DE2701890A1 - Alpha-amylase-inhibitor aus einem streptomyceten und verfahren zu seiner gewinnung - Google Patents
Alpha-amylase-inhibitor aus einem streptomyceten und verfahren zu seiner gewinnungInfo
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Description
HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT ~3- 27018^0
Datum: 18.01.1977 - Dr.LI/Pa
(fr -AMYLASE-INHIBITOR AUS EINEM STREPTOMYCETEN UND VERFAHREN
ZU SEINER GEWINNUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen neuen Inhibitor der Glycosidhydrolasen des Verdauungstraktes,
insbesondere der Λ -Amylsae aus Pankreas. Die Erfindung
betrifft ferner die Herstellung eines solchen Inhibitors durch Fermentation des spezifischen Mikroorganismus
Streptomyces tendae, Stamm 4158, sowie seiner Varianten und Mutanten, den genannten Mikrobenstamm als solchen und
auch Verfahren zur Gewinnung des Inhibitors aus dem Fermentationsansatz und zu seiner Reinigung.
Inhibitoren der Glycosidhydrolasen aus Mikroorganismen, besonders aus Actinomyceten sind bekannt. Die bisher näher
untersuchten Substanzen gehören chemisch in die Klasse der Oligo- oder Polysaccharide. Entsprechende Inhibitoren mit
wahrscheinlichem Peptidcharakter sind als hitzelabil, mehr oder weniger leicht durch Trypsin inaktivierbar und vor
allem vergleichsweise weniger aktiv beschrieben.
Es wurde nun in Fermentationsansätzen von Streptomyces tendae, Stamm 4158, ein hochaktiver Hemmstoff der rf^-Amylase
aus Pankreas gefunden, der sich chemisch zu den Peptiden einordnen läßt.
Der Inhibitor ist gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht von 5000 bis 10.000, ein Absorptionsmaximum in UV-Licht bei
276 nm, einen isoelektrischen Punkt von 4,4 und eine Aminosäurezusammensetzung
wie weiter unten angegeben.
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809830/0056
H
2701880
Der erfindungsgemäße Inhibitor hat ein relativ hohes Molekulargewicht.
Er diffundiert nicht oder allenfalls zu einem sehr geringen Teil durch handelsübliche Dialysiermembranen
(Ri
•wie Visking '-Schläuche. Naturgemäß ist die Bestimmung des genauen Molekulargewichts schwierig und man gelangt mit verschiedenen Bestimmungsmethoden zu unterschiedlichen Resulaten. Benützt man zur Molekulargewichtsbestimmung die analytische Ultrazentrifuge (Biochemisches Taschenbuch, 2. Teil, Seite 746 bis 767), so erhält man Werte von ungefähr 10.000. Werden hingegen Molekular-Siebe wie
•wie Visking '-Schläuche. Naturgemäß ist die Bestimmung des genauen Molekulargewichts schwierig und man gelangt mit verschiedenen Bestimmungsmethoden zu unterschiedlichen Resulaten. Benützt man zur Molekulargewichtsbestimmung die analytische Ultrazentrifuge (Biochemisches Taschenbuch, 2. Teil, Seite 746 bis 767), so erhält man Werte von ungefähr 10.000. Werden hingegen Molekular-Siebe wie
(R)
Sephadex G-50 superfein verwandt, so ermittelt man ein Molekulargewicht von 5000 oder sogar noch darunter. Es ist demgemäß aufgrund der derzeitig vorliegenden Untersuchungsergebnisse 'ein Molekulargewicht zwischen 5000 und 10.000 anzunehmen.
Sephadex G-50 superfein verwandt, so ermittelt man ein Molekulargewicht von 5000 oder sogar noch darunter. Es ist demgemäß aufgrund der derzeitig vorliegenden Untersuchungsergebnisse 'ein Molekulargewicht zwischen 5000 und 10.000 anzunehmen.
Die erfindungsemäße Verbindung ist eine farblose Substanz.
Sie absorbiert aber ultraviolettes Licht mit einem bei 276 nm liegenden Maximum, das bei 281 nm eine Schulter
1 %
aufweist. E1 = J_6. Figur 1 gibt ein Absorptionsspektrum wieder.
aufweist. E1 = J_6. Figur 1 gibt ein Absorptionsspektrum wieder.
Der Inhibitor ist seiner chemischen Struktur nach ein Peptid. Er kann durch Hydrolyse in Aminosäuren gespalten werden.
Es ist bis jetzt nicht gelungen, neben den Aminosäuren andere Bestandteile nachzuweisen. Bestimmt man die Aminosäurezusammensetzung
mit der von St. Moore und W.H. Stein (Methods in Enzymology, Band VI, Seite 819 bis 831, herausgegeben
von Colovick und Kaplan in Academic Press, New York, London 1963) angegebenen Methode, so kann man folgende Zusammensetzung
ermitteln:
Asparaginsäure 5-6
Threonin 5~6
Serin 3-5
Glutaminsäure 5~6
Prolin 2-3
Alanin 5-f
Glycin 5-6
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270'iaW
Cystein | 3-4 |
Valin | 5-6 |
Isoleucin | 1-2 |
Leucin | 3-4 |
Tyrosin | 4-5 |
Phenylalanin | 0-2 |
Histidin | 1-2 |
Lysin | 0-1 |
Arginin | 2-3 |
Tryptophan | 1-2 |
Der Wert von Tryptophan wurde aus der Absorption von ultraviolettem Licht geschätzt. Es ist naturgemäß, daß
die Ergebnisse der Aminosäure-Untersuchung nicht immer auf ein einziges ganzzahliges Mengenverhältnis deuten, und
daß derartige Messungen allgemein mit gewissen Fehlern behaftfet sind. Demgemäß beruhen die in der Aufzählung
wiedergegebenen Variationsgrenzen nicht auf einer Uneinheitlichkeit des Inhibitors, sondern auf der unvermeidlichen
Meßungenauigkeit des Analysenverfahrens. Kennzeichnend für den erfindungsgemäßen Inhibitor ist aber, daß die Aminosäuren
Apsparaginsäure, Glutaminsäure, Threonin, Glycin, Alanin und Valin einen überdurchschnittlich hohen molekularen
Anteil des Peptids einnehmen und daß Methionin in der reinen Substanz gänzlich zu fehlen scheint. Da Methionin eine weit
verbreitete Aminosäure ist, ist ihre weitgehende Abwesenheit ein gutes Kennzeichnungsmerkmal für den erfindungsgemäßen
Inhibitor und kann insbesondere auch bei Anreicherungsverfahren zur Reinheitsermittlung des Produkts dienen.
Der erfindungsemäße Inhibitor reagiert positiv auf Peptidreagenzien
aber negativ auf Phenol-Schwefelsäure.
Der erfindungsgemäße cC-Amylase-Inhibitor enthält keinen
Zuckeranteil. Dadurch, sowie durch seine Aminosäurezusammensetzung, sein Molekulargewicht und seinem isoelektrischen
Punkt unterscheidet er sich von allen bekannten c£ -Amylase-
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Inhibitoren. Reine PräDarate des Inhibitors weisen eine Aktivität von 2 bis 3 χ 106 AIE/g auf.
Für eine Substanz von Peptidnatur weist der beanspruchte Amylaseinhibitor eine bemerkenswerte thermische Stabilität
auf. Selbst Kochen in einem neutralen oder schwachsauren Medium (pH etwa 4-8) während einer Minute ist auf seine
glucosihydrolase-hemmenden Eigenschaften ohne nennenswerten Einfluß.
Der Inhibitor wird durch Pepsin, Trypsin oder Chymotrypsin im Vergleich zu anderen Proteinen nur sehr langsam proteolytisch
inaktiviert. Während des therapeutischen Wirkungszeitraums ist daher nicht mit einer nennenswerten Aktivitätsverminderung im Verdauungstrakt zu rechnen.
Der Inhibitor weist eine hohe Wirkungsspezifität auf. Die
rfä -Amylase aus Pankreas wird außerordertlich stark gehemmt,
während demgegenüber bakterielle c£ -Amylasen, z.B. solche aus Bacillus subtilis, nicht meßbar inhibiert werden.
Desgleichen ist keine Wirkung gegen ß-Amylasen beobachtet worden.
Schon geringe Dosierungen des erfindungsgemäßen Amylaseinhibitors
führen zu einer vollständigen Hemmung der enzymatischen Aktivität der Pankreasamylase. Dieser Befund ist mit den
klassischen Hemroechanismen nicht zu erklären, bei denen die Hemmung der enzymatischen Katalyse vom relativen Mengenverhältnis
von Inhibitor und Substrat (Stärke) abhängt. Es muß vielmehr eine irreversible Inaktivierung der Pankreasamylase
durch den erfindungsgemäßen Inhibitor angenommen werden.
Zur Herstellung des Amylaseinhibitors bedient man sich erfindungsgemäß
des Stammes Streptomyces tendae 4158. Dieser Stamm unterscheidet sich vom Originalstamro S. tendae (Ettlinger
et al., Arch. Mikrobiol. 31, 351 (1959)) hinsichtlich seiner Sporen-Morphologie. Die Sporen sind kugelförmig und haben einen
Durchmesser von 1 μ. Die Eigenschaften des Stammes sind wie folgt:
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- Sr-
Farbe des Substratmycels: | gelb-braun; keine Farbver änderung durch pH-Verschiebung |
Farbe des versporten Luft- mycels: |
grau-braun (light grayish redish brown nach: ISCC methods of designating colors) |
Morphologie der Sporen ketten : · |
Retinaculum apertum (RA) |
Sporenmorphologie: | kugelförmige Sporen mit einem durchschnittlichen Durch messer von 1 μ. Glatte bis leicht warzige Oberfläche. |
Melaninbildung auf Pepton- medium: |
positiv |
Nitratreduktion: | positiv |
Substratverwertungs- Spektrum: |
Glucose ++ Arabinose + Saccharose + Xylose + Inositol ++ Mannitol ++ Fructose + Rhamnose ++ Raffinose +- Cellulose - |
Der Stamm Streptomyces tendae 4158 ist bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Registrier Nr. 31210 hinterlegt.
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2?o
Die Fermentation kann bei 25 bis 35°C, vorzugsweise bei 28 bis 3O°C, entweder submers in Schüttelkultur oder in
verschieden großen Fermentationsgefäßen unter Rührung und Belüftung durchgeführt werden.
Als Kulturmedium hat sich eine Kombination von Kohlenstoff- und Stickstoffquellen besonders bewährt. Ein solches Kulturmedium
enthält z.B. neben den bei der Kultur von Mikroorganismen üblicherweise angewandten anorganischen Salzen mindestens eine
Kohlenstoffquelle wie Stärke, Glucose, Rohrzucker, Fruktose, Lactose, Glycerin oder Melasse sowie mindestens eine Stickstoffquelle
wie Sojamehl, Cornsteep liquor, Hefeextrakt, Baumwollsamenmehl, Erdnußmehl, Peptone, Milchpulver, Nitrate oder
Ammoniumsalze.
Als optimale Zusammensetzung hat sich erwiesen (Gewichts % in Lösung) 3-5 % lösliche Stärke, 0,2 -0,6 % Cornsteep,
0,5-1,5 % Glucose, 0,5-1 % (NH4J2HPO4, 0,3-0,6 % Sojamehl,
0/5-1,5 % Caseinpepton. Auch auf anderen stärkehaltigen Nährmedien,
z.B. einem solchen aus 2-6 % Erdnußmehl, 1-3 % Kartoffelstärke, 3-5 % Hafermehl, 3-5 % Molkepulver, 1-2 % Molkensirup,
1-2 % Molkensirup, 1-2 % Milchzucker wird der Amylaseinhibitor in guten Ausbeuten erhalten, wobei die Wahl der Stickstoffquelle
und des Pufferanteils, sofern man in physiologischen Bereichen ist, nicht so entscheidend ist. Wird jedoch der Gehalt
an Stärke vermindert oder ganz gestrichen, so geht die Inhibitorenausbeute drastisch zurück. Erhöht man andererseits
die Stärkekonzentration wesentlich über 7 %, so wird aufgrund der hohen Viskosität die Sauerstoff-Versorgung der Mikroorganismen
suboptimal. Damit verbunden sinkt die Inhibitorausbeute.
Im Fermentationsansatz setzt die Bildung des Inhibitors in der Regel zwischen der 10. und 30. Stunde der Fermentation
ein. Innerhalb der nächsten 20 Stunden wird sie weitgehend abgeschlossen. Längere Fermentationszeiten haben keinen
nachteiligen Einfluß auf die Inhibitorausbeute, jedoch
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erhöht sich diese auch nicht mehr nennenswert. Daraus ergibt sich, dass die Fermentationsansätze etwa 30 - 70 Stunden
in Betrieb zu halten sind.
Zur Isolierung des Inhibitors wird aus der Fermentationslösung
die Zellmasse durch Zentrifugieren, Filtrieren oder Nutschen entfernt, da sich der größte Teil des Wirkstoffes
in der Regel in der klaren Kulturflüssigkeit befindet.
Falls aufgrund spezieller Fermentationsbedingungen ein Teil des Inhibitors im Zellmaterial verbleibt, so bereitet es
keine Schwierigkeiten, den Wirkstoff durch geeignete Methoden daraus zu extrahieren, z.B. durch Ausrühren mit einem wassermischbaren
organischen Lösungsmittel wie Methanol, wobei ein zusätzliches Mazerieren des Zellmaterials von Vorteil ist.
Der im Extraktionsmittel gelöste Wirkstoff kann mittels Zentrifugieren oder Filtrieren von den ungelösten Zellbestandteilen
befreit und wie die klare Kulturflüssigkeit weiterbearbeitet werden.
Aus der Kulturflüssigkeit läßt sich der Inhibitor durch an sich bekannte Verfahren der Protein- und Peptidchemie isolieren. So eignen sich Fällungen mit wasser-mischbaren
organischen Lösungsmitteln wie Aceton, Isopropanol oder anderen niederen Alkoholen, oder auch mit Salzen, wie
Ammoniumsulfat.
Es ist weiter möglich, den Inhibitor auf entsprechende Träger, z.B. auf Aktivkohle zu adsorbieren und diese durch
Filtration oder Zentrifugation aus der wässrigen Lösung abzuscheiden. Das kann in einem weiten pH-Bereich zwischen
2 bis 10 geschehen, vorzugsweise benützt man aber den Bereich zwischen pH 4 bis 6. Ionenaustauscher können zur Abtrennung
des erfindungsgemäßen (^-Amylase-Inhibitors ebenfalls angewandt
werden. Da die beanspruchte Substanz sowohl saure als auch basische Eigenschaften hat, also amphoter ist, kann sie
sowohl mit Kationen- als auch mit Anionenaustauschern reagieren und mit Hilfe dieser aus der Fermentationslösung
entfernt werden. Hierbei können die Techniken angewandt
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-JSr-
^ 2701680
werden, die im Prinzip im Kapital über Ionenaustauscher im Biochemischen Taschenbuch, herausgegeben von H.M. Rauen im
Springer-Verlag 1964, 2. Teil, Seite 808-824, beschrieben sind.
Bei der Aufarbeitung von Fermentationsansätzen, die die erfindungsgemäße Substanz in der Kulturflüssigkeit enthalten,
ist es häufig zweckmässig, diese zu konzentrieren.
Hierzu können die bekannten Verfahren für Destillation, Ultrafiltration ι Sprüh- und Gefriertrocknung oder andere bekannte
Methoden herangezogen werden. Aus dem so erhaltenen Konzentrat lässt sich der Inhibitor wieder mit den oben beschriebenen
Verfahren abtrennen. Aus Konzentraten, wie sie die eingeengten Kulturfiltrate darstellen, kann der Inhibitor auch
dadurch angereichert werden, dass die wesentlichen Verunreinigungen entfernt werden. So haben sich zur Abtrennung von fettartigen Stoffen Extraktionen mit organischen Lösungsmitteln
bewährt. Durch Dialyse oder gegebenenfalls Ultrafiltration (C.J.O.Rund P.Morris "Separation methods in Biochemistry"
Ditman Publishing, London 1976, Seiten 944-950) kann die Lösung von niedermolekularen Substanzen befreit werden.
Hochmolekulare Stoffe, wie Nucleinsäuren, Polysaccharide oder manche Eiweißstoffe können mittels fraktionierter Fällung
durch Aussalzen oder durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, wie Aceton oder eines niederen Alkohols abgesondert
werden. Die Zugabe des Fällungsmittels wird in diesen Fällen so dosiert, daß die leicht präzipitierbaren Stoffe mit
Molekulargewichten über 100.000 ausgefällt werden, während der c^-Amylase-Inhibitor in Lösung bleibt.'Die geschilderten
Anreicherungsschritte können in beliebiger Reihenfolge kombiniert und variiert werden. Auf diese Weise gelangt man zu
Lösungen, die an Inhibitor stark angereichert sind.
Die Endreinigung kann mit verschiedenen gezielten Verfahren, wie Gel- und Ionenaustauscherchromatographie erfolgen oder
mit verwandten Verfahren, deren Trennprinzip nicht ausschliesslich
auf Ionenaustausch beruht, wie z.B. die Trennung an Hydroxylapatit. Weiterhin können Lösungsmittel- oder Salzfällungen,
präparative Elektrophorese oder andere ansich be-
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- Jär-
kannte Verfahren angewandt werden.Besonders bewährt haben
sich Trennungen an Diäthylaminoäthyl-(DEAE-)-Gruppen tragenden Ionenaustauschern sowie fraktionierte Fällungen
mit Ammoniumsulfat oder Äthanol, wobei sogar kristallines Material erhalten werden kann.
Die Eigenschaften des erfindungsgemäßen Inhibitors sind im Hinblick auf seine Anwendung als Therapeutikum gegen Diabetes
und Prädiabetes sowie Adipositas und Unterstützung von Diät interessant.
Stärkehaltige Nahrungs- und Genußmittel führen bei Tier und Mensch zu einem Anstieg des Blutzuckers und dadurch
auch zu einer vermehrten Insulinsekretion des Pankreas. Die Hyperglykämie kommt durch die Aufspaltung der Stärke
im Verdauungstrakt unter Einwirkung von Amylase und Maltase zu Glukose zustande.
Bei Diabetikern ist diese Hyperglykämie besonders ausgeprägt
und langanhaltend.
Bei Adipösen wirkt die vermehrte Insulinsektretion auf die
Lipogenese und vermindert die Lipolyse.
Die alimentäre Hyperglykämie sowie die Hyperinsulinämie
nach Stärkeaufnahme lässt sich durch den beanspruchten Amylase-Inhibitor vermindern. Diese Wirkung ist dosisabhängig.
Der erfindungsgemässe Amylase-Inhibitor lässt sich daher
als Therapeuticum einsetzen bei Diabetes, Prädiabetes und Adipositas sowie zur Unterstützung von Diät. Zu diesem
Zweck empfiehlt sich eine Verabreichung, insbesondere zu den Mahlzeiten. Die Dosierung, die sich nach dem Gewicht
des Patienten sowie dem individuellen Bedarf ausrichten soll, beträgt etwa 10.000 bis 300.000 AIE, sie kann jedoch
in begründeten Einzelfällen auch darüber oder darunter liegen.
Der erfindungsgemäße Amylase-Inhibitor eignet sich insbesondere zur oralen Verabreichung. Er kann als reine Substanz aber auch
in Form einer.pharmazeutischen Zubereitung unter Verwendung
der üblichen Hilfs- und Trägerstoffe angewandt werden.
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27Q18.&Ü ,
Auch eine kombinierte Anwendung mit anderen Arzneimitteln wie blutzuckersenkenden oder lipidsenkenden Substanzen kann von
Vorteil sein. Da höhermolekulare Peptide als solche nicht oder nicht nennenswert aus dem Verdauungstrakt resorbiert werden, sind
von der erfindungsgemäßen Substanz keine toxikologisch bedenklichen Nebenwirkungen zu erwarten. Aufgrund der nicht
außergewöhnlichen Aminosäurezusammensetzung sind auch evtl. proteolytische Spaltprodukte als physiologisch unbedenklich
anzusehen. Dementsprechend konnten bei oraler Gabe auch hoher Dosen des Amylaseinhibitors an Versuchstiere keine
auffälligen Symtome erkannt werden. Auch bei intravenöser Applikation an Mäusen (1 g/kg) wurde der erfindungsgemäße
Inhibitor bei 24-stündiger Beobachtungszeit ohne erkennbare toxische Wirkung vertragen.
Zur Prüfung der pharmakologischen Wirkung des Amylaseinhibitors erhielten nüchterne, männliche Wistar-Ratten
mit einem Gewicht zwischen 2OO und 25Og den erfindungsgemäßen
Hemmstoff gleichzeitig mit 2 g Stärke pro kg Körpergewicht oral verabreicht, nachdem unmittelbar zuvor eine Blutentnahme
zur Bestimmung des Ausgangsblutzuckerwertes erfolgte. Weitere Bitentnahmen erfolgten nach 15 und 30 Minuten sowie nach
1,2,3 und 5 Stunden aus der Schwanzvene. Die Blutzuckerbestimmungen wurden nach der Methode von Hoffman im Autoanalyzer
(J. Biol. Chem. 120, 51 (1937) durchgeführt.
NZO-Mäuse weisen eine gestörte Glucosetoleranz auf. Sie eignen sich deshalb,besonders gut für Untersuchungen bei
denen der Blutglucosespiegel beeinflußt wird. Die Versuchsanordnung entspricht der bei Ratten. Die Blutentnahme erfolgt
aus dem Orbitalvenen-Plexus. Der Blutzuckerverlauf wird über 3 Stunden verfolgt.
In analoger Weise wird der Wirkstoffnachweis an NMRI-Mäusen
erbracht. Die Blutentnahmen erfolgen ebenfalls aus dem Orbitalvenen-Plexus und der Blutzuckerverlauf wird über
3 Stunden verfolgt.
Unter diesen Versuchsanordnungen zeigten die mit dem erfindungemäßen
Inhibitor behandelten Tiere einen gegenüber unbehandelten Tieren geringeren, protrahierten Blutzuckeranstieg.
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-73
Eine Amylase-Inhibitoreinheit (AIE) ist definiert als die
Inhibitormenge, die unter den Testbedingungen zwei Amylaseeinheiten
(AE) zu 50 % zu hemmen vermag. Eine Amylaseeinheit ist nach internationaler Übereinkunft die Enzymmenge,
die in einer Minute 1 μ Äquivalent glucosidischer Bindungen in der Stärke spaltet. Die μ VaI gespaltener glucosidischer
Bindungen werden als iiVal reduzierender Zucker photometrisch
mit Dinitrosalizylsäure bestimmt. Die Angaben sind als μΜοΙβ
Maltose berechnet, die anhand einer Maltose-Eichgeraden ermittelt werden.
Die Teste werden folgendermaßen durchgeführt:
Die Teste werden folgendermaßen durchgeführt:
cC-Amylase aus Schweinepankreas und die zu testende Lösung
werden gemeinsam in 1,0 ml 20 mM Phosphatpuffer, pH 6.9 + 10 mM NaCl 10-20 min. bei 37°C vorinkubiert. Die enzymatische
Reaktion wird durch Zugabe von 1,0 ml löslicher Stärke nach Zulkowski (0.25 % in dem angegebenen Puffer) gestartet.
Nach genau 10 min. wird die Reaktion mit 2.0 ml Dinitrosali-.Zylsäure-Farbreagenz
(nach Boehringer Mannheim: Biochemica-Information II) abgestoppt und zur Farbentwicklung 5 min.
im siedenden Wasserbad erhitzt. Nach dem Abkühlen wird die Extinktion bei 546 nm gegen den Reagentienleerwert gemessen.
Die 50 %ige Hemmung wird im Vergleich zur ungehemmten Enzymreaktion durch Einsatz verschiedener Inhibitormengen graphisch
mittels der Wahrscheinlichkeitsauftragung bestimmt.
Der Stamm Streptomyces tendae 4158 wird auf Schrägröhrchen mit einem Nährboden folgender Zusammensetzung geimpft:
50 g Haferflocken
ad. 1000 ml H3O pHA 7,2
Das beimpfte Röhrchen wird 7 Tage bei 30°C bebrütet und danach bei +4 C gehalten. Die Sporen werden mit 1O ml
sterilisiertem A. dest. oder physiologischer NaCl-Lösung von dem Schrägröhrchen abgeschwemmt. 1,0 ml der Suspension
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270 183Q
dient zur Beimpfung eines 300 ml Erlenmeyerkolbens, der
mit 35 ml sterilisierter Nährlösung mit einem pH-Wert von 7,7 und folgender Zusammensetzung beschickt ist:
1 %' Glucose
1 % Sojamehl
0,25 % NaCl pH 7,7.
Der Kolben wird bei 220 Upm 48 Stunden bei +300C auf einer
Schüttelmaschine bei einer Amplitude von 4 cm geschüttelt. Danach werden je 5 ml dieser Vorkulta r in mehrere Erlenmeyer
kolben überführt, die mit 35 ml sterilisierter Nährlösung beschickt sind und einen pH-Wert von 8.3 haben. Die Zusammensetzung
dieser Hauptkultur ist folgende:
4 | % Stärke |
0,4 | % Cornsteep liq. |
1,0 | % Glucose |
0,8 | % (NH4J2HPO4 |
0,4 | % Sojamehl |
1,0 | % Pepton pHA 8,3. |
Die Hauptkulturen werden ebenfalls bei +300C mit 220 Upm
auf einer Schüttelmaschine mit einer Amplitude von 4 cm 2-3 Tage geschüttelt. Am ersten, zweiten und dritten
Kulturtag wird der Gehalt an cC-Amylase-Inhibitor gemäß
Testvorschrift bestimmt.
Der Stamm Streptomyces tendae4158 liefert unter den beschriebenen
Versuchs- und Kulturbedingungen durchschnittlich 1OO ΑΕΙ/ml bei einem End-pH von 5.2.
Ansatz wie im Beispiel 1, jedoch wird als Hauptkultur ein
Permentationsgefäß von 300 1 Gesamtvolumen gewählt, das mit 200 1 einer sterilisierten Nährlösung folgender Zusammensetzung
beschickt ist:
/13
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4 | % Stärke | pH- 8.3-8.5. |
0,4 | % Cornsteep liq. | |
1,0 | % Glucose | |
0,8 | % (NH4J2HPO4 | |
1,0 | % Caseinpepton | |
0,1 | % Desmophen | |
Die Sterilisationszeit für den Ansatz beträgt 45 min. bei 121°C und 1 bar, wobei die Glucose separat sterilisiert
und nach Abkühlung des Fermenters auf Betriebstemperatur steril zugeführt wurde.
Der pH-Wert soll nach der Sterilisation 6.8 betragen und wird nach Bedarf mit sterilisierter Säure(2 η H3PO4)
oder Lauge(2 η NaOH) auf diesen Wert eingestellt. Beimpft wird die Hauptstufe mit 20 1 entsprechend 10 %
einer wie unter BeisDiel 1 beschriebenen und in einem Kleinfermenter
von 30 1 Totalvolumen hergestellten Vorkultur.
Es wird 50 bis 70 Std. bei 30°C fermentiert. Die Belüftung beträgt 6 m /hr bei einer Rührung von 250 Uj^nt und einem
überdruck von 0,3 bar.
Durch die Probenahme wird der Fermentationsverlauf hinsichtlich der Inhibitoraktivität, des Substratabbaues, der Biomasseentwicklung
und des physikalisch-technischen Verhaltens der Kulturlösung (Oberflächenspannung, Viskosität, Dichte,
osmotischer Druck) überwacht und verfolgt.
Die maximale Inhibitoraktivität wird ab der 60. Kulturstunde mit durchschnittlich 105 AIE/ml erreicht. Danach wird der
Permenterinhalt der Aufarbeitung zugeführt.
Ansatz wie in Beispiel 1 und Beispiel 2. jedoch wird als Hauptstufe ein Bioreaktor von 4000 1 Gesamtvolumen benutzt,
der mit 2500 1 folgender Nährlösung beschickt ist:
/14
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- yr-
16 |
pHA 7.0-7.3 | |
6 | % Stärke | |
1,0 | % Glucose | |
0,4 | % Cornsteep liq. | |
0,8 | % (NH4)2HPO4 | |
1,0 | % Soypepton | |
0,1 | % Desmophen | |
Die .Sterilisationszeit für diesen Ansatz beträgt 60 min.
bei 121°C und 1 bar, wobei die Glucose separat sterilfiltriert
und nach Abkühlung des Permenters auf Betriebstemperatur diesem unter sterilen Bedingungen zugepumpt wird.
Der pH-Wert wird -wenn nötig- mit steriler Säure (H3PO4) oder
Lauge (NaOH) auf einen Anfangswert von 7.0 - 7.3 eingestellt.
Beimpft wird mit 200 1 einer unter Beisniel 2 beschriebenen und hergestellten Vorkultur.
Die Fermentationszeit beträgt 70 Std., wobei bei einer Temperatur von 3O°C, einer Belüftung von 60 Nm /hr, einem
überdruck von 0,5 bar und bei 180 Upm fermentiert wird.
Durch Probenahme - wie unter Beispiel 2 beschrieben- werden
alle wichtigen Prozeß-, Organismen- unu Aktivitätsdaten über die gesamte Fermentationszeit verfolgt.
Nach 70stündiger Fermentation ist eine durchschnittliche Aktivitätskonzentration von 95 AIE/ml erreicht. Die Fermentation
wird daraufhin abgebrochen und die Kulturlösung der Aufarbeitung zugeführt.
10 1 einer filtrierten Kulturflüssigkeit mit einer Wirksamkeit
von 100 AIE /ml wird in einem Sprühtrockner getrocknet und ergibt 400 g eines hellbraunen Pulvers.
Dieses wird dann zur Entfettung mit einer Mischung von 1 1 Methanol und 1 1 Chloroform gründlich durchgerührt
und anschliessend abgenutscht. Das noch lösungsmittelfeuchte, ungelöste Produkt in dem die Wirksubstanz enthalten ist,
wird in 3 1 Wasser gelöst, auf pH 6,5 gestellt und mit 4,5
809830/OOB5
/15
27018*0
Methanol versetzt. Es entsteht hierbei ein heller, flockiger
Niederschlag, der durch Zentrifugieren entfernt und verworfen wird, da er nur vernachlässigbare Mengen des c6 -Amylasehenunstoffes
enthält. Der dunkle überstand der Methanolfällung, der den gewünschten Inhibitor enthält, wird dann im
Vakuum vom Methanol befreit und die nun auf 2,5 1 aufkonzentrierte
Lösung gegen destilliertes Wasser salzfrei dialysiert. Das Retenat enthält 9 g Trockensubstanz (spez. Aktivität
96 AIE/mg). Das Retenat wird anschliessend bei pH 5,5 mit Ammoniumsulfat auf 50 % Sättigung gebracht, wozu bei 250 ml
79 g des Salzes erfoderlich sind. Bei dem Aussalzen entsteht ein Niederschlag, der rund 90 % der aktiven Substanz enthält.
Nach dem Zentrifugieren wird der überstand verworfen. Den Niederschlag löst man erneut in destilliertem Wasser und
bei pH 8 wird wieder mit Ammoniumsulfat versetzt, aber diesmal zunächst nur bis zu 15 % Sättigung und nach Entfernen
des Niederschlages weiter bis 35 % Sättigung. Der Niederschlag der Aussalzung zwischen 15 und 35 %
beinhaltete die Hauptmenge des Amylaseinhibitors. Diese fraktionierte Fällung wird wiederholt.
Das entstandene Produkt ist nach Dialyse und Trocknung 360 mg mit einer spez. Aktivität von 992 AIE/mg.
(R) 350 mg dieser Rohsubstanz werden dann in Sephadex
G-50 fine in einer 100 cm langen und 1,2 1 fassenden Glassäule aufgetrennt und angereichert. Als Quell- und Elutionsmittel
dient wässrige 5 Millimolar-Phosphatpufferlösung von pH 8, dem 0,02 % Natriumazid zugesetzt worden ist. Die Rohsubstanz
wird in 15 ml des gleichen Puffers gelöst und auf die Säule aufgetragen. Die Elution erfolgt während zwei
Tagen, wobei Fraktionen von 15 ml Inhalt abgenommen werden. Die vier aktivsten Fraktionen werden gesammelt, salzfrei
dialysiert und gefriergetrocknet. Sie ergeben 60 mg eines weißen Pulvers mit einer Aktivität von 2520 AIE oC-Amy
inhibitor/mg.
/16
809830/0055
2V018S0
2200 1 Kulturflüssigkeit werden auf 6° gekühlt und nach
Zusetzung von 2 % Kieselgur über einer Kammerpresse filtriert. Der Filterkuchen (ca. 450 kg feucht) wird verworfen, das
klare Filtrat (1750 1 mit einer Aktivität von 95 AIE/ml)
wird nach Zugabe von 500 g Natriumazid über einen Fallstromverdampfer auf 120 1 eingeengt. Das erhaltene Konzentrat
wird auf 1°C gekühlt und mit 120 1 vorgekühltem Aceton langsam unter Rühren versetzt. Zur vollständigen Fällung wird
dann noch 1/4 Stunde gerührt und nach Zugabe von 1 kg Kieselgur über eine Schenkpresse geklärt. Der Feststoff mit dem
Filterhilfsmittel wird verworfen. Das acetonische Filtrat, das die Wirksubstanz enthält, wird unter Rühren und Kühlen
mit 380 1 Aceton vermengt, wodurch eine ungefähr 80 %ige acetonische Suspension entsteht. Der entstandene (2.) Niederschlag
enthält den gewünschten Amylaseinhibitor. Er wird dadurch gewonnen, dass man die Fällungsflüssigkeit
ohne Rühren stehen läßt. Hierbei sinkt der Niederschlag ab und der überstand kann abgehebert werden. Aus dem überstand
dieser zweiten Acetonfällung können geringe. Mengen Niederschlag durch Zentrifugation abgetrennt werden. Dieser Feststoff
wird bei pH 7 gelöst und der Lösung des Niederschlages (siehe unten) zugesetzt. Der im Fällungskessel verbleibende
Hauptniederschlag wird in 120 1 Wasser bei pH 7 gelöst und die entstandene Lösung mit einer Durchlaufzentrifuge
(Cepa*R), 1700 Upm) geklärt. Dabei werden 90 g inaktive
Schwebeteilchen entfernt. Die klare Wasserphase wird nun mit einer DDS-Ultrafiltrationsanlage (Membran Nr. 8OO) auf
15 1 konzentriert und dialysiert. Um die Entsalzung zu vervollständigen, wird das Retenat mit destilliertem Wasser
verdünnt und erneut konzentriert. Nach zwei- bis dreimaliger Wiederholung ist das Retenat, in dem der Amylaseinhibitor
enthalten ist, praktisch salzfrei. Aus 50 1 Lösung des Retenats wird dann der Hemmstoff bei pH 5,5 durch Zugabe von 19,5 kg
Ammoniumsulfat gefällt, abzentrifugiert und der überstand
verworfen. Der Niederschlag wird erneut in 40 1 Wasser gelöst
809830/0055 /17
und diesmal bei pH 7,5 mit 12,5 kg Ammoniumsulfat präzipitiert.
Nach der Abtrennung der Klarphase in einer Röhrenzentrifuge .wird der Niederschlag wie im Beispiel 4 fraktioniert gefällt:
Aus 4O 1 der wieder aufgelösten Substanz wird bei pH 5,5 durch
Zugabe von 3,2 kg Ammoniumsulfat zunächst ein inaktiver Niederschlag gefällt, der abgetrennt und verworfen wird. Dann
wird durch weiteres Aufkonzentrieren der flüssigen Phase mit 7,4 kg Ammoniumsulfat der Hauptteil der Aktivität aus der
Flüssigkeit abgeschieden. Dieser Niederschlag wird gesammelt, gegen destillisertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet.
Es resultieren 114 g eines braunen Pulvers mit einer Aktivität
von 11OO AIE/mg.
Zur weiteren Auftrennung wird eine Glassäule von 5 cm 0
und 50 cm Höhe (ungefähr 1 1 Inhalt) mit DEAE-Sephadex A-25*R*
gefüllt, das vorher mit J^ molarem Phosphorpuffer auf pH 7,5
30
und 0,02 %igem Natriumazid equilibriert worden ist. Nun werden IO g Substanz gelöst in 100 ml des gleichen Puffers und auf die Säule aufgetragen. Zunächst wäscht man die Säule mit 1 1 des gleichen Puffers, dann wird zu diesem Elutionsmittel allmählich Kochsalz so zugemischt, dass ein kontinuierlicher Gradient gewährleistet ist. Wird der Säulenausfluß fraktioniert aufgefangen, so befindet sich der Amylaseinhibitor in den Fraktionen, in denen die NaCl-Konzentration etwa 0,5 molar ist.
und 0,02 %igem Natriumazid equilibriert worden ist. Nun werden IO g Substanz gelöst in 100 ml des gleichen Puffers und auf die Säule aufgetragen. Zunächst wäscht man die Säule mit 1 1 des gleichen Puffers, dann wird zu diesem Elutionsmittel allmählich Kochsalz so zugemischt, dass ein kontinuierlicher Gradient gewährleistet ist. Wird der Säulenausfluß fraktioniert aufgefangen, so befindet sich der Amylaseinhibitor in den Fraktionen, in denen die NaCl-Konzentration etwa 0,5 molar ist.
Diese Fraktionen werden gesammelt und gegen destilliertes Hasser dialysiert. Die Gefriertrocknung ergibt 5,6 g hellbraune
Substanz mit einer Wirksamkeit von 22OO AIE/mg.
Hierauf wird noch eine gelchromatographische Reinigung - wie im Beispiel 4 beschrieben - angeschlossen. Aus den 5,6 g
Material resultieren 4,1 g eines farblosen Pulvers, dessen Aktivität 2800 AIE/mg beträgt. Die Aminosäureanalyse des
Produktes ergibt nach einer 20-stündigen Salzsäurehydrolyse mit Hilfe eines Beckman-Multichromanalysators folgende Zu-.
sammensetzung:
809830/0055
30- 270Ί890
Asparaginsäure | 7,72 |
Threonin | 7,66 |
Serin | 5,35 |
Glutaminsäure | 10,05 |
Prolin | 3,43 |
Glycin | 4,93 |
Alanin | 5,84 |
1/2 Cystein | 4,26 |
Valin | 7,72 |
Methionin | 0,41 |
Isoleucin | 2,30 |
Leucin | 5,18 |
Tyrosin | 10,24 |
Phenylalanin | 3,35 |
Histidin | 3,01 |
Lysin | 1,45 |
Arginin | 5,16 |
809830/0055
Claims (8)
- PatentansprüchePeptidischer Glyccaidhydrolase-Inhibitor, gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht von 5000 bis 10.000, ein Absorptionsmaximum im UV-Licht bei 276 nm, einen isoelektrischen Punkt von 4.4 und folgender Aminosäure-Zusammensetzung:Asparaginsäure 5-6 Isoleucin 1-2
Threonin 5-6 Leucin 3-4 Serin 3-5 Tyrosin 4-5 Glutaminsäure 5-6 Phenylalanin 0-2 Prolin 2-3 Histidin 1 - 2 Glycin 5-6 Lysin 0 - 1 Alanin 5-6 Arginin 2-3 Cystein 3-4 Tryptophan 1 - 2 Valin 5-6 - 2. Verfahren zur Herstellung eines peptidischen Glucosidhydrolase-Inhibitors gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces tendea 4158 (ATCC Nr. 31210) kultiviert und aus der Kultur den Inhibitor gewinnt.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces tendea 4158 in einem Kulturmedium kultiviert, das mindestens eine Kohlenstoffquelle, mindestens eine Stickstoffquelle und organische Salze enthält.
- 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium 3 - 5 % lösliche Stärke; 0,2 - 0,6 % Cornsteep; 0,5 - 1,5 % Glucose; 0,5 - 1 % Na2HPO4; 0,3 - 0,6 % Sojamehl und 0,5 - 1,5 % Caseinpeton enthält.
- 5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium 2 - 6 % Erdnußmehl; 1 - 3 % Kartoffelstärke; 3 - 5 % Hafermehl; 3 - 5 % Molkepulver; 1 - 2 % Molkensirup und 1 - 2 % Milchzucker enthält./21809830/0055ORIGINAL INSPECTEDHOE
- 6. Streptomyces tendea 4158 (ATCC Nr. 31210)
- 7. Verwendung des Inhibitors gemäss Anspruch 1, als Mittel zur Regulierung des Blutzuckerspiegels.
- 8. Mittel zur Regulierung des Blutzuckerspiegels, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem peptidischen Glycosidhydrolase-Inhibitor gemäss Anspruch 1.8098 3 0/0055
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