DE69729200T2

DE69729200T2 - Biologischer Sprengstoffabbau

Info

Publication number: DE69729200T2
Application number: DE69729200T
Authority: DE
Inventors: Stephen Farnborough NICKLIN; Neil Charles Bruce; Christopher Edward French; Emma Rachel Travis; Amrik Basran
Original assignee: UK Secretary of State for Defence
Current assignee: UK Secretary of State for Defence
Priority date: 1996-08-21
Filing date: 1997-08-21
Publication date: 2005-05-04
Anticipated expiration: 2017-08-22
Also published as: HUP9904338A2; EP0920493A1; PL331464A1; AU4023197A; JP2000516473A; CZ296506B6; IL128603A; CZ57499A3; IL128603A0; US6274368B1; AU720888B2; GB2316408A; GB9617537D0; EP0920493B1; NO990806D0; HU224469B1; NO990806L; NO324799B1; ZA977530B; CA2261289A1

Description

Die Erfindung betrifft die Gebiete des Nachweises und des biologischen Abbaus von Explosivstoffen und insbesondere ein neues Bakteriumisolat und eine neue Enzymaktivität, d. h. ein einzelnes Enzym oder eine Gruppe von Enzymen, die davon abgeleitet sind. Sie ist weiterhin auf den aeroben biologischen Abbau von Hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (anschließend mit dem üblicherweise benutzten Akronym RDX bezeichnet) und auf Verfahren und eine Vorrichtung zum Nachweis von RDX unter Verwendung der RDX-abbauenden Enzymaktivität gerichtet.
Dabei hat sich gezeigt, dass die neue Enzymaktivität aus RDX, einem heterocyclischen Nitramin, Nitrit freisetzt.
Nitramine, obwohl sie offensichtlich in der Natur extrem selten vorkommen, werden in großen Mengen von der chemischen Industrie produziert und umfassen beispielsweise eine bedeutende Klasse energiereicher Materialien mit Verwendung als Explosiv- und Treibstoffe, wobei RDX gegenwärtig der in den USA wichtigste militärische Explosivstoff ist. Herstellung, Handhabung und Entsorgung von RDX können zur Verschmutzung der Umwelt mit ihm führen. Es herrschen Befürchtungen wegen des Verbleibs von Nitraminen in der Umwelt aufgrund ihrer relativen Beständigkeit, weshalb die Notwendigkeit eines Mittels zur Entfernung solcher Schadstoffe aus der Umwelt, ohne dabei andere unerwünschte Schadstoffe zu erzeu gen, besteht. Weiterhin existiert auch dringender Bedarf an einem besseren Verfahren zum Nachweis von RDX, da die gegenwärtig vorgeschlagenen Analysesysteme meist auf großen und hochentwickelten Apparaturen wie der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie beruhen und/oder für ihre Anwendung speziell ausgebildetes Laborpersonal erfordern.
Deshalb liegt der Erfindung als Aufgabe zugrunde, ein Enzym bereitzustellen, das in der Lage ist, den biologischen Abbau von RDX zu katalysieren, und welches in einem biologischen System zur Beseitigung der Umweltverschmutzung durch RDX-Schadstoffe verwendet werden kann. Ihr liegt weiterhin als Aufgabe zugrunde, ein Enzym bereitzustellen, das für RDX-Detektionssysteme nützlich ist.
Deshalb wird entsprechend einem ersten erfindungsgemäßen Merkmal der Bakterienstamm Rhodococcus rhodochrous 11Y, der als "11Y" bezeichnet wird und als NCIMB 40820 hinterlegt worden ist, und Mutanten und Abarten davon, die in der Lage sind, eine Enzymaktivität zu produzieren, die Hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (RDX) abbaut, und in einem zweiten erfindungsgemäßen Merkmal eine RDX-abbauende Enzymaktivität bereitgestellt, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie die Freisetzung von Nitrit aus Hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (RDX) katalysiert und aus Zellen von Rhodococcus rhodochrous 11Y oder Mutanten oder Abkömmlingen davon erhalten ist.
Diese Enzymaktivität zeigt eine geringere Aktivität gegen das ähnliche heterocyclische Nitramin Octahydro-1,3,5,7-tetranitro-1,3,5,7- tetrazocin (HMX) und auch eine geringere Aktivität gegen den Nitratester Pentaerythrittetranitrat (PETN). Dabei wurde festgestellt, dass die Aktivität membrangebunden ist und aus der Membran mit 5% Triton solubilisiert werden konnte. Es gibt keine Notwendigkeit eines Cofaktors wie NADPH, NADH, PES oder FAD für die Enzymaktivität, und die Enzymaktivität weist Stabilität gegenüber dem Vorhandensein relativ hoher Konzentrationen an denaturierenden Stoffen auf und wird bei Vorhandensein von Harnstoff erhöht. Die Enzymaktivität ist auch gegenüber einer Denaturierung durch Wärme relativ stabil. Weiterhin bleibt ein großer Anteil der Enzymaktivität löslich, wenn der pH-Wert mit Eisessig auf 3,5 gesenkt wird.
Der Bakterienstamm, aus welchem die erfindungsgemäße Enzymaktivität erhalten worden ist, wurde aus der Natur isoliert und ist ein Stamm von Rhodococcus rhodochrous, hierin als 11Y bezeichnet. Eine Probe des neuen Isolats ist unter den Bedingungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren in der UK National Collection of Industrial and Marine Bacteria, 23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB2 1RY, Schottland, am 7. August 1996 unter der Hinterlegungsnummer NCIMB 40820 hinterlegt worden.
Weitere Charakteristika des hinterlegten Bakteriums 11Y sind:

Gram-Färbung +ve

Sporen –ve

Motilität –ve

Wachstum

37°C +ve

41°C +ve

45°C –ve

Katalase +ve

Oxidase –ve

fermentativ in Glucose OF keine Veränderung.
Eine Zellwand- und Fettsäureanalyse lieferte folgende Informationen.
Mycolsäuren vorhanden.
Die Zellwanddiaminosäure ist mesoDAP.
Das Fettsäureprofil zeigt, dass die meisten vorhandenen Fettsäuren gesättigte und ungesättigte geradkettige Fettsäuren zusammen mit einem kleinen Anteil einer 10-Methyl-verzweigten Säure, d. h. Tuberculostearinsäure, sind.
Die Enzymaktivität kann durch Kultivieren von R. rhodochrous auf RDX oder NH₄Cl als Stickstoffquelle produziert werden. Zum Erhalten der Enzymaktivität können die Zellen auf eine beliebige herkömmliche Weise aufgerissen werden. Bequemerweise wird ein zellfreier Extrakt hergestellt. Der Extrakt kann dann durch Ultra zentrifugieren fraktioniert und der Niederschlag genommen werden, um eine aktive Membranfraktion zu ergeben.
Alternativ liefert der Überstand vom Ultrazentrifugieren das aktive lösliche Protein. Das lösliche Protein kann unter Anwendung von Anionenaustauschchromatographie teilweise gereinigt und mit einem linearen Salzgradienten von 0 bis 2 M Natriumchlorid eluiert werden. Das Protein eluiert mit einem einzelnen Peak bei etwa 350 mM Natriumchlorid.
Die als Zellextrakt erhaltene Enzymaktivität erfordert das Vorhandensein von Dithiothreitol (DTT) für die RDX-abbauende Enzymaktivität.
Anstatt des hinterlegten genauen Ausgangsorganismus kann ein Mutant davon, beispielsweise abgeleitet durch Bestrahlung mit Gammastrahlen bzw. Verwendung eines chemischen Mutationsmittels, Induktion durch Kultivieren, beispielsweise auf einem anderen Medium, oder ein Transkonjugat mit einem anderen Bakterium verwendet werden. Die Eignung eines solchen Organismus, die Enzymaktivität zu liefern, kann vom Fachmann leicht ermittelt werden.
Das Vermögen der neuen Enzymaktivität zur Katalyse der Entfernung von Nitrit aus RDX erlaubt die Verwendung der Enzymaktivität zum RDX-Nachweis. Entsprechend einem weiteren erfindungsgemäßen Merkmal wird daher ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von RDX in einer Probe bereitgestellt, welches das Aussetzen der Probe der RDX-abbauenden Enzymaktivität und den Nachweis des aus der Probe freigesetzten Nitrits umfasst. Bequemerweise wird ein solcher Nachweis durch ein aus dem Stand der Technik bekanntes kolorimetrisches V erfahren durchgeführt.
Durch die Entfernung des Nitrits aus RDX kann ein instabiles Zwischenprodukt gebildet werden, das sich dann spontan zersetzt, um ein Spektrum kleinerer Moleküle, einschließlich Formaldehyd und Ammoniak, zu ergeben. In einem anderen erfindungsgemäßen Merkmal wird daher ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von RDX in einer Probe bereitgestellt, welches umfasst, die Probe der RDX-abbauenden Enzymaktivität auszusetzen und erzeugtes Formaldehyd zu detektieren. Eine solche Detektion kann auch hier wieder durch ein aus dem Stand der Technik bekanntes kolorimetrisches Verfahren durchgeführt werden.
In einem wieder anderen erfindungsgemäßen Merkmal wird ein Biosensor zur Detektion von RDX in einer Probe bereitgestellt, welcher Mittel zum In-Berührung-Bringen der Probe mit der RDX-abbauenden Enzymaktivität und Mittel zur Detektion des Stattfindens einer durch die Enzymaktivität katalysierten Reaktion von RDX, falls dieses in der Probe vorhanden ist, umfasst. Alternativ wird in einem noch anderen Merkmal ein Biosensor zur Detektion von RDX in einer Probe bereitgestellt, welcher Mittel zum Beimpfen der Probe mit einer Kultur des Bakteriumisolats Rhodococcus rhodochrous 11Y und Aufbewahren der Probe unter Bedingungen, die für den Abbau des Schadstoffs durch das Isolat geeignet sind, und Mittel zur Detektion des Stattfindens einer durch das Isolat katalysierten Reaktion von RDX, falls dieses in der Probe vorhanden ist, umfasst. Dabei kann das Mittel zur Detektion des Stattfindens einer Reaktion bequemerweise einen kolorimetrischen Messwertwandler umfassen. Solche Sensoren können als Basis für leicht tragbare Detektoren zur Analyse des Ausmaßes einer Kontaminierung der Umwelt mit dem Schadstoff RDX verwendet werden.
In einem weiteren erfindungsgemäßen Merkmal wird ein Verfahren zur biologischen Wiederherstellung einer mit RDX kontaminierten Umgebung bereitgestellt, das die Stufen Zugeben einer Menge an Zellextrakt, der die Enzymaktivität enthält, zur kontaminierten Umgebung und Halten des Gemischs unter Bedingungen, die für den Abbau des RDX durch die Enzymaktivität geeignet sind, sodass das im Material vorhandene RDX verbraucht wird, umfasst.
Dabei kann das verbrauchte Material beispielsweise ein Abproduktstrom aus RDX enthaltendem Material, der aus der Zerstörung einer RDX enthaltenden Explosivstoffcharge stammt, oder eine Probe von mit RDX kontaminierte Erde oder einem anderen Material sein. Im ersteren Fall kann die biologische Wiederherstellung bequemerweise in einem Reaktor durchgeführt werden, während in letzterem die Enzymaktivität direkt in das Material eingebracht wird. Weitere geeignete Verfahren zur Durchführung der Behandlung liegen innerhalb des Könnens des Durchschnittsfachmanns.
Entsprechend einem wieder anderen erfindungsgemäßen Merkmal wird durch das Vermögen der Enzymaktivität zum RDX-Abbau, wie weiter oben beschrieben, ein alternatives Verfahren zur biologischen Wiederherstellung einer mit RDX kontaminierten Umgebung bereit gestellt. Dieses Verfahren umfasst die Stufe des Beimpfens der Umgebung mit einer Probe des Bakteriumisolats von dem mit 11Y bezeichneten Rhodococcus rhodochrous und ermöglicht es dem Isolat, das in der Umgebung vorhandene RDX zu verbrauchen. Die Umgebung kann beispielsweise ein Abproduktstrom aus RDX enthaltendem Material oder eine Probe von mit RDX kontaminierter Erde oder einem anderen Material sein. In ersterem Fall kann die biologische Wiederherstellung bequemerweise in einem Reaktor durchgeführt werden, während in letzterem das Isolat direkt durch Beimpfen der kontaminierten Erde mit ihm in die Umgebung eingebracht werden kann. Weitere geeignete Verfahren zur Durchführung der Behandlung liegen innerhalb des Könnens des Durchschnittsfachmanns.
Die Erfindung wird anschließend beispielhaft unter Bezugnahme auf die im Anhang befindlichen Zeichnungen näher erläutert, wobei
1 das Nitrit, das während der Inkubation des Zellextrakts von Rhodococcus Rhodochrous 11Y mit RDX produziert worden ist,
2 Nitrit und Formaldehyd, die während der Ganzzellinkubation von RDX mit Zellen von Rhodococcus Rhodochrous 11Y produziert worden sind,
3 die Veränderung des Nitrits, das bei Inkubationen von teilweise gereinigtem Extrakt von Rhodococcus Rhodochrous 11Y mit einer Konzentration von Dithiothreitol produziert worden ist,
4 das Nitrit, das bei der Inkubation von RDX mit teilweise gereinigtem Extrakt mit verschiedenen Konzentrationen an denaturierenden Stoffen freigesetzt worden ist,
5 das Nitrit, das in Abhängigkeit von der Kochzeit bei Inkubationen von wärmebehandeltem, teilweise gereinigtem Extrakt mit RDX freigesetzt worden ist,
6 den pH-Verlauf der Nitritfreisetzung aus Inkubationen von teilweise gereinigtem Extrakt mit RDX und die spontane RDX-Hydrolyse,
7 Nitrit und Formaldehyd, die während Inkubationen von teilweise gereinigtem Extrakt mit RDX freigesetzt worden sind, und
8 das Nitrit, das aus Inkubationen von teilweise gereinigtem Extrakt mit verschiedenen Nitrit enthaltenden Explosivstoffen freigesetzt worden ist,
zeigt.
Beispiel 1
1. Herstellung der Enzymaktivität aus dem Bakteriumstamm Rhodococcus Rhodochrous 11Y
Rhodococcus rhodochrous 11Y wurde unter Verwendung von Standardverfahren aus Proben, die von einer natürlichen Quelle gesammelt worden waren, durch Anreicherung mit RDX als Stickstoffquelle isoliert.
R. rhodochrous 11Y wurde in 1 Liter eines definierten Mediums gezüchtet, das aus 2,17 g/l Na₂HPO₄ und 1,325 g/l KH₂PO₄, pH 7,0, bestand und 0,4% Glucose (Gew./Vol.), Spurenelemente (wie beschrieben von Pfennig und Lippert, Arch. Microbiology, 55, 726–739 (1966)) und entweder 1 mM RDX oder 6 mM NH₄Cl enthielt. Die Kolben wurden bei 180 U/min und 30°C in einem Schüttelinkubator inkubiert.
Aus auf diese Weise gezüchteten Zellen wurden zellfreie Extrakte erhalten. Die Zellen wurden durch 15 min langes Schleudern bei 10 000 g und 4°C in einer Zentrifuge Sorval RC-5C, an welche ein GS-3-Rotor angeschlossen war, pelletiert. Diese Zellen wurden erneut in 2 ml eines Puffers aus 50 mM Tricin (pH 8,0) pro Gramm nasses Zellgewicht suspendiert. Die Zellen wurden durch Ultraschall in einem MSE Soniprep (Fisons, Instruments, FSA Ltd.) unter Anwendung von 15 Sekunden langen 6 × 12 μm-Berstvorgängen, abwechselnd mit 30 Sekunden langem Abkühlen in geschmolzenem Eis, aufgerissen. Der Zelldebris und die unversehrten Zellen wurden durch 1 min langes Zentrifugieren bei 13 000 g und 4°C in einer Mikrozentrifuge (Sigma) entfernt. Der Überstand wurde als zellfreier Extrakt verwendet. Die Membranfraktion wurde aus dem zellfreien Extrakt durch 1 h langes Ultrazentrifugieren bei 109 000 g und 4°C (Beckman Optima TLX Ultrazentrifuge TLA 45 Rotor) erhalten und der Niederschlag gewaschen und in einem Puffer 50 mM Tricin (pH 8,0) bis auf eine Konzentration von 2 mg/ml Protein erneut suspendiert.
2. Chemikalien
RDX hatte den höchsten Reinheitsgrad, und die anderen Chemikalien hatten Analysenreinheit und, sofern nichts anderes festgestellt, waren sie von BDH Ltd. (Poole, UK), Sigma Chemical Company Ltd. (Poole, UK) oder Aldrich (Gillingham, UK) bezogen.
3. Versuche
RDX-Abbau
Der RDX-Abbau wurde bestimmt durch Überwachung des Verschwindens von RDX durch HPLC in 50 mM Tricin (pH 8,0), das RDX (50 μM, Endkonzentration), 5 mM DTT und 40 μl zellfreien Extrakt oder Membranfraktion in einem Endvolumen von 1 ml enthielt.
Alternativ wurde der RDX-Abbau durch Überwachung des Freisetzens von Nitrit unter Verwendung von Grießschem Reagenz verfolgt (Rosenblatt, Burrows, Mitchell und Partner, 1991: "Organic Ex plosives and Related Compounds" in Handbook of Environmental Chemistry 3 (G), herausgegeben von O. Hutzinger, Springer-Verlag). Der Versuch wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. Sulfanilsäure (0,6 mM, Endkonzentration) wurde zugesetzt und 15 min lang stehen gelassen, anschließend wurde N-1-Naphthylethylendiamin (0,4 mM, Endkonzentration) hinzugegeben und nach 5 min die Farbe, die sich entwickelt hatte, spektralphotometrisch bei 540 nm gemessen.
Protein
Protein wurde routinemäßig durch die Coomassie-Farbstoff-Bindemethode von Bradford (Anal. Biochem., 72, 248–254 (1976)) unter Verwendung des kommerziell erhältlichen Reagenz und von Standard-Rinderserumalbumin (Pierce Ltd., bezogen durch Life Science Labs Ltd., Luton) untersucht. Ein Aliquot (20 μl) der Probe, der 0,2 bis 1 mg Protein/ml enthielt, wurde zu 1 ml Reagenz hinzugegeben und die Reaktion 5 min lang bei Raumtemperatur stattfinden gelassen, bevor der Lichtabsorptionsgrad bei 595 nm gegen eine Nullprobe aus Puffer (20 μl) plus Reagenz (1 ml) abgelesen wurde. Ein Vergleich mit einer Standardkurve aus Standardwerten (0 bis 1 mg/ml) erlaubte die Berechnung der Proteinkonzentration in der Probe.
4. Ergebnisse
RDX-Abbau
Der Rohextrakt wurde bei 30°C mit 50 mM Tricin, das 50 μM RDX und 5 mM DTT enthielt, über einen Zeitraum von 0 bis 60 min inkubiert. Die RDX-Konzentration wurde durch HPLC bestimmt. Es wurde eine abnehmende RDX-Konzentration festgestellt.
Die Membranfraktion wurde bei 30°C mit 50 mM Tricin, das 50 μm RDX und 5 mM DTT enthielt, über einen Zeitraum von 0 bis 60 min inkubiert. Die RDX-Konzentration wurde durch HPLC bestimmt. Die RDX-Konzentration sank mit der Zeit.
Nitriterzeugung
Der Rohextrakt wurde bei 30°C mit 50 mM Tricin, das 50 μM RDX und 5 mM DTT enthielt, über einen Zeitraum von 0 bis 60 min inkubiert. Danach wurde die Nitritkonzentration unter Verwendung von Grießschem Reagenz gemessen. Die Nitritkonzentration stieg, wie in 1 gezeigt.
Die Zugabe eines der Cofaktoren NADH, NADPH, PES oder FAD beeinflusste die Geschwindigkeit der Nitritproduktion nicht, was eine von Cofaktoren unabhängige verzehrende Enzymaktivität anzeigt.
Die Membranfraktion, die mit 50 μM RDX bei 30°C inkubiert wurde, erzeugte auch Nitrit. Die Solubilisierung dieser Aktivität mit 5% Triton war möglich.
Beispiel 2
Zellen des Stamms R. rhodochrous 11Y wurden in einem Medium gezüchtet, das aus 2,17 g/l Na₂HPO₄ und 1,325 g/l KH₂PO₄, pH 7,0, mit 0,4% (Gew./Vol.) Glucose, 6 mM Stickstoffatomen und Spurenelementen (Pfennig & Lippert, siehe weiter oben) bestand. Die Kulturen wurden bei 30°C und 170 U/min in einer Umlaufschüttelmaschine inkubiert.
Ganze Zellen von 11Y wurden durch Zentrifugieren von Kulturen im späten exponentiellen Wachstumsstadium bei 7 000 g 10 Minuten lang in einer Zentrifuge Sorvall RC5C mit einem GS3-Rotor geerntet. Die Zellen wurden gewaschen und in 50 mM Tricin, pH 8,0, auf eine Konzentration von 0,5 g/ml Nassgewicht der Zellen suspendiert.
Der RDX-Abbau in Ganzzellinkubationen von 11Y wurde in 50 mM Tricin, pH 8,0, das RDX (300 μM, Endkonzentration) und 10 μl ganze Zellen in einem Endvolumen von 1 ml enthielt, untersucht. Dabei wurde das Verschwinden von RDX unter Anwendung von Dünnschichtchromatographie (DC) mit Detektion unter Verwendung von Grießschem Reagenz (Rosenblatt et al., siehe oben) überwacht. Alternativ wurde die Formaldehydproduktion unter Verwendung des standardmäßigen spektralphotometrischen Hantzsch-Versuchs überwacht; 500 μl Probe wurden mit 500 μl Formaldehydreagenz (20 mM Acetylaceton, 2 mM Ammoniumacetat und 50 mM Essigsäure) (Nash, 1953, Biochemical Journal, Bd. 55, 416) vermischt. Danach wurde die Probe 10 Minuten lang bei 58°C inkubiert und die Bildung der gelben Färbung bei 418 nm unter Verwendung eines Dioden-Array-Spektralphotometers gemessen. Zum Aufstellen einer Kalibrierkurve wurden bekannte Formaldehydkonzentrationen (1 bis 500 μM) verwendet.
Die Proben aus ganzen Zellen wurden 12 Stunden lang bei 30°C inkubiert. Wie in 2 gezeigt, nahm die Nitritkonzentration zu. In 2 ist weiterhin gezeigt, dass auch die Formaldehydkonzentration zunahm.
Ganze Zellen wurden mit einer French Pressure Cell Press unter Verwendung der Minizelle mit einem Druck von 11 000 psi aufgerissen. Zelldebris und unversehrte Zellen wurden durch 1 Minute langes Zentrifugieren bei 13 000 U/min und 4°C in einer Mikrozentrifuge entfernt, und der Überstand wurde als Rohzellextrakt verwendet.
RDX-Abbau- und Nitritproduktionsaktivität des Rohzellextrakts wurden wie folgt untersucht; die Versuche wurden in Puffer 50 mM Tricin, pH 8,0, der RDX (50 μM Endkonzentration), 5 mM DTT und 40 μl Rohextrakt in einem Endvolumen von 1 ml enthielt, durchgeführt. Der RDX-Abbau wurde durch Überwachung des Verschwindens von RDX durch DC mit Detektion unter Verwendung von Grießschem Reagenz bestimmt. Zur Messung des produzierten Nitrits wurden Proteine durch Zugabe von 2 μl Eisessig ausgefällt und anschließend durch Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge (5 min, 13 000 U/min) entfernt. Die standardmäßige Grieß-Reaktion für Nitrit wurde durchgeführt. RDX-Abbau und damit einhergehende Nitritproduktion wurden beobachtet.
Durch 1 Stunde langes Ultrazentrifugieren des Rohextrakts bei 109 000 g und 4°C (Beckman Optima TLX Ultrazentrifuge TLA 45 Rotor) wurde eine subzelluläre Fraktionierung erreicht, wobei der Überstand die löslichen Proteine und der Niederschlag die Membranfraktion repräsentierten. Der Niederschlag wurde gewaschen und erneut in Puffer 50 mM Tricin, pH 8,0, bis auf eine Konzentration von 2 mg/ml Protein vor den Aktivitätsstudien suspendiert.
Das Vermögen zum Abbau von RDX wurde in beiden Fraktionen beobachtet, wobei die Membranfraktion stärker war.
Die RDX-abbauende Enzymaktivität im löslichen Protein wurde teilweise über einer Q-Sepharose-Säule unter Verwendung von Puffer 50 mM Tris, pH 8,5, und einem Salzgradienten von 0 bis 2 M NaCl gereinigt. Das Protein wurde als einzelner Peak bei etwa 350 mM Natriumchlorid eluiert. Das teilweise gereinigte Protein erwies sich als hitzestabil und wurde in 6 M Harnstoff denaturiert, wobei es sich wieder zurückfaltete, wenn es auf 2 M Harnstoff verdünnt wurde.
Beispiel 3
1. Züchtung von R. rhodochrous und teilweise Reinigung des Enzyms
16 l R. rhodochrous 11Y wurden in 20 mM KH₂PO₄, 0,4% Glucose (Gew./Gew.), 2 ml Spurenelementen (Pfennig & Lippert, siehe oben) und 1 mM RDX als einzige Stickstoffquelle bei 30°C kultiviert. Die Zellen wurden in 2-l-Kolben vermehren gelassen und durch 15 Minuten langes Zentrifugieren, nachdem sie die stationäre Wachstumsphase erreicht hatten, in einer Zentrifuge Sorvall RC5C unter Verwendung eines GS3-Rotors bei 10 000 g und 4°C geerntet. Das Zellpellet (57 g Nassgewicht der Zellen) wurde erneut in 120 ml von 50 mM Tris, pH 8,0, suspendiert. Die Suspension wurde unter Verwendung einer French pressure cell bei 35 000 psi (drei Durchläufe) mit anschließendem Zentrifugieren (Zentrifuge Sorvall RC5C unter Verwendung eines SS-34-Rotors bei 30 000 g und 4°C 30 Minuten lang), um den Zelldebris zu pelletieren, homogenisiert. Der Überstand wurde entfernt und erneut (Beckman XL-90-Ultrazentrifuge unter Verwendung eines Ti-70-Rotors bei 25 000 g und 4°C, 2 Stunden lang) zentrifugiert, um die Bakterienmembranen zu verdichten. Es wurde festgestellt, dass sowohl die Überstände als auch die Pellets das Vermögen zum Abbau von RDX mit Freisetzung von Nitrit, bestimmt durch den Grieß-Versuch, hatten. Der Überstand aus der Hochgeschwindigkeitszentrifugierstufe wurde für eine weitere Aufreinigung verwendet.
Der pH-Wert der Überstandsprobe wurde mit Eisessig auf 3,5 gesenkt und die Probe 30 Minuten lang auf Eis inkubiert. Es wurde festgestellt, dass ~60% des Proteins aus dem Hochgeschwindigkeitsüberstand aggregierten, die weiter durch Zentrifugieren (Sorvall-RC5C-Zentrifuge unter Verwendung eines SS-34-Rotors bei 30 000 g und 4°C, 30 Minuten lang) entfernt wurden. Der pH-Wert des Überstands wurde dann auf 8,0 unter Verwendung von 1 M Natriumhydroxid erhöht und der Extrakt auf die mit RDX verknüpfte Nitritfreisetzung wie in Beispiel 1 beschrieben untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass der größte Teil der Aktivität nach Behandlung mit Eisessig (~75%) löslich blieb. Diese Probe wurde in allen folgenden Versuchen verwendet.
2. Anforderungen an das Substrat
Unter Verwendung des teilweise gereinigten Proteins wurden die Anforderungen an Cofaktoren untersucht. Dabei wurde keine Notwendigkeit für einen Cofaktor wie NADPH oder NADH festgestellt. Die Abhängigkeit des RDX-Abbaus von der Konzentration von Dithiothreitol (DTT) wurde wie folgt untersucht; 26 μg teilweise gereinigtes Protein wurden 10 Minuten lang in Gegenwart von 4 M Harnstoff, 0,3 mM RDX, 50 mM Tricin, pH 8,5, bei 37°C inkubiert. Die DTT-Konzentration wurde variiert und das Endvolumen auf 200 μl gehalten. Der Anteil an freigesetztem Nitrit wurde unter Verwendung eines Spektralphotometers wie in Beispiel 1 beschrieben gemessen. Der Anteil des freigesetzten Nitrits mit der DTT-Konzentration ist in 3 gezeigt. Diese zeigt, dass vorzugsweise das DTT mit ~3 mM DTT vorhanden ist, um die maximale Aktivität zu erreichen. DTT wird verwendet, um ein reduzierendes Milieu aufrechtzuerhalten, nachdem die Zellen aufgerissen worden sind.
3. Löslichkeit und Stabilität
Die Aufkonzentrierung der teilweise gereinigten Enzymlösung unter Verwendung einer Amicon-Ultrafiltrationsanlage (3-kDa- Membranschnitt, 70 psi bei 4°C) führte zu einer Proteinaggregierung und einer Aktivitätsverringerung. Dabei wurde festgestellt, dass das aggregierte Protein in 8 M Harnstoff, 5 mM DTT und 50 mM Tris, pH 8,0, erneut solubilisiert und die Aktivität wiederhergestellt werden konnte.
Die Stabilität der Enzymaktivität in Gegenwart eines starken Denaturierungsmittels wurde durch Untersuchung der Nitritfreisetzung aus RDX in Gegenwart der Proteinprobe mit Harnstoff oder Guanidin-Hydrochlorid gemessen. Die Versuchsbedingungen waren 50 mM Tricin, pH 8,5, 0,3 mM RDX, 5 mM DTT bei 37°C und 10 Minuten lang mit 26 μg Protein, wobei die Nitritfreisetzung wie in Beispiel 1 beschrieben spektralphotometrisch gemessen wurde. Die Abhängigkeit der RDX-Aktivität von der Konzentration des Denaturierungsmittels ist in 4 gezeigt.
Es ist zu entnehmen, dass das Enzym eine unüblich hohe Stabilität bei hohen Konzentrationen an Denaturierungsmitteln besitzt. Die bei Harnstoff beobachtete Differenz der Aktivität, die vorwiegend durch Spaltung von Wasserstoffbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen mit Proteinen wirkt, und Guanidinium-Hydrochlorid, das vorwiegend ionische Wechselwirkungen und zu einem geringeren Maße hydrophobe Wechselwirkungen unterbricht, legen nahe, dass ionische Wechselwirkungen eine größere Rolle bei der Stabilität der Enzymaktivität spielen können.
Da die RDX-abbauende Aktivität durch die Gegenwart von Harnstoff verbessert wurde, wurden alle folgenden Versuche mit 4 M Harnstoff durchgeführt.
Zur Bestimmung der Hitzestabilität der Enzymaktivität wurde die teilweise gereinigte Proteinprobe auf 100°C erhitzt und wurden Proben in verschiedenen Abständen genommen und 10 Minuten lang mit 20 μl kochende Probe, 50 mM Tricin, pH 8,5, 4 M Harnstoff, 5 mM DTT und 0,3 mM RDX bei 37°C untersucht. Die Nitritfreisetzung wurde spektralphotometrisch gemessen, die Ergebnisse sind in 5 dargestellt.
Daraus geht hervor, dass die Enzymaktivität relativ hitzestabil ist und nach 10 Minuten bei 100°C nur ~20% Aktivität verliert.
4. pH-Profil
Das pH-Profil des teilweise gereinigten Extrakts wurde untersucht. Die Versuchsbedingungen waren 50 mM eines geeigneten Puffers, 4 M Harnstoff, 0,3 mM RDX und 5 mM DTT. Die Proben wurden 10 Minuten lang bei 37°C mit 26 μg teilweise gereinigtem Protein inkubiert. Die alkalische Hydrolyse von 0,3 mM RDX wurde auch unter gleichen Bedingungen gemessen und die Ergebnisse in 6 dargestellt. Daraus ist zu entnehmen, dass die Enzymaktivität die Freisetzung von Nitrit aus RDX deutlich erhöht, verglichen mit einem spontanen Abbau über den pH-Bereich.
5. Nitrit- und Formaldehydproduktion
Die Produktion von Nitrit und Formaldehyd aus dem enzymatischen Abbau von RDX wurde in 50 mM Tricin, pH 8,5, 4 M Harnstoff, 0,15 mM RDX und 5 mM DTT bei 37°C mit 26 μg teilweise gereinigtem Extrakt untersucht und der Anteil des freigesetzten Nitrits und des produzierten Formaldehyds unter Verwendung des spektralphotometrischen Standardversuchs, wie in Beispiel 1 beschrieben, gegen die Zeit gemessen.
Die Ergebnisse sind in 7 dargestellt. Die Anteile an aus RDX freigesetztem Formaldehyd und Nitrit waren ähnlich, was nahe legt, dass der Mechanismus des enzymatischen Abbaus von RDX ähnlich demjenigen sein kann, der für die alkalische Hydrolyse von RDX vorgeschlagen wurde (Croce und Okamoto, Journal of Organic Chemistry, Bd. 44, 2100–2103 (1978) und Heilmann et al., Environmental Science Technology, Bd. 30, Nr. 5, 1485–1492 (1996)), wobei die Entfernung einer Nitritgruppe aus RDX ein instabiles Zwischenprodukt bildet, das sich spontan zersetzt und dabei ein Spektrum an kleineren Molekülen, einschließlich Formaldehyd, ergibt.
6. Substratspezifität
Die Substratspezifität wurde untersucht, indem getestet wurde, ob die Enzymaktivität HMX oder PETN, beide Nitrit enthaltende Explo sivstoffe, abbaut. Die Versuche wurden in 50 mM Tricin, 4 M Harnstoff, 0,3 mM Explosivstoff und 5 mM DTT bei 37°C 20 Minuten lang mit 26 μg teilweise gereinigtem Extrakt durchgeführt und die Ergebnisse mit RDX verglichen. Die Ergebnisse sind in 8 dargestellt. Daraus ist zu entnehmen, dass die Enzymaktivität gegen alle diese untersuchten Explosivstoffe aktiv war, aber eine deutliche Bevorzugung (d. h. größere Aktivität) gegenüber RDX bestand.

Claims

Rhodococcus-rhodochrous-11Y-Bakterienstamm, der als "11Y" bezeichnet wird und als NCIMB 40820 hinterlegt worden ist, und Mutanten davon, der/die in der Lage ist/sind, einen Zellextrakt mit einer Enzymaktivität zu produzieren, die Hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (RDX) abbaut.
Zellextrakt mit RDX-abbauender Enzymaktivität, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Freisetzung von Nitrit aus Hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (RDX) katalysiert und aus Zellen von Rhodococcus rhodochrous 11Y NCIMB 40820 nach Patentanspruch 1 oder einem Mutanten davon erhältlich ist.
Verfahren zur Herstellung des Zellextrakts mit RDX-abbauender Enzymaktivität des Anspruchs 2, welches das Kultivieren einer Spezies von Rhodococcus rhodochrous 11Y NCIMB 40820 nach Anspruch 1 oder eines Mutanten davon, das Zerstören der Zellen und Extrahieren des Zellextrakts mit Enzymaktivität aus den zerstörten Zellen umfasst.
Verfahren zum Detektieren von Hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (RDX) in einer Probe, bei dem die Probe der Einwirkung des Zellextraktes mit RDX abbauender Enzymaktivität nach Anspruch 2 ausgesetzt und das von dieser Probe gebildete Nitrit detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Nitrit kolorimetrisch detektiert wird.
Verfahren zum Detektieren von Hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (RDX) in einer Probe, bei dem die Probe der Einwirkung des Zellextraktes mit RDX abbauender Enzymaktivität nach Anspruch 2 ausgesetzt und das von der Probe gebildete Formaldehyd nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Formaldehyd kolorimetrisch detektiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei der Zellextrakt mit RDX abbauender Enzymaktivität gemäß dem Verfahren von Anspruch 3 hergestellt wird und das Verfahren die Stufe einer Dithiothreitol-Zugabe zur Probe umfasst.
Biosensor zur Detektion von Hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (RDX) in einer Probe, welcher ein Mittel zum Kontaktieren der Probe mit dem Zellextrakt mit RDX-abbauender Enzymaktivität nach Anspruch 2, Halten der Probe unter Bedingungen, die für den Abbau des Schadstoffs durch den Zellextrakt mit Enzymaktivität geeignet sind, und Mittel zum Nachweis des Stattfindens einer Reaktion von Hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (RDX), falls Hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (RDX) in der Probe vorhanden ist, die von dem Zellextrakt mit der Enzymaktivität katalysiert wird, umfasst.
Biosensor zur Detektion von Hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (RDX) in einer Probe, welcher Mittel zum Beimpfen der Probe mit einer Kultur des Bakteriumisolats von Rhodococcus rhodochrous wie in Anspruch 1 definiert und Halten der Probe unter Bedingungen, die für den Abbau des Schadstoffs durch das Isolat geeignet sind, und Mittel zum Detektieren des Stattfindens einer Reaktion von Hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (RDX), falls Hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (RDX) in der Probe vorhanden ist, die von dem Isolat katalysiert wird, umfasst.
Biosensor nach Anspruch 9 oder 10, wobei das Mittel zur Detektion des Stattfindens einer Reaktion eine kolorimetrische Veränderung ist.
Verfahren zur biologischen Wiederherstellung einer Umgebung, die mit Hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (RDX) kontaminiert ist, das die Stufen Zugeben einer Menge des Zellextrakts mit RDX abbauender Enzymaktivität nach Anspruch 2 zu der Umgebung und Halten des Gemischs unter Bedingungen, die für den Abbau des Schadstoffs durch den Zellextrakt mit Enzymaktivität geeignet sind, so dass das im Material vorhandene Hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazin (RDX) verbraucht werden kann, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Stufe des Haltens des Gemischs unter Bedingungen, die für den Abbau des Schad stoffs durch den Zellextrakt mit Enzymaktivität geeignet sind, die Zugabe von Dithiothreitol zum Gemisch umfasst.