DE2701890A1

DE2701890A1 - Alpha-amylase-inhibitor aus einem streptomyceten und verfahren zu seiner gewinnung

Info

Publication number: DE2701890A1
Application number: DE19772701890
Authority: DE
Inventors: Volker Dr Oeding; Werner Dr Pfaff; Laszlo Dr Vertesy; Hans-Ludwig Dr Weidemueller
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1977-01-19
Filing date: 1977-01-19
Publication date: 1978-07-27
Also published as: US4226764A; GB1599372A; JPS5390201A; JPS6236040B2; NL7800630A; ES465940A1; DE2701890C2; US4282318A; CA1105404A; FR2378041A1; ATA35578A; AT363891B; FR2378041B1; US4339436A; BE863089A

Description

HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT ~3- 27018^0

Aktenzeichen: HOE 77/F

Datum: 18.01.1977 - Dr.LI/Pa

(fr -AMYLASE-INHIBITOR AUS EINEM STREPTOMYCETEN UND VERFAHREN ZU SEINER GEWINNUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen neuen Inhibitor der Glycosidhydrolasen des Verdauungstraktes, insbesondere der Λ -Amylsae aus Pankreas. Die Erfindung betrifft ferner die Herstellung eines solchen Inhibitors durch Fermentation des spezifischen Mikroorganismus Streptomyces tendae, Stamm 4158, sowie seiner Varianten und Mutanten, den genannten Mikrobenstamm als solchen und auch Verfahren zur Gewinnung des Inhibitors aus dem Fermentationsansatz und zu seiner Reinigung.

Inhibitoren der Glycosidhydrolasen aus Mikroorganismen, besonders aus Actinomyceten sind bekannt. Die bisher näher untersuchten Substanzen gehören chemisch in die Klasse der Oligo- oder Polysaccharide. Entsprechende Inhibitoren mit wahrscheinlichem Peptidcharakter sind als hitzelabil, mehr oder weniger leicht durch Trypsin inaktivierbar und vor allem vergleichsweise weniger aktiv beschrieben.

Es wurde nun in Fermentationsansätzen von Streptomyces tendae, Stamm 4158, ein hochaktiver Hemmstoff der rf^-Amylase aus Pankreas gefunden, der sich chemisch zu den Peptiden einordnen läßt.

Der Inhibitor ist gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht von 5000 bis 10.000, ein Absorptionsmaximum in UV-Licht bei 276 nm, einen isoelektrischen Punkt von 4,4 und eine Aminosäurezusammensetzung wie weiter unten angegeben.

/2

809830/0056

^H 2701880

Der erfindungsgemäße Inhibitor hat ein relativ hohes Molekulargewicht. Er diffundiert nicht oder allenfalls zu einem sehr geringen Teil durch handelsübliche Dialysiermembranen

(Ri
•wie Visking '-Schläuche. Naturgemäß ist die Bestimmung des genauen Molekulargewichts schwierig und man gelangt mit verschiedenen Bestimmungsmethoden zu unterschiedlichen Resulaten. Benützt man zur Molekulargewichtsbestimmung die analytische Ultrazentrifuge (Biochemisches Taschenbuch, 2. Teil, Seite 746 bis 767), so erhält man Werte von ungefähr 10.000. Werden hingegen Molekular-Siebe wie

(R)
Sephadex G-50 superfein verwandt, so ermittelt man ein Molekulargewicht von 5000 oder sogar noch darunter. Es ist demgemäß aufgrund der derzeitig vorliegenden Untersuchungsergebnisse 'ein Molekulargewicht zwischen 5000 und 10.000 anzunehmen.

Die erfindungsemäße Verbindung ist eine farblose Substanz. Sie absorbiert aber ultraviolettes Licht mit einem bei 276 nm liegenden Maximum, das bei 281 nm eine Schulter

1 %
aufweist. E₁ = J_6. Figur 1 gibt ein Absorptionsspektrum wieder.

Der Inhibitor ist seiner chemischen Struktur nach ein Peptid. Er kann durch Hydrolyse in Aminosäuren gespalten werden. Es ist bis jetzt nicht gelungen, neben den Aminosäuren andere Bestandteile nachzuweisen. Bestimmt man die Aminosäurezusammensetzung mit der von St. Moore und W.H. Stein (Methods in Enzymology, Band VI, Seite 819 bis 831, herausgegeben von Colovick und Kaplan in Academic Press, New York, London 1963) angegebenen Methode, so kann man folgende Zusammensetzung ermitteln:

Asparaginsäure 5-6

Threonin ⁵~⁶

Serin 3-5

Glutaminsäure ⁵~⁶

Prolin 2-3

Alanin 5-f

Glycin 5-6

809830/0055

270'iaW

Cystein	3-4
Valin	5-6
Isoleucin	1-2
Leucin	3-4
Tyrosin	4-5
Phenylalanin	0-2
Histidin	1-2
Lysin	0-1
Arginin	2-3
Tryptophan	1-2

Der Wert von Tryptophan wurde aus der Absorption von ultraviolettem Licht geschätzt. Es ist naturgemäß, daß die Ergebnisse der Aminosäure-Untersuchung nicht immer auf ein einziges ganzzahliges Mengenverhältnis deuten, und daß derartige Messungen allgemein mit gewissen Fehlern behaftfet sind. Demgemäß beruhen die in der Aufzählung wiedergegebenen Variationsgrenzen nicht auf einer Uneinheitlichkeit des Inhibitors, sondern auf der unvermeidlichen Meßungenauigkeit des Analysenverfahrens. Kennzeichnend für den erfindungsgemäßen Inhibitor ist aber, daß die Aminosäuren Apsparaginsäure, Glutaminsäure, Threonin, Glycin, Alanin und Valin einen überdurchschnittlich hohen molekularen Anteil des Peptids einnehmen und daß Methionin in der reinen Substanz gänzlich zu fehlen scheint. Da Methionin eine weit verbreitete Aminosäure ist, ist ihre weitgehende Abwesenheit ein gutes Kennzeichnungsmerkmal für den erfindungsgemäßen Inhibitor und kann insbesondere auch bei Anreicherungsverfahren zur Reinheitsermittlung des Produkts dienen.

Der erfindungsemäße Inhibitor reagiert positiv auf Peptidreagenzien aber negativ auf Phenol-Schwefelsäure.

Der erfindungsgemäße cC-Amylase-Inhibitor enthält keinen Zuckeranteil. Dadurch, sowie durch seine Aminosäurezusammensetzung, sein Molekulargewicht und seinem isoelektrischen Punkt unterscheidet er sich von allen bekannten c£ -Amylase-

809830/0055

Inhibitoren. Reine PräDarate des Inhibitors weisen eine Aktivität von 2 bis 3 χ 10⁶ AIE/g auf.

Für eine Substanz von Peptidnatur weist der beanspruchte Amylaseinhibitor eine bemerkenswerte thermische Stabilität auf. Selbst Kochen in einem neutralen oder schwachsauren Medium (pH etwa 4-8) während einer Minute ist auf seine glucosihydrolase-hemmenden Eigenschaften ohne nennenswerten Einfluß.

Der Inhibitor wird durch Pepsin, Trypsin oder Chymotrypsin im Vergleich zu anderen Proteinen nur sehr langsam proteolytisch inaktiviert. Während des therapeutischen Wirkungszeitraums ist daher nicht mit einer nennenswerten Aktivitätsverminderung im Verdauungstrakt zu rechnen.

Der Inhibitor weist eine hohe Wirkungsspezifität auf. Die rfä -Amylase aus Pankreas wird außerordertlich stark gehemmt, während demgegenüber bakterielle c£ -Amylasen, z.B. solche aus Bacillus subtilis, nicht meßbar inhibiert werden. Desgleichen ist keine Wirkung gegen ß-Amylasen beobachtet worden.

Schon geringe Dosierungen des erfindungsgemäßen Amylaseinhibitors führen zu einer vollständigen Hemmung der enzymatischen Aktivität der Pankreasamylase. Dieser Befund ist mit den klassischen Hemroechanismen nicht zu erklären, bei denen die Hemmung der enzymatischen Katalyse vom relativen Mengenverhältnis von Inhibitor und Substrat (Stärke) abhängt. Es muß vielmehr eine irreversible Inaktivierung der Pankreasamylase durch den erfindungsgemäßen Inhibitor angenommen werden.

Zur Herstellung des Amylaseinhibitors bedient man sich erfindungsgemäß des Stammes Streptomyces tendae 4158. Dieser Stamm unterscheidet sich vom Originalstamro S. tendae (Ettlinger et al., Arch. Mikrobiol. 31, 351 (1959)) hinsichtlich seiner Sporen-Morphologie. Die Sporen sind kugelförmig und haben einen Durchmesser von 1 μ. Die Eigenschaften des Stammes sind wie folgt:

809830/0055

- Sr-

Farbe des Substratmycels:	gelb-braun; keine Farbver änderung durch pH-Verschiebung
Farbe des versporten Luft- mycels:	grau-braun (light grayish redish brown nach: ISCC methods of designating colors)
Morphologie der Sporen ketten : ·	Retinaculum apertum (RA)
Sporenmorphologie:	kugelförmige Sporen mit einem durchschnittlichen Durch messer von 1 μ. Glatte bis leicht warzige Oberfläche.
Melaninbildung auf Pepton- medium:	positiv
Nitratreduktion:	positiv
Substratverwertungs- Spektrum:	Glucose ++ Arabinose + Saccharose + Xylose + Inositol ++ Mannitol ++ Fructose + Rhamnose ++ Raffinose +- Cellulose -

Der Stamm Streptomyces tendae 4158 ist bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Registrier Nr. 31210 hinterlegt.

/6

809830/0055

2?o

Die Fermentation kann bei 25 bis 35°C, vorzugsweise bei 28 bis 3O°C, entweder submers in Schüttelkultur oder in verschieden großen Fermentationsgefäßen unter Rührung und Belüftung durchgeführt werden.

Als Kulturmedium hat sich eine Kombination von Kohlenstoff- und Stickstoffquellen besonders bewährt. Ein solches Kulturmedium enthält z.B. neben den bei der Kultur von Mikroorganismen üblicherweise angewandten anorganischen Salzen mindestens eine Kohlenstoffquelle wie Stärke, Glucose, Rohrzucker, Fruktose, Lactose, Glycerin oder Melasse sowie mindestens eine Stickstoffquelle wie Sojamehl, Cornsteep liquor, Hefeextrakt, Baumwollsamenmehl, Erdnußmehl, Peptone, Milchpulver, Nitrate oder Ammoniumsalze.

Als optimale Zusammensetzung hat sich erwiesen (Gewichts % in Lösung) 3-5 % lösliche Stärke, 0,2 -0,6 % Cornsteep, 0,5-1,5 % Glucose, 0,5-1 % (NH₄J₂HPO₄, 0,3-0,6 % Sojamehl, 0/5-1,5 % Caseinpepton. Auch auf anderen stärkehaltigen Nährmedien, z.B. einem solchen aus 2-6 % Erdnußmehl, 1-3 % Kartoffelstärke, 3-5 % Hafermehl, 3-5 % Molkepulver, 1-2 % Molkensirup, 1-2 % Molkensirup, 1-2 % Milchzucker wird der Amylaseinhibitor in guten Ausbeuten erhalten, wobei die Wahl der Stickstoffquelle und des Pufferanteils, sofern man in physiologischen Bereichen ist, nicht so entscheidend ist. Wird jedoch der Gehalt an Stärke vermindert oder ganz gestrichen, so geht die Inhibitorenausbeute drastisch zurück. Erhöht man andererseits die Stärkekonzentration wesentlich über 7 %, so wird aufgrund der hohen Viskosität die Sauerstoff-Versorgung der Mikroorganismen suboptimal. Damit verbunden sinkt die Inhibitorausbeute.

Im Fermentationsansatz setzt die Bildung des Inhibitors in der Regel zwischen der 10. und 30. Stunde der Fermentation ein. Innerhalb der nächsten 20 Stunden wird sie weitgehend abgeschlossen. Längere Fermentationszeiten haben keinen nachteiligen Einfluß auf die Inhibitorausbeute, jedoch

809830/0058 ^/7

erhöht sich diese auch nicht mehr nennenswert. Daraus ergibt sich, dass die Fermentationsansätze etwa 30 - 70 Stunden in Betrieb zu halten sind.

Zur Isolierung des Inhibitors wird aus der Fermentationslösung die Zellmasse durch Zentrifugieren, Filtrieren oder Nutschen entfernt, da sich der größte Teil des Wirkstoffes in der Regel in der klaren Kulturflüssigkeit befindet.

Falls aufgrund spezieller Fermentationsbedingungen ein Teil des Inhibitors im Zellmaterial verbleibt, so bereitet es keine Schwierigkeiten, den Wirkstoff durch geeignete Methoden daraus zu extrahieren, z.B. durch Ausrühren mit einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel wie Methanol, wobei ein zusätzliches Mazerieren des Zellmaterials von Vorteil ist. Der im Extraktionsmittel gelöste Wirkstoff kann mittels Zentrifugieren oder Filtrieren von den ungelösten Zellbestandteilen befreit und wie die klare Kulturflüssigkeit weiterbearbeitet werden.

Aus der Kulturflüssigkeit läßt sich der Inhibitor durch an sich bekannte Verfahren der Protein- und Peptidchemie isolieren. So eignen sich Fällungen mit wasser-mischbaren organischen Lösungsmitteln wie Aceton, Isopropanol oder anderen niederen Alkoholen, oder auch mit Salzen, wie Ammoniumsulfat.

Es ist weiter möglich, den Inhibitor auf entsprechende Träger, z.B. auf Aktivkohle zu adsorbieren und diese durch Filtration oder Zentrifugation aus der wässrigen Lösung abzuscheiden. Das kann in einem weiten pH-Bereich zwischen 2 bis 10 geschehen, vorzugsweise benützt man aber den Bereich zwischen pH 4 bis 6. Ionenaustauscher können zur Abtrennung des erfindungsgemäßen (^-Amylase-Inhibitors ebenfalls angewandt werden. Da die beanspruchte Substanz sowohl saure als auch basische Eigenschaften hat, also amphoter ist, kann sie sowohl mit Kationen- als auch mit Anionenaustauschern reagieren und mit Hilfe dieser aus der Fermentationslösung entfernt werden. Hierbei können die Techniken angewandt

809830/0055

-JSr-

^ 2701680

werden, die im Prinzip im Kapital über Ionenaustauscher im Biochemischen Taschenbuch, herausgegeben von H.M. Rauen im Springer-Verlag 1964, 2. Teil, Seite 808-824, beschrieben sind.

Bei der Aufarbeitung von Fermentationsansätzen, die die erfindungsgemäße Substanz in der Kulturflüssigkeit enthalten, ist es häufig zweckmässig, diese zu konzentrieren. Hierzu können die bekannten Verfahren für Destillation, Ultrafiltration ι Sprüh- und Gefriertrocknung oder andere bekannte Methoden herangezogen werden. Aus dem so erhaltenen Konzentrat lässt sich der Inhibitor wieder mit den oben beschriebenen Verfahren abtrennen. Aus Konzentraten, wie sie die eingeengten Kulturfiltrate darstellen, kann der Inhibitor auch dadurch angereichert werden, dass die wesentlichen Verunreinigungen entfernt werden. So haben sich zur Abtrennung von fettartigen Stoffen Extraktionen mit organischen Lösungsmitteln bewährt. Durch Dialyse oder gegebenenfalls Ultrafiltration (C.J.O.Rund P.Morris "Separation methods in Biochemistry" Ditman Publishing, London 1976, Seiten 944-950) kann die Lösung von niedermolekularen Substanzen befreit werden. Hochmolekulare Stoffe, wie Nucleinsäuren, Polysaccharide oder manche Eiweißstoffe können mittels fraktionierter Fällung durch Aussalzen oder durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, wie Aceton oder eines niederen Alkohols abgesondert werden. Die Zugabe des Fällungsmittels wird in diesen Fällen so dosiert, daß die leicht präzipitierbaren Stoffe mit Molekulargewichten über 100.000 ausgefällt werden, während der c^-Amylase-Inhibitor in Lösung bleibt.'Die geschilderten Anreicherungsschritte können in beliebiger Reihenfolge kombiniert und variiert werden. Auf diese Weise gelangt man zu Lösungen, die an Inhibitor stark angereichert sind.

Die Endreinigung kann mit verschiedenen gezielten Verfahren, wie Gel- und Ionenaustauscherchromatographie erfolgen oder mit verwandten Verfahren, deren Trennprinzip nicht ausschliesslich auf Ionenaustausch beruht, wie z.B. die Trennung an Hydroxylapatit. Weiterhin können Lösungsmittel- oder Salzfällungen, präparative Elektrophorese oder andere ansich be-

809830/0055 ^/9

- Jär-

kannte Verfahren angewandt werden.Besonders bewährt haben sich Trennungen an Diäthylaminoäthyl-(DEAE-)-Gruppen tragenden Ionenaustauschern sowie fraktionierte Fällungen mit Ammoniumsulfat oder Äthanol, wobei sogar kristallines Material erhalten werden kann.

Die Eigenschaften des erfindungsgemäßen Inhibitors sind im Hinblick auf seine Anwendung als Therapeutikum gegen Diabetes und Prädiabetes sowie Adipositas und Unterstützung von Diät interessant.

Stärkehaltige Nahrungs- und Genußmittel führen bei Tier und Mensch zu einem Anstieg des Blutzuckers und dadurch auch zu einer vermehrten Insulinsekretion des Pankreas. Die Hyperglykämie kommt durch die Aufspaltung der Stärke im Verdauungstrakt unter Einwirkung von Amylase und Maltase zu Glukose zustande.

Bei Diabetikern ist diese Hyperglykämie besonders ausgeprägt und langanhaltend.

Bei Adipösen wirkt die vermehrte Insulinsektretion auf die Lipogenese und vermindert die Lipolyse.

Die alimentäre Hyperglykämie sowie die Hyperinsulinämie nach Stärkeaufnahme lässt sich durch den beanspruchten Amylase-Inhibitor vermindern. Diese Wirkung ist dosisabhängig. Der erfindungsgemässe Amylase-Inhibitor lässt sich daher als Therapeuticum einsetzen bei Diabetes, Prädiabetes und Adipositas sowie zur Unterstützung von Diät. Zu diesem Zweck empfiehlt sich eine Verabreichung, insbesondere zu den Mahlzeiten. Die Dosierung, die sich nach dem Gewicht des Patienten sowie dem individuellen Bedarf ausrichten soll, beträgt etwa 10.000 bis 300.000 AIE, sie kann jedoch in begründeten Einzelfällen auch darüber oder darunter liegen.

Der erfindungsgemäße Amylase-Inhibitor eignet sich insbesondere zur oralen Verabreichung. Er kann als reine Substanz aber auch in Form einer.pharmazeutischen Zubereitung unter Verwendung der üblichen Hilfs- und Trägerstoffe angewandt werden.

809830/0055

27Q18.&Ü ,

Auch eine kombinierte Anwendung mit anderen Arzneimitteln wie blutzuckersenkenden oder lipidsenkenden Substanzen kann von Vorteil sein. Da höhermolekulare Peptide als solche nicht oder nicht nennenswert aus dem Verdauungstrakt resorbiert werden, sind von der erfindungsgemäßen Substanz keine toxikologisch bedenklichen Nebenwirkungen zu erwarten. Aufgrund der nicht außergewöhnlichen Aminosäurezusammensetzung sind auch evtl. proteolytische Spaltprodukte als physiologisch unbedenklich anzusehen. Dementsprechend konnten bei oraler Gabe auch hoher Dosen des Amylaseinhibitors an Versuchstiere keine auffälligen Symtome erkannt werden. Auch bei intravenöser Applikation an Mäusen (1 g/kg) wurde der erfindungsgemäße Inhibitor bei 24-stündiger Beobachtungszeit ohne erkennbare toxische Wirkung vertragen.

Zur Prüfung der pharmakologischen Wirkung des Amylaseinhibitors erhielten nüchterne, männliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht zwischen 2OO und 25Og den erfindungsgemäßen Hemmstoff gleichzeitig mit 2 g Stärke pro kg Körpergewicht oral verabreicht, nachdem unmittelbar zuvor eine Blutentnahme zur Bestimmung des Ausgangsblutzuckerwertes erfolgte. Weitere Bitentnahmen erfolgten nach 15 und 30 Minuten sowie nach 1,2,3 und 5 Stunden aus der Schwanzvene. Die Blutzuckerbestimmungen wurden nach der Methode von Hoffman im Autoanalyzer (J. Biol. Chem. 120, 51 (1937) durchgeführt.

NZO-Mäuse weisen eine gestörte Glucosetoleranz auf. Sie eignen sich deshalb,besonders gut für Untersuchungen bei denen der Blutglucosespiegel beeinflußt wird. Die Versuchsanordnung entspricht der bei Ratten. Die Blutentnahme erfolgt aus dem Orbitalvenen-Plexus. Der Blutzuckerverlauf wird über 3 Stunden verfolgt.

In analoger Weise wird der Wirkstoffnachweis an NMRI-Mäusen erbracht. Die Blutentnahmen erfolgen ebenfalls aus dem Orbitalvenen-Plexus und der Blutzuckerverlauf wird über 3 Stunden verfolgt.

Unter diesen Versuchsanordnungen zeigten die mit dem erfindungemäßen Inhibitor behandelten Tiere einen gegenüber unbehandelten Tieren geringeren, protrahierten Blutzuckeranstieg.

809830/0055

-73

Amylasetest

Eine Amylase-Inhibitoreinheit (AIE) ist definiert als die Inhibitormenge, die unter den Testbedingungen zwei Amylaseeinheiten (AE) zu 50 % zu hemmen vermag. Eine Amylaseeinheit ist nach internationaler Übereinkunft die Enzymmenge, die in einer Minute 1 μ Äquivalent glucosidischer Bindungen in der Stärke spaltet. Die μ VaI gespaltener glucosidischer Bindungen werden als iiVal reduzierender Zucker photometrisch mit Dinitrosalizylsäure bestimmt. Die Angaben sind als μΜοΙβ Maltose berechnet, die anhand einer Maltose-Eichgeraden ermittelt werden.
Die Teste werden folgendermaßen durchgeführt:

cC-Amylase aus Schweinepankreas und die zu testende Lösung werden gemeinsam in 1,0 ml 20 mM Phosphatpuffer, pH 6.9 + 10 mM NaCl 10-20 min. bei 37°C vorinkubiert. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe von 1,0 ml löslicher Stärke nach Zulkowski (0.25 % in dem angegebenen Puffer) gestartet. Nach genau 10 min. wird die Reaktion mit 2.0 ml Dinitrosali-.^Zylsäure-Farbreagenz (nach Boehringer Mannheim: Biochemica-Information II) abgestoppt und zur Farbentwicklung 5 min. im siedenden Wasserbad erhitzt. Nach dem Abkühlen wird die Extinktion bei 546 nm gegen den Reagentienleerwert gemessen. Die 50 %ige Hemmung wird im Vergleich zur ungehemmten Enzymreaktion durch Einsatz verschiedener Inhibitormengen graphisch mittels der Wahrscheinlichkeitsauftragung bestimmt.

Beispiel 1

Der Stamm Streptomyces tendae 4158 wird auf Schrägröhrchen mit einem Nährboden folgender Zusammensetzung geimpft:

50 g Haferflocken

ad. 1000 ml H₃O pH_A 7,2

Das beimpfte Röhrchen wird 7 Tage bei 30°C bebrütet und danach bei +4 C gehalten. Die Sporen werden mit 1O ml sterilisiertem A. dest. oder physiologischer NaCl-Lösung von dem Schrägröhrchen abgeschwemmt. 1,0 ml der Suspension

809830/0055 /12

270 183Q

dient zur Beimpfung eines 300 ml Erlenmeyerkolbens, der mit 35 ml sterilisierter Nährlösung mit einem pH-Wert von 7,7 und folgender Zusammensetzung beschickt ist:

1 %' Glucose

1 % Sojamehl

0,25 % NaCl pH 7,7.

Der Kolben wird bei 220 Upm 48 Stunden bei +30⁰C auf einer Schüttelmaschine bei einer Amplitude von 4 cm geschüttelt. Danach werden je 5 ml dieser Vorkulta r in mehrere Erlenmeyer kolben überführt, die mit 35 ml sterilisierter Nährlösung beschickt sind und einen pH-Wert von 8.3 haben. Die Zusammensetzung dieser Hauptkultur ist folgende:

4	% Stärke
0,4	% Cornsteep liq.
1,0	% Glucose
0,8	% (NH₄J₂HPO₄
0,4	% Sojamehl
1,0	% Pepton pH_A 8,3.

Die Hauptkulturen werden ebenfalls bei +30⁰C mit 220 Upm auf einer Schüttelmaschine mit einer Amplitude von 4 cm 2-3 Tage geschüttelt. Am ersten, zweiten und dritten Kulturtag wird der Gehalt an cC-Amylase-Inhibitor gemäß Testvorschrift bestimmt.

Der Stamm Streptomyces tendae4158 liefert unter den beschriebenen Versuchs- und Kulturbedingungen durchschnittlich 1OO ΑΕΙ/ml bei einem End-pH von 5.2.

Beispiel 2

Ansatz wie im Beispiel 1, jedoch wird als Hauptkultur ein Permentationsgefäß von 300 1 Gesamtvolumen gewählt, das mit 200 1 einer sterilisierten Nährlösung folgender Zusammensetzung beschickt ist:

/13

809830/0055

4	% Stärke	pH- 8.3-8.5.
0,4	% Cornsteep liq.
1,0	% Glucose
0,8	% (NH₄J₂HPO₄
1,0	% Caseinpepton
0,1	% Desmophen

Die Sterilisationszeit für den Ansatz beträgt 45 min. bei 121°C und 1 bar, wobei die Glucose separat sterilisiert und nach Abkühlung des Fermenters auf Betriebstemperatur steril zugeführt wurde.

Der pH-Wert soll nach der Sterilisation 6.8 betragen und wird nach Bedarf mit sterilisierter Säure(2 η H₃PO₄) oder Lauge(2 η NaOH) auf diesen Wert eingestellt. Beimpft wird die Hauptstufe mit 20 1 entsprechend 10 % einer wie unter BeisDiel 1 beschriebenen und in einem Kleinfermenter von 30 1 Totalvolumen hergestellten Vorkultur.

Es wird 50 bis 70 Std. bei 30°C fermentiert. Die Belüftung beträgt 6 m /hr bei einer Rührung von 250 Uj^nt und einem überdruck von 0,3 bar.

Durch die Probenahme wird der Fermentationsverlauf hinsichtlich der Inhibitoraktivität, des Substratabbaues, der Biomasseentwicklung und des physikalisch-technischen Verhaltens der Kulturlösung (Oberflächenspannung, Viskosität, Dichte, osmotischer Druck) überwacht und verfolgt.

Die maximale Inhibitoraktivität wird ab der 60. Kulturstunde mit durchschnittlich 105 AIE/ml erreicht. Danach wird der Permenterinhalt der Aufarbeitung zugeführt.

Beispiel 3

Ansatz wie in Beispiel 1 und Beispiel 2. jedoch wird als Hauptstufe ein Bioreaktor von 4000 1 Gesamtvolumen benutzt, der mit 2500 1 folgender Nährlösung beschickt ist:

/14

809830/00 5.5

	- yr- 16	pH_A 7.0-7.3
6	% Stärke
1,0	% Glucose
0,4	% Cornsteep liq.
0,8	% (NH₄)₂HPO₄
1,0	% Soypepton
0,1	% Desmophen

Die .Sterilisationszeit für diesen Ansatz beträgt 60 min. bei 121°C und 1 bar, wobei die Glucose separat sterilfiltriert und nach Abkühlung des Permenters auf Betriebstemperatur diesem unter sterilen Bedingungen zugepumpt wird.

Der pH-Wert wird -wenn nötig- mit steriler Säure (H₃PO₄) oder Lauge (NaOH) auf einen Anfangswert von 7.0 - 7.3 eingestellt.

Beimpft wird mit 200 1 einer unter Beisniel 2 beschriebenen und hergestellten Vorkultur.

Die Fermentationszeit beträgt 70 Std., wobei bei einer Temperatur von 3O°C, einer Belüftung von 60 Nm /hr, einem überdruck von 0,5 bar und bei 180 Upm fermentiert wird.

Durch Probenahme - wie unter Beispiel 2 beschrieben- werden alle wichtigen Prozeß-, Organismen- unu Aktivitätsdaten über die gesamte Fermentationszeit verfolgt. Nach 70stündiger Fermentation ist eine durchschnittliche Aktivitätskonzentration von 95 AIE/ml erreicht. Die Fermentation wird daraufhin abgebrochen und die Kulturlösung der Aufarbeitung zugeführt.

Beispiel 4;

10 1 einer filtrierten Kulturflüssigkeit mit einer Wirksamkeit von 100 AIE /ml wird in einem Sprühtrockner getrocknet und ergibt 400 g eines hellbraunen Pulvers. Dieses wird dann zur Entfettung mit einer Mischung von 1 1 Methanol und 1 1 Chloroform gründlich durchgerührt und anschliessend abgenutscht. Das noch lösungsmittelfeuchte, ungelöste Produkt in dem die Wirksubstanz enthalten ist, wird in 3 1 Wasser gelöst, auf pH 6,5 gestellt und mit 4,5

809830/OOB5

/15

27018*0

Methanol versetzt. Es entsteht hierbei ein heller, flockiger Niederschlag, der durch Zentrifugieren entfernt und verworfen wird, da er nur vernachlässigbare Mengen des c6 -Amylasehenunstoffes enthält. Der dunkle überstand der Methanolfällung, der den gewünschten Inhibitor enthält, wird dann im Vakuum vom Methanol befreit und die nun auf 2,5 1 aufkonzentrierte Lösung gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Das Retenat enthält 9 g Trockensubstanz (spez. Aktivität 96 AIE/mg). Das Retenat wird anschliessend bei pH 5,5 mit Ammoniumsulfat auf 50 % Sättigung gebracht, wozu bei 250 ml 79 g des Salzes erfoderlich sind. Bei dem Aussalzen entsteht ein Niederschlag, der rund 90 % der aktiven Substanz enthält. Nach dem Zentrifugieren wird der überstand verworfen. Den Niederschlag löst man erneut in destilliertem Wasser und bei pH 8 wird wieder mit Ammoniumsulfat versetzt, aber diesmal zunächst nur bis zu 15 % Sättigung und nach Entfernen des Niederschlages weiter bis 35 % Sättigung. Der Niederschlag der Aussalzung zwischen 15 und 35 % beinhaltete die Hauptmenge des Amylaseinhibitors. Diese fraktionierte Fällung wird wiederholt. Das entstandene Produkt ist nach Dialyse und Trocknung 360 mg mit einer spez. Aktivität von 992 AIE/mg.

(R) 350 mg dieser Rohsubstanz werden dann in Sephadex G-50 fine in einer 100 cm langen und 1,2 1 fassenden Glassäule aufgetrennt und angereichert. Als Quell- und Elutionsmittel dient wässrige 5 Millimolar-Phosphatpufferlösung von pH 8, dem 0,02 % Natriumazid zugesetzt worden ist. Die Rohsubstanz wird in 15 ml des gleichen Puffers gelöst und auf die Säule aufgetragen. Die Elution erfolgt während zwei Tagen, wobei Fraktionen von 15 ml Inhalt abgenommen werden. Die vier aktivsten Fraktionen werden gesammelt, salzfrei dialysiert und gefriergetrocknet. Sie ergeben 60 mg eines weißen Pulvers mit einer Aktivität von 2520 AIE oC-Amy inhibitor/mg.

/16

809830/0055

2V018S0

Beispiel 5

2200 1 Kulturflüssigkeit werden auf 6° gekühlt und nach Zusetzung von 2 % Kieselgur über einer Kammerpresse filtriert. Der Filterkuchen (ca. 450 kg feucht) wird verworfen, das klare Filtrat (1750 1 mit einer Aktivität von 95 AIE/ml) wird nach Zugabe von 500 g Natriumazid über einen Fallstromverdampfer auf 120 1 eingeengt. Das erhaltene Konzentrat wird auf 1°C gekühlt und mit 120 1 vorgekühltem Aceton langsam unter Rühren versetzt. Zur vollständigen Fällung wird dann noch 1/4 Stunde gerührt und nach Zugabe von 1 kg Kieselgur über eine Schenkpresse geklärt. Der Feststoff mit dem Filterhilfsmittel wird verworfen. Das acetonische Filtrat, das die Wirksubstanz enthält, wird unter Rühren und Kühlen mit 380 1 Aceton vermengt, wodurch eine ungefähr 80 %ige acetonische Suspension entsteht. Der entstandene (2.) Niederschlag enthält den gewünschten Amylaseinhibitor. Er wird dadurch gewonnen, dass man die Fällungsflüssigkeit ohne Rühren stehen läßt. Hierbei sinkt der Niederschlag ab und der überstand kann abgehebert werden. Aus dem überstand dieser zweiten Acetonfällung können geringe. Mengen Niederschlag durch Zentrifugation abgetrennt werden. Dieser Feststoff wird bei pH 7 gelöst und der Lösung des Niederschlages (siehe unten) zugesetzt. Der im Fällungskessel verbleibende Hauptniederschlag wird in 120 1 Wasser bei pH 7 gelöst und die entstandene Lösung mit einer Durchlaufzentrifuge (Cepa*^R), 1700 Upm) geklärt. Dabei werden 90 g inaktive Schwebeteilchen entfernt. Die klare Wasserphase wird nun mit einer DDS-Ultrafiltrationsanlage (Membran Nr. 8OO) auf 15 1 konzentriert und dialysiert. Um die Entsalzung zu vervollständigen, wird das Retenat mit destilliertem Wasser verdünnt und erneut konzentriert. Nach zwei- bis dreimaliger Wiederholung ist das Retenat, in dem der Amylaseinhibitor enthalten ist, praktisch salzfrei. Aus 50 1 Lösung des Retenats wird dann der Hemmstoff bei pH 5,5 durch Zugabe von 19,5 kg Ammoniumsulfat gefällt, abzentrifugiert und der überstand verworfen. Der Niederschlag wird erneut in 40 1 Wasser gelöst

809830/0055 ^/17

und diesmal bei pH 7,5 mit 12,5 kg Ammoniumsulfat präzipitiert. Nach der Abtrennung der Klarphase in einer Röhrenzentrifuge .wird der Niederschlag wie im Beispiel 4 fraktioniert gefällt: Aus 4O 1 der wieder aufgelösten Substanz wird bei pH 5,5 durch Zugabe von 3,2 kg Ammoniumsulfat zunächst ein inaktiver Niederschlag gefällt, der abgetrennt und verworfen wird. Dann wird durch weiteres Aufkonzentrieren der flüssigen Phase mit 7,4 kg Ammoniumsulfat der Hauptteil der Aktivität aus der Flüssigkeit abgeschieden. Dieser Niederschlag wird gesammelt, gegen destillisertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet. Es resultieren 114 g eines braunen Pulvers mit einer Aktivität von 11OO AIE/mg.

Zur weiteren Auftrennung wird eine Glassäule von 5 cm 0

und 50 cm Höhe (ungefähr 1 1 Inhalt) mit DEAE-Sephadex A-25*^R* gefüllt, das vorher mit J^ molarem Phosphorpuffer auf pH 7,5

30
und 0,02 %igem Natriumazid equilibriert worden ist. Nun werden IO g Substanz gelöst in 100 ml des gleichen Puffers und auf die Säule aufgetragen. Zunächst wäscht man die Säule mit 1 1 des gleichen Puffers, dann wird zu diesem Elutionsmittel allmählich Kochsalz so zugemischt, dass ein kontinuierlicher Gradient gewährleistet ist. Wird der Säulenausfluß fraktioniert aufgefangen, so befindet sich der Amylaseinhibitor in den Fraktionen, in denen die NaCl-Konzentration etwa 0,5 molar ist.

Diese Fraktionen werden gesammelt und gegen destilliertes Hasser dialysiert. Die Gefriertrocknung ergibt 5,6 g hellbraune Substanz mit einer Wirksamkeit von 22OO AIE/mg.

Hierauf wird noch eine gelchromatographische Reinigung - wie im Beispiel 4 beschrieben - angeschlossen. Aus den 5,6 g Material resultieren 4,1 g eines farblosen Pulvers, dessen Aktivität 2800 AIE/mg beträgt. Die Aminosäureanalyse des Produktes ergibt nach einer 20-stündigen Salzsäurehydrolyse mit Hilfe eines Beckman-Multichromanalysators folgende Zu-. sammensetzung:

809830/0055

30- 270Ί890

Asparaginsäure	7,72
Threonin	7,66
Serin	5,35
Glutaminsäure	10,05
Prolin	3,43
Glycin	4,93
Alanin	5,84
1/2 Cystein	4,26
Valin	7,72
Methionin	0,41
Isoleucin	2,30
Leucin	5,18
Tyrosin	10,24
Phenylalanin	3,35
Histidin	3,01
Lysin	1,45
Arginin	5,16

809830/0055

Claims

Patentansprüche

Peptidischer Glyccaidhydrolase-Inhibitor, gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht von 5000 bis 10.000, ein Absorptionsmaximum im UV-Licht bei 276 nm, einen isoelektrischen Punkt von 4.4 und folgender Aminosäure-Zusammensetzung:

Asparaginsäure 5-6 Isoleucin 1-2

Threonin 5-6 Leucin 3-4 Serin 3-5 Tyrosin 4-5 Glutaminsäure 5-6 Phenylalanin 0-2 Prolin 2-3 Histidin 1 - 2 Glycin 5-6 Lysin 0 - 1 Alanin 5-6 Arginin 2-3 Cystein 3-4 Tryptophan 1 - 2 Valin 5-6
2. Verfahren zur Herstellung eines peptidischen Glucosidhydrolase-Inhibitors gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces tendea 4158 (ATCC Nr. 31210) kultiviert und aus der Kultur den Inhibitor gewinnt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces tendea 4158 in einem Kulturmedium kultiviert, das mindestens eine Kohlenstoffquelle, mindestens eine Stickstoffquelle und organische Salze enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium 3 - 5 % lösliche Stärke; 0,2 - 0,6 % Cornsteep; 0,5 - 1,5 % Glucose; 0,5 - 1 % Na₂HPO₄; 0,3 - 0,6 % Sojamehl und 0,5 - 1,5 % Caseinpeton enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium 2 - 6 % Erdnußmehl; 1 - 3 % Kartoffelstärke; 3 - 5 % Hafermehl; 3 - 5 % Molkepulver; 1 - 2 % Molkensirup und 1 - 2 % Milchzucker enthält.

/21

809830/0055

ORIGINAL INSPECTED

HOE
6. Streptomyces tendea 4158 (ATCC Nr. 31210)
7. Verwendung des Inhibitors gemäss Anspruch 1, als Mittel zur Regulierung des Blutzuckerspiegels.
8. Mittel zur Regulierung des Blutzuckerspiegels, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem peptidischen Glycosidhydrolase-Inhibitor gemäss Anspruch 1.

8098 3 0/0055