el al menos un lote adicional de s-GDH de tipo salvaje o de forma mutante de la curva estándar o de referencia, por ejemplo, al comparar la señal detectada con la referencia.
Sistemas
La presente invención también proporciona sistemas para ser utilizados al poner en práctica los presentes procedimientos, en lo que los sistemas incluyen al menos una muestra o medio fluido que incluye una enzima de sistema reactivo redox y una célula electroquímica que incluye una composición de reactivo libre de enzimas, como se ha descrito anteriormente.
Los presentes sistemas también pueden incluir un dispositivo para ser utilizado al someter de manera electroquímica a ensayo una muestra utilizando las presentes composiciones de reactivo.
Los dispositivos o medidores de los presentes sistemas son normalmente dispositivos electroquímicos de medición. Los presentes medidores incluyen normalmente: (a) un medio para aplicar un potencial eléctrico a una célula electroquímica en la que se ha introducido una muestra; y (b) un medio para medir la corriente de la célula en la célula. En los documentos de patente U.S.: 5.723.284; 5.834.224; 5.942.102; 5.972.199; 5.997.817; 6.083.710; 6.121.009; 6.134.461; y 6.193.873 al igual que en otros documentos de patente: WO 99/49307; WO 97/18465; WO 01/57510; WO 01/57238; WO 02/48707; WO02/50609; EP 0 969 097A2 y GB 2 304 628 se describen medidores o dispositivos electroquímicos representativos.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.
Experimental Ejemplo 1 Rendimiento de tiras reactivas convencionales revestidas con s-GDH de tipo salvaje o formas mutantes
Para desarrollar un ensayo para análisis de formas mutantes de s-GDH con especificidades variables de azúcar, primero se prueba la respuesta de s-GDH de tipo salvaje y formas mutantes con azúcares reductores en un formato convencional de tira reactiva de glucosa revestida con enzimas. Idealmente, el ensayo analítico imita la respuesta mostrada con tiras revestidas convencionalmente con enzimas sometidas a ensayo con sangre total o plasma enriquecido con un azúcar reductor. Cada una de las formas mutantes de s-GDH probadas contuvieron una sustitución de aminoácido: Asn452Thr y Asp167Glu. Se hicieron las tiras reactivas mediante un proceso basado en una banda de papel en la que el electrodo de trabajo (oro) estaba revestido con recubrimiento realizado mediante ranura con una solución de reactivo tampón que contenía aproximadamente 50 hasta 500 kU/ml de s-GDH de tipo salvaje o mutante, PQQ con una relación de 2 a 1 de PQQ a GDH, 2 mM de CaCl_{2}, 750 mM de ferricianuro, 67 mM de citraconato con un pH de 6,8, 0,1% de Pluronic y 75 mM de sacarosa. Se ajustó la concentración de s-GDH de tipo salvaje o mutante en la solución de reactivo de forma que se usaron aproximadamente 13 unidades de actividad por célula electroquímica; por lo tanto, las unidades de actividad por ml de solución de reactivo variaron dependiendo de las unidades de actividad por gramo de enzima utilizada. La actividad de cada enzima estaba basada en un ensayo de espectrofotometría utilizando DCIP (2,6-diclorofenolindofenol) y PES (etosulfato de fenacina) en 50 mM de tampón de PIPES (piperacina, N, N' bis-(ácido 2-etanosulfónico)) con un pH de 6,8. En el ensayo, se monitorizó el cambio en la absorción de DCIP a 600 nm y se hizo referencia a la velocidad decreciente de absorción como la velocidad de reacción de la enzima. La actividad enzimática por la que se reduce 1 mmol de DCIP en un minuto fue definida como 1 Unidad. El coeficiente de absorción molar de DCIP con un pH de 6,8 fue de 17,4 mM-1. Se utilizó un analizador centrífugo COBAS FARA II para el ensayo de espectrofotometría.
Se utilizó una fuente de energía IR para secar el reactivo en el electrodo de trabajo, como se describe en la solicitud de patente europea nº EP1324038, que está incorporada en el presente documento por referencia. Las células electroquímicas (o tiras reactivas) se formaron adhiriendo al electrodo de trabajo reactivo seco a un contraelectrodo de oro que contenía MESA seco para evitar la contaminación del contraelectrodo.
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Se enriqueció sangre total a aproximadamente 80 mg/dL (o 4,4 mM) de glucosa endógena con un nivel terapéutico alto (aproximadamente 60 mg/dL o 4 mM) o con tres veces un nivel terapéutico alto (aproximadamente 180 mg/dL o 12 mM) del azúcar interferente xilosa. Se dosificaron las muestras enriquecidas sobre las tiras reactivas y se determinó la concentración de glucosa mediante cronoamperometría, en la que se aplicó un potencial de -0,3 V durante 10 segundos, y a continuación se aplicó un potencial de +0,3 V durante 5 segundos. Se calculó la tendencia absoluta para una muestra de control sin nada de xilosa para cada enzima y se expresó como una función de la concentración de xilosa, como se muestra en la Fig. 4. Hubo una correlación lineal entre la tendencia absoluta y el azúcar interferente xilosa para s-GDH de tipo salvaje y el mutante Asn452Thr, indicando que tanto la s-GDH de tipo salvaje y el Asn452Thr reconocen la xilosa al igual que la glucosa. Sin embargo, el mutante Asp167Glu exhibió una respuesta reducida con la xilosa. Ambas formas mutantes también demostraron correlaciones lineales entre tendencia absoluta y galactosa o maltosa (datos no mostrados), indicando que se reconocen estos carbohidratos al igual que la glucosa. Así, un ensayo utilizado para analizar formas mutantes de s-GDH debería dar resultados similares a los obtenidos en la Fig. 4 en la que solo el Asp167Glu exhibió una respuesta reducida a la xilosa.
Los resultados mostrados en la Fig. 4 no incluyeron probar en todo el rango fisiológicamente relevante de concentración de azúcar (o sea, hasta 720 mg/dL o 40 mM); por lo tanto, se llevaron a cabo más pruebas de tiras reactivas convencionales revestidas con s-GDH de tipo salvaje para expandir el rango de concentración de azúcar. El plasma con aproximadamente 80 mg/dL (o 4,4 mM) de glucosa endógena fue enriquecido con hasta 40 mM de cada uno de los cinco azúcares reductores: glucosa, maltosa, xilosa, galactosa y lactosa. Se dosificaron las muestras enriquecidas sobre las anteriores tiras reactivas y se determinó la concentración de glucosa mediante cronoamperometría, como anteriormente. Se trazó la respuesta de corriente medida como una función de la concentración de azúcar como se muestra en la Fig. 5. Como en la Fig. 4, con menos de aproximadamente 10 mM, la s-GDH de tipo salvaje reacciona realmente bien con cada uno de los cinco azúcares reductores probados. Sin embargo, cuando se probaron con el ensayo espectrofotométrico de DCIP/PES descrito anteriormente, la s-GDH tiene una baja reactividad con la xilosa y la galactosa en el mismo rango de concentraciones de azúcar (resultados no mostrados), indicando que el ensayo espectrofotométrico no puede ser utilizado para tiras reactivas convencionales revestidas con enzimas. Como se ha mencionado anteriormente, el ensayo espectrofotométrico utiliza condiciones limitantes de las enzimas, mientras que las tiras reactivas revestidas convencionalmente con enzimas utilizan la enzima en exceso; explicando así la diferencia en respuesta al azúcar con cada formato de ensayo.
Ejemplo 2 Prueba de respuesta de la s-GDH de tipo salvaje a los azúcares reductores en un proceso que utiliza una célula electroquímica conforme a la presente invención
Se midió la respuesta de la s-GDH de tipo salvaje a azúcares reductores utilizando células electroquímicas (o sea, tiras reactivas) hechas mediante un proceso basado en una banda de papel en la que el electrodo de trabajo (oro) estaba revestido con recubrimiento realizado mediante ranura con una solución de reactivo tampón que contenía aproximadamente 750 mM de ferricianuro, 67 mM de citraconato con un pH de 6,8, 0,1% de Pluronics y 75 mM de sacarosa. Como en el Ejemplo 1, se utilizó una fuente de energía IR para secar el reactivo sobre el electrodo de trabajo. Se formaron células electroquímicas al adherir el electrodo de trabajo con el reactivo secado a un contraelectrodo de oro que contenía MESA secado para evitar la contaminación del contraelectrodo.
Se mezcló s-GDH de tipo salvaje en 67 mM de citraconato con un pH de 6,8 con PQQ con una relación de 2 a 1 de PQQ a GDH y 2 mM de CaC12 con concentraciones fisiológicamente relevantes (hasta aproximadamente 40 mM o 720 mg/dL) de uno de los siguientes azúcares: glucosa, xilosa, galactosa, maltosa o lactosa. Se ajustó la concentración de la s-GDH de tipo salvaje en cada solución de forma que se utilizaron aproximadamente 13 unidades de actividad por célula electroquímica. Se dosificó cada solución que contenía enzima/azúcar en una célula electroquímica que contenía ferricianuro secado, citraconato, Pluronics y sacarosa pero ninguna enzima (véase más arriba para las concentraciones). Se midió la respuesta de corriente y se trazó la media de tres determinaciones como una función de la concentración de azúcar, como se muestra en la Fig. 6. Los resultados fueron similares a los obtenidos con las tiras revestidas con s-GDH en el Ejemplo 1 (véase la Fig. 4) con concentraciones de xilosa menores de 10 mM en las que la enzima reaccionó realmente bien con la glucosa y la xilosa. También se obtuvieron resultados similares a los obtenidos en la Fig. 5 con todos los azúcares reductores. Así, el ensayo modela la respuesta obtenida con las tiras reactivas convencionales revestidas con enzimas de tipo salvaje con las siguientes ventajas: (1) las tiras revestidas con enzimas no tienen que ser fabricadas con cada forma de enzima, ahorrando por lo tanto tiempo y recursos (equipo y técnicos) y se utilizan menos enzimas; y (2) se pueden utilizar muestras basadas en tampón que contienen concentraciones variables de azúcar reductor en vez de sangre total o plasma, de riesgo biológico, enriquecido con azúcar.
Ejemplo 3 Prueba de respuesta de Asn452Thr (una forma mutante de s-GDH) a los azúcares reductores en un proceso que utiliza una célula electroquímica conforme a la presente invención
Se midió la respuesta de Asn452Thr a azúcares reductores utilizando el mismo lote de células electroquímicas como se ha descrito en el anterior Ejemplo 2 (o sea, con células que contenían ferricianuro secado, citraconato, Pluronics y sacarosa pero sin ninguna enzima). Se mezcló Asn452Thr con concentraciones fisiológicamente relevantes (hasta aproximadamente 40 mM o 720 mg/dL) de uno de los siguientes azúcares: glucosa, xilosa, galactosa, maltosa o lactosa. Se ajustó la concentración de Asn452Thr de forma que se utilizaron aproximadamente 1-3 unidades de actividad por célula electroquímica. Se dosificó cada solución que contenía enzima/azúcar en una célula electroquímica que contenía ferricianuro secado, citraconato, Pluronics y sacarosa pero ninguna enzima. Se midió la respuesta de corriente y se trazó como una función de la concentración de azúcar como se muestra en la Fig. 7. Los resultados fueron similares a los obtenidos con las tiras revestidas con Asn452Thr en el Ejemplo 1 (véase la Fig. 4) a menos de 10 mM de xilosa (o sea, a aproximadamente tres veces el nivel terapéutico alto) en los que al igual que la enzima de tipo salvaje, Asn452Thr reacciona igual de bien con la glucosa y la xilosa. Los datos también muestran que esta forma mutante de s-GDH reacciona igualmente bien con todos los azúcares probados a menos de 10 mM de azúcar. Así, el ensayo imita los resultados obtenidos con las tiras revestidas con Asn452Thr con las ventajas expuestas anteriormente.
Ejemplo 4 Prueba de respuesta de Asp167Glu (otra forma mutante de s-GDH) a los azúcares reductores en un proceso que utiliza una célula electroquímica conforme a la presente invención
Se midió la respuesta del Asp167Glu a azúcares reductores como se ha descrito en el anterior Ejemplo 3. Se mezcló Asp167Glu con concentraciones fisiológicamente relevantes (hasta aproximadamente 40 mM o 720 mg/dL) de uno de los siguientes azúcares: glucosa, xilosa, galactosa, maltosa o lactosa; y se dosificó en una célula electroquímica que contenía ferricianuro secado, citraconato, Pluronics y sacarosa, pero ninguna enzima. Se midió la respuesta de corriente y se trazó como una función de la concentración de azúcar como se muestra en la Fig. 8. Los resultados fueron similares a los obtenidos de las tiras revestidas con Asp167Glu en el Ejemplo 1 (véase la Fig. 4) a menos de 10 mM de xilosa (o sea, a aproximadamente tres veces el nivel terapéutico alto) en los que esta forma mutante de s-GDH exhibe una respuesta reducida a la xilosa. Esta mutación también reacciona igualmente bien con todos los otros azúcares reductores probados. Así, de nuevo, el ensayo imita de forma beneficiosa los resultados obtenidos con las tiras revestidas con Asp167Glu pero en un formato rápido y sencillo de usar.
Los ejemplos anteriores demuestran que se puede utilizar el procedimiento para modelar el rendimiento de la tira revestida con enzimas y se puede utilizar para analizar formas mutantes de s-GDH para una respuesta frente a los azúcares.
Los siguientes ejemplos demuestran cómo utilizar el procedimiento para medir la actividad de enzima.
Ejemplo 5 Curva estándar para una célula electroquímica dosificada con s-GDH de tipo salvaje conforme a un proceso de la presente invención
Se generó una curva estándar (véase la Fig. 9) para s-GDH de tipo salvaje al dosificar células electroquímicas que contenían ferricianuro secado, citraconato, Pluronics y sacarosa, pero ninguna enzima (véase más arriba para las concentraciones) con concentraciones crecientes de s-GDH de tipo salvaje que variaron desde aproximadamente 0-10 mg/ml. Se mantuvo la concentración de glucosa en 450 mg/dL. Los expertos en la técnica reconocerán que también se puede construir una curva estándar para cualquier forma mutante de s-GDH.
Se construyó un trazado de doble recíproco (o sea, 1/respuesta como una función de 1/concentración de enzima) a partir de la curva estándar en la Fig. 9 y éste se muestra en la Fig. 10. Existe una fuerte correlación lineal (r2=0,9986) entre la respuesta de la célula electroquímica y la cantidad de s-GDH de tipo salvaje. Se puede determinar fácilmente la concentración de un lote de prueba de enzima midiendo la respuesta de corriente y leyendo la concentración en la curva estándar.
La generación de una curva estándar para s-GDH en un formato electroquímico permite de forma beneficiosa la medición de la actividad de las enzimas captadas utilizadas para fabricar las tiras reactivas convencionales, midiendo la estabilidad de las enzimas revestidas en tiras secas y resolviendo los problemas potenciales de revestimiento de tiras relacionados con la actividad enzimática.
Los anteriores resultados y exposición demuestran que la presente invención proporciona formas convenientes y rentables para caracterizar enzimas de sistema reactivo redox. Las ventajas de la presente invención incluyen un menor coste y la capacidad para hacer ensayos sin utilizar sangre o productos sanguíneos. Como tal, la presente invención representa una contribución significativa a la técnica.

Claims (13)

  1. \global\parskip0.900000\baselineskip
    1. Un procedimiento para caracterizar una enzima de un sistema reactivo redox que comprende:
    (a)
    aplicar una muestra que comprende una primera enzima de un sistema reactivo redox y una cantidad conocida de un sustrato de enzima a una célula electroquímica que comprende una composición de reactivo libre de enzimas que comprende un mediador de dicho sistema reactivo redox; y
    (b)
    detectar una señal eléctrica producida por dicha célula.
  2. 2. El procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el que dicha enzima es una enzima oxidante.
  3. 3. El procedimiento conforme a la reivindicación 2, en el que dicha enzima oxidante está escogida entre una oxidasa y una dehidrogenasa.
  4. 4. El procedimiento conforme a la reivindicación 1, 2 o 3, en el que dicha muestra comprende además un cofactor de enzima.
  5. 5. El procedimiento conforme a la reivindicación 1, 2, 3 o 4, en el que dicho procedimiento comprende además utilizar dicha señal eléctrica detectada para determinar la especificidad del analito de dicha primera enzima de un sistema reactivo redox.
  6. 6. El procedimiento conforme a la reivindicación 5, en el que dicho procedimiento comprende detectar señales eléctricas producidas en al menos las siguientes muestras: (i) una muestra que contiene una primera enzima de un sistema reactivo redox y una primera concentración conocida de un primer sustrato de enzima; (ii) una muestra que contiene dicha primera enzima de un sistema reactivo redox y una primera concentración conocida de un segundo sustrato de enzima; (iii) una muestra que contiene una segunda enzima de un sistema reactivo redox y dicha primera concentración conocida de dicho primer sustrato de enzima; y (iv) una muestra que contiene dicha segunda enzima de un sistema reactivo redox y dicha primera concentración conocida de dicho segundo sustrato de enzima.
  7. 7. El procedimiento conforme a la reivindicación 6, en el que dicho procedimiento comprende además detectar señales eléctricas producidas en las siguientes muestras:
    (i)
    una muestra que contiene dicha primera enzima de un sistema reactivo redox y una segunda concentración conocida de dicho primer sustrato de enzima;
    (ii)
    una muestra que contiene dicha primera enzima de un sistema reactivo redox y una segunda concentración conocida de dicho segundo sustrato de enzima;
    (iii)
    una muestra que contiene dicha segunda enzima de un sistema reactivo redox y dicha segunda concentración conocida de dicho primer sustrato de enzima; y
    (iv)
    una muestra que contiene dicha segunda enzima de un sistema reactivo redox y dicha segunda concentración de dicho segundo sustrato de enzima.
  8. 8. El procedimiento conforme a la reivindicación 7, en el que dicha especificidad determinada de analito de dicha primera enzima de un sistema reactivo redox es relativa a dicha segunda enzima de un sistema reactivo redox.
  9. 9. El procedimiento conforme a la reivindicación 8, en el que dicha primera enzima de un sistema reactivo redox es una enzima que no se da de forma natural de un sistema reactivo redox.
  10. 10. El procedimiento conforme a la reivindicación 8, en el que dicha segunda enzima de un sistema reactivo redox es una enzima que se da de forma natural de un sistema reactivo redox.
  11. 11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho procedimiento comprende además utilizar dicha señal eléctrica detectada para determinar la actividad de dicha enzima en dicha muestra.
  12. 12. Una célula electroquímica que comprende un electrodo de trabajo y un electrodo de referencia que están separados mediante una capa separadora para definir una zona de reacción; y una composición de reactivo libre de enzimas que comprende un mediador de sistema reactivo redox que está presente en la zona de reacción de la célula electroquímica.
  13. 13. Un sistema que comprende:
    (a)
    una célula electroquímica que comprende una composición de reactivo libre de enzimas que comprende un mediador de sistema reactivo redox; y
    (b)
    un medio fluido que comprende una enzima de un sistema reactivo redox y una cantidad conocida de un sustrato de enzima.
    \global\parskip1.000000\baselineskip
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