JPH0218835B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、好気性微生物によつて細胞内で生成
された酵素を効率的に回収する方法を目的とす
る。より詳しくは、本発明は、好気性土壌微生物
からの回収の間に、細胞内クレアチニンイミノヒ
ドロラーゼの優れた収量と増大された安定性を得
るために、特に有用な方法を示すものである。 時にはクレアチニンデスイミダーゼと呼ばれる
クレアチニンイミノヒドロラーゼは、クレアチニ
ンの加水分解に特定的に触媒作用を及ぼしてアン
モニアにする酵素である。好気性の土壌微生物
ATCC＃31546は、クレアチニンイミノヒドロラ
ーゼの新しい微生物源を代表する。この源から得
られるクレアチニンイミノヒドロラーゼは特に有
用である。なぜなら、それは実質上ウレアーゼ活
性を有していないが、ウレアーゼは、クレアチニ
ンおよび尿素の両方を含有する水性液体に行なわ
れるクレアチニンの検定に対して非常に望ましく
ない干渉物であるからである。そのため、アンモ
ニア検出器とともにウレアーゼを含まないクレア
チニンイミノヒドロラーゼは、水性液体、例え
ば、血清中に含まれるクレアチニンの決定のため
の定量分析組成物を提供することができる。 このウレアーゼを含まないクレアチニンイミノ
ヒドロラーゼは、微生物によつて細胞内で生成さ
れ、そして微生物の細胞の成長のあとでそれから
抽出されねばならない。 細胞内で生成されたクレアチニンイミノヒドロ
ラーゼ酵素の回収は、公知の技術で実施される
が、この技術では酵素を解放するために細胞は破
壊され、所望ならば続いて酵素が部分的に精製さ
れる。周知の細胞破壊技術には、超音波処理およ
び摩砕が含まれる。部分的な精製は、遠心分離ま
たはろ過のような方法で所望の酵素を微生物細胞
の残屑から分離し、続いて有機溶媒による分別沈
でんによつて所望の酵素を他の微生物細胞蛋白質
から分離することによつて行なわれることができ
る。 破壊および部分精製工程には、細胞破壊および
微生物細胞残屑からの所望の細胞内酵素の分離、
それに続く有機溶媒による分別沈でん、を含む
個々の工程段階が連続して用いられる。例えば、
この個々の工程段階の連続は、米国特許第
4087329号および第4134793号に記載されている
が、そこにはクレアチニンデスイミダーゼ（クレ
アチニンイミノヒドロラーゼの別名）の、種々の
好気性微生物からの回収が記載されている。しか
しながら、この連続的な工程によれば、微生物細
胞から酵素の一部のみが抽出される。その上、微
生物の細胞残屑から所望の酵素を分離する個々の
工程段階は、大規模な生成体制で実施されると
き、大規模な遠心分離またはろ過装置と時間を必
要とする。 さらに、先に述べた連続工程によつて微生物か
ら回収されたとき、好気性土壌微生物によつて細
胞内で生成されたクレアチニンイミノヒドロラー
ゼは、酵素の不安定性の問題を示す。すなわち、
微生物の細胞から回収する間に、酵素はしばしば
活性の著しい減少を示す。この同じ酵素の不安定
性の問題は、他の細胞内酵素によつても示され
る。 そのため、好気性微生物によつて細胞内で生成
される酵素を回収するためにより有効な方法は、
明らかな当分野に有用な貢献となるであろう。そ
のような方法は、もしそれが工程中に酵素を安定
させることもできそして所望の酵素の収量を改良
することもできるならば、上に引用したウレアー
ゼを含まないクレアチニンイミノヒドロラーゼの
ような細胞内酵素について使用するのに特に望ま
しいであろう。 米国特許第3597323号には、破壊された微生物
を含有する混合物からＬ−アスパラギナーゼを精
製する方法が記載されているが、この方法は、こ
の混合物に十分な量の水と混和し得る有機溶媒を
加えて、Ｌ−アスパラギナーゼを沈でんさせるこ
となく、微生物の細胞膜および混合物中に存在す
る他の望ましくない成分を沈でんさせることによ
つて、Ｌ−アスパラギナーゼを得るものである。
その後沈でんした残渣から上澄を分離し、そして
さらに多くの水と混和し得る有機溶媒を加えるこ
とによつてＬ−アスパラギナーゼを上澄から沈で
んさせる。Ｌ−アスパラギナーゼを含有する沈で
んを上澄から分離し、適当な緩衝剤中に懸濁さ
せ、そしてクロマトグラフイーによつて、Ｌ−ア
スパラギナーゼとともに沈でんする他の成分から
分離する。 本発明は増大した収率および回収の間の酵素の
安定化を提供する。 本発明は、好気性微生物の細胞によつて生成さ
れるクレアチニンイミノヒドロラーゼの回収方法
を目的とするものであつて、段階： (a) クレアチニンイミノヒドロラーゼを含有する
細胞の水性懸濁液を形成する； (b) 懸濁液中の細胞を破壊して、クレアチニンイ
ミノヒドロラーゼを懸濁液中に解放する；およ
び (c) 段階(b)の前、段階(b)中、または段階(b)の後
に、破壊された細胞および他の細胞成分の除去
に先だつて、懸濁液に水と混和し得る有機溶媒
を導入して溶媒と懸濁液との混合物を形成さ
せ、それから他の微生物細胞の蛋白質のような
望ましくない細胞成分が沈でんする間、その混
合物がその液相中にクレアチニンイミノヒドロ
ラーゼを効果的に保持するようにする、 によつて特徴づけられる。 本発明の回収方法の特に好適な具体化には、付
付的段階： (d) クレアチニンイミノヒドロラーゼを含有する
段階(c)の液相を、例えば、遠心分離またはろ過
によつて、沈でんおよび破壊された細胞から分
離する；および (e) 段階(d)で分離された液相中に付加的な水と混
和し得る有機溶媒を導入して、そこからクレア
チニンイミノヒドロラーゼを沈でんさせる、 が含まれる。得られる酵素を含有する沈でんをそ
の後分離し、水性緩衝剤と混合して、実質上有機
溶媒を含まないより有用な水性組成物中に酵素を
置くことができ、および／またはもし必要がある
かまたは所望ならば、さらに精製することができ
る。有機溶媒を含まない水性酵素組成物は直接ま
たは凍結乾燥した粉末として有用である。 好適な具体化においては、本回収方法の段階(a)
および(b)は、細胞内で生成された酵素を含有する
凍結した細胞を、物理的にかくはんされている水
性液体の存在下で溶解させ、それによつて、溶解
した細胞を水性液体中に懸濁させ、そして酵素を
細胞から懸濁液中に解放することによつて実行さ
れる。物理的かくはんは、得られる懸濁液を流体
状態に保つて、粘性の高い懸濁液の形成を避ける
に十分なものではなくてはならない。 本発明は、ATCC＃31546のような好気性土壌
微生物からの回収の間、細胞内クレアチニンイミ
ノヒドロラーゼの安定させるのに特に有用である
ことがわかつた。その上、本発明の方法によつて
ATCC＃31546から回収されるクレアチニンイミ
ノヒドロラーゼの収率は、上述した公知の個々の
工程段階の連続によつて回収される収率よりも少
なくとも25％、好適には100％以上大きい。 本発明の回収方法は、重要な特徴と利点を提供
する。例えば、一般に行なわれている回収工程
は、酵素の精製を実施するために水と混和し得る
有機溶媒を導入するに先だつて、（他の不溶性細
胞残屑と同様に）破壊された微生物細胞から所望
の細胞内酵素を分離するために、遠心分離段階の
ような個々の分離段階を必要とする。しかしなが
ら、本発明の方法では、クレアチニンイミノヒド
ロラーゼを含有する水性懸濁液への所望の水と混
和できる有機溶媒の導入は、破壊された微生物細
胞の除去に先だつて実施され、それによつて、こ
れらの物質を除去するための分離段階が除かれ
る。このように、本発明の方法は、完全な分離操
作を効果的に除き、そしてそれによつて酵素生成
の時間および装置を減少させる。 本発明の方法のもう一つの利点は、達成され得
る細胞内酵素の改良された収率である。この改良
された収率は、微生物から解放される酵素の割合
の増大および回収工程の間におこつてくる活性の
減損に対する酵素の安定化、の結果として生ずる
ものである。先に述べた結果を得させる特定の機
構（ｓ）は完全には理解されていない。しかしな
がら、その機構（ｓ）が何であろうと、これらの
結果は、段階(b)の間に生成される、破壊された微
生物細胞および他の細胞成分、の除去に先だつ
て、本発明の方法の段階(c)において、水と混和し
得る有機溶媒を導入することによつて、引き起こ
される。 この中でATCC＃31546として同定された微生
物は、米国メリーランド州20852、ロツクビルの
American Type Culture Collectionへのその寄
託に基づいてこの名称を受けた。この微生物は暫
定的にフラボバクテリウム属に指定され、そして
種名フイラメントサム（filamentosum）を与え
られた。 一度、クレアチニンイミノヒドロラーゼを含む
細胞が適当な栄養素媒体中で生成されると、それ
らは、酵素の回収を始めることができるように栄
養素媒体から分離される。これは、微生物細胞を
含む栄養素媒体を遠心分離するかまたはろ過し、
それによつて、それらが成長した媒体からそれら
を分離しそして集めることによつて、実施される
ことができる。集めた細胞からの酵素の回収はた
だちに始めることができ、あるいは、集められた
細胞は、酵素の回収方法が実行される時まで低温
条件下で都合よく貯蔵されることもできる。例え
ば、好気性土壌微生物ATCC＃31546からのウレ
アーゼを含まないクレアチニンイミノヒドロラー
ゼの抽出に関する、本発明の方法の好適な具体化
の場合には、所望の酵素を含有するこの微生物の
細胞は凍結され、それによつて所望の酵素は、実
質的な活性の減損なしに、凍結した微生物細胞内
に本質的に保持される。 一度、酵素を含有する微生物細胞が集められる
と、本発明の回収方法を始めることができる。本
発明の方法は、細胞が水性液体中に懸濁している
間に、細胞を破壊して、細胞から懸濁液中に酵素
を解放することによつて、段階(a)および(b)で始め
られる。これらの段階が実施される条件は、含ま
れる微生物細胞によつて広く変化するであろう。
これらの段階に対して、酵素およびその活性水準
を逆に妨害することのない、PHおよび温度条件を
選ばなくてはならない。例えば、好適なATCC
＃31546の微生物細胞の場合には、本発明の方法
の段階(a)および(b)において、４ないし37℃、好適
には20ないし25℃の範囲内の温度、および5.0な
いし10、好適には７ないし7.5の範囲内のPHで、
この細胞は懸濁され、そして所望のウレアーゼを
含まないクレアチニンイミノヒドロラーゼは解放
される。しかしながら、より高いかあるいはより
低いPHおよび温度値によつて逆の影響を及ぼされ
ない微生物および酵素については、先述の範囲外
の条件を進んで使用することができる。 その中で細胞が破壊される水性懸濁液中の微生
物細胞の量は、一部分、特定の細胞およびそれか
ら得られる酵素組成物のみならず、使用される特
定の細胞破壊方法によつてもまた変化し得る。代
表的な細胞破壊方法の一部を挙げると、水性媒質
中に懸濁させた細胞の連続流れ超音波処理のよう
な、超音波処理、および微生物細胞の水性懸濁液
をDYNOMILL（スイス国、バーゼル、the
Willy A.Bachofen Mashinen fabrik Company
から入手できる）中で摩砕することによるよう
な、摩砕、が含まれる。典型的には、その中で細
胞の破壊が行なわれる水性懸濁液の固体含量は、
水性懸濁液中に含まれる微生物細胞の湿潤重量を
基にして、５ないし40wt％の範囲内である。 細胞、特にウレアーゼを含まないクレアチニン
イミノヒドロラーゼを含有する細胞を、懸濁さ
せ、そして破壊するために特に行適な技術は、懸
濁液に、はげしくかくはんするような物理的なか
くはんを行ないながら、凍結させた微生物の細胞
を室温条件下（ほぼ22℃）で水性液体中に懸濁さ
せることによつて達成される。こうして、所望の
ウレアーゼを含まないクレアチニンイミノヒドロ
ラーゼ酵素は効果的に水性懸濁液中に解放され、
そして懸濁液は流体の状態に保たれる。これは、
懸濁液が高い粘性を帯びて、その結果酵素の解放
がほとんどまたは全くおこらなくなるのを妨げ
る。先に述べたような、物理的なかくはんと組み
合わせた凍結細胞の溶解技術によつて、細胞の破
壊と酵素の解放が実施されるとき、効果的な水準
の物理的かくはんは、例えば直径56cmの200リツ
トルの槽中で、400rpmで回転する9.4cmのプロペ
ラを用いることによつて都合よく達成されること
ができる。 かくはん時間と同様に、特定の水性懸濁液をか
くはんする特定の方法は、懸濁液の体積、その中
の細胞の量と型、およびかくはんを実施する装置
によつて広く変化するであろう。これらのパラメ
ーターは当分野で普通の熟練を有する者によつて
容易に決定される。好適な好気性土壌微生物であ
るATCC＃31546の場合には、上述の400rpmで動
く200リツトルの槽中での細胞破壊は、かくはん
時間20時間で効果的に実施される。 本方法の段階(c)は、水性細胞懸濁液中に水と混
和し得る有機溶媒を導入することによつて実施さ
れる。段階(c)は、段階(b)の前、段階(b)の間または
段階(c)の後に始められる。この有機溶媒の導入
は、段階(c)において、破壊された微生物細胞およ
び段階(b)の間に水性懸濁液中に解放された他の細
胞成分を前もつて分離することなく始められる。
選択される特定の有機溶媒は、他の微生物の細胞
蛋白質のような望ましくない細胞成分の実質的な
量を沈でんさせ、一方、クレアチニンイミノヒド
ロラーゼは水−溶媒混合物の液相（上澄）中に溶
解あるいは懸濁させたままにしておくために効果
的な、水−溶媒混合物を形成する、水と混和し得
る溶媒でなくてはならない。そのため段階(c)に対
して、選択される温度条件、特定の水と混和し得
る溶媒、および溶媒−水割合は、クレアチニンイ
ミノヒドロラーゼの溶解度特性に依存すると同様
に、特定の微生物細胞の廃棄物成分の溶解度特性
に大きく依存するであろう。好気性土壌微生物
ATCC＃31546から得られる好適なウレアーゼを
含まないクレアチニンイミノヒドロラーゼの場合
は、有用な水と混和し得る有機溶媒の一部とし
て、プロパノール、例えばｎ−プロパノールおよ
びイソプロパノール、ｔ−ブタノール、エタノー
ル、およびアセトンがあげられるが、ｎ−プロパ
ノールが好適である。 本方法の段階(c)の最後に、クレアチニンイミノ
ヒドロラーゼは、その中でクレアチニンイミノヒ
ドロラーゼを生成した微生物細胞から除かれ、そ
して有機溶媒−水の混合物の液相中に分離される
のであるが、この液相は破壊された微生物細胞お
よび他の細胞成分の大部分を含んでいない。その
結果、有機溶媒−水混合物中で、酵素を構成する
微生物細胞の蛋白質と同等またはそれ以上に可溶
性の他の微生物細胞の蛋白質および細胞成分と会
合した精製の形のままであるけれども、酵素は回
収された。このため、さらに酵素を精製すること
がしばしば望ましい。 さらに、ほとんどの酵素が水性の環境で使用さ
れるので、酵素を、有機溶媒を含まない形にする
かまたは有機溶媒を含まない媒質中に置くのが非
常に望ましい。従つて、任意にではあるけれど
も、酵素を、有機溶媒から容易に分離し得るより
精製された形に置く本発明の方法の、段階(d)およ
び(e)は、特に有用であると考えられる。 段階(d)および(e)において、クレアチニンイミノ
ヒドロラーゼを含有する上澄は、破壊された細胞
および望ましくない微生物細胞蛋白質を含む沈で
んから分離される。それから、付加的な水と混和
し得る有機溶媒を、酵素を含有する上澄に導入し
て、それから酵素を沈でんさせる段階(c)、(d)およ
び(e)の結合した効果は、有機溶媒分別沈でん工程
に等しく、段階(e)で加えられた付加的な有機溶媒
は、水−有機溶媒混合物中に、酵素の沈でんをひ
きおこすのに十分な有機溶媒分画を供給する。 段階(d)においては、先の段階(c)で得られた酵素
を含む上澄の分離は、遠心分離またはろ過のよう
な、公知の分離工程によつて都合よく実施され
る。ここで、ろ過は、例えば回転真空ろ過器また
は圧濾器、を使用して実施される。 段階(e)で、所望の細胞内酵素を沈でんさせるた
めに、先の段階(d)から得られた分離された液相
（すなわち、段階(d)の上澄）に導入される水と混
和し得る有機溶媒は、必らずというわけではない
が、段階(c)において酵素を含む水性懸濁液中に導
入された水と混和し得る有機溶媒と同じものであ
つてもよい。段階(e)で使用される特定の水と混和
し得る有機溶媒の選択および量は、特有の溶解度
特性および、溶媒が段階(d)の上澄に導入される条
件（例えば、温度条件）に、大きく依存する。段
階(c)、(d)および(e)を組み合わせて用いて、本方法
を実施するとき、段階(c)における水と混和し得る
有機溶媒の選択は、段階(c)におけると同様に、段
階(e)において溶媒が果すべき機能を考慮しなくて
はならない。本方法の好適な具体化においては、
段階(c)および(e)で使用される水と混和し得る有機
溶媒は、同一であつて、段階(c)で有機溶媒の第一
量を添加すると望ましくない汚染物の大部分が効
果的に沈でんし、一方所望の細胞内酵素蛋白質は
液相の上澄中に保持されるように選択される。そ
の後、段階(e)で、この上澄中に含まれる酵素は、
この上澄に溶媒の第二量を導入することによつ
て、それから沈でんさせられる。段階(e)で有用な
有機溶媒には、先述の性能特性を示すすべての有
機溶媒が含まれる。好気性土壌微生物ATCC
＃31546から得られる好適な、ウレアーゼを含ま
ないクレアチニンイミノヒドロラーゼの場合に
は、有用な水と混和し得る有機溶媒の一部とし
て、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｔ−
ブタノール、およびアセトンのような、先に段階
(c)で使用するために述べたと同じ溶媒の大多数の
ものが包含されるが、メタノールおよびエタノー
ルのようなその他のものは包含されない。他の水
と混和し得る有機溶媒もまた、好適な微生物に対
して有用であり、そしてもちろん、さらに他の有
機溶媒はATCC＃31546以外の微生物に対して有
用である。 本方法の段階(c)、(d)および(e)が実施される、温
度およびPH条件は変化することができる。段階
(c)、(d)および(e)は、−10ないし37℃、好適には２
ないし５℃の範囲内の温度および5.0ないし10.0、
好適には6.0ないし8.0の範囲のPHで実施するのが
しばしば望ましい。温度制御は、例えば、グリコ
ール冷却液が循環しているジヤケツト付容器中
で、段階(c)、(d)および(e)を実施することによつて
容易に達成される。もちろん、より高い温度また
は、より低いPHあるいはより高いPHによつて逆の
影響を及ぼされない好気性微生物およびそれから
回収される細胞内酵素に対しては、先に述べた水
準より高い温度またはそれより高いかまたは低い
PHを使用することができる。 本方法の段階(e)でより精製された形の所望の細
胞内酵素を沈でんとして得たとき、必要ならば、
この酵素を含む沈でんを凍結乾燥させて粉末の形
の酵素とすることができる。しかしながら、好適
には、酵素活性を保持するのに効果的なPH水準に
緩衝した水性溶液中に沈でんを混合するような方
法で、酵素をさらに精製する。これによつて、ま
だ酵素と会合しているであろう、望ましくない微
生物蛋白質のようなあらゆる望ましくない水に不
溶性の汚染の分離が行なわれ、酵素は緩衝溶液中
に溶解しているであろう。そのため、段階(c)に続
いて、酵素を含有する沈でんは、ろ過または遠心
分離のような方法によつて液相から分離されるこ
とができ、そして水性緩衝溶液中に混合されるこ
とができる。クレアチニンイミノヒドロラーゼは
水性緩衝液に溶解し、一方水に不溶性の汚染物は
沈でんとして残る。その結果生ずる酵素を含む上
澄をとつておき、沈でんを捨てる。しかしながら
所望ならば、沈でんを集めて追加の水性懸濁液で
洗浄して、まだそれと会合しているそれ以上の可
溶性酵素をすべて除去することができる。その
後、水性緩衝溶液からの酵素を含む上澄を一緒に
して、いつでも使用できる最終的な水性酵素組成
物を形成させる。もちろん、所望ならば、種々の
クロマトグラフイー工程のような、それ以上の精
製工程を使用することができる。それから、最終
的な水性酵素組成物を、直接使用して、濃縮する
か、あるいは凍結乾燥させて、粉末の形の酵素を
得る。 次の非限定的実施例は、本発明をさらに説明す
るために示される。 この実施例中では、次の原料および工程が使用
された： 原料： 還元された形のニコチンアミドアデニン二核酸
化合物リン酸塩（NADPH）；Ｌ−グルタミンデ
ヒドロゲナーゼ（GDH）；トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン（tris）；Ｎ，Ｎ−ビス（２
−ヒドロキシエチル）グリシン（bicine）；卵白
リゾチーム、牛の膵臓からのリボ核酸酵素および
デオキシリボ核酸酵素はすべてミズーリ州、セン
トルイス市のSigma Chemical Co.によつて供給
された。他の有機化学薬品はニユーヨーク州、ロ
チエスター市のEastman Kodak Company，
Eastman Organic Chemicalsから得られた。イ
オン交換した水がずつと使用された。 工程： １ 発酵検定のためのリゾチームの使用 下の実施例中で言及された微生物細胞のリゾ
チーム処理によつて、細胞の破損と、それに続
く酵素の解放がおこつた。リゾチーム処理は次
の方法で実施された： 取り入れた好気性土壌微生物ATCC＃31546
細胞の試料を、150リツトルの発酵器中の110リ
ツトルの水性栄養媒質からとつた。発酵器中の
水性栄養素媒質の組成は、１リツトルあたりの
基礎原料に関して次の通りである： フマール酸 10ｇ クレアチニン ５ｇ K₂HPO₄ ５ｇ 酵母エキス １ｇ ポリグリコールＰ−2000※ 0.1ｇ MgSO₄・7H₂O 0.12ｇ CaCl₂・2H₂O 0.00076ｇ FeSO₄・7H₂O 0.028ｇ MnSO₄・H₂O 0.017ｇ NaCl 0.006ｇ NaMoO₄・2H₂O 0.001ｇ ZnSO₄・7H₂O 0.0006ｇ PHを6.7に調整するに十分なKOH ※（MI州、ミツドランド市Dow Chemical
Co.によつて販売されているポリグリコー
ル泡止剤に対する商品名） 細胞懸濁液は、0.05Matris−緩衝剤、PH8.5
および10^-3Mの（エチレンジニトリロ）−テト
ラ酢酸、二カリウム塩（K₂EDTA）中で、１
より小さい660nmでの光学濃度まで希釈され
た。この懸濁液に、0.05Mのtris−緩衝液1.8ml
と0.2mlのリダチーム溶液を加えた。リゾチー
ム溶液はイオン交換した水１mlあたり、リゾチ
ーム5.0mg、牛の膵臓のデオキシリボン核酸酵
素１mg、および牛の膵臓のリボ核酸酵素１mg、
を含有した。この懸濁液を水浴中37℃で20分間
振とうさせた。冷却遠心機中15000rpmで15分
間遠心分離することによつて、細胞残屑を除去
し、そして下の工程２に記載した方法によつ
て、上澄の酵素活性を決定した。収獲された
ATCC＃31546細胞の全活性は、発酵器の全内
容物に対して、この小規模検定をもとにした値
を投入することによつて計算された。 ２ クレアチニンイミノヒドロラーゼの検定 下の実施例に記載されたクレアチニンイミノ
ヒドロラーゼの活性を決定するために、Ｌ−グ
ルタミンデヒドロゲナーゼ、“GDH”、検定法
が使用された。このGDH検定法においては、
クレアチニンイミノヒドロラーゼ酵素組成物の
活性をあらわす、クレアチニンからのアンモニ
アの生成が、次のようなGDH−触媒反応中に
NADPH（還元された形のニコチンアミド−ア
デニン二核酸化合物リン酸塩）を使用すること
によつて測定された：クレアチニンは、未知の
クレアチニンイミノヒドロラーゼ酵素試料の酵
素としての活性によつて触媒的に加水分解され
てアンモニアとなり、その結果生ずるアンモニ
アは、GDHの存在でα−ケトグルタール酸と
反応してグルタミン酸を生成する。GDHによ
つて触媒作用を及ぼされる後者の反応は、付随
的にNADPHをNADPに変化させ、340nmで
のNADPH吸収ピークの消失が、検定を監視
するための分光器によつて検出できる方法を提
供する。すなわち、NADPHの消失割合がグ
ルタミン酸生成の割合の尺度であり、このグル
タミン酸の生成割合が、今度は、アンモニア生
成の割合の尺度である。GDH検定方法に使用
された反応混合物は、PH7.5を有する0.1Mの
Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−グリ
シン−KOH緩衝溶液の全容積１ミリリツトル
中に、0.4mgの（エチレンジニトリロ）テトラ
酢酸、二ナトリウム塩（Na₂EDTA）；1.6mgの
α−ケトグルタール酸；0.24mgのNADPH；15
単位のDGH（アンモニアを含まない）；および
4.52mgのクレアチニンを含有していた。Ｌ−グ
ルタミンデヒドロゲナーゼの１単位は、PH7.6
および37℃で毎分１マイクロモルのα−ケトグ
ルタル酸塩のグルタミン酸塩への還元を触媒す
る酵素の量として定義される。反応は、上記反
応混合物を37℃で平衡させた後、これに少量の
所望のクレアチニンイミノヒドロラーゼ酵素組
成物の試料（約２〜10ミリ単位）を加えること
によつて始められた。クレアチニンイミノヒド
ロラーゼの活性は、ベツクマン25型分光光度計
で340nmでのNADPH消失割合（340nmでの
NADPHのモル吸光係数は6.22×10³である）
を測定することによつて計算された。酵素活性
の１単位は、上記したGDH検出反応条件下で
毎分１マイクロモルのクレアチニンを１マイク
ロモルのアンモニアに変える反応を触媒するの
に必要な酵素の量として定義される。 ３ かくはん条件 400rpmで回転する9.4cmのプロペラをもつ
た、直径56cmの200リツトルの槽を使用して、
下の実施例に記載した細胞懸濁液をかくはんし
た。 実施例 １ 細胞内酵素の回収 上の工程１に記載されたような発酵媒質から遠
心分離することによつて、好気性土壌微生物
ATCC＃31546の細胞を集め、−15℃で４ないし22
日間凍結させた。凍結した細胞を、PH7.5の
0.1Mtrisリン酸塩緩衝剤70リツトルを含む200リ
ツトルの槽に入れて、室温で20時間はげしくかく
はんした。槽中の細胞懸濁液をすばやく４℃まで
冷却し、４℃で77リツトルのｎ−プロパノールを
加えた。激しく混合している懸濁液に、30リツト
ル／時の割合でアルコールを注入した。アルコー
ルの添加が完了してから、懸濁液は、15リツト
ル／時の割合で、ポンプを使つて８リツトルの容
量の固体を保持する遠心機を通した。所望の酵素
を含む上澄を４℃で貯蔵し、ペレツトを捨てた。
この上澄に対し、４℃で30リツトル／時の割合で
ｎ−プロパノールの第２の添加（38.5リツトル）
を行ない、この添加の間中はげしく混合し続け
た。完了後、水−プロパノール懸濁液は、30リツ
トル／時の割合で、ポンプを使つて２リツトル容
量の固体を保有する遠心機を通した。上澄を捨て
た。クレアチニンイミノヒドロラーゼを含むペレ
ツトをPH7.5の0.01Mtrisリン酸塩緩衝液3.5リツト
ル中に再懸濁させ、４℃で一夜かくはんした。懸
濁液中の固体を２リツトルの遠心機で分離し、上
澄とペレツトの両方を集めた。上澄は、所望の酵
素の大部分を含有していた。ペレツトは、前のよ
うにtrisリン酸塩緩衝液に再懸濁させ、再び遠心
分離を実施した。酵素をいくらか含有している第
２の上澄を第１の上澄と合わせ、一緒にした上澄
を凍結乾燥機上で48時間凍結乾燥させた。自由流
動性で、クリーム色の、酵素を含有する粉末、
126ｇを回収した。 実施例 ２ 微生物源からのクレアチニンイミノヒドロラー
ゼの解放 はげしくかくはんすることによつて、好気性土
壌微生物ATCC＃31546からクレアチニンイミノ
ヒドロラーゼを解放した。酵素の解放は、この実
施例に示された細胞懸濁液に直接ｎ−プロパノー
ルを添加することによつてさらに増大された。 Ａ かげしいかくはんによる酵素の解放 凍結させた細胞を溶解させて、細胞の湿潤重
量１Kgあたり10リツトルの0.1Mtrisリン酸塩緩
衝液（PH7.5）に懸濁させた。（上の工程１に記
載された発酵検定は、凍結される前のこれらの
細胞の試料について行なわれた）それから工程
３に記載したように、懸濁液を22℃で20時間は
げしくかくはんした。部分標本を懸濁液から除
き、遠心分離して、工程２に記載したように、
上澄の酵素活性を測定した。第表（第２欄）
に示したように、発酵検定に基づいて高いパー
センテージの酵素が、はげしくかくはんによつ
て解放された。 Ｂ ｎ−プロパノールの添加によつて増大した酵
素の解放 上のＡで残留する細胞懸濁液に、等体積のｎ
−プロパノールを直接加えた。50％プロパノー
ルの上澄を遠心分離によつて分離した。上澄の
酵素活性は、上の工程２に記載されたように決
定された。第表（第３欄）に示したように、
はげしくかくはんし、直接プロパノールを添加
することによつて、はげしくかくはんのみを使
用した場合よりも高いパーセンテージの酵素が
細胞から解放された。この工程を６回くり返し
た。

【表】 ＊ 工程１に従つて行なつた発酵検定の％
＊＊ 第２欄−第１欄
実施例 ３ 増大した全酵素収率 細胞懸濁液へのｎ−プロパノールの直接添加
（本発明の方法）によつて得られた酵素収率を、
細胞残屑を除去するために細胞懸濁液を遠心分離
してからｎ−プロパノールの添加を行なう方法と
比較した。 本発明の方法においては、上の工程１における
発酵媒質からの遠心分離によつて、７KgのATCC
＃31546微生物細胞を集めた。細胞から小さな試
料を抽出し、工程１に記載したように、リゾチー
ム溶液を用いて破壊して、上の工程２に記載した
GDH法によつて酵素の活性を測定した。この水
準は、初期酵素活性（第表の第１項）と等しい
ように計画された。残りの細胞を−15℃で４ない
し22日間凍結させた。その後、凍結した細胞を、
PH7.5の0.1Mtrisリン酸塩緩衝液70リツトルを含
有する200リツトルの槽に入れ、室温で20時間は
げしくかくはんした30mlの試料を除き、遠心分離
し、そして、上の工程２のようにして、上澄の酵
素活性を検定した（第表の第２項）。残りの細
胞懸濁液を、上の実施例１に記載したような本発
明の工程に従つて処理したが、ただしここでは所
望の酵素を含有するペレツトを１容積の水性緩衝
剤に混合して不溶性成分を分離し、この水性緩衝
剤処理を繰り返さなかつた（第表の第３および
４項）。この工程の結果を第表に示す。

【表】 ら得られた再懸濁させたペレ
ツト
第２の制御工程においては、ｎ−プロパノール
は、細胞懸濁液の遠心分離に続いて加えられた。
ATCC＃31546微生物細胞（1.18Kg）は、上の工
程１に記載した組成を有する発酵媒質の第２バツ
チから集めた。細胞の小さな抽出試料を、工程１
のリゾチーム溶液を用いて破壊して、上記工程２
のGDH法によつて酵素活性を測定した（第表
の第１項）。残りの細胞を−15℃で４ないし22日
間凍結させた。凍結した細胞を、PH7.5の
0.1Mtrisリン酸塩緩衝液11.8リツトルを含有する
15リツトルの槽に入れ、４℃で48時間激しくかく
はんした。20mlの試料を除去して遠心分離し、そ
して上澄の酵素活性を、上の工程２に記載したよ
うに検定した（第表の第２項）。残りの細胞懸
濁液は、２リツトルの容量の固体を保持する遠心
機中で、流量15リツトル／時、18000rpmで遠心
分離した。上澄を集めた。４℃で等体積のｎ−プ
ロパノールを、30リツトル／時の割合で、激しく
混合している上澄に注入した。完了後、アルコー
ル懸濁液は、２リツトル容量の固体を保持する遠
心機をポンプを使つて通され、上澄は集められ
た。上澄の酵素活性は、上の工程２に記載したよ
うに測定した（第表の第３項）。激しくかくは
んしている50％アルコール懸濁液に、４℃で5.7
リツトルのｎ−プロパノールを加えた。得られる
懸濁液は、ポンプを使つて60リツトル／時の割合
で、２リツトルの容量の、固体を保持する遠心機
を通し、固体を集めて、上澄を捨てた。ペレツト
を、PH7.5の0.1Mtrisリン酸塩緩衝液中に再懸濁
させ、一夜かくはんした。冷却した遠心機中、
17000rpmで、４℃で２時間遠心分離することに
よつて上澄を集め、上澄の酵素活性を工程２に記
載したように検定した（第表の第４項）。この
制御工程の結果を第表に示す。２つの工程の比
較は、本発明の方法によつて全酵素収率がかなり
増大する（35％対89）ことを示す。

【表】 懸濁させたペレツト
実施例 ４ プロパノールの添加によつて達成された細胞を
含まない上澄中のクレアチニンイミノヒドロラ
ーゼの安定性 凍結された好気性土壌微生物ATCC＃31546の
細胞を溶解させ、PH7.5の0.1Mtrisリン酸塩緩衝
剤10リツトル中に懸濁させた。この懸濁液を４℃
で48時間激しくかくはんし、その後冷却した遠心
機中39000×ｇで、４℃で10分間遠心分離した。
得られる酵素を含む上澄を２つの部分に分け、４
℃に保持した。１つの部分に等体積のｎ−プロパ
ノールを加えた。４、８、12、16および20時間で
の各部分の酵素活性を、上の工程２に記載された
ように決定した。 その結果は、酵素は試験期間中（20時間）、50
％プロパノール溶液中で安定なままであつたが、
一方プロパノールを欠く上澄からは12時間後にそ
の活性の50％が失われ、20時間後にはその活性の
約30％のみが保持されたことを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 段階： (a) クレアチニンイミノヒドロラーゼを含有する
   細胞の水性懸濁液を形成させる； (b) 懸濁液中の細胞を破壊してクレアチニンイミ
   ノヒドロラーゼを懸濁液中に解放する； および (c) 段階(b)の前、段階(b)中、または段階(b)の後、
   破壊された細胞および他の細胞成分の除去に先
   だつて、水と混和し得る有機溶媒を懸濁液に加
   えて溶媒と懸濁液との混合物を形成させて、望
   ましくない細胞成分がそこから沈でんする間、
   この混合物がその液相中に酵素を効果的に保持
   するようにする、 からなることによつて特徴づけられる、好気性微
   生物の細胞によつて生成されるクレアチニンイミ
   ノヒドロラーゼの回収方法。 ２ さらに、段階： (d) 酵素を含有する段階(c)の液相を、沈でんおよ
   び破壊された細胞から分離する；および (e) 上述の段階(d)の分離した液相に、追加量の水
   と混和し得る有機溶媒を導入して、それから所
   望の酵素を沈でんさせる； を含むことによつて特徴づけられる、特許請求の
   範囲第１項に記載の方法。 ３ 酵素を含有する段階(e)の沈でんを水性緩衝組
   成物に溶解させて、段階(e)の沈でん中に含まれる
   望ましくない水に溶解しない成分を除去する、特
   許請求の範囲第２項に記載の方法。 ４ 段階(c)、(d)および(e)を温度範囲−10ないし37
   ℃で実施する、特許請求の範囲第２項または第３
   項のいづれかに記載の方法。 ５ 水と混和し得る有機溶媒が、ｎ−プロパノー
   ル、イソプロパノール、ｔ−ブタノール、または
   アセトンである、特許請求の範囲第１−４項のい
   づれかに記載の方法。 ６ 懸濁液を流体状態に効果的に保持するために
   懸濁液をかくはんしながら、懸濁液中の凍結した
   微生物の細胞を溶解させることによつて、段階(b)
   を実施する、特許請求の範囲第１−５項のいづれ
   かに記載の方法。 ７ 好気性微生物が好気性の土壌微生物である、
   特許請求の範囲第１−６項のいづれかに記載の方
   法。 ８ 好気性土壌微生物がATCC＃31546である、
   特許請求の範囲第７項に記載の方法。 ９ 指定された段階が、５から10までの範囲のPH
   で実施される、特許請求の範囲第１−８項のいづ
   れかに記載の方法。