JPH05260964A - 新規酵素、その製造方法及びこの酵素を用いたｄ−乳酸の製造方法 - Google Patents
新規酵素、その製造方法及びこの酵素を用いたｄ−乳酸の製造方法Info
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- JPH05260964A JPH05260964A JP4064544A JP6454492A JPH05260964A JP H05260964 A JPH05260964 A JP H05260964A JP 4064544 A JP4064544 A JP 4064544A JP 6454492 A JP6454492 A JP 6454492A JP H05260964 A JPH05260964 A JP H05260964A
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- enzyme
- lactic acid
- chloropropionic
- chloropropionic acid
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Abstract
(57)【要約】
【目的】 光学活性な種々の医薬農薬の合成原料として
有用なＤ−乳酸の製造方法として安価な原料であるＬ−
２−クロロプロピオン酸及びＤ−２−クロロプロピオン
酸に作用し、いずれの光学異性体からも光学活性なＤ−
乳酸を生成しうる微生物及び酵素を提供する。 【構成】 下記の理化学的性質を有する新規酵素。 (1) 作用及び基質特異性 各種ハロ化合物に作用し、脱ハロゲン化する。Ｌ−２−
クロロプロピオン酸及びＤ−２−クロロプロピオン酸に
作用し、いずれの基質からもＤ−乳酸を生成しうる。 (2) 至適pH：9.5 付近 (3) 安定pH範囲：８〜11 (4) 至適温度：55〜65℃ (5) 熱安定性：75℃以下で安定（pH9.5 、処理時間20
分） (6) Ｌ−２−クロロプロピオン酸に対するミハエリス定
数（Km値）：0.37mM Ｄ−２−クロロプロピオン酸に対するミハエリス定数
（Km値）：20mM (7) 分子量：54,000（ゲル濾過法）、27,000（SDS 電気
泳動法） (8) 阻害剤：ｐ−クロロ水銀安息香酸
有用なＤ−乳酸の製造方法として安価な原料であるＬ−
２−クロロプロピオン酸及びＤ−２−クロロプロピオン
酸に作用し、いずれの光学異性体からも光学活性なＤ−
乳酸を生成しうる微生物及び酵素を提供する。 【構成】 下記の理化学的性質を有する新規酵素。 (1) 作用及び基質特異性 各種ハロ化合物に作用し、脱ハロゲン化する。Ｌ−２−
クロロプロピオン酸及びＤ−２−クロロプロピオン酸に
作用し、いずれの基質からもＤ−乳酸を生成しうる。 (2) 至適pH：9.5 付近 (3) 安定pH範囲：８〜11 (4) 至適温度：55〜65℃ (5) 熱安定性：75℃以下で安定（pH9.5 、処理時間20
分） (6) Ｌ−２−クロロプロピオン酸に対するミハエリス定
数（Km値）：0.37mM Ｄ−２−クロロプロピオン酸に対するミハエリス定数
（Km値）：20mM (7) 分子量：54,000（ゲル濾過法）、27,000（SDS 電気
泳動法） (8) 阻害剤：ｐ−クロロ水銀安息香酸
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規な脱ハロゲン化酵
素（デハロゲナーゼ）及びその製造方法、並びにこの酵
素を用いるＤ−乳酸の製造方法に関する。
素（デハロゲナーゼ）及びその製造方法、並びにこの酵
素を用いるＤ−乳酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】各種脂
肪族の２−ハロ酸に作用し、２−ヒドロキシ酸を生成す
るいわゆる２−ハロ酸デハロゲナーゼについては、これ
までもいくつか報告されている（特開昭59−31690 号、
特開昭61−104785号）。しかしながら、Ｌ−２−クロロ
プロピオン酸及びＤ−２−クロロプロピオン酸に作用
し、いずれの基質からもＤ−乳酸を生成しうる２−ハロ
酸デハロゲナーゼはこれまで知られていない。
肪族の２−ハロ酸に作用し、２−ヒドロキシ酸を生成す
るいわゆる２−ハロ酸デハロゲナーゼについては、これ
までもいくつか報告されている（特開昭59−31690 号、
特開昭61−104785号）。しかしながら、Ｌ−２−クロロ
プロピオン酸及びＤ−２−クロロプロピオン酸に作用
し、いずれの基質からもＤ−乳酸を生成しうる２−ハロ
酸デハロゲナーゼはこれまで知られていない。
【０００３】本発明の目的は、光学活性な種々の医薬農
薬の合成原料として有用なＤ−乳酸の製造方法として安
価な原料であるＬ−２−クロロプロピオン酸及びＤ−２
−クロロプロピオン酸のエナンチオマー混合物、望まし
くはこれらのラセミ体に作用し、いずれの光学異性体か
らも光学活性なＤ−乳酸を生成しうる微生物及び酵素を
提供することにある。また、本発明の他の目的は酵素の
作用によりＬ−２−クロロプロピオン酸及びＤ−２−ク
ロロプロピオン酸のエナンチオマー混合物からＤ−乳酸
を効率よく得ることができる製造方法を提供することに
ある。
薬の合成原料として有用なＤ−乳酸の製造方法として安
価な原料であるＬ−２−クロロプロピオン酸及びＤ−２
−クロロプロピオン酸のエナンチオマー混合物、望まし
くはこれらのラセミ体に作用し、いずれの光学異性体か
らも光学活性なＤ−乳酸を生成しうる微生物及び酵素を
提供することにある。また、本発明の他の目的は酵素の
作用によりＬ−２−クロロプロピオン酸及びＤ−２−ク
ロロプロピオン酸のエナンチオマー混合物からＤ−乳酸
を効率よく得ることができる製造方法を提供することに
ある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく、Ｌ−２−クロロプロピオン酸及びＤ−２−
クロロプロピオン酸のエナンチオマー混合物からＤ−乳
酸を効率よく生成する微生物及び酵素を探索した結果、
シュードモナス（Pseudomonas)属に属する微生物が前記
目的を達成しうる新規酵素を生産することを見出すと共
に、この酵素の理化学的性質を明らかにすることにより
本発明を完成した。
解決すべく、Ｌ−２−クロロプロピオン酸及びＤ−２−
クロロプロピオン酸のエナンチオマー混合物からＤ−乳
酸を効率よく生成する微生物及び酵素を探索した結果、
シュードモナス（Pseudomonas)属に属する微生物が前記
目的を達成しうる新規酵素を生産することを見出すと共
に、この酵素の理化学的性質を明らかにすることにより
本発明を完成した。
【０００５】即ち、本発明は下記(1) 〜(8) に示す理化
学的性質を有する新規酵素を提供するものである。 (1) 作用及び基質特異性 各種ハロ化合物に作用し、脱ハロゲン化する。Ｌ−２−
クロロプロピオン酸及びＤ−２−クロロプロピオン酸に
作用し、いずれの基質からもＤ−乳酸を生成しうる。 (2) 至適pH：9.5 付近 (3) 安定pH範囲：８〜11 (4) 至適温度：55〜65℃ (5) 熱安定性：75℃以下で安定（pH9.5 、処理時間20
分） (6) Ｌ−２−クロロプロピオン酸に対するミハエリス定
数（Km値）：0.37mM Ｄ−２−クロロプロピオン酸に対するミハエリス定数
（Km値）：20mM (7) 分子量：54,000（ゲル濾過法）、27,000（SDS 電気
泳動法） (8) 阻害剤：ｐ−クロロ水銀安息香酸 また、本発明は、シュードモナス（Pseudomonas)属に属
する微生物を培養し、該培養物から前記理化学的性質を
有する酵素を採取することを特徴とする新規酵素の製造
方法を提供するものである。
学的性質を有する新規酵素を提供するものである。 (1) 作用及び基質特異性 各種ハロ化合物に作用し、脱ハロゲン化する。Ｌ−２−
クロロプロピオン酸及びＤ−２−クロロプロピオン酸に
作用し、いずれの基質からもＤ−乳酸を生成しうる。 (2) 至適pH：9.5 付近 (3) 安定pH範囲：８〜11 (4) 至適温度：55〜65℃ (5) 熱安定性：75℃以下で安定（pH9.5 、処理時間20
分） (6) Ｌ−２−クロロプロピオン酸に対するミハエリス定
数（Km値）：0.37mM Ｄ−２−クロロプロピオン酸に対するミハエリス定数
（Km値）：20mM (7) 分子量：54,000（ゲル濾過法）、27,000（SDS 電気
泳動法） (8) 阻害剤：ｐ−クロロ水銀安息香酸 また、本発明は、シュードモナス（Pseudomonas)属に属
する微生物を培養し、該培養物から前記理化学的性質を
有する酵素を採取することを特徴とする新規酵素の製造
方法を提供するものである。
【０００６】さらに本発明は、前記理化学的性質を有す
る新規酵素を、Ｌ−２−クロロプロピオン酸、Ｄ−２−
クロロプロピオン酸又はこれらのエナンチオマー混合物
に作用させ、Ｄ−乳酸を生成させることを特徴とするＤ
−乳酸の製造方法を提供するものである。
る新規酵素を、Ｌ−２−クロロプロピオン酸、Ｄ−２−
クロロプロピオン酸又はこれらのエナンチオマー混合物
に作用させ、Ｄ−乳酸を生成させることを特徴とするＤ
−乳酸の製造方法を提供するものである。
【０００７】本発明の新規酵素の起源は特に限定される
ものではなく、前記理化学的性質を有する酵素を生産し
うる微生物であれば良い。好ましい微生物は例えば、シ
ュードモナス（Pseudomonas)属に属する微生物である。
これらの微生物の中で好ましい微生物は本発明者らによ
り土壌中より分離されたシュードモナス・エスピー．YL
（Pseudomonas sp. YL）が挙げられ、本菌株は微工研菌
寄第 12834号として微生物工業技術研究所に寄託されて
いる。本菌株の分類学上の位置を決めるための試験結果
は下記の通りである。
ものではなく、前記理化学的性質を有する酵素を生産し
うる微生物であれば良い。好ましい微生物は例えば、シ
ュードモナス（Pseudomonas)属に属する微生物である。
これらの微生物の中で好ましい微生物は本発明者らによ
り土壌中より分離されたシュードモナス・エスピー．YL
（Pseudomonas sp. YL）が挙げられ、本菌株は微工研菌
寄第 12834号として微生物工業技術研究所に寄託されて
いる。本菌株の分類学上の位置を決めるための試験結果
は下記の通りである。
【０００８】(a) 形態 (1) 細胞の形および大きさ 桿菌 0.5〜0.8 μ× 1.5〜3.0 μ (2) 運動性 あり (3) グラム染色性 陰性 (4) 胞子の有無 なし (b) 生理学的性質 (1) オキシダーゼ 陽性 (2) カタラーゼ 陽性 (3) アミノペプチダーゼ（Cerny) 陽性 (4) インドールの生成 陰性 (5) VPテスト 陰性 (6) 硝酸塩の還元 陰性 (7) 脱窒反応 陰性 (8) クエン酸の利用（Simons) 陽性 (9) ウレアーゼ 陽性 (10) フェニルアラニンデアミナーゼ 陰性 (11) マロン酸の利用 陽性 (12) シュクロースからレバンの生成 陰性 (13) レシチナーゼ 陰性 (14) デンプンの加水分解 陰性 (15) ゼラチンの加水分解 陰性 (16) カゼインの加水分解 陰性 (17) ＤNAの加水分解 陰性 (18) Tween 80の加水分解 陰性 (19) エクスリンの加水分解 陰性 (20) ３％HOH による溶菌 陽性 (21) 酸素に対する態度 好気性 (22) 37℃での生育 − (23) 41℃での生育 − (24) pH 5.6での生育 ＋ (25) Mac-Conkey-Agar 培地での生育 − (26) SS-Agar 培地での生育 − (27) Cetrimid-Agar 培地での生育 − (28) 色素の生成 黄色 非拡散性 陽性 拡散性 陰性 蛍光性 陰性 ピロシアニン 陰性 (29) OFテスト 糖を分解しな
い (30) 酸の生成 グルコース − フラクトース − キシロース − (31) ONPG（β−ガラクトシダーゼ） 陰性 (32) アルギニンジヒドロラーゼ 陰性 (33) グルコースからのガスの生成 − (34) チロシン分解 陽性 (35) 生育因子要求性 − (36) 各種炭素化合物の利用性 酢酸 ＋ アジピン酸 ＋ カプリン酸 − クエン酸 ＋ シトラコン酸 − グリコール酸 ＋ レブリン酸 − マレイン酸 ＋ マロン酸 ＋ メサコン酸 ＋ ムコン酸 ＋ フェニル酢酸 ＋ 糖酸 ＋ セバシン酸 ＋ Ｄ−酒石酸 − ｍ−酒石酸 ＋ Ｌ−アラビノース − セロビオース − フラクトース − Ｄ−フコース − グルコース − マンノース − マルトース − リボース − ラムノース − キシロース − マンニトール − グルコン酸 ＋ ２−ケトグルコン酸 ＋ Ｎ−アセチルグルコサミン − トリプタミン − エタノールアミン − Ｄ−アラニン − Ｌ−オルニチン −Ｌ−セリン
− Ｌ−スレオニン ＋ グルタミン酸 ＋ 安息香酸 ＋ ｍ−ヒドロキシ安息香酸 ＋ サリシン酸ナトリウム − 2,3 −ブチレングリコール − 以上の結果をバージーの細菌分類書〔Bergy's Manual o
f Systematis Bacteriology,（1986) 〕に基づいて分類
すると本菌株はシュードモナス属に属すると判定される
がこれらの性質が標準株と一致するものは見出せなかっ
た。そこで、本菌株はシュードモナス・スピーシーズ
YL株（Pseudomonas sp. YL) と呼ぶことにした。
い (30) 酸の生成 グルコース − フラクトース − キシロース − (31) ONPG（β−ガラクトシダーゼ） 陰性 (32) アルギニンジヒドロラーゼ 陰性 (33) グルコースからのガスの生成 − (34) チロシン分解 陽性 (35) 生育因子要求性 − (36) 各種炭素化合物の利用性 酢酸 ＋ アジピン酸 ＋ カプリン酸 − クエン酸 ＋ シトラコン酸 − グリコール酸 ＋ レブリン酸 − マレイン酸 ＋ マロン酸 ＋ メサコン酸 ＋ ムコン酸 ＋ フェニル酢酸 ＋ 糖酸 ＋ セバシン酸 ＋ Ｄ−酒石酸 − ｍ−酒石酸 ＋ Ｌ−アラビノース − セロビオース − フラクトース − Ｄ−フコース − グルコース − マンノース − マルトース − リボース − ラムノース − キシロース − マンニトール − グルコン酸 ＋ ２−ケトグルコン酸 ＋ Ｎ−アセチルグルコサミン − トリプタミン − エタノールアミン − Ｄ−アラニン − Ｌ−オルニチン −Ｌ−セリン
− Ｌ−スレオニン ＋ グルタミン酸 ＋ 安息香酸 ＋ ｍ−ヒドロキシ安息香酸 ＋ サリシン酸ナトリウム − 2,3 −ブチレングリコール − 以上の結果をバージーの細菌分類書〔Bergy's Manual o
f Systematis Bacteriology,（1986) 〕に基づいて分類
すると本菌株はシュードモナス属に属すると判定される
がこれらの性質が標準株と一致するものは見出せなかっ
た。そこで、本菌株はシュードモナス・スピーシーズ
YL株（Pseudomonas sp. YL) と呼ぶことにした。
【０００９】さらに、これらの微生物は、前記理化学的
性質を有する酵素を生産する限り、野生株、変異株、ま
たは細胞融合もしくは遺伝子操作法などの遺伝的手法に
より誘導される組み換え株などのいずれの菌株でも好適
に用いることができる。
性質を有する酵素を生産する限り、野生株、変異株、ま
たは細胞融合もしくは遺伝子操作法などの遺伝的手法に
より誘導される組み換え株などのいずれの菌株でも好適
に用いることができる。
【００１０】本発明の酵素は、前記微生物を培地で培養
し、培養菌体から抽出精製することにより得ることがで
きる。培地は、微生物が増殖し得るものであれば特に制
限されない。培地の炭素源としては、上記微生物が利用
可能であればいずれも使用でき、例えば、酢酸、クエン
酸、及びこれらの混合物などが使用できる。窒素源とし
ては、例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、
リン酸アンモニウムなどの無機酸のアンモニウム塩；フ
マル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機
酸のアンモニウム塩；肉エキス、酵母エキス、麦芽エキ
ス、ペプトン、コーンスティープリカー、カゼイン加水
分解物、尿素などの無機又は有機含窒素化合物；これら
の混合物を使用できる。また、培地には、前記成分以外
に、通常の培養に用いられる栄養源、例えば、無機塩、
微量金属塩、ビタミン類などを適宜、混合して用いるこ
とができる。さらに、必要に応じて、微生物の増殖を促
進する因子、培地のpH保持に有効な物質等を添加でき
る。また、本酵素を生産させるためには培地中に本酵素
を生産させるために有効な化合物、例えばＬ−２−クロ
ロプロピオン酸、Ｄ−２−クロロプロピオン酸あるいは
これらのエナンチオマー混合物等を加えておく方が良
い。
し、培養菌体から抽出精製することにより得ることがで
きる。培地は、微生物が増殖し得るものであれば特に制
限されない。培地の炭素源としては、上記微生物が利用
可能であればいずれも使用でき、例えば、酢酸、クエン
酸、及びこれらの混合物などが使用できる。窒素源とし
ては、例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、
リン酸アンモニウムなどの無機酸のアンモニウム塩；フ
マル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機
酸のアンモニウム塩；肉エキス、酵母エキス、麦芽エキ
ス、ペプトン、コーンスティープリカー、カゼイン加水
分解物、尿素などの無機又は有機含窒素化合物；これら
の混合物を使用できる。また、培地には、前記成分以外
に、通常の培養に用いられる栄養源、例えば、無機塩、
微量金属塩、ビタミン類などを適宜、混合して用いるこ
とができる。さらに、必要に応じて、微生物の増殖を促
進する因子、培地のpH保持に有効な物質等を添加でき
る。また、本酵素を生産させるためには培地中に本酵素
を生産させるために有効な化合物、例えばＬ−２−クロ
ロプロピオン酸、Ｄ−２−クロロプロピオン酸あるいは
これらのエナンチオマー混合物等を加えておく方が良
い。
【００１１】微生物の培養は、生育に適した条件下、例
えば、培地のpH 3.0〜9.5 、好ましくは４〜８、培養温
度20〜45℃、好ましくは25〜37℃の条件で行うことがで
きる。微生物の培養は、嫌気的又は好気的条件下で行う
ことができる。培養時間は、例えば、１〜120 時間、好
ましくは５〜72時間程度である。
えば、培地のpH 3.0〜9.5 、好ましくは４〜８、培養温
度20〜45℃、好ましくは25〜37℃の条件で行うことがで
きる。微生物の培養は、嫌気的又は好気的条件下で行う
ことができる。培養時間は、例えば、１〜120 時間、好
ましくは５〜72時間程度である。
【００１２】本発明の酵素は、培養した微生物菌体から
抽出し精製することにより得ることができる。例えば、
培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、超音波破砕
や、機械的破砕法と遠心分離法とを組み合わせる方法な
どにより無細胞抽出液を得る。次いで、抽出液を、例え
ば、ストレプトマイシン硫酸処理、硫酸アンモニウム分
画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、溶出液による溶出、ゲル濾過法、限
外濾過法などの通常の精製方法を一種又は二種以上組み
合わせて精製することにより、酵素を得ることができ
る。
抽出し精製することにより得ることができる。例えば、
培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、超音波破砕
や、機械的破砕法と遠心分離法とを組み合わせる方法な
どにより無細胞抽出液を得る。次いで、抽出液を、例え
ば、ストレプトマイシン硫酸処理、硫酸アンモニウム分
画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、溶出液による溶出、ゲル濾過法、限
外濾過法などの通常の精製方法を一種又は二種以上組み
合わせて精製することにより、酵素を得ることができ
る。
【００１３】以下に本発明の酵素を用いて、Ｌ−２−ク
ロロプロピオン酸あるいはＤ−２−クロロプロピオン
酸、又はこれらのエナンチオマー混合物からＤ−乳酸を
製造する方法について説明する。本発明のＤ−乳酸の製
造方法において用いる基質は価格の面からラセミ体が好
ましい。
ロロプロピオン酸あるいはＤ−２−クロロプロピオン
酸、又はこれらのエナンチオマー混合物からＤ−乳酸を
製造する方法について説明する。本発明のＤ−乳酸の製
造方法において用いる基質は価格の面からラセミ体が好
ましい。
【００１４】本脱ハロゲン化反応は前記酵素の活性が安
定に発現する条件下、基質と酵素を適当な水性溶媒下に
混合して反応させればよい。反応系のpHは例えば３〜1
2、好ましくは８〜10.5程度である。また反応温度は例
えば10〜80℃、好ましくは40〜75℃程度である。反応は
攪拌下又は静置下、１分〜120 時間程度行うことができ
る。基質の濃度は例えば0.01〜20重量％、好ましくは
0.1〜10重量％程度が挙げられる。酵素と基質の比率は
反応が目的時間内で終了するような範囲で自由に選択で
きる。
定に発現する条件下、基質と酵素を適当な水性溶媒下に
混合して反応させればよい。反応系のpHは例えば３〜1
2、好ましくは８〜10.5程度である。また反応温度は例
えば10〜80℃、好ましくは40〜75℃程度である。反応は
攪拌下又は静置下、１分〜120 時間程度行うことができ
る。基質の濃度は例えば0.01〜20重量％、好ましくは
0.1〜10重量％程度が挙げられる。酵素と基質の比率は
反応が目的時間内で終了するような範囲で自由に選択で
きる。
【００１５】さらに、本発明の酵素は、慣用の方法、例
えば、吸着、包括、共有結合、イオン結合、架橋結合な
どの方法により、種々の固定化担体に固定化することに
より固定化酵素として使用することも可能である。担体
の種類は特に制限されず、例えばポリアクリルアミド、
セルロース系材料、スチレン系ポリマー、DEAE−セファ
デックス、イオン交換樹脂、コラーゲン、アルブミン、
カラギーナン、アルギン酸、寒天などであってもよい。
えば、吸着、包括、共有結合、イオン結合、架橋結合な
どの方法により、種々の固定化担体に固定化することに
より固定化酵素として使用することも可能である。担体
の種類は特に制限されず、例えばポリアクリルアミド、
セルロース系材料、スチレン系ポリマー、DEAE−セファ
デックス、イオン交換樹脂、コラーゲン、アルブミン、
カラギーナン、アルギン酸、寒天などであってもよい。
【００１６】生成したＤ−乳酸は各種の分離精製手段に
より精製できる。例えば、反応液を膜分離、有機溶媒抽
出、カラムクロマトグラフィーイオン交換樹脂による分
離、減圧濃縮、蒸留等に供することによりＤ−乳酸を得
ることができる。
より精製できる。例えば、反応液を膜分離、有機溶媒抽
出、カラムクロマトグラフィーイオン交換樹脂による分
離、減圧濃縮、蒸留等に供することによりＤ−乳酸を得
ることができる。
【００１７】このように、本酵素は、Ｌ−２−クロロプ
ロピオン酸及びＤ−２−クロロプロピオン酸という基質
両エナンチオマーに対してそれぞれ立体反転及び立体保
持で反応を触媒し、１種のエナンチオマーであるＤ−乳
酸を特異的に生成するものであり、このような酵素の例
は本酵素が初めてである。
ロピオン酸及びＤ−２−クロロプロピオン酸という基質
両エナンチオマーに対してそれぞれ立体反転及び立体保
持で反応を触媒し、１種のエナンチオマーであるＤ−乳
酸を特異的に生成するものであり、このような酵素の例
は本酵素が初めてである。
【００１８】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。
【００１９】なお、酵素活性は次のような標準活性測定
法により測定した。Ｌ−２−クロロプロピオン酸25mM、
トリス−硫酸緩衝液（pH 9.5) 100mM 、及び適量の酵素
溶液を含む全容0.2ml の反応系を構成し、30℃で20分間
反応させる。しかる後、３M 硫酸20μl を添加し反応を
停止する。以後、この反応液中に遊離した塩素イオンを
IWASAKI の方法（Bull. Chem. Soc. Jpn., Vol 29, P86
0(1956))により定量し酵素活性を算出した。なお、上記
の条件下で１分間に１μｍｏｌｅの塩素イオンが遊離す
る酵素活性を１単位（Ｕ）とした。また、比活性は蛋白
質１mg当たりの単位（Ｕ）数として算出した。なお、蛋
白質量は、牛血清アルブミンを標準物質として用い、ロ
ーリイ(Lowry) 法により測定した。
法により測定した。Ｌ−２−クロロプロピオン酸25mM、
トリス−硫酸緩衝液（pH 9.5) 100mM 、及び適量の酵素
溶液を含む全容0.2ml の反応系を構成し、30℃で20分間
反応させる。しかる後、３M 硫酸20μl を添加し反応を
停止する。以後、この反応液中に遊離した塩素イオンを
IWASAKI の方法（Bull. Chem. Soc. Jpn., Vol 29, P86
0(1956))により定量し酵素活性を算出した。なお、上記
の条件下で１分間に１μｍｏｌｅの塩素イオンが遊離す
る酵素活性を１単位（Ｕ）とした。また、比活性は蛋白
質１mg当たりの単位（Ｕ）数として算出した。なお、蛋
白質量は、牛血清アルブミンを標準物質として用い、ロ
ーリイ(Lowry) 法により測定した。
【００２０】実施例１（菌体調製） KH2PO4 0.2％、K2HPO4 0.2％、硫安 0.1％、塩化ナトリ
ウム 0.1％、酵母エキス 0.1％、MgSO4・6H2O 0.05％、
消泡剤0.01％の組成を有する培地20リットルを調製し、
30リットルジャーに仕込み加熱殺菌後フィルター濾過に
より除菌したラセミ体２−クロロプロピオン酸20ｇを加
える。しかる後、10M NaOH溶液25mlを加えpHを6.8 〜7.
0 にする。ここにシュードモナス・エスピー. YLの種培
養液 100mlを植菌し、30℃、 150rpm 、１vvm の条件
下、16時間培養した。しかる後、遠心分離により集菌
し、12.5mMリン酸バッファー（pH 7.5) により洗浄後、
酵素の給源とした。
ウム 0.1％、酵母エキス 0.1％、MgSO4・6H2O 0.05％、
消泡剤0.01％の組成を有する培地20リットルを調製し、
30リットルジャーに仕込み加熱殺菌後フィルター濾過に
より除菌したラセミ体２−クロロプロピオン酸20ｇを加
える。しかる後、10M NaOH溶液25mlを加えpHを6.8 〜7.
0 にする。ここにシュードモナス・エスピー. YLの種培
養液 100mlを植菌し、30℃、 150rpm 、１vvm の条件
下、16時間培養した。しかる後、遠心分離により集菌
し、12.5mMリン酸バッファー（pH 7.5) により洗浄後、
酵素の給源とした。
【００２１】実施例２（酵素の精製） 上記の湿菌体10ｇを50mMリン酸バッファー(pH 7.5) (含
１mM PMSF 、0.1mM TPCK、１mM EDTA)40mlにサスペンド
し、超音波破砕にかけ菌体をこわした。この破砕液を遠
心分離にかけ上澄液48mlを得た。次にこの抽出液をZeta
prep（QAE, 250)(20mMリン酸バッファ(pH 7.5)で平衡
化済) にチャージしカラムを同じバッファーで洗浄後、
順次濃度を上げた同じバッファーで溶出していった。そ
の結果目的の酵素は 200mMのところで溶出された。次に
この活性画分をHiload Superdex 200 を充填したカラム
(1.3×60cm)(50mMリン酸バッファー(pH 7.5)で平衡化
済) にかけゲル濾過を行った。次にこの活性画分をPhen
yl super rose HRを充填したカラムにかけ、1.24M 硫酸
アンモニウム／50mMリン酸バッファーpH7.25と50mMリン
酸バッファpH7.25を用いるグラジュント溶出法によりク
ロマトを行った。得られた活性画分をまとめて精製酵素
標品とした。精製工程をまとめて表１に示した。
１mM PMSF 、0.1mM TPCK、１mM EDTA)40mlにサスペンド
し、超音波破砕にかけ菌体をこわした。この破砕液を遠
心分離にかけ上澄液48mlを得た。次にこの抽出液をZeta
prep（QAE, 250)(20mMリン酸バッファ(pH 7.5)で平衡
化済) にチャージしカラムを同じバッファーで洗浄後、
順次濃度を上げた同じバッファーで溶出していった。そ
の結果目的の酵素は 200mMのところで溶出された。次に
この活性画分をHiload Superdex 200 を充填したカラム
(1.3×60cm)(50mMリン酸バッファー(pH 7.5)で平衡化
済) にかけゲル濾過を行った。次にこの活性画分をPhen
yl super rose HRを充填したカラムにかけ、1.24M 硫酸
アンモニウム／50mMリン酸バッファーpH7.25と50mMリン
酸バッファpH7.25を用いるグラジュント溶出法によりク
ロマトを行った。得られた活性画分をまとめて精製酵素
標品とした。精製工程をまとめて表１に示した。
【００２２】
【表１】
【００２３】実施例３ 実施例１と同様な培地で培養した菌体から定法により染
色体ＤＮＡを調製した。このＤＮＡをSau3AIで部分分解
し、pUC19 のBamH1 サイトに連結した。これをE. coliJ
M109株に形質転換し、ブロモ酢酸存在下で生育する株を
選択した。得られた株について実施例１で用いた培地と
同じ培地で培養し、標準法により酵素活性を測定したと
ころ親株に比べ比活性が約９倍に上昇した株を得た。
色体ＤＮＡを調製した。このＤＮＡをSau3AIで部分分解
し、pUC19 のBamH1 サイトに連結した。これをE. coliJ
M109株に形質転換し、ブロモ酢酸存在下で生育する株を
選択した。得られた株について実施例１で用いた培地と
同じ培地で培養し、標準法により酵素活性を測定したと
ころ親株に比べ比活性が約９倍に上昇した株を得た。
【００２４】実施例４（基質特異性） 標準活性測定法に準拠し、実施例２で得られた酵素標品
を用い、表２に記載の各種基質について反応速度を調べ
た。Ｌ−２−クロロプロピオン酸に対する活性を 100に
し、得られた結果を表２に相対活性として示した。
を用い、表２に記載の各種基質について反応速度を調べ
た。Ｌ−２−クロロプロピオン酸に対する活性を 100に
し、得られた結果を表２に相対活性として示した。
【００２５】
【表２】
【００２６】注）遊離したBr、I の定量はClの場合と同
様にIWASAKI の方法によった。また、２−クロロプロピ
オンアミドからの生成物はHPLC法により定量した。
様にIWASAKI の方法によった。また、２−クロロプロピ
オンアミドからの生成物はHPLC法により定量した。
【００２７】実施例５ 実施例２で得られた酵素標品の至適pH、pH安定性、至適
温度、熱安定性、阻害剤、分子量、立体特異性及びＬ−
２−クロロプロピオン酸及びＤ−２−クロロプロピオン
酸に対するミハエリス定数（Km値）を測定した結果を以
下に示す。
温度、熱安定性、阻害剤、分子量、立体特異性及びＬ−
２−クロロプロピオン酸及びＤ−２−クロロプロピオン
酸に対するミハエリス定数（Km値）を測定した結果を以
下に示す。
【００２８】 〔pH安定性〕 測定法 実施例２で得られた酵素溶液12μl を最終100mM になる
ようにバッファーで希釈し（pH6.5 〜9.5 は Bis-tris-
propane バッファー、pH10〜11はCAPSバッファー使用）
15μl とする。これを50℃で10分処理後冷却し、残存活
性を測定した。残存活性を相対値で示す。
ようにバッファーで希釈し（pH6.5 〜9.5 は Bis-tris-
propane バッファー、pH10〜11はCAPSバッファー使用）
15μl とする。これを50℃で10分処理後冷却し、残存活
性を測定した。残存活性を相対値で示す。
【００２９】 pH 残存活性 6.5 70.1 7.0 75.6 7.5 74.4 8.0 95.1 pH８〜11の範囲内で安定である。 8.5 80.5 9.0 82.9 9.5 80.5 10.0 100 10.5 97.6 11.0 87.8 〔至適温度〕 測定法 実施例２で得られた酵素標品の至適温度を次のようにし
て調べた。即ち、標準活性測定法に準拠し反応温度を変
化させ、反応速度を測定した。
て調べた。即ち、標準活性測定法に準拠し反応温度を変
化させ、反応速度を測定した。
【００３０】 温度 相対活性 20 ℃ 29.７％ 25 35.8 30 45.9 35 58.8 40 62.8 45 72.3 50 82.4 55 98.6 60 99.8 よって至適温度は55〜65℃付近 65 100 75 70.9 〔熱安定性〕 測定法 実施例２で得られた酵素標品の熱安定性を次のようにし
て調べた。即ちこの酵素溶液を異なる温度条件下、pH9.
5 で20分間処理し残存する活性を標準活性測定法に準拠
して測定した。
て調べた。即ちこの酵素溶液を異なる温度条件下、pH9.
5 で20分間処理し残存する活性を標準活性測定法に準拠
して測定した。
【００３１】温度 残存活性 65 ℃ 100 ％ 75 100 よって75℃までは安定 80 10 85 0 〔阻害剤〕 測定法 実施例２で得られた酵素標品を用い、標準活性測定法の
反応系に各種化合物を加え阻害効果を調べた。
反応系に各種化合物を加え阻害効果を調べた。
【００３２】コントロール
100 ％ MgSO4 1 mM 107 ZnSO4 〃 64 CuSO4 〃 93 MnSO4 〃 97 FeSO4 〃 100 Ｎ−エチルマレイミド 〃 52 ヨードアセトアミド 〃 74 ｐ−クロロ水銀安息香酸 0.1mM 45 〔分子量〕精製に用いたHiload Super dex 200を充填し
たカラムを用い常法によりゲル濾過法による分子量を測
定したところ54,000であった。また、SDS 電気泳動法に
より分子量を求めたところ27,000となり本酵素は同一サ
ブユニット２ケから成ることがわかった。
100 ％ MgSO4 1 mM 107 ZnSO4 〃 64 CuSO4 〃 93 MnSO4 〃 97 FeSO4 〃 100 Ｎ−エチルマレイミド 〃 52 ヨードアセトアミド 〃 74 ｐ−クロロ水銀安息香酸 0.1mM 45 〔分子量〕精製に用いたHiload Super dex 200を充填し
たカラムを用い常法によりゲル濾過法による分子量を測
定したところ54,000であった。また、SDS 電気泳動法に
より分子量を求めたところ27,000となり本酵素は同一サ
ブユニット２ケから成ることがわかった。
【００３３】〔立体特異性〕本酵素の作用によりＬ−２
−クロロプロピオン酸及びＤ−２−クロロプロピオン酸
から生成する乳酸の立体配置についてＤ−あるいはＬ−
乳酸脱水素酵素を用いる方法（Archives of Microbiolo
gy, vol 131, p179(1982))により調べたところ、本酵素
はＬ−２−クロロプロピオン酸及びＤ−２−クロロプロ
ピオン酸のいずれからもＤ−乳酸のみを生成することが
判明した。
−クロロプロピオン酸及びＤ−２−クロロプロピオン酸
から生成する乳酸の立体配置についてＤ−あるいはＬ−
乳酸脱水素酵素を用いる方法（Archives of Microbiolo
gy, vol 131, p179(1982))により調べたところ、本酵素
はＬ−２−クロロプロピオン酸及びＤ−２−クロロプロ
ピオン酸のいずれからもＤ−乳酸のみを生成することが
判明した。
【００３４】〔ミハエリス定数（Km値）〕実施例２で得
られた酵素標品を用い、常法により標準活性測定法の基
質濃度を変化させ、Ｌ−２−クロロプロピオン酸及びＤ
−２−クロロプロピオン酸に対するKm値を測定した。そ
の結果、Ｌ−２−クロロプロピオン酸に対するKm値は0.
37mM、Ｄ−２−クロロプロピオン酸に対するKm値は20mM
であった。
られた酵素標品を用い、常法により標準活性測定法の基
質濃度を変化させ、Ｌ−２−クロロプロピオン酸及びＤ
−２−クロロプロピオン酸に対するKm値を測定した。そ
の結果、Ｌ−２−クロロプロピオン酸に対するKm値は0.
37mM、Ｄ−２−クロロプロピオン酸に対するKm値は20mM
であった。
【００３５】実施例６ 0.5 Ｍラセミ体２−クロロプロピオン酸25μl 、１Ｍト
リス−硫酸バッファー（pH9.5 ）125 μl 、0.25Ｍ NaO
H 50μl 、0.05Ｍリン酸カリウムバッファー（pH7.5 ）
110 μl 、6.6 単位のデハロゲナーゼ（実施例２で得ら
れた酵素標品）溶液940 μl の反応系を組み、30℃で反
応させた。反応20分後に反応液の一部を採り生成したＤ
−乳酸を定量したところラセミ体の２−クロロプロピオ
ン酸から67％の転換率でＤ−乳酸が生成していた。
リス−硫酸バッファー（pH9.5 ）125 μl 、0.25Ｍ NaO
H 50μl 、0.05Ｍリン酸カリウムバッファー（pH7.5 ）
110 μl 、6.6 単位のデハロゲナーゼ（実施例２で得ら
れた酵素標品）溶液940 μl の反応系を組み、30℃で反
応させた。反応20分後に反応液の一部を採り生成したＤ
−乳酸を定量したところラセミ体の２−クロロプロピオ
ン酸から67％の転換率でＤ−乳酸が生成していた。
【００３６】実施例７ 実施例６において、ラセミ体２−クロロプロピオン酸の
替わりにＬ−２−クロロプロピオン酸を用い、実施例６
と同様に反応させたところ反応時間20分で96％の転換率
でＤ−乳酸が生成していた。
替わりにＬ−２−クロロプロピオン酸を用い、実施例６
と同様に反応させたところ反応時間20分で96％の転換率
でＤ−乳酸が生成していた。
【００３７】実施例８ 実施例６において、ラセミ体２−クロロプロピオン酸の
替わりにＤ−２−クロロプロピオン酸を用い、実施例６
と同様に反応させたところ反応時間20分で83％の転換率
でＤ−乳酸が生成していた。
替わりにＤ−２−クロロプロピオン酸を用い、実施例６
と同様に反応させたところ反応時間20分で83％の転換率
でＤ−乳酸が生成していた。
Claims (4)
- 【請求項１】 下記の(1) 〜(8) に示す理化学的性質を
有する新規酵素。 (1) 作用及び基質特異性 各種ハロ化合物に作用し、脱ハロゲン化する。Ｌ−２−
クロロプロピオン酸及びＤ−２−クロロプロピオン酸に
作用し、いずれの基質からもＤ−乳酸を生成しうる。 (2) 至適pH：9.5 付近 (3) 安定pH範囲：８〜11 (4) 至適温度：55〜65℃ (5) 熱安定性：75℃以下で安定（pH9.5 、処理時間20
分） (6) Ｌ−２−クロロプロピオン酸に対するミハエリス定
数（Km値）：0.37mM Ｄ−２−クロロプロピオン酸に対するミハエリス定数
（Km値）：20mM (7) 分子量：54,000（ゲル濾過法）、27,000（SDS 電気
泳動法） (8) 阻害剤：ｐ−クロロ水銀安息香酸 - 【請求項２】 Ｌ−２−クロロプロピオン酸及びＤ−２
−クロロプロピオン酸に作用し、いずれの基質からもＤ
−乳酸を生成しうる請求項１記載の新規酵素。 - 【請求項３】 シュードモナス（Pseudomonas)属に属す
る微生物を培養し、該培養物から、請求項１記載の酵素
を採取することを特徴とする新規酵素の製造方法。 - 【請求項４】 請求項１記載の酵素をＬ−２−クロロプ
ロピオン酸、Ｄ−２−クロロプロピオン酸又はこれらの
エナンチオマー混合物に作用させＤ−乳酸を生成させる
ことを特徴とするＤ−乳酸の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4064544A JPH05260964A (ja) | 1992-03-23 | 1992-03-23 | 新規酵素、その製造方法及びこの酵素を用いたｄ−乳酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4064544A JPH05260964A (ja) | 1992-03-23 | 1992-03-23 | 新規酵素、その製造方法及びこの酵素を用いたｄ−乳酸の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05260964A true JPH05260964A (ja) | 1993-10-12 |
Family
ID=13261277
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4064544A Pending JPH05260964A (ja) | 1992-03-23 | 1992-03-23 | 新規酵素、その製造方法及びこの酵素を用いたｄ−乳酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05260964A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007114017A1 (ja) * | 2006-03-29 | 2007-10-11 | Bio-Energy Corporation | 乳酸発酵液からの乳酸成分の分離方法および分離装置 |
| CN100436399C (zh) * | 2006-06-27 | 2008-11-26 | 浙江工业大学 | 一种制备(s)-(-)-2-氯丙酸酯和(r)-(+)-2-氯丙酸的方法 |
-
1992
- 1992-03-23 JP JP4064544A patent/JPH05260964A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007114017A1 (ja) * | 2006-03-29 | 2007-10-11 | Bio-Energy Corporation | 乳酸発酵液からの乳酸成分の分離方法および分離装置 |
| US8859245B2 (en) | 2006-03-29 | 2014-10-14 | Bio-Energy Corporation | Method for separation of lactic acid component from lactic acid fermentation liquor, and separation apparatus |
| CN100436399C (zh) * | 2006-06-27 | 2008-11-26 | 浙江工业大学 | 一种制备(s)-(-)-2-氯丙酸酯和(r)-(+)-2-氯丙酸的方法 |
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