JPH10257883A - カタラーゼ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 カタラーゼ生産量がより高い生産菌を用い
て、工業的に効率良くカタラーゼを製造する方法の提
供、及びそのような製造方法によって有利に生産され
る、新規な特性を有するカタラーゼの提供。 【解決手段】 カタラーゼ産生能を有する微生物とし
て、サーモマイセス属の好熱性糸状菌を用い、これを培
養することにより、カタラーゼを菌体外に生産させる工
程と、かかる培養工程で得られた培養物よりカタラーゼ
を分離する工程とを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は、カタラーゼ及びその製造方法に
係り、特に、カタラーゼ産生能を有する微生物を用いた
カタラーゼの効果的な製造方法と、そのような製造方法
によって有利に得られる、有用な理化学的性質を有する
新規な耐熱性のカタラーゼに関するものである。

【０００２】

【背景技術】カタラーゼは、過酸化水素等の過酸化物の
分解を触媒する酵素であって、従来から、食品加工等の
分野において、殺菌剤や漂白料として使用される過酸化
水素の分解除去に用いられてきている。また、最近で
は、繊維関係、排水関係、電子機器部品の洗浄等の分野
においても、塩素系漂白剤に代わり、過酸化水素の使用
が主流となってきているところから、そのような分野で
の過酸化水素の分解除去にも、カタラーゼは、工業的に
大量消費されている酵素となっている。

【０００３】そして、そのようなカタラーゼを得る場合
において、工業的な生産の見地からは、カタラーゼ産生
能を有する微生物を培養して得るのが最も好ましいもの
であるところから、従来より、微生物由来のカタラーゼ
として、細菌に関しては、サーマス属（特開昭５５−１
３５５８８号公報）、バチルス属（特開平７−２４６０
９２号公報）に由来するものが、また酵母にあっては、
サッカロミセス属（特開昭６０−８３５７９号公報）、
ハンセヌラ属（特開昭６３−３７８８号公報）に由来す
るものが、更に糸状菌に関しては、アスペルギルス属
（特開平２−７６５７９号公報）、アスペルギルス属、
アクレモニウム属、サーモアスカス属（特開平５−１５
３９７５号公報）、及びアスペルギルス属、サーモアス
カス属（特開平７−１６３３４２号公報）に由来するも
のが、種々提案されてきているが、これまでに、サーモ
マイセス属の好熱性糸状菌によって生産されるカタラー
ゼについては、全く知られていない。

【０００４】また、かかる従来のカタラーゼの殆どは、
菌体内酵素であって、そのために所定の微生物の培養に
よって生産された酵素を採取するには、菌体破砕等の煩
雑な操作が必要とされているのであり、更に、培地中に
カタラーゼを生成、蓄積させることによってカタラーゼ
を製造しようとする方法（特開平７−１６３３４２号公
報）においても、液体培養によるカタラーゼの工業的な
生産量としては、充分とは言えないものであった。

【０００５】

【解決課題】かかる状況下、本発明者らは、カタラーゼ
を工業的に効率良く製造する方法の開発を目的として、
その供給源を微生物に求め、鋭意研究した結果、サーモ
マイセス属に属する好熱性糸状菌が、固体培養或いは液
体培養の何れの方法によっても、カタラーゼを菌体外に
生産し、特に液体培養においては、固体培養に比較し
て、培地固形物当たりの生産量を著しく増大させ得ると
の知見を得たのであり、また、そのようにして生産され
たカタラーゼが、従来の微生物由来のカタラーゼとは異
なる物性を備えた、耐熱性を有する新規なものであるこ
とを見出し、本発明を完成するに至ったのである。

【０００６】従って、本発明の課題とするところは、カ
タラーゼ生産量がより高い生産菌を用い、それによって
工業的に効率良くカタラーゼを製造する方法を提供する
ことにあり、また、他の課題とするところは、そのよう
な製造方法によって有利に生産される、高分子量且つ低
等電点の新規な特性を有する耐熱性のカタラーゼを提供
することにある。

【０００７】

【解決手段】そして、本発明にあっては、かかる課題を
解決するために、カタラーゼ産生能を有する微生物とし
て、サーモマイセス属の好熱性糸状菌を用い、これを培
養することにより、カタラーゼを菌体外に生産させる工
程と、かかる培養工程で得られた培養物よりカタラーゼ
を分離する工程とを含むことを特徴とするカタラーゼの
製造方法を、その要旨とするものである。

【０００８】なお、このようなカタラーゼの製造方法に
おいて、サーモマイセス属の好熱性糸状菌としては、有
利には、サーモマイセス・ラヌギノーサス(Thermomyces
lanuginosus) ＡＴＣＣ２２０８３またはＡＴＣＣ２２
０７０が用いられ、また、そのようなサーモマイセス属
菌の培養は、有利には、液体培養によって行なわれ、そ
してそれによって、カタラーゼの生産量を更に効果的に
増大せしめることが出来るのである。

【０００９】また、本発明は、次の如き理化学的性質を
有するカタラーゼをも、その要旨とするものである。 ａ）作用：過酸化水素に作用し、過酸化水素を水と酸素
に分解する、 ｂ）至適作用ｐＨ：作用ｐＨ範囲が３〜１２で、至適ｐ
Ｈが５〜１０である、 ｃ）ｐＨ安定性：３０℃、６０分間処理で、ｐＨ６〜１
０の範囲で極めて安定であり、ｐＨ３の酸性側及びｐＨ
１２のアルカリ側においても５０％以上の残存活性を示
す、 ｄ）至適作用温度：ｐＨ７において２０〜８０℃の範囲
で活性を示し、至適温度が５０℃である、 ｅ）熱安定性：ｐＨ７、３０分間の加熱において６０℃
まで極めて安定で、８０℃でも６５％以上の残存活性を
示す、 ｆ）分子量：４７００００〜４８００００、 ｇ）等電点：３．９〜４．０、 ｈ）紫外部及び可視部の吸収スペクトル：２８０ｎｍ及
び４１０ｎｍに極大吸収を有する。

【００１０】特に、このような本発明に従うカタラーゼ
は、サーモマイセス属の好熱性糸状菌由来のものであ
り、更に望ましくはサーモマイセス・ラヌギノーサスＡ
ＴＣＣ２２０８３またはＡＴＣＣ２２０７０由来のもの
である。

【００１１】

【発明の実施の形態】ところで、かかる本発明において
用いられるカタラーゼ生産菌は、サーモマイセス属に属
する好熱性糸状菌であって、例えば、アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に保存され
ており、容易に入手が可能であるサーモマイセス・ラヌ
ギノーサス(Thermomyces lanuginosus) があり、また、
その菌種としては、サーモマイセス・ラヌギノーサス(T
hermomyces lanuginosus) ＡＴＣＣ２２０８３やＡＴＣ
Ｃ２２０７０等が挙げられる。そして、このカタラーゼ
生産菌は、また、よく知られているように、フミコーラ
・ラヌギノーサ(Humicola lanuginosa) とも称されてい
るものである。なお、このような属に属する微生物であ
って、紫外線、Ｘ線、γ線等の物理的処理、或いはニト
ロソグアニジン等の薬剤による化学的処理からなる突然
変異誘導法によって得られるカタラーゼ高生産性突然変
異株も使用することが出来る。そして、このようなサー
モマイセス属に属する好熱性糸状菌を用いて培養するこ
とにより、目的とするカタラーゼが、菌体外に、有利に
生産され得ることとなるのである。

【００１２】また、かくの如き微生物の培養方法として
は、好気的培養法であれば、特に制約はなく、固体培養
及び液体培養の何れの方法であっても、採用可能である
が、本発明にあっては、培養管理と共に、かかる微生物
のカタラーゼ生産性の面等から、液体培養が有利に採用
されることとなる。

【００１３】そして、本発明において、カタラーゼを生
産する培地としては、前記した微生物が良好に成育し得
るものであれば、特に制限はなく、採用される培養方法
に応じた公知の固体培地乃至は液体培地が、適宜に採用
されることとなるが、通常、固体培養では、小麦ふすま
が培地として用いられることとなる。また、この小麦ふ
すまにアンモニウム塩等の無機窒素化合物を添加してな
る培地は、本発明に従うカタラーゼ生産により優れた効
果を与える。

【００１４】一方、液体培養の場合には、炭素源とし
て、澱粉等の多糖類、グルコース、フルクトース、シュ
クロース等の少糖類を用いることが出来る。なお、窒素
源としては、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープ
リカー、肉エキス、尿素等の有機窒素、及び塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等のアン
モニウム塩、更には他の無機窒素化合物を用いることが
出来る。また、無機塩としては、リン酸塩、カリウム
塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等を用いることが出
来る。更に、補助添加物として、小麦ふすま等の天然固
体原料を用い、それを液体培地に添加することも、本発
明に従うカタラーゼ生産に有効である。

【００１５】なお、本発明に従う微生物の培養に際し
て、その培養期間中の培養温度としては、一般に、３５
〜５０℃程度、好ましくは３７〜４５℃程度の範囲の温
度とされ、また培地ｐＨにあっては、一般に、５．０〜
７．０程度、好ましくは５．５〜６．５程度の範囲内に
維持されることとなる。更に、培養期間としては、通
常、２日間〜６日間程度である。

【００１６】このようにして、前記した微生物が培養さ
れることによって、カタラーゼは、その殆どが菌体外に
生産され、そして、その生産されたカタラーゼは、固体
培養の場合においては、その培養物を、常法に従って、
水またはカタラーゼが安定な範囲のｐＨ緩衝液により抽
出して、粗酵素液として得られる。一方、液体培養の場
合には、その培養液を常法に従って濾過または遠心分離
することにより、粗酵素液が得られる。

【００１７】そして、以上のようにして得られた粗酵素
液の精製は、公知の方法に従って行なうことが出来るの
である。例えば、硫酸アンモニウム等による塩析、有機
溶媒等による沈殿法、カラムクロマトグラフィ、ゲル濾
過、電気泳動等を、適宜組み合わせて精製することによ
り、目的とする精製カタラーゼを得ることが可能であ
る。また、この精製されたカタラーゼは、必要ならば脱
水或いは乾燥を施すことにより、酵素粉末として採取す
ることが出来、また場合によっては、限外濾過膜により
濃縮した粗酵素液を、そのままカタラーゼ標品として使
用することも、可能である。

【００１８】かくの如くして製造された、本発明に従う
カタラーゼは、以下の性質を有しているのである。

【００１９】（１）作用：従来のカタラーゼと同様に、
過酸化水素に作用して、それを水と酸素に分解するもの
である。

【００２０】（２）至適作用ｐＨ：リン酸緩衝液を用い
て調製された、過酸化水素を含む各種ｐＨの緩衝液を用
いて、２５℃で活性を測定すると、本カタラーゼは、作
用ｐＨ範囲が３〜１２で、至適ｐＨ範囲が５〜１０の、
広範囲の至適領域を有している。

【００２１】（３）ｐＨ安定性：リン酸緩衝液を用いて
調製されたｐＨ３〜１２の溶液中に、４００ＩＵ／ｍｌ
となるように酵素を溶解し、３０℃で６０分間処理した
後、残存活性を測定することにより、本カタラーゼは、
ｐＨ６〜１０の範囲で極めて安定であり、ｐＨ３の酸性
側及びｐＨ１２のアルカリ側においても、５０％以上の
残存活性を示すものである。

【００２２】（４）至適作用温度：ｐＨ７のリン酸緩衝
液で調製された０．０４％の過酸化水素水溶液に対す
る、各温度下での酵素の活性測定にて、本カタラーゼ
は、２０〜８０℃の範囲で活性を示し、至適温度は５０
℃である。

【００２３】（５）熱安定性：ｐＨ７のリン酸緩衝液に
溶解してなる４００ＩＵ／ｍｌの酵素溶液を、各温度で
３０分保持した後、急冷し、２５℃において残存活性を
測定すると、本カタラーゼは、６０℃まで極めて安定
で、８０℃でも６５％以上の残存活性を示す。

【００２４】（６）分子量：シリカゲルを基材とするＴ
ＳＫ−Ｇｅｌ−Ｇ３０００ＳＷ（東洋曹達株式会社製）
を担体として用いて、高速液体クロマトグラフィ装置
（株式会社日立製作所製６５５Ａ型）により、溶出時間
を測定することからなるゲル濾過法にて測定すると、本
カタラーゼの分子量は４７００００〜４８００００であ
る。また、ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ゲ
ルスラブ電気泳動法による測定にて、本カタラーゼは、
分子量が７８０００〜８００００のサブユニットからな
る６量体であることが確認される。

【００２５】（７）等電点：アガロースゲルを用いた等
電点電気泳動装置により測定すると、本カタラーゼの等
電点は、３．９〜４．０である。

【００２６】（８）紫外部及び可視部の吸収スペクト
ル：酵素をｐＨ７のリン酸緩衝液に溶かし、分光光度計
にて測定すると、本カタラーゼは、紫外部領域では２８
０ｎｍに、また可視部領域では４１０ｎｍに極大吸収を
有していることが認められる。

【００２７】（９）金属イオンの影響：本カタラーゼ
は、硫酸銅により略失活し、また塩化鉄、塩化第二鉄、
及び塩化第二水銀により、７０〜８０％の阻害を受け
る。

【００２８】（１０）阻害剤の影響：本カタラーゼは、
ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）により、７０〜８
０％の阻害を受ける。

【００２９】そして、このような本発明に従う耐熱性の
あるカタラーゼにあっては、上記の理化学的性質の中で
も、特に、分子量及び等電点において、従来のカタラー
ゼとは大きな差異を有しているのである。けだし、従来
のカタラーゼの分子量は、高々、３６００００〜３７０
０００程度（特開平５−１５３９７５号公報、特開平２
−７６５７９号公報等参照）であり、また等電点にあっ
ても、約４．８程度（特開平７−２４６０９２号公報等
参照）に過ぎないものであるからである。

【００３０】なお、本発明において、カタラーゼ活性
は、次のようにして測定した結果から算出されたもので
ある。即ち、３０％濃度の過酸化水素水の０．１２ｍｌ
をｐＨ７のリン酸緩衝液で１００ｍｌとした溶液を、基
質溶液として用い、この基質溶液の３ｍｌを反応試験管
に入れて、２５℃の温度で約５分間予熱し、次いで、こ
れに４００ＵＩ／ｍｌに希釈した酵素溶液の０．０３ｍ
ｌを加え、同温度で反応を開始すると同時に、過酸化水
素の２４０ｎｍの吸光値が０．４５から０．４０へ低下
するに要した時間を計測する。そして、このような条件
下において、１分間に、１μｍｏｌの過酸化水素を分解
する酵素量を１単位として、カタラーゼ活性が、以下の
式によって求められるのである。 カタラーゼ活性（ＩＵ／ｍｌ）＝（Ａ×Ｂ／Ｖ／ｔ）×
ｎ 但し、ＩＵ：International Units Ａ：Bergmeyer units 定数（＝１７） Ｂ：Bergmeyer units からＩＵへの変換係数（＝１３） Ｖ：希釈酵素溶液の採取量（＝０．０３ｍｌ） ｔ：吸光値が０．４５から０．４０へ低下するに要した
時間（秒） ｎ：酵素の希釈倍率

【００３１】

【実施例】以下に、本発明の実施例を示し、本発明を更
に具体的に明らかにすることとするが、本発明が、その
ような実施例の記載によって、何等の制約をも受けるも
のでないことは、言うまでもないところである。また、
本発明には、以下の実施例の他にも、更には上記した発
明の実施の形態における記述以外にも、本発明の趣旨を
逸脱しない限りにおいて、当業者の知識に基づいて種々
なる変更、修正、改良等を加え得るものであることが、
理解されるべきである。

【００３２】実施例 １ サーモマイセス・ラヌギノーサス(Thermomyces lanugin
osus) ＡＴＣＣ２２０８３を用いて、固体培養及び液体
培養をそれぞれ行なった。先ず、固体培養の場合は、小
麦ふすま：１０ｇ、塩化アンモニウム：０．０１２ｇ
を、５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、オートクレーブ
で１２０℃×３０分間加熱滅菌することにより、調製し
た培地に対して、サーモマイセス・ラヌギノーサスＡＴ
ＣＣ２２０８３の胞子を接種し、初発水分を５４％に調
節して、３７℃で静置培養した。そして、この得られた
培養物を２００ｍｌの水に入れ、３７℃で１時間浸漬処
理した後、濾過して、その抽出液のカタラーゼ活性を測
定した。固体培養でのカタラーゼ活性は、培養５日目が
最も高く、２０４０ＩＵ／ｇ−原料であった。

【００３３】また、液体培養の場合にあっては、小麦ふ
すま：２％、コーンスターチ：５．６％、ペプトン：
１．８％、塩化カリウム：０．０５％、硫酸マグネシウ
ム・７水塩：０．１５％、塩化カルシウム・２水塩：
０．２％、リン酸一カリウム：０．１％からなり、且つ
ｐＨ６に調整されてなる液体培地を用い、そのような培
地の３０ｍｌを３００ｍｌ容三角フラスコに分注し、オ
ートクレーブで１２０℃×３０分間加熱滅菌した後、サ
ーモマイセス・ラヌギノーサスＡＴＣＣ２２０８３の胞
子を接種し、そしてロータリー式振盪培養機（２００ｒ
ｐｍ）を用いて、４５℃の温度で振盪培養した。この培
養の終了後、得られた培養液を、８０００ｒｐｍ×１０
分間の遠心分離操作に付し、更にその得られた培養上澄
み液について、そのカタラーゼ活性を測定した。かかる
液体培養でのカタラーゼ活性は、培養４８時間目が最も
高く、３６８０ＩＵ／ｍｌ−培養液であった。この活性
を培地固形物当たりの生産量に換算すると、３７１７０
ＩＵ／ｇ−固形物となり、固体培養の場合に比較して、
約１８倍も生産量が高くなることが明らかとなった。

【００３４】実施例 ２ サーモマイセス・ラヌギノーサス(Thermomyces lanugin
osus) ＡＴＣＣ２２０７０を用い、実施例１の場合と同
様にして、固体培養及び液体培養を行なった。固体培養
（３７℃、５日）によるカタラーゼ活性は、１８００Ｉ
Ｕ／ｇ−原料であった。また、液体培養（４５℃、４８
時間）によるカタラーゼ活性は、３５５０ＩＵ／ｍｌ−
培養液であった。この液体培養でのカタラーゼ活性を、
培地固形物当たりの生産量に換算すると、３５８６０Ｉ
Ｕ／ｇ−固形物となり、固体培養の場合に比較して、約
２０倍も生産量の高いものであった。

【００３５】実施例 ３ 実施例１と同一組成からなる液体培地を用い、その３Ｌ
を５Ｌジャーファメンターに仕込み、オートクレーブで
１２０℃×３０分間の加熱滅菌を行なった後、サーモマ
イセス・ラヌギノーサスＡＴＣＣ２２０８３の前培養液
を２５０ｍｌ接種し、攪拌速度：４００〜６００ｒｐ
ｍ、通気量：１ｖｖｍ、温度：４０℃で、７０時間培養
した。かくして得られた培養液上澄みのカタラーゼ活性
を測定したところ、５８００ＩＵ／ｍｌ−培養液であっ
た。

【００３６】実施例 ４ 実施例１と同一組成からなる液体培地を用い、その１５
Ｌを３０Ｌジャーファメンターに仕込み、１２０℃×３
０分間、加熱蒸気滅菌した後、サーモマイセス・ラヌギ
ノーサスＡＴＣＣ２２０７０の前培養液を１Ｌ接種し、
攪拌速度：４００ｒｐｍ、通気量：１ｖｖｍ、温度：４
０℃で、５２時間培養した。この得られた培養液を遠心
分離して、菌体を除去した後、更に菌体は水洗して、酵
素を回収した。この菌体除去後の培養液と菌体を水洗し
て酵素を回収した液とを合わせ、その合わせ液に対し
て、濾過助剤を用いて、濾過を施すことにより、１８Ｌ
の清澄液を得た。次いで、この得られた清澄液のカタラ
ーゼ活性を調べたところ、６０００ＩＵ／ｍｌであっ
た。また、この清澄液を、限外膜濾過装置（独国：ザル
トリウス社製）により濃縮し、粗酵素液２．５Ｌを得
た。この粗酵素液のカタラーゼ活性は、３７３００ＩＵ
／ｍｌ（回収率８６％）であった。

【００３７】実施例 ５ 実施例４において得られた粗酵素液を用い、そのエタノ
ール沈殿を行ない、エタノール濃度：４０〜５０％画分
を、遠心分離によって集めた後、沈殿物は、５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７）の７００ｍｌに溶解した（カタラ
ーゼ活性：１１６０００ＩＵ／ｍｌ、回収率：７５
％）。次いで、かかる操作を再度繰り返して、４００ｍ
ｌの酵素液を得た（カタラーゼ活性：１８２０００ＩＵ
／ｍｌ、回収率：６７％）。そして、このようにして得
られた酵素液を透析チューブに入れて、５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７）を外液として、５℃で２４時間透析し
た。この透析中に生じた沈殿は、遠心分離によって除い
た後、シールクリーンフィルタカートリッジ（ポアサイ
ズ：０．４５μｍ、日本ポール株式会社製）を用いて、
無菌濾過して、４７０ｍｌの酵素液を得た（カタラーゼ
活性：１５００００ＩＵ／ｍｌ、回収率：６５％）。そ
の後、この得られた酵素液を凍結乾燥して、酵素粉末：
２５ｇを得た。この得られた精製酵素のカタラーゼ活性
は、２６８０ＩＵ／ｍｇ（回収率６２％）であって、電
気泳動的に単一なバンドを示した。

【００３８】このようにして得られた酵素粉末を用い
て、その至適作用ｐＨ、ｐＨ安定性、至適作用温度、熱
安定性、分子量、等電点、紫外部及び可視部の吸収スペ
クトル、金属イオン及び阻害剤の影響について調べた。

【００３９】（１）至適作用ｐＨについて ０．０４％の過酸化水素を含む、５０ｍＭの各ｐＨの緩
衝液（ｐＨ３〜４：ＨＣｌ−リン酸緩衝液、ｐＨ６〜
７：リン酸緩衝液、ｐＨ８〜１２：ＮａＯＨ−リン酸緩
衝液）に、１２ＩＵ／ｍｌになるように、酵素溶液を添
加して、２５℃の温度でカタラーゼ活性を測定した。そ
の結果を下記表１及び図１に示すが、それらより明らか
なように、得られた酵素（カタラーゼ）は、作用ｐＨ範
囲が３〜１２で、至適ｐＨは５〜１０の広範囲と認めら
れる。

【００４０】

【表１】

【００４１】（２）ｐＨ安定性について ５０ｍＭの各ｐＨのリン酸緩衝液中に、４００ＩＵ／ｍ
ｌとなるように酵素をそれぞれ溶解して、３０℃の温度
で６０分間処理した後、残存活性を測定し、その結果
を、下記表２及び図２に示した。それらの結果から明ら
かな如く、本発明に従って得られた酵素（カタラーゼ）
は、ｐＨ６〜１０の範囲で極めて安定であり、ｐＨ３の
酸性側及びｐＨ１２のアルカリ側においても、５０％以
上の残存活性を示した。

【００４２】

【表２】

【００４３】（３）至適作用温度について ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で調製した０．０４％
の過酸化水素溶液を、各温度に５分間保持した後、酵素
溶液を添加せしめ、各温度における活性を測定して、そ
の結果を、下記表３及び図３に示した。それらの結果か
ら、本発明に従って得られるカタラーゼは、２０〜８０
℃の範囲で活性を示し、至適温度は５０℃であることが
認められた。

【００４４】

【表３】

【００４５】（４）熱安定性について ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解した４００ＩＵ
／ｍｌの酵素溶液を、各温度で３０分保持した後、急冷
し、２５℃において残存活性を測定した。その結果を、
下記表４及び図４に示すが、それらの結果から明らかな
ように、本発明に従って得られたカタラーゼは、６０℃
まで極めて安定であり、８０℃でも６５％以上の残存活
性を示した。

【００４６】

【表４】

【００４７】（５）分子量について ゲル濾過法及びＳＤＳ−ゲル電気泳動法によって調べ
た。ゲル濾過法では、シリカゲルを基材とするＴＳＫ−
Ｇｅｌ−Ｇ３０００ＳＷ（東洋曹達株式会社製）を担体
として用い、高速液体クロマトグラフィ装置（６５５Ａ
型、株式会社日立製作所製）により、本発明に従って得
られた酵素（カタラーゼ）の溶出時間を測定した。標準
蛋白として、アルドラーゼ（Aldolase；分子量＝１５８
０００）、カタラーゼ（Catalase；分子量＝２３２００
０）、フェリチン（Ferritin；分子量＝４４０００
０）、チログロブリン（Thyroglobulin ；分子量＝６６
９０００）を用い、これら標準蛋白の溶出時間をプロッ
トして得られた検量線から、本発明に従って得られたカ
タラーゼの分子量が４７００００〜４８００００である
ことを認めた。

【００４８】他方、ポリアクリルアミドゲルを用いたＳ
ＤＳ−ゲルスラブ電気泳動法による測定の場合、本発明
に従って得られたカタラーゼは、単一のバンドとして泳
動され、標準蛋白として用いたミオグロビン（Myoglobi
n ；分子量＝１７２００）、カルボニック・アンハイド
ラーゼ（Carbonic anhydrase；分子量＝３００００）、
アルドラーゼ（Aldolase；分子量＝４２４００）、ボビ
ン・セラム・アルブミン（Bovine serum albumin；分子
量＝６６２００）、β−ガラクトシダーゼ（β-Galacto
sidase；分子量＝１１６０００）、ミオシン（Myosin；
分子量＝２０００００）の泳動距離から推定した分子量
は７８０００〜８００００に相当した。この結果から、
本発明に従って得られたカタラーゼは、７８０００〜８
００００のサブユニットからなる６量体であることが確
認された。

【００４９】（６）等電点について アガロースゲルを用いて等電点電気泳動装置（ＡＥ−３
２３０型、アトー社製）により測定した。その結果、標
準蛋白〔ソイビーン・トリプシン・インヒビタ(Soybean
trypsin inhibitor) ：ｐＩ−４．５５、グルコース・
オキシダーゼ(Glucose oxidase) ：ｐＩ−４．１５、ア
ミログルコシダーゼ(Amyloglucosidase)：ｐＩ−３．５
０、ペプシノーゲン(Pepsinogen)：ｐＩ−２．８０〕の
プロットより得られた直線から、本発明に従って得られ
たカタラーゼの等電点は３．９〜４．０であることを認
めた。

【００５０】（７）紫外部及び可視部の吸収スペクトル
について 酵素を５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）に溶かし、紫
外部及び可視部吸収スペクトルを分光光度計（Ｕ−２０
０１型、株式会社日立製作所製）により測定した。その
結果を、下記表５及び表６並びに図５及び図６に示す
が、それらから明らかな如く、本発明に従って得られた
カタラーゼは、紫外部領域では２８０ｎｍに、また可視
部領域では４１０ｎｍに極大吸収を有しているのであ
る。

【００５１】

【表５】

【００５２】

【表６】

【００５３】（８）金属イオン及び阻害剤の影響につい
て 酵素溶液（４００ＩＵ／ｍｌ）に、各種金属塩及び阻害
剤を、１０ｍＭ濃度になるように添加し、３０℃で３０
分間処理した後、残存活性を測定した。その結果、本発
明に従って得られたカタラーゼは、硫酸銅により略失活
し、塩化鉄、塩化第二鉄、塩化第二水銀及びＥＤＴＡ
（エチレンジアミン四酢酸）により、７０〜８０％の阻
害を受けることを認めた。

【００５４】

【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
に従うサーモマイセス属の好熱性糸状菌を用いたカタラ
ーゼの製造方法によれば、カタラーゼが菌体外に大量生
産されることとなるのであり、そのため、遠心分離して
菌体を除去する等の簡単な方法によって、容易に且つ効
率良く、カタラーゼを得ることが出来るのである。それ
故に、本発明によれば、従来に比べて、菌体破砕等の煩
雑な操作をする必要がなく、また精製も容易であるとこ
ろに、大きな利点があり、そこに、本発明の工業的意義
が存するのである。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例５において得られた、本発明に従うカタ
ラーゼの至適作用ｐＨの測定結果を示すグラフである。

【図２】実施例５において得られた、本発明に従うカタ
ラーゼのｐＨ安定性の測定結果を示すグラフである。

【図３】実施例５において得られた、本発明に従うカタ
ラーゼの至適作用温度の測定結果を示すグラフである。

【図４】実施例５において得られた、本発明に従うカタ
ラーゼの熱安定性の測定結果を示すグラフである。

【図５】実施例５において得られた、本発明に従うカタ
ラーゼの紫外部領域における吸収スペクトルの測定結果
を示すグラフである。

【図６】実施例５において得られた、本発明に従うカタ
ラーゼの可視部領域における吸収スペクトルの測定結果
を示すグラフである。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カタラーゼ産生能を有する微生物とし
   て、サーモマイセス属の好熱性糸状菌を用い、これを培
   養することにより、カタラーゼを菌体外に生産させる工
   程と、かかる培養工程で得られた培養物よりカタラーゼ
   を分離する工程とを含むことを特徴とするカタラーゼの
   製造方法。
2. 【請求項２】 前記サーモマイセス属の好熱性糸状菌
   が、サーモマイセス・ラヌギノーサスＡＴＣＣ２２０８
   ３またはＡＴＣＣ２２０７０である請求項１記載のカタ
   ラーゼの製造方法。
3. 【請求項３】 前記サーモマイセス属菌の培養が、液体
   培養によって行なわれる請求項１または請求項２記載の
   カタラーゼの製造方法。
4. 【請求項４】 次の理化学的性質を有するカタラーゼ； ａ）作用：過酸化水素に作用し、過酸化水素を水と酸素
   に分解する、 ｂ）至適作用ｐＨ：作用ｐＨ範囲が３〜１２で、至適ｐ
   Ｈが５〜１０である、 ｃ）ｐＨ安定性：３０℃、６０分間処理で、ｐＨ６〜１
   ０の範囲で極めて安定であり、ｐＨ３の酸性側及びｐＨ
   １２のアルカリ側においても５０％以上の残存活性を示
   す、 ｄ）至適作用温度：ｐＨ７において２０〜８０℃の範囲
   で活性を示し、至適温度が５０℃である、 ｅ）熱安定性：ｐＨ７、３０分間の加熱において６０℃
   まで極めて安定で、８０℃でも６５％以上の残存活性を
   示す、 ｆ）分子量：４７００００〜４８００００、 ｇ）等電点：３．９〜４．０、 ｈ）紫外部及び可視部の吸収スペクトル：２８０ｎｍ及
   び４１０ｎｍに極大吸収を有する。
5. 【請求項５】 サーモマイセス属の好熱性糸状菌の培養
   によって得られた請求項４記載のカタラーゼ。
6. 【請求項６】 前記サーモマイセス属の菌が、サーモマ
   イセス・ラヌギノーサスＡＴＣＣ２２０８３またはＡＴ
   ＣＣ２２０７０である請求項５記載のカタラーゼ。