JPH0474999B2

JPH0474999B2 -

Info

Publication number: JPH0474999B2
Application number: JP59166022A
Authority: JP
Priority date: 1984-08-08
Filing date: 1984-08-08
Publication date: 1992-11-27
Also published as: JPS6143986A

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野本発明はカンジダ属酵母によるウリカーゼの生
産方法に関し、更に詳細には該酵素を酵母菌体外
に生産させる方法に関する。従来の技術ウリカーゼは、尿酸をアラントインと過酸化水
素に酸化する酵素で、種々の動物組織中や微生物
組織中に広く存在する。現在、ウリカーゼは人体
内の尿酸蓄積に起因する種々の疾患の診断のた
め、血液または尿中に存在する尿酸の測定用酵素
として使用されている。種々の抽出起源からのウ
リカーゼの中で、カンジダ・ウテイルス
（Candida utilis）の生産する酵素ウリカーゼは
尿酸に対するKm値が最も小さく、水に対する溶
解性が大きい理由から実用性が最も高いものであ
る。従来、カンジダ属酵母のウリカーゼの生産には
三段法が使用されてきた。すなわち、酵素生産に
は菌体の培養集菌、酵素の誘導的生成、そして菌
体内酵素の分離抽出の三工程を要し、非常に煩雑
で時間を要し、労働集約的な作業を必要とするも
のであつた。この状況の解決を目指すものとしては、バクテ
リアを用いて酵素を菌体外生産する方法〔特公昭
49−4385号、特公昭48−40756号、アナリテイカ
ル・バイオケミストリー（Analytical
Biochemistry）第38巻、第65頁（1970年）」があ
る。しかしながら、前述した如く、カンジダ属酵
母のウリカーゼが最小のKm値（5.9×10^-6Ｍ）を
有するところからカンジダ・ウテイリスの酵素ウ
リカーゼが血中または尿中の尿酸の分析に最も多
く使用されている。ウリカーゼのカンジダ・ウテイリスからの上述
した分離抽出操作は、海砂と共存させての磨砕、
超音波、浸透圧シヨツク（特公昭43−24451号）、
凍結融解（特公昭42−5192号）、有機溶媒処理
（特公昭53−14636号）等の方法が知られている。
しかしながら、これらの方法による抽出液中には
ウリカーゼ以外の夾雑たんぱくが多く、精製工程
を煩雑にする原因となつている。発明が解決しようとする問題点本発明の目的は上記問題点にかんがみて、カン
ジダ属酵母の生産するウリカーゼの工業的生産に
適した迅速にして容易な生産方法の開発にある。問題点を解決するための手段本発明を概説すれば、本発明は酵母によるウリ
カーゼの生産方法に関し、ウリカーゼ生産能を有
するカンジダ属酵母によるウリカーゼの生産にお
いて、培養液中または培養して得た菌体の懸濁液
中に還元剤と非イオン系界面活性剤またはカチオ
ン系界面活性剤とを添加し、酵母菌体外へ該酵素
を蓄積させることを特徴とする。本発明の上記方法によれば菌体外へ蓄積された
ウリカーゼは菌体を遠心分離することで簡単に粗
酵素液を得ることが出来る。この粗酵素液は界面
活性剤を透析で除いた後、硫安塩析、限外過、
イオン交換クロマトグラフイー等の通常の精製手
段を用いて精製することが出来る。本発明で用いるカンジダ属酵母はウリカーゼ生
産能を有する菌株であればよく、例えばカンジ
ダ・ウテイリス（IFO−0396、IFO−0626、IFO
−0639）を使用できる。本発明方法を実施するに
当つては例えば、グルコース、コーン・ステイー
ブ・リカー、尿素、リン酸アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウムを
含む培地（pH6.2）で上記菌株を用い27℃、22時
間培養し、その培養液から酵母菌体を遠心分離に
よつて集め、よく水洗して培地成分を除去する。次いで、尿酸を唯一の窒素源とする、例えば、
尿酸、グルコース、リン酸ナトリウム、塩化カリ
ウム、硫酸マグネシウムを含む培地（pH7.2）に
その菌体を懸濁して、25℃で３時間好気的に振と
う培養する。この時点で、菌体内ウリカーゼの蓄積量は最大
となる。活性値は、培養液当たりに換算すると１
ml当たり0.4単位〔１単位は硼酸緩衝液（pH8.5）
中で25℃で１分間に1μモルの尿酸をアラントイ
ンに変化さす酵素量〕である。次いで培養液のpHを中性からアルカリ性に調
整したのち、非イオン系またはカチオン系界面活
性剤と還元剤を添加して更に好気的振とうを続け
ることによりウリカーゼは培養液中に溶出されて
くる。本発明で用いる界面活性剤としては非イオン系
界面活性剤およびカチオン系界面活性剤があり、
たとえば非イオン系界面活性剤としてはトライト
ンＮ−101、トライトンＸ−100（ローム・アン
ド・ハース社製）、カチオン系界面活性剤として
は塩化ラウリルピリジニウム、塩化セチルピリジ
ニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウムおよ
び塩化ステアリルトリメチルアンモニウムがあげ
られる。添加量は酵母菌体濃度等処理条件により
異なるが、通常0.01〜５％（トライトンの場合
ｖ／ｖ、その他はｗ／ｖ）、好ましくは0.02〜１
％が使用される。また還元剤としては、たとえば
β−メルカプトエタノール、システイン、ハイド
ロサルフアイト、亜硫酸ナトリウムおよび硫酸鉄
があげられる。添加量は酵母菌体量等処理条件に
より異なるが、通常0.005〜５％（β−メルカプ
トエタノールの場合ｖ／ｖ、その他はｗ／ｖ）、
好ましくは0.01〜１％が使用される。例えば、誘導培養液に途中で非イオン系界面活
性剤トライトンＮ−101（ローム・アンド・ハース
社製）を0.1％（ｖ／ｖ）量と、それと共に種々
の還元剤を0.1％量添加した場合の実験結果を表
−１に示した。

【表】

【表】表−１から明らかなごとくトライトンＮ−101
とβ−メルカプトエタノールを添加した場合が最
も効果的で添加後2.5時間で培養液１ml当たりの
活性は0.4単位に達した。最も効果の強かつたβ−メルカプトエタノール
について、添加量を変えて実験を行なつた（表−
２）。表−２より明らかな如く、0.05％（ｖ／ｖ）
以上の添加が効果的である。

【表】 β−メルカプトエタノールを0.1％（ｖ／ｖ）
添加するとともに種々の界面活性剤を0.1％添加
した場合の結果を表−３に示した。

【表】

【表】間
非イオン系界面活性剤では、トライトンＮ−
101、トライトンＸ−100が効果的である。カチオ
ン系界面活性剤では、塩化ラウリルピリジニウ
ム、塩化セチルピリジニウム、臭化セチルトリメ
チルアンモニウム、塩化ステアリルトリメチルア
ンモニウムが有効である。アニオン系界面活性剤
は調べた範囲では効果がみられなかつた。効果の高かつたトライトンＮ−101について、
添加濃度の影響を調べたのが表−４である。

【表】トライトンＮ−101は0.1％（ｖ／ｖ）以上の添
加で非常に効果を示した。ウリカーゼ生産に対す
る培養液pHの影響を調べた（表−５）。pH11の
場合にウリカーゼ生産量が低いのはウリカーゼの
安定pH領域（pH7〜10）からはずれることに因
ると推定される。

【表】

【表】誘導培養して得た菌体を緩衝液中に懸濁させ、
これに還元剤および界面活性剤を添加した場合も
同様の効果を奏する。実施例以下、本発明を実施例により具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。実施例１酵母カンジダ・ウテイリスIFO−0396をグルコ
ース５％、コーン・ステイープ・リカー３％、尿
素0.33％、リン酸二アンモニウム0.025％、硫酸
アンモニウム0.025％、硫酸マグネシウム0.1％、
塩化カリウム0.1％からなる培地（pH6.2）で27℃
にて22時間培養した。培養は500ml三角フラスコ
に培地100mlを入れて、回転振とう機（220rpm）
で、好気条件下で行なつた。培養終了後、菌体を
遠心分離によつて集め、冷却した蒸留水で２回洗
浄し、湿菌体8gを得た。この洗浄菌体をグルコース５％、リン酸二ナト
リウム0.3％、塩化カリウム0.1％、硫酸マグネシ
ウム0.05％、尿酸0.03％からなる培地100ml
（pH7.2）に再度懸濁し、好気条件下で誘導培養
を行なつた。 25℃にて３時間回転振とう機（200rpm）で培
養し、ついで培養液pHを水酸化ナトリウム溶液
でpH9に調整したのち、β−メルカプトエタノー
ルとトライトンＮ−101を共に0.1％添加した。更に４時間、回転数を下げて振とうを続けると
ウリカーゼは培地中に生産された。培養液１ml当
たりのウリカーゼ活性は0.4単位であり、比活性
は280nmの吸光度当たり0.066単位であつた。透析で界面活性剤を除いたのち、通常の硫安塩
析、限外過、イオン交換クロマトグラフイーに
よつて、ウリカーゼを精製した。活性回収率は55
％であり、比活性は280nmの吸光度当たり６単位
であつた。得られたウリカーゼの酵素化学的性質（pH・
熱安定性、最適pH、最適温度）は従来の自己消
化法で得られたウリカーゼと同じであつた。実施例２酵母カンジダ・ウテイリスIFO−0626を実施例
１と同一の培地20で30容ジヤーフアーメンタ
ーを用いて培養した。28℃で1VVM、300rpmで
12時間培養後、集菌、洗浄し、ついで実施例１と
同一の誘導培地20で誘導培養を行なつた。培養
条件は25℃、1VVM、300rpmとした。なお、ジ
ヤー培養の場合には発泡を抑えるため消泡剤とし
てKM−70（信越化学社製）を0.05％添加した。誘導培養３時間の時点で培養液のpHを9.0に調
整し、更に、β−メルカプトエタノールとトライ
トンＮ−101を共に0.1％添加した。更に、通気を止め、25℃、200rpmで３時間か
くはんを続けるとウリカーゼが培地中に生産され
た。培養液１ml当たりのウリカーゼ活性は0.5単位
であつた。限外過機によつて界面活性剤を除いたのち、
ウリカーゼは通常の硫安塩析、イオン交換クロマ
トグラフイーによつて精製した。活性回収率は50
％であり、比活性は280nmの吸光度当たり５単位
であつた。発明の効果以上、詳細に説明したとおり、本発明によって
カンジダ・ウテイリスのウリカーゼの迅速、容易
な生産方法を確立することができた。本発明は従
来法と比較して工業的に優れたウリカーゼの生産
技術を開発した点で効果を有する。

Claims

【特許請求の範囲】

１ウリカーゼ生産能を有するカンジダ属酵母に
よるウリカーゼの生産において、培養液中または
培養して得た菌体の懸濁液中に還元剤と非イオン
系界面活性剤またはカチオン系界面活性剤とを添
加し、酵母菌体外へ該酵素を蓄積させることを特
徴とする酵母ウリカーゼの生産方法。