JPH05227954A - 新規なグリセロールデヒドロゲナーゼ、その製法及びその用途 - Google Patents
新規なグリセロールデヒドロゲナーゼ、その製法及びその用途Info
- Publication number
- JPH05227954A JPH05227954A JP4073568A JP7356892A JPH05227954A JP H05227954 A JPH05227954 A JP H05227954A JP 4073568 A JP4073568 A JP 4073568A JP 7356892 A JP7356892 A JP 7356892A JP H05227954 A JPH05227954 A JP H05227954A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glycerol
- enzyme
- glycerol dehydrogenase
- dehydrogenase
- electron acceptor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 可溶化および安定化に界面活性剤を必要とし
ないピロロキノリノキノン依存性グリセロールデヒドロ
ゲナーゼを提供する。 【構成】 （１）次の性質を有するグリセロールデヒド
ロゲナーゼ、その製法およびその用途。 次の反応を触媒する。 グリセロール＋電子受容体→ジヒドロキシアセトン（グ
リセルアルデヒド）＋還元型電子受容体 至適作用ｐＨ：ｐＨ８〜９ ｐＨ安定性：ｐＨ７〜１１ 至適作用温度：２０〜２５℃ 熱安定性：ｐＨ７．０、１０分の反応で３０℃以下で
安定である。 分子量：ゲル濾過法およびＳＤＳアクリルアミドゲル
電気泳動法で７万の分子量を示す。 補欠分子属としてピロロキノリノキノンを含む。 可溶化および安定化に界面活性化剤を必要としない。
ないピロロキノリノキノン依存性グリセロールデヒドロ
ゲナーゼを提供する。 【構成】 （１）次の性質を有するグリセロールデヒド
ロゲナーゼ、その製法およびその用途。 次の反応を触媒する。 グリセロール＋電子受容体→ジヒドロキシアセトン（グ
リセルアルデヒド）＋還元型電子受容体 至適作用ｐＨ：ｐＨ８〜９ ｐＨ安定性：ｐＨ７〜１１ 至適作用温度：２０〜２５℃ 熱安定性：ｐＨ７．０、１０分の反応で３０℃以下で
安定である。 分子量：ゲル濾過法およびＳＤＳアクリルアミドゲル
電気泳動法で７万の分子量を示す。 補欠分子属としてピロロキノリノキノンを含む。 可溶化および安定化に界面活性化剤を必要としない。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規な特性を有するグリ
セロールデヒドロゲナーゼ、その製法およびその用途に
関するものである。本発明のグリセロールデヒドロゲナ
ーゼはピロロキノリノキノン（ＰＱＱ）を補欠分子属と
して有し、可溶化および安定化に界面活性化剤を必要と
しないから、試料中にグリセロールを含む系において、
グリセロールの定量を感度よく定量することができる。
セロールデヒドロゲナーゼ、その製法およびその用途に
関するものである。本発明のグリセロールデヒドロゲナ
ーゼはピロロキノリノキノン（ＰＱＱ）を補欠分子属と
して有し、可溶化および安定化に界面活性化剤を必要と
しないから、試料中にグリセロールを含む系において、
グリセロールの定量を感度よく定量することができる。
【０００２】
【従来の技術】従来、試料中のグリセロールをグリセロ
ールデヒドロゲナーゼで定量する方法は次の反応式に従
う。 グリセロール＋ＮＡＤ＋→ジヒドロキシアセトン＋ＮＡ
ＤＨ（グリセロールデヒドロゲナーゼ） この方法はＮＡＤのように高価な補酵素を用いていた
が、本発明者らは、より安価で、簡便なグリセロール測
定法を開発しようと考えた。そこで注目したのが人工電
子受容体を利用するＰＱＱ依存性グリセロールデヒドロ
ゲナーゼである。該グリセロールデヒドロゲナーゼは、
既に酢酸菌由来のもの（Ameyama et. al.Agric.Biol.Ch
em.,49,1001-1010(1985)）が報告されている。しかしな
がら該酵素は細胞膜結合型酵素であり、菌体からの可溶
化および安定化に特定の界面活性化剤を必要とし、好ま
しくない界面活性化剤が存在することによりグリセロー
ルの測定において、測定誤差を生じることが考えられ
る。
ールデヒドロゲナーゼで定量する方法は次の反応式に従
う。 グリセロール＋ＮＡＤ＋→ジヒドロキシアセトン＋ＮＡ
ＤＨ（グリセロールデヒドロゲナーゼ） この方法はＮＡＤのように高価な補酵素を用いていた
が、本発明者らは、より安価で、簡便なグリセロール測
定法を開発しようと考えた。そこで注目したのが人工電
子受容体を利用するＰＱＱ依存性グリセロールデヒドロ
ゲナーゼである。該グリセロールデヒドロゲナーゼは、
既に酢酸菌由来のもの（Ameyama et. al.Agric.Biol.Ch
em.,49,1001-1010(1985)）が報告されている。しかしな
がら該酵素は細胞膜結合型酵素であり、菌体からの可溶
化および安定化に特定の界面活性化剤を必要とし、好ま
しくない界面活性化剤が存在することによりグリセロー
ルの測定において、測定誤差を生じることが考えられ
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは上記の背
景を踏まえ、可溶化および安定化に界面活性化剤を必要
としないＰＱＱ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼを
見いだそうと種々試みた。
景を踏まえ、可溶化および安定化に界面活性化剤を必要
としないＰＱＱ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼを
見いだそうと種々試みた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題点
を解決するため鋭意研究を重ねた結果、シュードモナス
・エスピー（Pseudomonas sp. ）ＴＥ３４９３から可溶
性のグリセロールデヒドロゲナーゼを見いだし、本発明
を完成するに至った。すなわち本発明は、次の性質を有
するグリセロールデヒドロゲナーゼである。 次の反応を触媒する。 グリセロール＋電子受容体→ジヒドロキシアセトン（グ
リセルアルデヒド）＋還元型電子受容体 至適作用ｐＨ：ｐＨ８〜９ ｐＨ安定性：ｐＨ７〜１１ 至適作用温度：２０〜２５℃ 熱安定性：ｐＨ７．０、１０分の反応で３０℃以下で
安定である。 分子量：ゲル濾過法およびＳＤＳアクリルアミドゲル
電気泳動法で７万の分子量を示す。 補欠分子属としてピロロキノリノキノンを含む。 可溶化および安定化に界面活性化剤を必要としない。
を解決するため鋭意研究を重ねた結果、シュードモナス
・エスピー（Pseudomonas sp. ）ＴＥ３４９３から可溶
性のグリセロールデヒドロゲナーゼを見いだし、本発明
を完成するに至った。すなわち本発明は、次の性質を有
するグリセロールデヒドロゲナーゼである。 次の反応を触媒する。 グリセロール＋電子受容体→ジヒドロキシアセトン（グ
リセルアルデヒド）＋還元型電子受容体 至適作用ｐＨ：ｐＨ８〜９ ｐＨ安定性：ｐＨ７〜１１ 至適作用温度：２０〜２５℃ 熱安定性：ｐＨ７．０、１０分の反応で３０℃以下で
安定である。 分子量：ゲル濾過法およびＳＤＳアクリルアミドゲル
電気泳動法で７万の分子量を示す。 補欠分子属としてピロロキノリノキノンを含む。 可溶化および安定化に界面活性化剤を必要としない。
【０００５】また本発明はシュードモナス属に属し、上
記の新規なグリセロールデヒドロゲナーゼの生産能を有
する菌株を栄養培地にて培養し、該培養物から新規なグ
リセロールデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とす
る新規なグリセロールデヒドロゲナーゼの製造法であ
る。更に本発明は試料中のグリセロールを分析する系に
おいて、上記の新規なグリセロールデヒドロゲナーゼを
用いるグリセロールの定量法である。
記の新規なグリセロールデヒドロゲナーゼの生産能を有
する菌株を栄養培地にて培養し、該培養物から新規なグ
リセロールデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とす
る新規なグリセロールデヒドロゲナーゼの製造法であ
る。更に本発明は試料中のグリセロールを分析する系に
おいて、上記の新規なグリセロールデヒドロゲナーゼを
用いるグリセロールの定量法である。
【０００６】本発明の酵素の性質は以下の通りである。 次の反応を触媒する。 グリセロール＋電子受容体→ジヒドロキシアセトン（グ
リセルアルデヒド）＋還元型電子受容体 至適作用ｐＨ：ｐＨ８−９ ｐＨ安定性：ｐＨ７−１１ 至適作用温度：２０−２５℃ 熱安定性：ｐＨ７．０、１０分の反応で３０℃以下で
安定である。 分子量：ゲル濾過法およびＳＤＳアクリルアミドゲル
電気泳動法で７万の分子量を示す。 補欠分子属としてピロロキノリノキノンを含む。 可溶化および安定化に界面活性化剤を必要としない。
リセルアルデヒド）＋還元型電子受容体 至適作用ｐＨ：ｐＨ８−９ ｐＨ安定性：ｐＨ７−１１ 至適作用温度：２０−２５℃ 熱安定性：ｐＨ７．０、１０分の反応で３０℃以下で
安定である。 分子量：ゲル濾過法およびＳＤＳアクリルアミドゲル
電気泳動法で７万の分子量を示す。 補欠分子属としてピロロキノリノキノンを含む。 可溶化および安定化に界面活性化剤を必要としない。
【０００７】本発明の酵素の起源は上記性質を有するグ
リセロールデヒドロゲナーゼを産生しうるものであれば
動物、植物、微生物など如何なる起源のものを用いても
良い。好ましくは、上記性質を有するグリセロールデヒ
ドロゲナーゼを産生しうるシュードモナス属細菌であっ
て、好適な例としてはシュードモナス・エスピー（Pseu
domonas sp. ）ＴＥ３４９３が挙げられる。シュードモ
ナス・エスピーＴＥ３４９３は土壌中より分離した菌株
であり、その菌学的性質は以下の通りである。 （ａ）形態 （１）菌形：短かん菌 （２）細胞の大きさ：２．０〜２．５×１．０μｍ （３）運動性：あり。 （４）細胞の多形性：なし。 （５）胞子の有無：なし。 （６）グラム染色性：陰性。 （７）抗酸性：陰性。 （ｂ）各培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板培養：３０℃、４８時間培養で淡褐
色円形のコロニーを形成する。コロニーの周縁は全縁、
もしくは波状であり、隆起状である。表面は滑らかで光
沢を有し、不透明である。色素の生成はない。 （２）肉汁寒天斜面培養：生育は良好で（１）に同じ。 （３）肉汁液体培養：生育は良好で、やや濁り沈さも少
しある。 （４）肉汁ゼラチン穿刺培養：上部でのみ良好な生育を
示す。ゼラチンは液化しない。 （５）リトマスミルク：色に変化はない。ミルクは固化
する。 （ｃ）生理学的性質 （１）硝酸塩の還元：陰性。 （２）脱窒反応：陰性。 （３）ＭＲテスト：陰性。 （４）ＶＰテスト：陰性。 （５）インドールの生成：陰性。 （６）硫化水素の生成：陰性。 （７）デンプンの加水分解：陰性。 （８）クエン酸の利用：Koser の培地、Christensen の
培地ともに陽性。 （９）無機Ｎ源の利用：アンモニウム塩は利用するが、
硝酸塩は利用しない。 （１０）色素の生成：色素を生成しない。 （１１）ウレアーゼ：陰性。 （１２）オキシダーゼ：陽性。 （１３）カタラーゼ：陽性。 （１４）β−ガラクトシダーゼ：陰性。 （１５）アルギニンジヒドラーゼ：陽性。 （１６）リジンデカルボキシラーゼ：陰性。 （１７）オルニチンデカルボキシラーゼ：陰性。 （１８）トリプトファンデアミナーゼ：陰性。 （１９）β−グルコシダーゼ：陰性。 （２０）生育の範囲：ｐＨ５．０〜１０．０で生育。温
度２０〜３７℃で生育。４２℃で生育しない。 （２１）酸素に対する態度：好気性。 （２２）Ｏ−Ｆテスト：Ｏ（酸化） （２３）糖からの酸の生成 Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−フラクトース − Ｄ−ガラクトース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｄ−キシロース − Ｄ−ソルビット − Ｄ−マンニトール − イノシット − Ｌ−ラムノース − サッカロース − マンノース − ラクトース − Ｄ−メリビオース − Ｄ−アミダクリン − グリセリン − でんぷん −
リセロールデヒドロゲナーゼを産生しうるものであれば
動物、植物、微生物など如何なる起源のものを用いても
良い。好ましくは、上記性質を有するグリセロールデヒ
ドロゲナーゼを産生しうるシュードモナス属細菌であっ
て、好適な例としてはシュードモナス・エスピー（Pseu
domonas sp. ）ＴＥ３４９３が挙げられる。シュードモ
ナス・エスピーＴＥ３４９３は土壌中より分離した菌株
であり、その菌学的性質は以下の通りである。 （ａ）形態 （１）菌形：短かん菌 （２）細胞の大きさ：２．０〜２．５×１．０μｍ （３）運動性：あり。 （４）細胞の多形性：なし。 （５）胞子の有無：なし。 （６）グラム染色性：陰性。 （７）抗酸性：陰性。 （ｂ）各培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板培養：３０℃、４８時間培養で淡褐
色円形のコロニーを形成する。コロニーの周縁は全縁、
もしくは波状であり、隆起状である。表面は滑らかで光
沢を有し、不透明である。色素の生成はない。 （２）肉汁寒天斜面培養：生育は良好で（１）に同じ。 （３）肉汁液体培養：生育は良好で、やや濁り沈さも少
しある。 （４）肉汁ゼラチン穿刺培養：上部でのみ良好な生育を
示す。ゼラチンは液化しない。 （５）リトマスミルク：色に変化はない。ミルクは固化
する。 （ｃ）生理学的性質 （１）硝酸塩の還元：陰性。 （２）脱窒反応：陰性。 （３）ＭＲテスト：陰性。 （４）ＶＰテスト：陰性。 （５）インドールの生成：陰性。 （６）硫化水素の生成：陰性。 （７）デンプンの加水分解：陰性。 （８）クエン酸の利用：Koser の培地、Christensen の
培地ともに陽性。 （９）無機Ｎ源の利用：アンモニウム塩は利用するが、
硝酸塩は利用しない。 （１０）色素の生成：色素を生成しない。 （１１）ウレアーゼ：陰性。 （１２）オキシダーゼ：陽性。 （１３）カタラーゼ：陽性。 （１４）β−ガラクトシダーゼ：陰性。 （１５）アルギニンジヒドラーゼ：陽性。 （１６）リジンデカルボキシラーゼ：陰性。 （１７）オルニチンデカルボキシラーゼ：陰性。 （１８）トリプトファンデアミナーゼ：陰性。 （１９）β−グルコシダーゼ：陰性。 （２０）生育の範囲：ｐＨ５．０〜１０．０で生育。温
度２０〜３７℃で生育。４２℃で生育しない。 （２１）酸素に対する態度：好気性。 （２２）Ｏ−Ｆテスト：Ｏ（酸化） （２３）糖からの酸の生成 Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−フラクトース − Ｄ−ガラクトース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｄ−キシロース − Ｄ−ソルビット − Ｄ−マンニトール − イノシット − Ｌ−ラムノース − サッカロース − マンノース − ラクトース − Ｄ−メリビオース − Ｄ−アミダクリン − グリセリン − でんぷん −
【０００８】上記菌学的性質同定のための実験法は主と
して長谷川武治編著、改訂版「微生物の分類と同定」学
会出版センター（１９８５年）によって行った。また分
類同定の基準として「バージッス・マニュアル・オブ・
デタミネイティブ・バクテリオロジー」第８版を参考に
した。以上の文献および菌学的性質から本菌はシュード
モナス属に属するとみなされる。さらに本菌は種々の性
質がシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）と
よく一致したが、水溶性蛍光色素を産生しないので、本
菌株をシュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp. ）
ＴＥ３４９３と命名した。なお本菌は工業技術院微生物
工業技術研究所に微工研菌寄第１２２９８号として寄託
されている。
して長谷川武治編著、改訂版「微生物の分類と同定」学
会出版センター（１９８５年）によって行った。また分
類同定の基準として「バージッス・マニュアル・オブ・
デタミネイティブ・バクテリオロジー」第８版を参考に
した。以上の文献および菌学的性質から本菌はシュード
モナス属に属するとみなされる。さらに本菌は種々の性
質がシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）と
よく一致したが、水溶性蛍光色素を産生しないので、本
菌株をシュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp. ）
ＴＥ３４９３と命名した。なお本菌は工業技術院微生物
工業技術研究所に微工研菌寄第１２２９８号として寄託
されている。
【０００９】本発明の酵素を製造するにあたっては、上
記グリセロールデヒドロゲナーゼ生産菌を栄養培地に培
養し、該培養物からグリセロールデヒドロゲナーゼを採
取することにより製造できる。グリセロールデヒドロゲ
ナーゼ生産菌の培養にあたって使用する培地としては、
使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他
必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地、
天然培地いづれも使用できる。炭素源としては、例えば
グルコース、グリセロール等が使用される。窒素源とし
ては、例えばペプトン類、肉エキス、酵母エキス等の窒
素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニ
ウム等の無機窒素含有化合物が使用される。無機物とし
ては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネ
シウム等が使用される。またグリセロールデヒドロゲナ
ーゼの生産誘導物質として、グリセロールを培地に添加
しておくことが望ましい。培地は通常振とう培養、ある
いは通気撹はん培養で行う。培養温度は２０〜４０℃、
好ましくは２５〜３７℃、培養ｐＨは５〜９の範囲で、
好ましくは７〜８に制御するのが良い。これら以外の条
件下でも使用する菌株が生育すれば実施できる。培養期
間は通常１〜１０日で生育し、菌体内にグリセロールデ
ヒドロゲナーゼが生産蓄積される。
記グリセロールデヒドロゲナーゼ生産菌を栄養培地に培
養し、該培養物からグリセロールデヒドロゲナーゼを採
取することにより製造できる。グリセロールデヒドロゲ
ナーゼ生産菌の培養にあたって使用する培地としては、
使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他
必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地、
天然培地いづれも使用できる。炭素源としては、例えば
グルコース、グリセロール等が使用される。窒素源とし
ては、例えばペプトン類、肉エキス、酵母エキス等の窒
素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニ
ウム等の無機窒素含有化合物が使用される。無機物とし
ては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネ
シウム等が使用される。またグリセロールデヒドロゲナ
ーゼの生産誘導物質として、グリセロールを培地に添加
しておくことが望ましい。培地は通常振とう培養、ある
いは通気撹はん培養で行う。培養温度は２０〜４０℃、
好ましくは２５〜３７℃、培養ｐＨは５〜９の範囲で、
好ましくは７〜８に制御するのが良い。これら以外の条
件下でも使用する菌株が生育すれば実施できる。培養期
間は通常１〜１０日で生育し、菌体内にグリセロールデ
ヒドロゲナーゼが生産蓄積される。
【００１０】本発明の酵素の精製法は一般に使用される
精製法を用いれば良い。例えば、抽出法には超音波破
砕、ガラスビーズを用いる機械的な破砕、フレンチプレ
ス、界面活性剤などいずれを用いても良い。さらに抽出
液については、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネ
シウムや塩化カルシウムなどの金属凝集法、プロタミン
やポリエチレンイミンなどの凝集法、さらにはＤＥＡＥ
（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カル
ボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマ
ト法などにより精製することができる。またこれらの方
法で得られた粗酵素液や精製酵素液は、例えば、スプレ
ードライや凍結乾燥により粉末化できる。さらには適当
な担体に固定化して固定化酵素として使用できる。
精製法を用いれば良い。例えば、抽出法には超音波破
砕、ガラスビーズを用いる機械的な破砕、フレンチプレ
ス、界面活性剤などいずれを用いても良い。さらに抽出
液については、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネ
シウムや塩化カルシウムなどの金属凝集法、プロタミン
やポリエチレンイミンなどの凝集法、さらにはＤＥＡＥ
（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カル
ボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマ
ト法などにより精製することができる。またこれらの方
法で得られた粗酵素液や精製酵素液は、例えば、スプレ
ードライや凍結乾燥により粉末化できる。さらには適当
な担体に固定化して固定化酵素として使用できる。
【００１１】次に本発明の新規なグリセロールデヒドロ
ゲナーゼの活性測定法を示す。反応液に５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．７ｍｌ，０．１Ｍグリセ
ロール０．１ｍｌ，酵素液を加えて全液量を０．９ｍｌ
とする。２５℃で５分間予備加温を行った後、０．１Ｍ
フェリシアン化カリウムを０．１ｍｌ添加して反応を開
始する。硫酸第２鉄・デュパノール試薬を０．５ｍｌ添
加して反応を停止させる。蒸留水を３．５ｍｌ加えて全
液量を５ｍｌとし、２５℃で３０分放置後に６６０ｎｍ
での吸光度を測定する。盲検は酵素液の代わりに蒸留水
を加え、上記同様に操作を行う。グリセロールデヒドロ
ゲナーゼの活性の表示は、上記条件下で１分間で１マイ
クロモルのグリセロールを酸化する酵素活性を１単位
（Ｕ）とする。
ゲナーゼの活性測定法を示す。反応液に５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．７ｍｌ，０．１Ｍグリセ
ロール０．１ｍｌ，酵素液を加えて全液量を０．９ｍｌ
とする。２５℃で５分間予備加温を行った後、０．１Ｍ
フェリシアン化カリウムを０．１ｍｌ添加して反応を開
始する。硫酸第２鉄・デュパノール試薬を０．５ｍｌ添
加して反応を停止させる。蒸留水を３．５ｍｌ加えて全
液量を５ｍｌとし、２５℃で３０分放置後に６６０ｎｍ
での吸光度を測定する。盲検は酵素液の代わりに蒸留水
を加え、上記同様に操作を行う。グリセロールデヒドロ
ゲナーゼの活性の表示は、上記条件下で１分間で１マイ
クロモルのグリセロールを酸化する酵素活性を１単位
（Ｕ）とする。
【００１２】また本発明は試料中のグリセロールを分析
する系において、新規なグリセロールデヒドロゲナーゼ
を用いるグリセロールの定量法である。グリセロールを
含む試料としては、食品、血清や血奬等が挙げられ、本
発明のグリセロールデヒドロゲナーゼを用いて以下の方
法でグリセロールを定量できる。電子受容体として、例
えばフェリシアン化カリウムを用い、吸光度の減少を測
定するか、または２，６−ジクロロフェノールインドフ
ェノールとフェナジンメトスルフェートの共存下で吸光
度の減少を測定する。さらにはフェナジンメトスルフェ
ートとニトロテトラゾリウムブルー存在下で生成するホ
ルマザン発色を測定することで定量できる。また本発明
の酵素は血清や血奬等の中性脂肪測定にも有利に使用す
ることができる。すなわちこれらの試料の中性脂肪は、
例えばリポプロテインリパーゼにより遊離脂肪酸とグリ
セロールに分解されるが、ここで生じたグリセロールを
本発明のグリセロールデヒドロゲナーゼを使用し、上記
方法を利用して定量することができる。中性脂肪測定時
には精神病治療患者、透析患者では遊離グリセロールが
問題になるが、本発明のクリセロールデヒドロゲナーゼ
を用いればグリセロールを予め消去するか、もしくはそ
の量を測定しておくことで真の中性脂肪値を求めること
が可能である。本発明の酵素は可溶化または安定化に特
定の界面活性剤を使用しないので、グリセロールの測定
時において、好ましくない界面活性剤の使用により起き
る測定誤差を回避することが可能である。
する系において、新規なグリセロールデヒドロゲナーゼ
を用いるグリセロールの定量法である。グリセロールを
含む試料としては、食品、血清や血奬等が挙げられ、本
発明のグリセロールデヒドロゲナーゼを用いて以下の方
法でグリセロールを定量できる。電子受容体として、例
えばフェリシアン化カリウムを用い、吸光度の減少を測
定するか、または２，６−ジクロロフェノールインドフ
ェノールとフェナジンメトスルフェートの共存下で吸光
度の減少を測定する。さらにはフェナジンメトスルフェ
ートとニトロテトラゾリウムブルー存在下で生成するホ
ルマザン発色を測定することで定量できる。また本発明
の酵素は血清や血奬等の中性脂肪測定にも有利に使用す
ることができる。すなわちこれらの試料の中性脂肪は、
例えばリポプロテインリパーゼにより遊離脂肪酸とグリ
セロールに分解されるが、ここで生じたグリセロールを
本発明のグリセロールデヒドロゲナーゼを使用し、上記
方法を利用して定量することができる。中性脂肪測定時
には精神病治療患者、透析患者では遊離グリセロールが
問題になるが、本発明のクリセロールデヒドロゲナーゼ
を用いればグリセロールを予め消去するか、もしくはそ
の量を測定しておくことで真の中性脂肪値を求めること
が可能である。本発明の酵素は可溶化または安定化に特
定の界面活性剤を使用しないので、グリセロールの測定
時において、好ましくない界面活性剤の使用により起き
る測定誤差を回避することが可能である。
【００１３】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示
す。 実施例１ グリセロール０．５％、ＮａＮＯ3 ０．２％、（Ｎ
Ｈ4 ）2 ＳＯ4 ０．２％、Ｋ2 ＨＰＯ4 １％、ＫＨ2 Ｐ
Ｏ4 １％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ０．０２％、酵母エキ
ス０．０５％を含む培地１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口
フラスコに移し、１２１℃、１５分間オートクレーブを
行った。種菌として、シュードモナス・エスピー（Pseu
domonas sp.）ＴＥ３４９３（微工研菌寄第１２２９８
号）を一白菌耳植菌し、３０℃で２４時間培養し、種培
養液とした。次に同培地６ｌを１０ｌ容ジャーファーメ
ンターに移し、１２１℃で１５分間オートクレーブを行
い、放冷後、種培養液１００ｍｌを移し、３００ｒｐ
ｍ，通気量２ｌ／分、３０℃で３０時間培養した。培養
液を遠心分離にて集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁
した。フレンチプレスで処理し、遠心分離を行い、上清
液を得た。得られた粗酵素液を硫安分画、ＤＥＡＥーセ
ルロースクロマトグラフィー、ＤＥＡＥートヨパールク
ロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマト
グラフィー、ゲル濾過の順に分画し、比活性１５Ｕ／ｍ
ｇの酵素標品を得た。得られたグリセロールデヒドロゲ
ナーゼは下記の特性を有していた。 (1)下記の反応を触媒した。 グリセロール＋電子受容体→ジヒドロキシアセトン（グ
リセルアルデヒド）＋還元型電子受容体 (2)電子受容体 フェリシアン化カリウム、２，６−ジクロロフェノール
インドフェノール、Wurster's blue、ニトロテトラゾリ
ウムブルー等を利用した。 (3)Ｋｍ値 グリセロールに対するＫｍ値は２．４５ｍＭであった。 (4)至適ｐＨ ５０ｍＭマクルバイン緩衝液（ｐＨ５．０〜６．０）、
５０ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）、５
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０〜９．０）、およ
び５０ｍＭグリシン／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０〜１
１．０）中での酵素活性を測定した。その結果は図１に
示す通りであって、至適ｐＨはｐＨ８．０−９．０であ
った。 (5)安定ｐＨ 本発明の酵素を至適ｐＨの測定で用いた緩衝液中で５
℃、１日間保存してその残存活性を測定した。その結果
は図２に示す通りであって、安定ｐＨはｐＨ７．０〜１
１．０であった。 (6)至適温度 各温度における酵素活性を測定した。その結果は図３に
示す通りであって、至適温度は２０〜２５℃であった。 (7)熱安定性 本発明の酵素を５０ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）中で１０分間保温した後、残存する酵素活性を測定
した。その結果は図４に示す通りであって、３０℃まで
安定であった。 (8)吸収スペクトル 精製酵素は２８０、４１５、５２３、５５２ｎｍに特異
的な吸収を示した（図５）。 (9)補欠分子属 本発明の酵素をピリジンヘムクロモゲンスペクトルで分
析したところ、酵素１分子当り１分子のチトクロムＣを
含むことがわかった。また酵素を有機溶媒処理によって
ＰＱＱを遊離させた後、その含量を酵素定量法で測定し
たところ酵素１分子当りＰＱＱ１分子を含むことが明か
となった。 (10)分子量 セファデクスＧ−２００を用いたゲル濾過法により分析
したところ分子量は約７０、０００であった。またＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥの結果も分子量約７０、０００を示した。
す。 実施例１ グリセロール０．５％、ＮａＮＯ3 ０．２％、（Ｎ
Ｈ4 ）2 ＳＯ4 ０．２％、Ｋ2 ＨＰＯ4 １％、ＫＨ2 Ｐ
Ｏ4 １％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ０．０２％、酵母エキ
ス０．０５％を含む培地１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口
フラスコに移し、１２１℃、１５分間オートクレーブを
行った。種菌として、シュードモナス・エスピー（Pseu
domonas sp.）ＴＥ３４９３（微工研菌寄第１２２９８
号）を一白菌耳植菌し、３０℃で２４時間培養し、種培
養液とした。次に同培地６ｌを１０ｌ容ジャーファーメ
ンターに移し、１２１℃で１５分間オートクレーブを行
い、放冷後、種培養液１００ｍｌを移し、３００ｒｐ
ｍ，通気量２ｌ／分、３０℃で３０時間培養した。培養
液を遠心分離にて集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁
した。フレンチプレスで処理し、遠心分離を行い、上清
液を得た。得られた粗酵素液を硫安分画、ＤＥＡＥーセ
ルロースクロマトグラフィー、ＤＥＡＥートヨパールク
ロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマト
グラフィー、ゲル濾過の順に分画し、比活性１５Ｕ／ｍ
ｇの酵素標品を得た。得られたグリセロールデヒドロゲ
ナーゼは下記の特性を有していた。 (1)下記の反応を触媒した。 グリセロール＋電子受容体→ジヒドロキシアセトン（グ
リセルアルデヒド）＋還元型電子受容体 (2)電子受容体 フェリシアン化カリウム、２，６−ジクロロフェノール
インドフェノール、Wurster's blue、ニトロテトラゾリ
ウムブルー等を利用した。 (3)Ｋｍ値 グリセロールに対するＫｍ値は２．４５ｍＭであった。 (4)至適ｐＨ ５０ｍＭマクルバイン緩衝液（ｐＨ５．０〜６．０）、
５０ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）、５
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０〜９．０）、およ
び５０ｍＭグリシン／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０〜１
１．０）中での酵素活性を測定した。その結果は図１に
示す通りであって、至適ｐＨはｐＨ８．０−９．０であ
った。 (5)安定ｐＨ 本発明の酵素を至適ｐＨの測定で用いた緩衝液中で５
℃、１日間保存してその残存活性を測定した。その結果
は図２に示す通りであって、安定ｐＨはｐＨ７．０〜１
１．０であった。 (6)至適温度 各温度における酵素活性を測定した。その結果は図３に
示す通りであって、至適温度は２０〜２５℃であった。 (7)熱安定性 本発明の酵素を５０ｍＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）中で１０分間保温した後、残存する酵素活性を測定
した。その結果は図４に示す通りであって、３０℃まで
安定であった。 (8)吸収スペクトル 精製酵素は２８０、４１５、５２３、５５２ｎｍに特異
的な吸収を示した（図５）。 (9)補欠分子属 本発明の酵素をピリジンヘムクロモゲンスペクトルで分
析したところ、酵素１分子当り１分子のチトクロムＣを
含むことがわかった。また酵素を有機溶媒処理によって
ＰＱＱを遊離させた後、その含量を酵素定量法で測定し
たところ酵素１分子当りＰＱＱ１分子を含むことが明か
となった。 (10)分子量 セファデクスＧ−２００を用いたゲル濾過法により分析
したところ分子量は約７０、０００であった。またＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥの結果も分子量約７０、０００を示した。
【００１４】
【実施例２】グリセロールを０．０１、０．０２、０．
０４，０．０６、０．０８、０．１０マイクロモル含む
６種類の試料溶液を作製し、これらの溶液０．１ｍｌに
酵素液０．８、ｌを加え、全量を０．９ｍｌとして２５
℃で５分間放置した後、フェリシアン化カリウム溶液
０．１ｍｌを加えて反応を開始した。２５℃で２０分間
反応させ、反応停止液に硫酸第２鉄・デュパノール試薬
０．５ｍｌを加えて反応を停止した。ついでこの反応混
合液に蒸留水３．５ｍｌを加え、２５℃で３０分放置
後、分光光度計で６６０ｎｍの吸光度を測定した。結果
は図６に示す通りであって、グリセロールの量が０．０
１〜０．１マイクロモルまで直線となり、定量が可能で
あった。
０４，０．０６、０．０８、０．１０マイクロモル含む
６種類の試料溶液を作製し、これらの溶液０．１ｍｌに
酵素液０．８、ｌを加え、全量を０．９ｍｌとして２５
℃で５分間放置した後、フェリシアン化カリウム溶液
０．１ｍｌを加えて反応を開始した。２５℃で２０分間
反応させ、反応停止液に硫酸第２鉄・デュパノール試薬
０．５ｍｌを加えて反応を停止した。ついでこの反応混
合液に蒸留水３．５ｍｌを加え、２５℃で３０分放置
後、分光光度計で６６０ｎｍの吸光度を測定した。結果
は図６に示す通りであって、グリセロールの量が０．０
１〜０．１マイクロモルまで直線となり、定量が可能で
あった。
【００１５】
【発明の効果】本発明では可溶化および安定化に界面活
性化剤を必要としないＰＱＱ依存性グリセロールデヒド
ロゲナーゼが得られる。本酵素を用いることにより高価
な補酵素を用いることなく、簡便で安価にグリセロール
の定量が可能である。
性化剤を必要としないＰＱＱ依存性グリセロールデヒド
ロゲナーゼが得られる。本酵素を用いることにより高価
な補酵素を用いることなく、簡便で安価にグリセロール
の定量が可能である。
図１は反応ｐＨと本発明酵素の相対活性との関係を示す
グラフであり、図２はｐＨ安定性を示すグラフであり、
図３は反応温度と本発明酵素の相対活性との関係を示す
グラフであり、図４は温度安定性を示すグラフであり、
図５は本発明酵素の吸収スペクトルを示す図である。ま
た図６はグリセロールの検量線である。
グラフであり、図２はｐＨ安定性を示すグラフであり、
図３は反応温度と本発明酵素の相対活性との関係を示す
グラフであり、図４は温度安定性を示すグラフであり、
図５は本発明酵素の吸収スペクトルを示す図である。ま
た図６はグリセロールの検量線である。
Claims (3)
- 【請求項１】 次の性質を有するグリセロールデヒドロ
ゲナーゼ 次の反応を触媒する。 グリセロール＋電子受容体→ジヒドロキシアセトン（グ
リセルアルデヒド）＋還元型電子受容体 至適作用ｐＨ：ｐＨ８〜９ ｐＨ安定性：ｐＨ７〜１１ 至適作用温度：２０〜２５℃ 熱安定性：ｐＨ７．０、１０分の反応で３０℃以下で
安定である。 分子量：ゲル濾過法およびＳＤＳアクリルアミドゲル
電気泳動法で７万の分子量を示す。 補欠分子属としてピロロキノリノキノンを含む。 可溶化および安定化に界面活性化剤を必要としない。 - 【請求項２】 シュードモナス属に属し、請求第１項記
載の新規なグリセロールデヒドロゲナーゼの生産能を有
する菌株を栄養培地にて培養し、該培養物から新規なグ
リセロールデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とす
る新規なグリセロールデヒドロゲナーゼの製造法。 - 【請求項３】 試料中のグリセロールを分析する系にお
いて、請求第１項記載の酵素を用いるグリセロールの定
量法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4073568A JP3041840B2 (ja) | 1992-02-24 | 1992-02-24 | 新規なグリセロールデヒドロゲナーゼ、その製法及びその用途 |
| US08/019,676 US5346819A (en) | 1992-02-24 | 1993-02-19 | Glycerol dehydrogenase, process for its production and its use |
| US08/225,328 US5614374A (en) | 1992-02-24 | 1994-04-08 | Glycerol dehydrogenase, process for its production and its use |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4073568A JP3041840B2 (ja) | 1992-02-24 | 1992-02-24 | 新規なグリセロールデヒドロゲナーゼ、その製法及びその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05227954A true JPH05227954A (ja) | 1993-09-07 |
| JP3041840B2 JP3041840B2 (ja) | 2000-05-15 |
Family
ID=13522010
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4073568A Expired - Fee Related JP3041840B2 (ja) | 1992-02-24 | 1992-02-24 | 新規なグリセロールデヒドロゲナーゼ、その製法及びその用途 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5346819A (ja) |
| JP (1) | JP3041840B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006275818A (ja) * | 2005-03-29 | 2006-10-12 | Cci Corp | バイオセンサ |
| JP2006275819A (ja) * | 2005-03-29 | 2006-10-12 | Cci Corp | バイオセンサ |
| JP2007259814A (ja) * | 2006-03-29 | 2007-10-11 | Cci Corp | 安定なポリオール脱水素酵素組成物 |
| JP2010233531A (ja) * | 2009-03-31 | 2010-10-21 | Cci Corp | ポリオール脱水素酵素組成物 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3041840B2 (ja) * | 1992-02-24 | 2000-05-15 | 東洋紡績株式会社 | 新規なグリセロールデヒドロゲナーゼ、その製法及びその用途 |
| AUPQ275799A0 (en) * | 1999-09-10 | 1999-10-07 | Luminis Pty Limited | Recombinant bacterium expressing an oligosaccharide receptor mimic |
| EP1873516B1 (en) | 2005-03-29 | 2009-10-28 | Cci Corporation | Biosensor |
| JP5311613B2 (ja) * | 2007-02-13 | 2013-10-09 | シーシーアイ株式会社 | ポリオール脱水素酵素の製造方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4259440A (en) * | 1979-05-21 | 1981-03-31 | Miles Laboratories, Inc. | Hydrolysis and assay of triglycerides |
| DE3311027A1 (de) * | 1983-03-25 | 1984-09-27 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Nad(p)-unabhaengige glycerindehydrogenase, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zur bestimmung von glycerin und triglyceriden |
| JPS59196100A (ja) * | 1983-04-21 | 1984-11-07 | Amano Pharmaceut Co Ltd | グリセロ−ルの測定法および測定組成物 |
| JPS60251895A (ja) * | 1984-05-29 | 1985-12-12 | Ube Ind Ltd | ピロロキノリンキノンの製造方法 |
| JP3041840B2 (ja) * | 1992-02-24 | 2000-05-15 | 東洋紡績株式会社 | 新規なグリセロールデヒドロゲナーゼ、その製法及びその用途 |
-
1992
- 1992-02-24 JP JP4073568A patent/JP3041840B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-02-19 US US08/019,676 patent/US5346819A/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-04-08 US US08/225,328 patent/US5614374A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006275818A (ja) * | 2005-03-29 | 2006-10-12 | Cci Corp | バイオセンサ |
| JP2006275819A (ja) * | 2005-03-29 | 2006-10-12 | Cci Corp | バイオセンサ |
| JP2007259814A (ja) * | 2006-03-29 | 2007-10-11 | Cci Corp | 安定なポリオール脱水素酵素組成物 |
| JP2010233531A (ja) * | 2009-03-31 | 2010-10-21 | Cci Corp | ポリオール脱水素酵素組成物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5614374A (en) | 1997-03-25 |
| JP3041840B2 (ja) | 2000-05-15 |
| US5346819A (en) | 1994-09-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4987076A (en) | Uricase and a method for the preparation thereof | |
| JP3041840B2 (ja) | 新規なグリセロールデヒドロゲナーゼ、その製法及びその用途 | |
| IE51745B1 (en) | Cholesterol esterase achromobacter delicatulus,and the hydrolysis of cholesterol esters therewith | |
| JPS61268178A (ja) | フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ | |
| JP3216739B2 (ja) | ソルビトールオキシダーゼ、その製法及びその用途 | |
| JPH0284178A (ja) | Ｎ−アセチルヘキソサミンデヒドロゲナーゼ、その製造法及び該酵素を用いるｎ−アセチルグルコサミン又はｎ−アセチルガラクトサミンの定量法及びその定量用キット | |
| JPS61128887A (ja) | ペルオキシダ−ゼの製造法 | |
| US4965194A (en) | Pyruvate oxidase and an analytical method using the same | |
| JPH0249720B2 (ja) | ||
| JP3114838B2 (ja) | 新規なクレアチンアミジノハイドロラーゼおよびその用途 | |
| US4496655A (en) | Process for the production of tyramine oxidase | |
| JP3642344B2 (ja) | クレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法 | |
| JP3102543B2 (ja) | グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびその製造法 | |
| JPS5889183A (ja) | Ｎａｄ（ｐ）依存性コレステロ−ル脱水素酵素の製造法 | |
| CA1163217A (en) | Process for obtaining glycerol dehydrogenase | |
| JPH0638756B2 (ja) | ピルビン酸オキシダーゼを用いるピルビン酸の測定法およびその試薬 | |
| JPH09247A (ja) | Ｄ−乳酸脱水素酵素およびその製造法 | |
| JP3778297B2 (ja) | 新規なアルカリフォスファターゼおよびその製造法 | |
| JPH10179153A (ja) | ３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよびその製法 | |
| JPH0568543A (ja) | アルコールデヒドロゲナーゼ及びその製法 | |
| JPH0833482A (ja) | 新規なソルビトールデヒドロゲナーゼ、その製造方法並びに該酵素を用いたソルビトールの定量のための試薬及び方法 | |
| JPH07322898A (ja) | アンモニア測定用試薬組成物 | |
| JPS584551B2 (ja) | コリン酸化酵素の製造法 | |
| JPH043947B2 (ja) | ||
| JPH06209770A (ja) | 新規アスコルビン酸オキシダーゼ、その製法およびその用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080310 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090310 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090310 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100310 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100310 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110310 Year of fee payment: 11 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |