JP2000516473A - 爆発物の生分解 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヘキサヒドロ-1,3,5-トリニトロ-1,3,5-トリアジン(RDX)からのニトライトの除去を触媒可能な、酵素的に活性な細胞遊離抽出物又は膜画分を提供する。細胞遊離抽出物は、天然由来のロドコッカス−ロドクラウスバクテリア株を培養することにより生成する。11Yと称される株は、NCIMB40820として寄託されている。また、そのようにして生成した酵素的に活性な細胞遊離抽出物を用いるバイオレメディエーション処理する方法を提供する。更に、サンプル中のRDXの存在を検出する方法、及びそのような方法において有用なバイオセンサーを提供する。RDXについての酵素触媒反応において生成するニトライトが、例えば比色的に、検出され、あるいはまた、ホルムアルデヒドなどのRDX分解生成物が検出される。

Description

【発明の詳細な説明】 爆発物の生分解 本発明は、爆発物(explosive)の検出及び生分解の分野に関するものであり、 特に新規なバクテリア単離物(bacterial isolate)及びそれらから誘導された新 規な酵素活性物質(activity)に関するものである。本発明は、更に、ヘキサヒド ロ-1,3,5-トリニトロ-1,3,5-トリアジン（以降、通常用いられる略語RDXとして 言及する）の好気性生分解、及びRDX分解酵素活性物質を利用するRDX検出につい ての方法及び装置に関する。 新規な酵素活性物質により、RDX、ヘテロ環式ニトラミンからニトライトが遊 離されることが示された。 ニトラミンは、自然界に極微量でしか存在しないことが明らかであるが、化学 工業により有意量(significant quantity)生成され、かつ、例えば爆発物及び噴 霧剤として適用される、重要なクラスのエネルギー性材料を含み、RDXは、現在 、米国において最も重要な軍事的爆発物である。RDXの製造、取り扱い及び処分 の全てが、RDXでの環境汚染の原因になり得る。ニトラミンは比較的取り扱いに くいことからその環境破壊について関心が高まり、従って、他の不本意な汚染物 質を生成することなく環境からそのような汚染物を取り除く手段が求められる。 また、現在意図されている分析システムは、大抵、高速液体クロマトグラフィー などの装置のかさ高い及び高性能の(sophisticated)部品に依存し、及び／又は その適用のために特に熟練した検査技師を必要とするので、RDXを検出するより よい方法が急いで求められる。 本発明の目的は、RDXの生分解を触媒可能であり、かつ、RDX汚染物質の環境汚 染に対するバイオレメディエーションシステムにおいて使用可能な酵素を提供す ることである。本発明の更なる目的は、RDX検出システムに有用な酵素を提供す ることである。 従って、本発明の第１の態様によれば、RDXからのニトライトの除去を触媒す る酵素活性物質が提供される。この酵素活性物質は、類似のヘテロ環式ニトラ ミンオクタヒドロ-1,3,5,7-テトラニトロ-1,3,5,7-テトラゾシン(tetrazocine)( HMX)に対してより低い活性を示し、かつ、ニトレートエステルペンタエリスリト ールテトラニトレート(PETN)に対してより低い活性を示す。その活性物質は、膜 関連のものであることが分かり、かつ、５％トリトンで膜から可溶化できる。 酵素活性物質のためのNADPH、NADH、PES又はFADなどのコファクターは要求さ れず、酵素活性物質は、比較的高濃度の変性剤の存在に対して安定性であり、そ の活性物質は、ウレアの存在により高められる。酵素活性物質は、また、熱変性 に対しても比較的安定性である。更に、酵素活性物質の大部分は、ｐＨが氷酢酸 により3.5に低減されたときに溶解性を保持する。 本発明での酵素活性物質は、自然から単離(isolate)した菌株から得られる。 この菌株は、ロドコッカス−ロドクラウスの株（本件明細書において11Yと称す る）である。この新規なバクテリア単離物は、本発明の更なる態様である。新規 な単離物のサンプルは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペ スト条約下にインダストリアル及びマリンバクテリアのUK国内的コレクション、 23St.Machar Drive,Aberdeen,AB2 1RY,Scotlandに1996年８月７日付けで寄託番 号NCIMB40820として寄託されている。 寄託されたバクテリア11Yの更なる特徴を以下に記載する。 グラム染色 ＋ｖｅ 胞子 −ｖｅ 運動性 −ｖｅ 成長 37℃ ＋ｖｅ 41℃ ＋ｖｅ 45℃ −ｖｅ カタラーゼ ＋ｖｅ オキシダーゼ −ｖｅ グルコースOF中の発酵性 変化なし 細胞壁及び脂肪酸の分析により以下の情報が提供された。 ミコール酸が存在する。 細胞壁ジアミノ酸はメソDAPである。 脂肪酸プロフィールにより、存在する主要な酸は直鎖状の飽和又は不飽和酸であ り、10-メチル分枝酸、即ちツベルクロステアリン酸は少量であることが示され る。 酵素活性物質は、窒素源としてのRDX又はNH₄Cl上においてR.ロドクラウスを培 養することにより生じ得る。酵素活性物質を得るために、細胞を従来の方法のい ずれかにおいて崩壊させてもよい。首尾よくは、細胞遊離抽出物を得る。抽出物 を、その後、超遠心分離分画し、ペレットを取り出して活性膜画分を得ることが できる。 あるいはまた、超遠心分離からの上清により、活性的な溶解性タンパクが得ら れる。溶解性タンパクは、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて部分精製す ることができ、0〜2Ｍ塩化ナトリウムから直線状塩グラジエントで溶出できる。 そのタンパクは、単一ピークとして、約350ｍＭ塩化ナトリウムで溶出する。 細胞抽出物として得られた酵素活性物質は、RDX分解酵素活性のために、ジチ オスレイトール(DTT)の存在を必要とする。 寄託された出発微生物自体の代わりに、例えばγ線照射若しくは化学的変異誘 発物質(mutant)の使用により誘導されたそれらの変異体、他の培地などにおいて 誘導されたそれらの変異体、又はほかのバクテリア若しくは人工的に製造された 変種体(variant)とのそれらの接合固体を使用してもよい。酵素活性物質を提供 するそのような微生物の能力は、当業者により容易に測定され得る。 RDXからのニトライトの除去を触媒する、新規な酵素活性物質の能力により、 酵素活性物質がRDXの検出において使用可能となる。従って、本発明の更なる態 様によれば、サンプル中のRDXの存在を検出する方法であって、該サンプルをRDX 分解酵素活性物質に付すこと、及び該サンプルから遊離したニトライトを検出す ることを含む該方法が提供される。首尾よくは、そのような検出は、当該技術分 野において周知の比色法の手段によるものであろう。 RDXからのニトライトの除去により、その後に自然発生的に分解して、ホルム アルデヒド及びアンモニアを含む、より低分子範囲のものを生じる不安定な中間 体が生じ得る。従って、本発明の更なる態様においては、サンプル中のRDX の存在を検出する方法であって、該サンプルをRDX分解酵素活性物質に付すこと 、及び生成されたホルムアルデヒドを検出することを含む該方法が提供される。 そのような検出は、また、当該技術分野において公知の比色法の手段によるもの であってもよい。 更なる態様において、本発明により、また、サンプル中のRDXの検出のための バイオセンサーであって、該サンプルをRDX分解酵素活性物質と接触させるため の手段、及びRDXがサンプル中に存在する場合のRDXの反応（酵素活性物質により 触媒される）の発生を検出するための手段を含む該バイオセンサーが提供される 。反応の発生を検出するための手段は、首尾よくは、比色トランスデューサーを 含み得る。そのようなセンサーは、環境内のRDX汚染物質の汚染程度を分析する ための、効率よく持ち運び可能な検出器のベースとして使用することができる。 本発明の更なる態様は、RDXで汚染された環境のバイオレメディエーション処 理(bioremedial treatment)のための方法の提供であり、その方法は、汚染され た環境に、酵素活性物質を含む多量の細胞抽出物(a quantity of cell extract) を添加する工程、及び該混合物を、材料中に存在するRDXが消耗されるような、 酵素活性物質によるRDXの分解に適切な条件下で保持する工程を含む。 消耗される材料は、例えば、RDXを含む爆発物充填物(explosives charge)の破 壊により生じるRDXを含む材料の廃棄物流、又はRDX汚染土壌若しくはその他の材 料のサンプルであってもよい。前者のケースにおいては、バイオレメディエーシ ョン処理を首尾よく、反応容器内において行うことができ、後者のケースにおい ては、酵素活性物質を該材料に直接導入することができる。その他の適切な、効 果的処理法は、当該技術分野における当業者に明らかであろう。 本発明の更なる態様によれば、上述したようにRDXを分解する酵素活性物質の 能力により、RDX汚染環境のバイオレメディエーション処理の代替法が提供され る。この方法には、名称11Yのロドコッカス−ロドクラウスのバクテリア単離物 のサンプルを環境に加える工程、及び該単離物による環境中に存在するRDXの消 耗を可能にする工程が含まれる。環境は、例えば、RDXを含む材料の廃棄物流、 又はRDX汚染土壌若しくは他の材料のサンプルであってもよい。前 者のケースにおいては、バイオレメディエーション処理を首尾よく、反応容器内 において行うことができ、後者のケースにおいては、単離物を、汚染土壌に加え ることにより直接的に環境に導入することができる。その他の適切な、効果的処 理法は、当該技術分野における当業者に明らかであろう。 本発明を、以下の図を用い、単に例として更に記載する。 図１は、ロドコッカス−ロドクラウス11Yからの細胞抽出物とRDXのインキュベ ーションの間に生じたニトライトを示す。 図２は、RDXとロドコッカス−ロドクラウス11Yの細胞の全細胞(whole cell)イ ンキュベーションの間に生じたニトライト及びホルムアルデヒドを示す。 図３は、ジチオスレイトールの濃度に対する、ロドコッカス−ロドクラウス11 Yからの部分精製抽出物のインキュベーションの間に生じたニトライトの変化を 示す。 図４は、変性剤濃度変化に対する、部分精製抽出物とRDXのインキュベーショ ンにより放出されたニトライトを示す。 図５は、熱処理した部分精製抽出物とRDXのインキュベーションのボイル時間 に対する、放出ニトリルを示す。 図６は、部分精製抽出物とRDXのインキュベーションからのニトライトの放出 、及びRDXの自然発生的加水分解のｐＨプロフィールを示す。 図７は、部分精製抽出物とRDXのインキュベーション工程の間に遊離したニト ライト及びホルムアルデヒドを示す。 図８は、部分精製抽出物と、種々のニトライト含有爆発物のインキュベーショ ンにより遊離したニトライトを示す。 実施例１ １．菌株ロドコッカス−ロドクラウス11Yからの酵素活性物質の製造 ロドコッカス−ロドクラウス11Yを、当該技術分野における技術標準(techniqu es standard)を用いて、窒素源としてのRDXが豊富な天然源から収集したサンプ ルから単離した。 ロドコッカス−ロドクラウス11Yを、0.4％グルコース(w/v)、痕跡元素(Pfenni ng及びLippertのArch.Microbiology,1966,55,726-739に記載され たようなもの)及び1ｍＭのRDX又は6ｍＭのNH₄Clのいずれかを含む、ｐＨ7.0の、 KH₂PO₄1.325g/l及びNa₂HPO₄2.17g/lからなる所定の培地１リットル中において成 長させた。フラスコを、180r.p.m.で振とう培養器中において30℃でインキュベ ートした。 細胞遊離抽出物を、上述のように成長させた細胞から得た。細胞を、GS-3ロタ ーが備え付けられたSorval RC-5C遠心機中において4℃で15分間10,000gで回転さ せることによりペレット化した。これらの細胞を、湿潤細胞重量グラムあたり、 2ｍｌの50ｍＭトリシンバッファー(ｐＨ8.0)中において再懸濁した。細胞を、溶 解した氷中における30秒の冷却で置きかえられた、15秒の６×12μｍバースト(b urst)を用いて、MSE Soniprep（Fisons,Instruments,FSA Ltd.）中において超音 波処理することにより破壊した。細胞の破片及び未分解細胞を、マイクロ遠心機 (microcentrifuge)(Sigma)中において4℃で１分間、13,000gでの遠心分離により 除去した。この上清を細胞遊離抽出物として使用した。膜分画を、4℃で１時間 、109,000ｇでの超遠心分離（Beckman Optima TLX Ultracentrifuge TLA 45 rot or）により細胞抽出物から得、ペレットを洗浄し、50ｍＭトリシンバッファー( ｐＨ8.0)中において再懸濁して、タンパク濃度を2mg/mlとした。 ２．化学物質 RDXは純度が最も高いものとし、他の化学物質は分析用のものとし、別に記載 のない限り、BDH Ltd.(Poole,UK.)、Sigma Chemical Company Ltd.(Poole,UK.) 、又はAldrich(Gillingham,UK)から得たものである。 ３．アッセイ RDX 分解 RDX分解を、最終容量１ｍｌ中にRDX最終濃度50μＭ)、5ｍＭ DTT、及び40μｌ の細胞遊離抽出物又は膜画分を含む、50ｍＭトリシン(ｐＨ8.0)中におけるHPLC によりRDXの消失をモニターすることにより測定した。 あるいはまた、RDX分解を、グリース試薬を用いてニトライトの放出をモニタ ーすることにより追跡した(Rosenblatt,Burrows,Mitchell及びPartner.1991:環 境的化学3(Ｇ)のハンドブックの"Organic Explosives and Related Compounds",O.Hutzinger,Springer-Verlag編集)。アッセイは上述のように行っ た。スルファニル酸（最終濃度0.6ｍＭ）を添加し、15分間放置し、その後N-1- ナフチルエチレンジアミン（最終濃度0.4ｍＭ）を添加し、かつ、５分後に、展 開された色彩を分光光度的に540nmで測定した。タンパク タンパクは、商業的に入手可能な試薬及び牛血清アルブミン標準(Pierce Ltd. -Life Science Labs Ltd.,Lutonから得られた)を用いてブラッドフォードのクー マシー色素結合法(Anal.Biochem.(1976)72,248-254)により通常通りにアッセイ した。0.2〜1mgタンパク/mlを含むサンプルのアリコート(20μｌ)を、試薬１ｍ ｌに添加し、その反応により、バッファー(20μｌ）と試薬(1ml)のブランク(bra nk)に対する595nmでの吸光度を読み取る前の、室温で５分間の展開が可能となっ た。標準値(10〜１mg/ml)検量線と比較することにより、サンプル中におけるタ ンパク濃度の計算が可能となった。 ４．結果 RDX 分解 天然の抽出物を、5ｍＭ DTT及び50μＭ RDXを含む50ｍＭトリシンを用いて300 Cで０〜60分間インキュベートした。RDXの濃度を、HPLCを用いて測定した。RDX の濃度が低減されることが観察された。 膜画分を、5ｍＭ DTT及び50μＭ RDXを含む50ｍＭトリシンを用いて30℃で０ 〜60分間インキュベートした。RDXの濃度を、HPLCを用いて測定した。 RDXの濃度が経時的に低減されることが観察された。 ニトライト生成 天然の抽出物を、5ｍＭ DTT及び50μＭ RDXを含む50ｍＭトリシンを用いて30 どで０〜60分間インキュベートした。その後、ニトライトの濃度を、グリース試 薬を用いて測定した。ニトライトの濃度は、図１に示したように低減することが 観察された。 コファクターNADH、NADPH、PES又はFADのいずれの添加も、ニトライト生成の 速度に影響を与えず、消耗可能なコファクター非依存性酵素活性が示される。 30℃で50μＭ RDXを用いてインキッュベートされた膜画分により、また、ニト ライトが生成された。この活性物質の可溶化は、5％トリトンで可能であった。実施例２ R.ロドクラウス株11Yの細胞を、0.4％グルコース(w/v)、6ｍＭ窒素原子、及び 痕跡元素を含み、ｐＨ7.0の、Na₂HPO₄2.17g/l及びKH₂PO₄1.325g/lからなる培地 中において成長させた(前述のPfenning及びLippert)。培養物を30℃で、回転振 とう機において170r.p.m.でインキュベートした。 11Yの全細胞を、GS3ローターを用いるSorvall RC5C遠心分離機において10分間 7000gでの対数増殖後期の培養物(late exponential culture)の遠心分離により 収集した。細胞を、洗浄し、ｐＨ8.0の50ｍＭトリシン中において懸濁して、細 胞の湿潤重量濃度を0.5g/mlとした。 11Yの全細胞インキュベーションにおけるRDXの分解を、最終容量１ml中にRDX （最終濃度300μＭ）及び全細胞10μｌを含む、pH8.0の50ｍＭトリシン中におい てアッセイした。RDXの消失を、薄層クロマトグラフィー(TLC)を用いて、グリー ス試薬での検出によりモニターした(前述のRosenblattら)。あるいはまた、ホル ムアルデヒドの生成を、標準ハンツシュ分光光度アッセイを用いてモニターし、 サンプル500μｌをホルムアルデヒド試薬と混合した（20ｍＭアセチルアセトン 、2ｍＭ酢酸アンモニウム、及び50ｍＭ酢酸）(Nash,1953,Biochemical Josrnal, Vol.55,p416)。その後、サンプルを、58℃で10分間インキュベートし、ダイオー ドアレー分光光度計を用いて418nmで黄色形成を測定した。既知濃度のホルムア ルデヒド（１〜500μＭ）を用いて検量線を形成した。 全細胞サンプルを、30℃で、12時間インキュベートした。ニトライトの濃度が 、図２に示されたように増加することが観察された。図２により、また、ホルム アルデヒドの濃度も増加することが示される。 全細胞を、11,000p.s.i.の圧力で、ミニセルを用いて、フレンチ加圧細胞プレ スで破壊した。細胞破壊物及び未破壊細胞を、マイクロ遠心分離機における4℃ で１分間13,000r.p.m.での遠心分離により除去し、上清を天然の細胞抽出物とし て使用した。 天然抽出物のRDX分解及びニトライト生成活性物質を、以下のようにアッセイ した：アッセイは、最終容量１ml中にRDX(最終濃度50μＭ)、５ｍＭ DTT及び40 μｌの天然抽出物を含む、ｐＨ8.0の50ｍＭトリシンバッファー中において行っ た。RDX分解を、グリース試薬を用いる検出でのTLCによりRDXの消失をモニター することにより測定した。生成されたニトライトを測定するために、タンパクを 、2μｌの氷酢酸の添加により沈澱させ、その後、マイクロ遠心分離機における 遠心分離（５分、13,000r.p.m.）により除去した。ニトライトについて標準グリ ース反応を行った。RDX分解及び同時に生じるニトライト生成を観察した。 細胞成分分画を、109,000gで１時間４℃での天然抽出物の超遠心分離（Beckma n Optima TLX Ultracentrifuge TLA 45 rotor)により達成したが、上清は溶解性 タンパクを示し、ペレットは膜画分を示す。ペレットを洗浄し、pH8.0の50ｍＭ トリシンバッファー中において再懸濁して、活性研究前にタンパク濃度を2mg/ml とした。 RDX分解能力を、両画分について（主には膜画分について）観察した。 溶解性タンパク中のRDX分解酵素活性物質を、０〜２Ｍ NaClの塩グラジエント 及びｐＨ8.5の50ｍＭトリスバッファーを用いて、Ｑ-セファローズカラム(Q-sep harose column)により部分的に精製した。タンパクは、350ｍＭ塩化ナトリウム 周辺の単一ピークとして溶離された。部分精製されたタンパクは、熱安定性であ り、かつ、6Ｍウレアにおいて変性されたが、2Ｍウレアに希釈されるとリフォー ルディングされた。実施例３ １．R. ロドクラウスの成長及び酵素の部分精製 16LのR.ロドクラウス11Yを、30℃で、唯一の窒素源としての1ｍＭ RDX及び痕 跡元素2ml(前述のPfenning及びLippert)、0.4％グルコース(w/w)及び20ｍＭ KH₂ PO₄中において培養した。細胞を、2Lフラスコ中において成長させ、かつ、それ らが、4℃で15分間、10,000gでのGS3ローターを用いたSorvall RC5C遠心分離機 中において成長停止相に達したときに遠心分離により収集した。細胞ペレット（ 細胞の湿潤重量57g）を、ｐＨ8.0の50ｍＭトリス120ml中に再懸濁 した。懸濁物は、フレンチ加圧細胞を用いて35,000p.s.i.（３パス）で均質化し 、その後遠心分離(4℃で30分、30,000gでSS-34ローターを用いるSorvall RC5C遠 心分離）して、細胞破壊物をペレット化した。上清を除去し、再び遠心分離(4℃ で２時間、25,000gでTi-70ローターを用いるBeckman XL-90超遠心分離）して、 細菌の膜をペレット化した。上清及びペレットの双方が、グリースアッセイによ り測定されるように、ニトライトの遊離を伴うRDX分解をする能力を有すること が分かった。高速遠心分離工程からの上清を更なる精製のために用いた。 上清サンプルのｐＨを、氷酢酸により3.5に下げ、サンプルを氷上で30分間イ ンキュベートした。高速遠心分離の上清からのタンパク〜60％が凝集し、更なる 遠心分離（4℃で30分、30,000gでSS-34ローターを用いるSorvan llRC5C遠心分離 ）により除去されたことが分かった。その後、上清のｐＨを、1Ｍ水酸化ナトリ ウムを用いて8.0に移行させ、抽出物を、実施例１に記載したような、RDX関連ニ トライト放出についてアッセイした。主要活性物質は、氷酢酸での処理後に溶解 性を保持することが分かった(〜75％)。このサンプルを、その後の全アッセイに おいて使用した。 ２．基質条件 部分精製タンパクを用いて、コファクターの条件について調べた。NADPH又はN ADHなどのコファクターが必要でないことが分かった。ジオチオスレイトール(DT T)の濃度についてのRDX分解の依存性を以下のようにアッセイした；部分精製し たタンパク26μｇを、4Ｍウレア、0.3ｍＭ RDX、pH8.5の50ｍＭトリシンの存在 下において37℃で10分間インキュベートした。DTT濃度が変化し、最終容量は200 μｌで維持した。放出されたニトライト量を、実施例１に記載したような分光光 度アッセイを用いて測定した。DTT濃度に対する放出ニトライト量を図３に示す 。これにより、DTTの存在が好ましく、〜3ｍＭのDTTが最大活性を達成するため に必要とされることが示される。DTTを用いることにより、細胞が破壊された際 の低減環境が維持される。 ３．溶解性及び安定性 アミコン(Amicon)限外ろ過ユニット（膜の3kDaカット、70p.s.i.、4℃）を用 いる部分精製酵素溶液の濃縮により、タンパク凝集及び活性の低減が導かれる。 凝集したタンパクは、8Ｍウレア、5ｍＭ DTT及びｐＨ8.0の50ｍＭトリス中に再 溶解(resolubilise)可能であり、活性が回復されることが分かった。 強変性剤の存在下での酵素活性物質の安定性を、ウレア又は塩酸グアニジンを 有するタンパクサンプルの存在下でのRDXからのニトライト放出についてアッセ イすることにより測定した。アッセイ条件は、タンパク26μｇについて、ｐＨ8. 5の50ｍＭトリシン、0.3ｍＭ RDX、5ｍＭ DTT、37℃、10分間とし、ニトライト 放出を、実施例１に記載したような分光光度アッセイにより測定した。変性剤の 濃度に対するRDX活性物質の依存性を図４に示す。 酵素が、高濃度の変性剤の存在に対して、異常に高い安定性を示すことが分か った。タンパク及び塩酸グアニジン内の水素結合及び疎水性相互作用を崩壊させ ることにより主に作用し、主にイオン性相互作用を崩壊させ、かつ疎水性相互作 用をより低い程度のものとする、ウレアについて観察される活性における差から 、イオン相互作用が酵素活性物質の安定性について非常に重要な役割を果たし得 ることが示される。 RDX分解活性はウレアの存在により強化されるので、その後の全アッセイを、4 Ｍウレアの存在下において行った。 酵素活性物質の熱安定性を測定するために、部分精製されたタンパクサンプル を、I00℃に加熱し、サンプルを種々のインターバルで取り出し、20μｌの沸騰 サンプル、ｐＨ8.5の50ｍＭトリシン、4Ｍウレア、5ｍＭ DTT及び0.3ｍＭ RDXを 用いて37℃で10分間アッセイした。ニトライトの放出を、分光光度的に測定し、 結果を図５に示す。 酵素活性物質は、熱に対して比較的安定のものであり、100℃、10分後にほん の〜20％の活性損失であった。 ４．ｐＨプロフィール 部分精製した抽出物のｐＨプロフィールを調べた。アッセイ条件は、50ｍＭの 適切なバッファー、4Ｍウレア、0.3ｍＭ RDX及び5ｍＭ DTTとした。サンプルを 、37℃で10分間、26μｇの部分精製タンパクを用いてインキュベートした。また 、3ｍＭのRDXのアルカリ加水分解を、同一条件下で測定し、その結果を図６に示 す。酵素活性物質により、ｐＨ範囲中、自然発生的分解と比べて、 RDXからのニトライト放出が有意に高められることが分かった。 ５．ニトライト及びホルムアルデヒド生成 RDXの酵素的分解からのニトライト及びホルムアルデヒド生成を、ｐＨ8.5の50 ｍＭトリシン、4Ｍウレア、0.15ｍＭ RDX及び5ｍＭ DTT中において、37℃で、26 μｇの部分生成された抽出物を用いてアッセイし、遊離されたニトライト及び生 成されたホルムアルデヒドの量を、実施例１に記載したような標準分光光度アッ セイを用いて経時的に測定した。 結果を図７に示す。放出されたニトライトとホルムアルデヒドの量は、同程度 であり、RDXの酵素的分解のメカニズムは、RDXのアルカリ加水分解について意図 されたもの(Croce及びOkamoto,1978,Journal of Organic Chemistry,Vol.44,pp2 100-2103;Heilmannら,1996,Environmental Science Technology,Vol.30,No.5,pp 1485-1492)と同様であることが示され、ここで、RDXからのニトライト基の除去 により、自然発生的に分解して、ホルムアルデヒドを含む低分子量範囲のものを 生じる非安定性の中間体が形成される。 ６．基質特異性 基質特異性を、酵素活性物質により、HMX又はPETN（双方ともにニトライト含 有爆発物）が分解されたかについて試験することにより調べた。アッセイを、50 ｍＭトリシン、4Ｍウレア、0.3ｍＭの適切な爆発物及び5ｍＭ DTT中において、3 7℃で、20分間、部分精製された抽出物26μｇを用いて行い、結果をRDXと比較し た。結果を図８に示す。酵素的活性は、試験した全爆発物に対して活性的であっ たが、RDXに対して明らかに好ましいものである（より活性的である）ことが分 かる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０２Ｆ 3/34 Ｂ０９Ｂ 3/00 ＺＡＢＥ (Ｃ１２Ｎ 9/14 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ニックリン スティーヴン イギリス国 ハンプシャー ジーユー14 ０エルエックス ファーンボロー アイヴ ェリー ロード（番地なし）ディフェンス エヴァリュエイション アンド リサー チ エージェンシー エックス92 ビルデ ィング アイピーディー (72)発明者 ブルース ニール チャールズ イギリス ケンブリッジ シービー２ １ キューティー テニス コート ロード （番地なし）ユニヴァーシティー オヴ ケンブリッジ インスティテュート オヴ バイオテクノロジー (72)発明者 フレンチ クリストファー エドワード イギリス ケンブリッジ シービー２ １ キューティー テニス コート ロード （番地なし）ユニヴァーシティー オヴ ケンブリッジ インスティテュート オヴ バイオテクノロジー (72)発明者 トラヴィス エマ レイチェル イギリス ケンブリッジ シービー２ １ キューティー テニス コート ロード （番地なし）ユニヴァーシティー オヴ ケンブリッジ インスティテュート オヴ バイオテクノロジー (72)発明者 バスラン アムリック イギリス ケンブリッジ シービー２ １ キューティー テニス コート ロード （番地なし）ユニヴァーシティー オヴ ケンブリッジ インスティテュート オヴ バイオテクノロジー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．RDXからのニトライト放出を触媒するRDX分解酵素活性物質。 ２．より低い程度でHMX及びPETNからのニトライト放出を触媒する請求項１記載 のRDX分解酵素活性物質。 ３．前記活性物質が高濃度の変性剤の存在に対して安定である請求項１又は２記 載のRDX分解酵素活性物質。 ４．RDX分解酵素活性がウレアの存在下において高められる請求項１〜３のいず れか１項記載のRDX分解酵素活性物質。 ５．RDX分解酵素活性物質の大部分が、ｐＨが氷酢酸により3.5に低減された後に 溶解性を保持する請求項１〜４のいずれか１項記載のRDX分解酵素活性物質。 ６．“11Y”と称され、かつ、NCIMB40820として寄託されたロドコッカス−ロド クラウス11Y菌株、及びRDXを分解する酵素活性物質を生じる能力を有するその 変異体又は変種体。 ７．請求項１〜５のいずれか１項記載のRDX分解活性物質を生じさせる方法であ って、請求項６記載のロドコッカス−ロドクラウス11Y種NCIMB40820、又はそ の変異体若しくは変種体を培養し、該細胞を破壊し、かつ、破壊された細胞か ら酵素活性物質を抽出することを含む該方法。 ８．請求項７記載の方法により生じるRDX分解酵素活性物質。 ９．サンプル中のRDXを検出する方法であって、該サンプルを、請求項１〜５の いずれか１項記載のRDX分解酵素活性物質に付し、かつ、該サンプルから生成 されたニトライトを検出することを含む該方法。 10．ニトライトが比色的に検出される請求項９記載の方法。 11．サンプル中のRDXを検出する方法であって、該サンプルを、請求項１〜５の いずれか１項記載のRDX分解酵素活性物質に付し、該サンプルから生成された ホルムアルデヒドを検出することを含む該方法。 12．ホルムアルデヒドが比色的に検出される請求項10記載の方法。 13．RDX分解酵素活性物質が、請求項７記載の方法により生じ、かつ、サンプ ルにジチオスレイトールを添加する工程を含む、請求項９〜12のいずれか１項 記載の方法。 14．サンプル中のRDXの検出用バイオセンサーであって、サンプルを、請求項１ 〜５のいずれか１項又は請求項８記載のRDX分解酵素活性物質と接触させ、該 サンプルを酵素活性物質による汚染物質の分解に適切な条件下に保持するため の手段、及びRDXがサンプル中に存在する場合に、酵素活性物質により触媒さ れる、RDXの反応の発生を検出するための手段を含む該バイオセンサー。 15．反応の発生を検出するための手段が比色変化である請求項14記載のバイオセ ンサー。 16．RDXにより汚染された環境をバイオレメディエーション処理する方法であっ て、該環境に対して、請求項１〜５のいずれか１項記載のRDX分解酵素活性物 質を多量に添加し、かつ、該混合物を、材料中に存在するRDXの消耗が可能と なるような、酵素活性物質による汚染物質の分解に適する条件下に保持する工 程を含む該方法。 17．材料が、RDXを含む廃棄物流である請求項16記載の方法。 18．材料が、RDXを含む土壌又は土サンプルである請求項16記載の方法。 19．RDX分解酵素活性物質が、請求項７記載の方法により生じる、請求項16〜18 のいずれか１項記載の方法。 20．混合物を、酵素活性物質による汚染物質の分解に適切な条件下に保持する工 程が、ジチオスレイトールを該混合物に添加することを含む請求項19記載の方 法。 21．RDXで汚染された環境をバイオレメディエーション処理する方法であって、 該環境に、請求項６記載のロドコッカス−ロドクラウスのバクテリア単離物の サンプルを添加し、かつ、該単離物が、環境中に存在するRDXを消耗すること を可能にする工程を含む該方法。 22．材料が、RDXを含む廃棄物流である請求項21記載の方法。 23．材料が、RDXを含む土壌又は土サンプルである請求項21記載の方法。