JP2665681B2 - 1,5―アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼの製造法 - Google Patents
1,5―アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼの製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は糖尿病の診断マーカーとして期待される,1,5
−アンヒドログルシトール(以下1,5AGという)の測定
に利用しうる1,5AGデヒドロゲナーゼの製造法に関す
る。1,5AGデヒドロゲナーゼは、1,5AGを基質としてNAD
を還元型NADに変換する反応を触媒する酵素である。
−アンヒドログルシトール(以下1,5AGという)の測定
に利用しうる1,5AGデヒドロゲナーゼの製造法に関す
る。1,5AGデヒドロゲナーゼは、1,5AGを基質としてNAD
を還元型NADに変換する反応を触媒する酵素である。
1,5AGはヒト髄液及び血漿中に存在しある種の疾患,
特に糖尿病において血漿中の量が低下することが報告さ
れている化合物である。この1,5AGを酵素による酸化反
応を用いて定量測定する事ができ,1,5AG酸化酵素の需要
が高まっている。従来の1,5AGデヒドロゲナーゼの製造
法としては例えばシュードモナス属に属する微生物を培
養し採取する方法(特開昭62−79780)等が知られてい
る。
特に糖尿病において血漿中の量が低下することが報告さ
れている化合物である。この1,5AGを酵素による酸化反
応を用いて定量測定する事ができ,1,5AG酸化酵素の需要
が高まっている。従来の1,5AGデヒドロゲナーゼの製造
法としては例えばシュードモナス属に属する微生物を培
養し採取する方法(特開昭62−79780)等が知られてい
る。
NADを補酵素とし,1,5AGに高し特異性を示す1,5AGデヒ
ドロゲナーゼを効率良く生産する新規な製造法を提供す
る事である。
ドロゲナーゼを効率良く生産する新規な製造法を提供す
る事である。
本発明は下記の真菌類に属する1,5AGデヒドロゲナー
ゼ生産菌を培地に培養し,得られた菌体を破砕し菌体中
に蓄積した1,5AGデヒドロゲナーゼを採取することによ
る1,5AGデヒドロゲナーゼの製造法に関する。
ゼ生産菌を培地に培養し,得られた菌体を破砕し菌体中
に蓄積した1,5AGデヒドロゲナーゼを採取することによ
る1,5AGデヒドロゲナーゼの製造法に関する。
本発明に使用される真菌類は1,5AGデヒドロゲナーゼ
を生産する能力を有するものであればいずれの菌株でも
良いが,モニリエラ属,プレオスポラ属,コクリオボラ
ス属,アルターナリア属,ペスタロチア属,スコピュラ
リオプシス属,ネクトリア属,カエトミウム属,ドレク
スレラ属,シリンドロセファラム属,コリネスポラ属,
クテノマイセス属,ペトリエラ属,ヒポマイセス属,タ
ラロマイセス属,オイペニシリウム属,ネオサルトリア
属,セファロスポリウム属,スポロルミエラ属,セラト
シスチス属,フィアロセファラ属,バイソクラミス属,
グロメレラ属,マイコゴネ属,カルバラリア属,シリン
ドロクラディウム属,ヒポクレア属,グリオクラディウ
ム属,ゴナトボトリウム属,エメリセロプシス属,バシ
ディオボラム属,フィアロマイセス属,ディヘテロスポ
ラ属,サブリスポラ属,ピチア属,ハンセヌラ属又はマ
イコスファエレア属に属する微生物であり,好ましくは
ペスタロチア・ディオスピリ(Pestalotia diospyri)I
FO−5282,ネクトリア・ディティッシマ(Nectria ditis
sima)IFO−5995,ドレクスレラ・ジザニエ(Drechslera
zizaniae)IFO−6632,アルターナリア・ソラニ(Alter
naria solani)IFO−7517,スポロルミエラ・インターメ
ディア(Sporormiella intermedia)IFO−8392,セラト
シスチス・コエルレッセンス(Ceratocystis coerulesc
ens)IFO−8668,マイコスファエレラ・メロニス(Mycos
phaerella melonis)IFO−8776,ネオサルトリア・オー
ラタ(Neosartorya aurata)IFO−8783,オイペニシリウ
ム・クルスタセウム(Eupenicillium crustacenm)IFO
−8938,フィアロマイセス・マクロポラス(Phialomyces
macrosporus)IFO−9323,サブリスポラ・レクチリネタ
(Subulispora rectilineata)IFO−30162,ハンセヌラ
・カリホニア(Hansenura carifonia)HUT−7321,デバ
リオマイセス・ミソ(Debaryomyces miso)HUT−7036,
ピチア・シュードポリモルア(Pichia pseudopolymorh
a)HUT−7330等があげられる。
を生産する能力を有するものであればいずれの菌株でも
良いが,モニリエラ属,プレオスポラ属,コクリオボラ
ス属,アルターナリア属,ペスタロチア属,スコピュラ
リオプシス属,ネクトリア属,カエトミウム属,ドレク
スレラ属,シリンドロセファラム属,コリネスポラ属,
クテノマイセス属,ペトリエラ属,ヒポマイセス属,タ
ラロマイセス属,オイペニシリウム属,ネオサルトリア
属,セファロスポリウム属,スポロルミエラ属,セラト
シスチス属,フィアロセファラ属,バイソクラミス属,
グロメレラ属,マイコゴネ属,カルバラリア属,シリン
ドロクラディウム属,ヒポクレア属,グリオクラディウ
ム属,ゴナトボトリウム属,エメリセロプシス属,バシ
ディオボラム属,フィアロマイセス属,ディヘテロスポ
ラ属,サブリスポラ属,ピチア属,ハンセヌラ属又はマ
イコスファエレア属に属する微生物であり,好ましくは
ペスタロチア・ディオスピリ(Pestalotia diospyri)I
FO−5282,ネクトリア・ディティッシマ(Nectria ditis
sima)IFO−5995,ドレクスレラ・ジザニエ(Drechslera
zizaniae)IFO−6632,アルターナリア・ソラニ(Alter
naria solani)IFO−7517,スポロルミエラ・インターメ
ディア(Sporormiella intermedia)IFO−8392,セラト
シスチス・コエルレッセンス(Ceratocystis coerulesc
ens)IFO−8668,マイコスファエレラ・メロニス(Mycos
phaerella melonis)IFO−8776,ネオサルトリア・オー
ラタ(Neosartorya aurata)IFO−8783,オイペニシリウ
ム・クルスタセウム(Eupenicillium crustacenm)IFO
−8938,フィアロマイセス・マクロポラス(Phialomyces
macrosporus)IFO−9323,サブリスポラ・レクチリネタ
(Subulispora rectilineata)IFO−30162,ハンセヌラ
・カリホニア(Hansenura carifonia)HUT−7321,デバ
リオマイセス・ミソ(Debaryomyces miso)HUT−7036,
ピチア・シュードポリモルア(Pichia pseudopolymorh
a)HUT−7330等があげられる。
上記微生物を培養する培地の栄養源としては微生物の
培養に通常用いられるものが広く使用され,例えば窒素
源としてペプトン,酵母エキス,肉エキス,麦芽エキ
ス,コーンスチープリカー等の窒素含有天然物及び塩化
アンモニウム,硫酸アンモニウム,リン酸アンモニウ
ム,グルタミン酸等のアミノ酸などの無機あるいは有機
の窒素化合物が使用できる。炭素源としては資化可能な
炭素化合物であれば良く,グルコース,シュークロー
ス,デキストリン,デンプン,糖蜜などが使用できる。
無機塩類としてはリン酸第一カリウム,リン酸第二カリ
ウム,硫酸マグネシウム,硫酸第一鉄,塩化ナトリウム
などが使用できる。培養は振盪あるいは通気撹拌など好
気的条件が良く,pH4〜8好ましくは5〜7,温度20〜35℃
好ましくは25〜30℃で行われる。培養期間は2〜7日通
常は3〜5日で完了する。
培養に通常用いられるものが広く使用され,例えば窒素
源としてペプトン,酵母エキス,肉エキス,麦芽エキ
ス,コーンスチープリカー等の窒素含有天然物及び塩化
アンモニウム,硫酸アンモニウム,リン酸アンモニウ
ム,グルタミン酸等のアミノ酸などの無機あるいは有機
の窒素化合物が使用できる。炭素源としては資化可能な
炭素化合物であれば良く,グルコース,シュークロー
ス,デキストリン,デンプン,糖蜜などが使用できる。
無機塩類としてはリン酸第一カリウム,リン酸第二カリ
ウム,硫酸マグネシウム,硫酸第一鉄,塩化ナトリウム
などが使用できる。培養は振盪あるいは通気撹拌など好
気的条件が良く,pH4〜8好ましくは5〜7,温度20〜35℃
好ましくは25〜30℃で行われる。培養期間は2〜7日通
常は3〜5日で完了する。
上記の方法で培養することにより培養物中,主に菌体
中に1,5AGデヒドロゲナーゼが生成蓄積する。培養物中
からの1,5AGデヒドロゲナーゼの採取は例えば次のよう
に行う。
中に1,5AGデヒドロゲナーゼが生成蓄積する。培養物中
からの1,5AGデヒドロゲナーゼの採取は例えば次のよう
に行う。
培養終了後培養液を濾過して菌体を得,適当な緩衝液
中で菌体を破砕し破砕液から遠心分離等によって上清液
を得る。上清液を通常酵素精製に用いられる方法,例え
ば塩析,有機溶媒沈澱,透析,イオン交換カラムクロマ
ト,ゲル濾過等の方法を用いて処理する。以上のように
して1,5AGデヒドロゲナーゼを採取することができる。
中で菌体を破砕し破砕液から遠心分離等によって上清液
を得る。上清液を通常酵素精製に用いられる方法,例え
ば塩析,有機溶媒沈澱,透析,イオン交換カラムクロマ
ト,ゲル濾過等の方法を用いて処理する。以上のように
して1,5AGデヒドロゲナーゼを採取することができる。
(実施例) 実施例−1. オイペニシウム・クルスタセウムIFO−8938による1,5AG
デヒドロゲナーゼの製造 グリコース0.2%,酵母エキス0.5%,麦芽エキス1.0
%,KH2PO40.2%,NaCl0.1%,MgSO47H2O0.05%,FeSO4・7H
2O0.001%,pH6からなる培地100mlを500ml容の三角フラ
スコに分注し,120℃,15分間殺菌後オイペニシリウム・
クルスタセウムIFO−8939を一白金耳植菌し27℃で5日
間振盪培養を行った。培養液を濾過し菌体を得た。この
菌体を0.85%の食塩水で洗浄後,2倍容のトリス−塩酸緩
衝液(0.1M,pH10,15%グリセロース含有)に懸濁した。
懸濁液を冷却下でフレンチプレスにより菌体を破砕し,
破砕液を遠心分離(10000xg,10分間)して菌体残滓を除
去し粗酵素溶液を得た。この粗酵素溶液に硫酸アンモニ
ウム粉末を加え撹拌溶解させる。この時析出するタンパ
ク質を遠心分離(10000xg,10分間)し,各硫酸アンモニ
ウム画分の1,5AGデヒドロゲナーゼ活性を測定すると活
性は主に50〜80%飽和画分に存在した。
デヒドロゲナーゼの製造 グリコース0.2%,酵母エキス0.5%,麦芽エキス1.0
%,KH2PO40.2%,NaCl0.1%,MgSO47H2O0.05%,FeSO4・7H
2O0.001%,pH6からなる培地100mlを500ml容の三角フラ
スコに分注し,120℃,15分間殺菌後オイペニシリウム・
クルスタセウムIFO−8939を一白金耳植菌し27℃で5日
間振盪培養を行った。培養液を濾過し菌体を得た。この
菌体を0.85%の食塩水で洗浄後,2倍容のトリス−塩酸緩
衝液(0.1M,pH10,15%グリセロース含有)に懸濁した。
懸濁液を冷却下でフレンチプレスにより菌体を破砕し,
破砕液を遠心分離(10000xg,10分間)して菌体残滓を除
去し粗酵素溶液を得た。この粗酵素溶液に硫酸アンモニ
ウム粉末を加え撹拌溶解させる。この時析出するタンパ
ク質を遠心分離(10000xg,10分間)し,各硫酸アンモニ
ウム画分の1,5AGデヒドロゲナーゼ活性を測定すると活
性は主に50〜80%飽和画分に存在した。
さらに上記硫安画分をトリス−塩酸緩衝液(0.1M,pH1
0,15%グリセロース含有)に溶解し透析膜を用いて脱塩
する。脱塩液をDEAEトヨパール650カラムに通して酵素
を吸着させた後NaClを0〜0.3M含むトリス−塩酸緩衝液
(0.1M,pH10)により酵素を溶出した。各溶出画分の1,5
AGデヒドロゲナーゼ活性を測定し活性画分を得た。活性
画分をアミコン社のダイアフローUF膜を用いて濃縮し酵
素液を得た。この酵素液の活性は6単位/mlであり湿菌
体1g当たり0.6単位の酵素を得た。
0,15%グリセロース含有)に溶解し透析膜を用いて脱塩
する。脱塩液をDEAEトヨパール650カラムに通して酵素
を吸着させた後NaClを0〜0.3M含むトリス−塩酸緩衝液
(0.1M,pH10)により酵素を溶出した。各溶出画分の1,5
AGデヒドロゲナーゼ活性を測定し活性画分を得た。活性
画分をアミコン社のダイアフローUF膜を用いて濃縮し酵
素液を得た。この酵素液の活性は6単位/mlであり湿菌
体1g当たり0.6単位の酵素を得た。
実施例−2 第2表に示す微生物による1,5AGデヒドロゲナーゼの製
造 実施例−1と同様の方法で微生物を培養し,培養液を
濾過し菌体を得る。この菌体を0.85%の食塩水で洗浄後
2倍容のトリス−塩酸緩衝液(0.1M,pH10,15%グリセロ
ール含有)に懸濁した。懸濁液を冷却下でフレンチプレ
スにより菌体を破砕し破砕液を遠心分離(10000xg,10分
間)して菌体残滓を除去し粗酵素溶液を得た。
造 実施例−1と同様の方法で微生物を培養し,培養液を
濾過し菌体を得る。この菌体を0.85%の食塩水で洗浄後
2倍容のトリス−塩酸緩衝液(0.1M,pH10,15%グリセロ
ール含有)に懸濁した。懸濁液を冷却下でフレンチプレ
スにより菌体を破砕し破砕液を遠心分離(10000xg,10分
間)して菌体残滓を除去し粗酵素溶液を得た。
実施例−3 ハンセヌラ・カリホニアHUT−7321による1,5AGデヒドロ
ゲナーゼの製造 グリコース1%,酵母エキス0.3%,麦芽エキス0.3
%,ペプトン0.5%,KH2PO40.2%,MgSO4・7H2O0.05%,Fe
SO4・7H2O0.001%,pH6から成る培地100mlを500ml容の三
角フラスコに分注し,120℃,15分間殺菌後,ハンセヌラ
・カリホニアHUT−7321を一白金耳植菌し27℃で3日間
振盪培養した。培養液を遠心分離(10000xg,10分間)し
菌体を得た。この菌体を実施例−1と同様の方法で処理
し酵素溶液を得た。
ゲナーゼの製造 グリコース1%,酵母エキス0.3%,麦芽エキス0.3
%,ペプトン0.5%,KH2PO40.2%,MgSO4・7H2O0.05%,Fe
SO4・7H2O0.001%,pH6から成る培地100mlを500ml容の三
角フラスコに分注し,120℃,15分間殺菌後,ハンセヌラ
・カリホニアHUT−7321を一白金耳植菌し27℃で3日間
振盪培養した。培養液を遠心分離(10000xg,10分間)し
菌体を得た。この菌体を実施例−1と同様の方法で処理
し酵素溶液を得た。
実施例−4 ピチア・カルソニーHUT−7284,ピチア・シュードポリモ
ルファHUT−7330による1,5AGデヒドロゲナーゼの製造 実施例−3と同様の方法で微生物を培養し培養液を濾
過し菌体を得た。この菌体を0.85%の食塩水で洗浄後2
倍容のトリス−塩酸緩衝液(0.1M,pH10,15%グリセロー
ル含有)に懸濁した。懸濁液を冷却下でフレンチプレス
により菌体を破砕し破砕液を遠心分離(10000xg,10分
間)して菌体残滓を除去し粗酵素溶液を得た。
ルファHUT−7330による1,5AGデヒドロゲナーゼの製造 実施例−3と同様の方法で微生物を培養し培養液を濾
過し菌体を得た。この菌体を0.85%の食塩水で洗浄後2
倍容のトリス−塩酸緩衝液(0.1M,pH10,15%グリセロー
ル含有)に懸濁した。懸濁液を冷却下でフレンチプレス
により菌体を破砕し破砕液を遠心分離(10000xg,10分
間)して菌体残滓を除去し粗酵素溶液を得た。
(作用) 本発明で得られた1,5AGデヒドロゲナーゼは下記の性
質を示す。
質を示す。
1.実施例−1で得られた1,5AGデヒドロゲナーゼは下記
の性質を示す。
の性質を示す。
酵素作用 1,5AGを基質としNADを還元型NADに変換する反応を触
媒する。
媒する。
基質特異性 第1表に示すように1,5AGに対して高い特異性を示し
た。
た。
至適pH 第1図に示すように至適pHはpH9〜11である。
至適温度 第2図に示すように至適温度は30〜50℃である。
pH安定性 1単位/ml(1Mトリス−塩酸緩衝液)の酵素溶液を各p
Hで40℃,30分間処理し残存活性を本文記載の方法で測定
した。第3図に示すようにpH9〜12で安定である。
Hで40℃,30分間処理し残存活性を本文記載の方法で測定
した。第3図に示すようにpH9〜12で安定である。
2.実施例−2で得られた1,5AGデヒドロゲナーゼは第2
表に示す基質特異性を示す。
表に示す基質特異性を示す。
3.実施例−3で得られた1,5AGデヒドロゲナーゼは下記
の性質を示す。
の性質を示す。
酵素作用 1,5AGを基質としNADを還元型NADに変換する反応を触
媒する。
媒する。
基質特異性 第3表に示すように1,5AGに対して高い特異性を示し
た。
た。
至適pH 第4図に示すように至適pHは9〜11である。
至適温度 第5図に示すように至適温度は30〜50℃である。
pH安定性 1単位/ml(1Mトリス−塩酸緩衝液)の酵素溶液を各p
Hで40℃,30分間処理し残存活性を本文記載の方法で測定
した。第6図に示すようにpH8〜12で安定である。
Hで40℃,30分間処理し残存活性を本文記載の方法で測定
した。第6図に示すようにpH8〜12で安定である。
4.実施例−4で得られた1,5AGデヒドロゲナーゼは第4
表に示す基質特異性を示す。
表に示す基質特異性を示す。
(1,5AGデヒドロゲナーゼ活性測定法) 本発明において得られた1,5AGデヒドロゲナーゼの活
性は下記のようにして測定した。
性は下記のようにして測定した。
1Mトリス−塩酸緩衝液(pH10)0.6ml,0.01M NAD0.1m
l,0.0001M MnSO40.1ml,0.5M 1,5AG0.1ml,酵素溶液0.1
mlより成る全量1.0mlの酵素含有液を35℃で30分間反応
させ340nmの吸光度の増加量を測定する。酵素一単位は
一分間に1μmolの還元型NADを生成する活性とした。
l,0.0001M MnSO40.1ml,0.5M 1,5AG0.1ml,酵素溶液0.1
mlより成る全量1.0mlの酵素含有液を35℃で30分間反応
させ340nmの吸光度の増加量を測定する。酵素一単位は
一分間に1μmolの還元型NADを生成する活性とした。
(発明の効果) 本発明は1,5AGデヒドロゲナーゼの新しい製造法を提
供するものである。本発明で得られる1,5AGデヒドロゲ
ナーゼは第1表,第3表に示される如く1,5AGに対して
高い特異性を示す。
供するものである。本発明で得られる1,5AGデヒドロゲ
ナーゼは第1表,第3表に示される如く1,5AGに対して
高い特異性を示す。
第1図,第2図及び第3図はそれぞれ,オイペニシリウ
ム・クルスタセウムIFO−8938により製造した1,5AGデヒ
ドロゲナーゼの至適pH,至適温度,pH安定性を表すグラフ
である。第4図,第5図及び第6図はそれぞれ,ハンセ
ヌラ・カリホニアHUT−7321により製造した1,5AGデヒド
ロゲナーゼの至適pH,至適温度,pH安定性を表すグラフで
ある。
ム・クルスタセウムIFO−8938により製造した1,5AGデヒ
ドロゲナーゼの至適pH,至適温度,pH安定性を表すグラフ
である。第4図,第5図及び第6図はそれぞれ,ハンセ
ヌラ・カリホニアHUT−7321により製造した1,5AGデヒド
ロゲナーゼの至適pH,至適温度,pH安定性を表すグラフで
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:745) (C12N 9/04 C12R 1:84)
Claims (1)
- 【請求項1】モニリエラ属、プレオスポラ属、コクリオ
ボラス属、アルターナリア属、ペスタロチア属、スコピ
ュラリオプシス属、ネクトリア属、カエトミウム属、ド
レクスレラ属、シリンドロセファラム属、コリネスポラ
属、クテノマイセス属、ペトリエラ属、ヒポマイセス
属、タラロマイセス属、オイペニシリウム属、ネオサル
トリア属、セファロスポリウム属、スポロルミエラ属、
セラトシスチス属、フィアロセファラ属、バイソクラミ
ス属、グロメレラ属、マイコゴネ属、カルバラリア属、
シリンドロクラディウム属、ヒポクレア属、グリオクラ
ディウム属、ゴナトボトリウム属、エメリセロプシス
属、バシディオボラム属、フィアロマイセス属、ディヘ
テロスポラ属、サブリスポラ属、ピチア属、ハンセヌラ
属、又はマイコスファエレラ属に属し1,5−アンヒドロ
グルシトールデヒドロゲナーゼ生産能を有する微生物を
栄養培地に培養し培養菌体中に、1,5−アンヒドログル
シトールデヒドロゲナーゼを生成蓄積させこれを採取す
る事を特徴とする1,5−アンヒドログルシトールデヒド
ロゲナーゼの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1087962A JP2665681B2 (ja) | 1989-04-10 | 1989-04-10 | 1,5―アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1087962A JP2665681B2 (ja) | 1989-04-10 | 1989-04-10 | 1,5―アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02268679A JPH02268679A (ja) | 1990-11-02 |
JP2665681B2 true JP2665681B2 (ja) | 1997-10-22 |
Family
ID=13929486
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1087962A Expired - Fee Related JP2665681B2 (ja) | 1989-04-10 | 1989-04-10 | 1,5―アンヒドログルシトールデヒドロゲナーゼの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2665681B2 (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0767697A (ja) * | 1993-09-03 | 1995-03-14 | Pentel Kk | 1,5−アンヒドログルシトールの定量方法 |
US5871949A (en) * | 1996-12-04 | 1999-02-16 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol and reagent for quantitative assay |
EP1895303B1 (en) | 2005-06-13 | 2011-05-11 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | Method of assaying 1, 5-anhydroglucitol by using whole blood |
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1989
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