JPS6120268B2 - - Google Patents
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- JPS6120268B2 JPS6120268B2 JP52143829A JP14382977A JPS6120268B2 JP S6120268 B2 JPS6120268 B2 JP S6120268B2 JP 52143829 A JP52143829 A JP 52143829A JP 14382977 A JP14382977 A JP 14382977A JP S6120268 B2 JPS6120268 B2 JP S6120268B2
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- cholesterol oxidase
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はコレステロール・オキシダーゼの精製
改良法に関する。さらに詳述すれば、コレステロ
ール・オキシダーゼ生産菌を培養し、培養液より
コレステロール・オキシダーゼを分離、精製する
際、基質であるコレステロールそのものを担体と
し、酵素を吸着させ、担体をよく洗浄後、界面活
性剤により溶出させる事により、コレステロー
ル・オキシダーゼを容易に精製する方法に関する
ものである。 コレステロール・オキシダーゼによる血中コレ
ステロールの定量法は従来の化学定量法に代るも
のとして、近年、多く研究があり、コレステロー
ル・オキシダーゼの需用は将来、増加するものと
考えられる。コレステロール・オキシダーゼを生
産する微生物としては、例えばストレプトミセス
バイオレツセンス〔ケミカル アンド フアー
マセテイカル ブリチン（Chemical and
pharmaceutical Bulletin）第21巻、2057頁、
1973〕、ノカルジア属〔クリニカル ケミストリ
ー（Clinical Chemistry）第19巻、1350頁、
1973〕、ブレビバクテリウム ステロリカム〔ア
グリカルチヤー アンド バイオロジカル ケミ
ストリー（Agric−ulture and Biological
Chemistry）第37巻、2345頁、1973〕、スエヒロ
タケ（日本薬学会大会 講演要旨集 第107頁
1975）等が知られている。これらの微生物の生産
するコレステロール・オキシダーゼの精製法とし
ては、現在通常の、イオン交換セルロース、ゲル
〓過剤等が用いられている。しかし、このような
方法は操作が煩雑で収率が低い欠点がある。そこ
で本発明者等はコレステロール・オキシダーゼを
容易に精製する方法を考えた。 基質であるコレステロールをコレステロール・
オキシダーゼの吸着担体として用いる考えとして
は、リツチモンド〔クリニカル ケミストリー
（Clinical Chemistry）第19巻、1350頁 1973〕
がセフアデツクスLH−20にコレステロールを分
散させ、これを酵素の担体として酵素を精製して
いる。しかし、この方法ではカラムに充填できる
コレステロールの量が限られており、酵素の大量
精製には向かない。また、吸着した酵素は容易に
は溶出して来ない。このため本発明者等はコレス
テロールをそのままコレステロール・オキシダー
ゼの吸着担体として用いられないかと考えた。通
常コレステロールは水には溶解せず、コレステロ
ールに水を加えるとコレステロールは浮遊する。 しかし、水に浮遊させたコレステロールを加熱
するとコレステロールは水に沈澱するようにな
る。この沈澱したコレステロールを用いコレステ
ロール・オキシダーゼの吸着担体を作れる事を知
り本発明を完成した。すなわち本発明はコレステ
ロール浮遊物を加熱し、沈澱性のコレステロール
とし、これを親和担体とし、コレステロール・オ
キシダーゼを吸着させ、担体コレステロールをよ
く洗浄した後、界面活性剤溶液で溶出する事によ
りコレステロール・オキシダーゼを容易に精製す
る事を特徴とする精製法である。 酵素活性測定法 活性の測定はコレステロールを基質としPH6.8
で酵素液を作用させ、生成したコレスト−４−エ
ン−３−オンによる240nｍの吸収増加を測定す
る。〔クリニカル ケミストリー（Clinical
Chemistry）第20巻、470頁、1974〕コレステロ
ール・オキシダーゼ１単位は37℃で１分間に１マ
イクロモルの基質分解物を生成する酵素量であ
る。 実施例 １ コレステロールは通常、水に不溶で水の表面に
浮遊するための、コレステロール500ｇを５の
水に浮遊させ、沸盪水浴上で撹拌しながら、コレ
ステロールを水に沈澱する不溶物とした。 実施例 ２ ジヤガイモデンプン１％、ブドウ糖３％、肉エ
キス３％、ペプトン３％、食塩0.75％、硫酸マグ
ネシウム0.1％、少量の二価イオンを含んだ培地
（PH7.2）を１ずつ、容量５のフラスコに分注
し、120℃、30分間、加熱滅菌後、ストレプトミ
セス バイオレツセンスH82N−SY7の菌液20ml
を接種し、27℃で96時間、培養した。 培養終了後の酵素液は0.813単位／mlであつ
た。この培養液10（8130単位）に対し、1Nア
ンモニア水でPHを７に調整しながら硫安４Kgを加
え、塩析を行なつた。沈澱を遠心または過によ
り集め、少量の水に溶解した。この酵素溶液を大
量の水に対し透析した。 酵素溶液6829単位を実施例１により調製したコ
レステロール１をつめたカラムに吸着させ、水
でよく洗浄した後、界面活性剤トライトンＸ−
100、0.1％溶液により溶出を行なつた。 ここでの収量は5327単位であつた。酵素溶液を
７倍容のエタノールで沈澱させ、沈澱を遠心によ
り集め、少量の水に溶解し、凍結乾燥を行なつ
た。この段階での収量は5167単位で、この操作に
より86倍に精製された。精製の各段階の蛋白量、
総活性、比活性および収量を表１に示した。 【表】
改良法に関する。さらに詳述すれば、コレステロ
ール・オキシダーゼ生産菌を培養し、培養液より
コレステロール・オキシダーゼを分離、精製する
際、基質であるコレステロールそのものを担体と
し、酵素を吸着させ、担体をよく洗浄後、界面活
性剤により溶出させる事により、コレステロー
ル・オキシダーゼを容易に精製する方法に関する
ものである。 コレステロール・オキシダーゼによる血中コレ
ステロールの定量法は従来の化学定量法に代るも
のとして、近年、多く研究があり、コレステロー
ル・オキシダーゼの需用は将来、増加するものと
考えられる。コレステロール・オキシダーゼを生
産する微生物としては、例えばストレプトミセス
バイオレツセンス〔ケミカル アンド フアー
マセテイカル ブリチン（Chemical and
pharmaceutical Bulletin）第21巻、2057頁、
1973〕、ノカルジア属〔クリニカル ケミストリ
ー（Clinical Chemistry）第19巻、1350頁、
1973〕、ブレビバクテリウム ステロリカム〔ア
グリカルチヤー アンド バイオロジカル ケミ
ストリー（Agric−ulture and Biological
Chemistry）第37巻、2345頁、1973〕、スエヒロ
タケ（日本薬学会大会 講演要旨集 第107頁
1975）等が知られている。これらの微生物の生産
するコレステロール・オキシダーゼの精製法とし
ては、現在通常の、イオン交換セルロース、ゲル
〓過剤等が用いられている。しかし、このような
方法は操作が煩雑で収率が低い欠点がある。そこ
で本発明者等はコレステロール・オキシダーゼを
容易に精製する方法を考えた。 基質であるコレステロールをコレステロール・
オキシダーゼの吸着担体として用いる考えとして
は、リツチモンド〔クリニカル ケミストリー
（Clinical Chemistry）第19巻、1350頁 1973〕
がセフアデツクスLH−20にコレステロールを分
散させ、これを酵素の担体として酵素を精製して
いる。しかし、この方法ではカラムに充填できる
コレステロールの量が限られており、酵素の大量
精製には向かない。また、吸着した酵素は容易に
は溶出して来ない。このため本発明者等はコレス
テロールをそのままコレステロール・オキシダー
ゼの吸着担体として用いられないかと考えた。通
常コレステロールは水には溶解せず、コレステロ
ールに水を加えるとコレステロールは浮遊する。 しかし、水に浮遊させたコレステロールを加熱
するとコレステロールは水に沈澱するようにな
る。この沈澱したコレステロールを用いコレステ
ロール・オキシダーゼの吸着担体を作れる事を知
り本発明を完成した。すなわち本発明はコレステ
ロール浮遊物を加熱し、沈澱性のコレステロール
とし、これを親和担体とし、コレステロール・オ
キシダーゼを吸着させ、担体コレステロールをよ
く洗浄した後、界面活性剤溶液で溶出する事によ
りコレステロール・オキシダーゼを容易に精製す
る事を特徴とする精製法である。 酵素活性測定法 活性の測定はコレステロールを基質としPH6.8
で酵素液を作用させ、生成したコレスト−４−エ
ン−３−オンによる240nｍの吸収増加を測定す
る。〔クリニカル ケミストリー（Clinical
Chemistry）第20巻、470頁、1974〕コレステロ
ール・オキシダーゼ１単位は37℃で１分間に１マ
イクロモルの基質分解物を生成する酵素量であ
る。 実施例 １ コレステロールは通常、水に不溶で水の表面に
浮遊するための、コレステロール500ｇを５の
水に浮遊させ、沸盪水浴上で撹拌しながら、コレ
ステロールを水に沈澱する不溶物とした。 実施例 ２ ジヤガイモデンプン１％、ブドウ糖３％、肉エ
キス３％、ペプトン３％、食塩0.75％、硫酸マグ
ネシウム0.1％、少量の二価イオンを含んだ培地
（PH7.2）を１ずつ、容量５のフラスコに分注
し、120℃、30分間、加熱滅菌後、ストレプトミ
セス バイオレツセンスH82N−SY7の菌液20ml
を接種し、27℃で96時間、培養した。 培養終了後の酵素液は0.813単位／mlであつ
た。この培養液10（8130単位）に対し、1Nア
ンモニア水でPHを７に調整しながら硫安４Kgを加
え、塩析を行なつた。沈澱を遠心または過によ
り集め、少量の水に溶解した。この酵素溶液を大
量の水に対し透析した。 酵素溶液6829単位を実施例１により調製したコ
レステロール１をつめたカラムに吸着させ、水
でよく洗浄した後、界面活性剤トライトンＸ−
100、0.1％溶液により溶出を行なつた。 ここでの収量は5327単位であつた。酵素溶液を
７倍容のエタノールで沈澱させ、沈澱を遠心によ
り集め、少量の水に溶解し、凍結乾燥を行なつ
た。この段階での収量は5167単位で、この操作に
より86倍に精製された。精製の各段階の蛋白量、
総活性、比活性および収量を表１に示した。 【表】
Claims (1)
- １ コレステロール・オキシダーゼ生成微生物を
生育培地中で生育させ、培地からコレステロー
ル・オキシダーゼを分離精製する際、コレステロ
ールそのものを担体とし、酵素を吸着させ、担体
をよく洗浄後、界面活性剤により溶出させ酵素を
精製する事を特徴とするコレステロール・オキシ
ダーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14382977A JPS5476893A (en) | 1977-12-02 | 1977-12-02 | Novel preparation of chlesterol oxidase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14382977A JPS5476893A (en) | 1977-12-02 | 1977-12-02 | Novel preparation of chlesterol oxidase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5476893A JPS5476893A (en) | 1979-06-19 |
| JPS6120268B2 true JPS6120268B2 (ja) | 1986-05-21 |
Family
ID=15347906
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14382977A Granted JPS5476893A (en) | 1977-12-02 | 1977-12-02 | Novel preparation of chlesterol oxidase |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5476893A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2924875A1 (de) * | 1979-06-20 | 1981-01-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur gewinnung von cholesterinoxidase |
| US4374930A (en) * | 1981-10-19 | 1983-02-22 | Eastman Kodak Company | Method for the purification of cholesterol oxidase |
| JP3337575B2 (ja) * | 1994-11-15 | 2002-10-21 | 旭化成株式会社 | 抗ストレプトリジンｏ抗体の決定方法 |
| JP7116061B2 (ja) | 2016-08-21 | 2022-08-09 | アドヴァ バイオテクノロジー リミテッド | バイオリアクタおよびその使用法 |
-
1977
- 1977-12-02 JP JP14382977A patent/JPS5476893A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5476893A (en) | 1979-06-19 |
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