JP2689140B2 - 新規β−ハイドロオキシステロイドオキシダーゼ及びその調製法 - Google Patents
新規β−ハイドロオキシステロイドオキシダーゼ及びその調製法Info
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- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新規なβ−ハイドロオキシステロイドオキ
シダーゼ（β−Hydroxy steroid oxidase）及びその調
製法に関し、この酵素はステロイドの変換、コレステロ
ールの定量に利用される。
シダーゼ（β−Hydroxy steroid oxidase）及びその調
製法に関し、この酵素はステロイドの変換、コレステロ
ールの定量に利用される。
技術的背景 ステロイドは、ステロイド核を有する化合物の総称で
あつて、胆汁酸、性ホルモン、副腎皮質ホルモン及びコ
レステロールなどの生物学的にきわめて重要な物質を多
数含有しており、医薬品や医薬合成中間体としての需要
が大きい。
あつて、胆汁酸、性ホルモン、副腎皮質ホルモン及びコ
レステロールなどの生物学的にきわめて重要な物質を多
数含有しており、医薬品や医薬合成中間体としての需要
が大きい。
現在のところ、羊毛脂から抽出したコレステロールや
大豆脂肪などから抽出した植物ステロールがステロイド
合成の出発物質として使用されている。近年、ステロイ
ドの合成にあたつては、微生物を使用した変換が有馬ら
により開発され〔有馬 啓他「アグリカルチュアル エ
ンド バイオロジカル ケミストリィ」（Agric.Biol.C
hem.）33巻1636頁、（1969年）〕、この方法が工業的に
採用されている。
大豆脂肪などから抽出した植物ステロールがステロイド
合成の出発物質として使用されている。近年、ステロイ
ドの合成にあたつては、微生物を使用した変換が有馬ら
により開発され〔有馬 啓他「アグリカルチュアル エ
ンド バイオロジカル ケミストリィ」（Agric.Biol.C
hem.）33巻1636頁、（1969年）〕、この方法が工業的に
採用されている。
この反応は、コレステロールを３β−ハイドロオキシ
ステロイドオキシダーゼ（Hydroxy steroid oxidase）
の作用によりコレスト−４−エン３−オンに変換する反
応が出発となる。反応は下記のように表わされる。
ステロイドオキシダーゼ（Hydroxy steroid oxidase）
の作用によりコレスト−４−エン３−オンに変換する反
応が出発となる。反応は下記のように表わされる。
微生物によるステロイド反応の多くは酸化還元反応で
あり、これに関係する補酵素を反応系に供給する必要か
ら、工業的に酵素単体を使用している例はなく、酵素系
として微生物菌体が使用されてきた。このため、ステロ
イド変換に関係する酵素を単離し、反応機構を詳細に解
析するなどの試みは殆ど行われなかった。
あり、これに関係する補酵素を反応系に供給する必要か
ら、工業的に酵素単体を使用している例はなく、酵素系
として微生物菌体が使用されてきた。このため、ステロ
イド変換に関係する酵素を単離し、反応機構を詳細に解
析するなどの試みは殆ど行われなかった。
一方、臨床検査、生化学分析などの分野に於いてはコ
レステロールを定量し、高脂血症や動脈硬化症の診断に
利用することが行われてきた。このコレステロールの酵
素的測定方法としてコレステロールオキシダーゼが用い
られている。しかし、この酵素は、従来アースロバクタ
ー属、ブレビバクテリウム属、ノカルディア属、ミクロ
バクテリウム属、シュードモナス属並びにストレプトミ
セス属に属する微生物の菌体内、又は菌体外に生産する
酵素を抽出した粗酵素がそのまま使用されていた。しか
して、この酵素学的な性質などを明らかにし、精製酵素
を使用した例は未だみられない。又ロドコッカス・エク
イ（Rhodococcus equi）No.23株を培養してコレステロ
ールオキシダーゼを得る方法が特開昭61-247381号に開
示されているが、この方法では、精製酵素は得られてお
らず、又、反応系に補酵素系が必要か、否かも明らかに
されていない。
レステロールを定量し、高脂血症や動脈硬化症の診断に
利用することが行われてきた。このコレステロールの酵
素的測定方法としてコレステロールオキシダーゼが用い
られている。しかし、この酵素は、従来アースロバクタ
ー属、ブレビバクテリウム属、ノカルディア属、ミクロ
バクテリウム属、シュードモナス属並びにストレプトミ
セス属に属する微生物の菌体内、又は菌体外に生産する
酵素を抽出した粗酵素がそのまま使用されていた。しか
して、この酵素学的な性質などを明らかにし、精製酵素
を使用した例は未だみられない。又ロドコッカス・エク
イ（Rhodococcus equi）No.23株を培養してコレステロ
ールオキシダーゼを得る方法が特開昭61-247381号に開
示されているが、この方法では、精製酵素は得られてお
らず、又、反応系に補酵素系が必要か、否かも明らかに
されていない。
発明が解決しようとする課題 上述のように、これまでのステロイドの変換では精製
された酵素を使用して進められた例はなく、又工業的に
使用可能で、かつ補酵素の供給を必要としない３−β−
ハイドロオキシステロイドオキシダーゼは得られていな
い。更に、コレステロールの測定に於いても精製された
コレステロールオキシダーゼを使用した例もなく、使用
している酵素の基質特異性も広いものであつて、測定の
信頼度にも問題があつた。
された酵素を使用して進められた例はなく、又工業的に
使用可能で、かつ補酵素の供給を必要としない３−β−
ハイドロオキシステロイドオキシダーゼは得られていな
い。更に、コレステロールの測定に於いても精製された
コレステロールオキシダーゼを使用した例もなく、使用
している酵素の基質特異性も広いものであつて、測定の
信頼度にも問題があつた。
本発明は、工業的にも、臨床検査用にも使用可能な、
補酵素系の供給を必要としない精製されたロドコッカス
・エクイ（Rhodococcus equi）に属する菌株の生産する
新規な３−β−ハイドロオキシステロイドオキシダーゼ
を提供することを課題とする。
補酵素系の供給を必要としない精製されたロドコッカス
・エクイ（Rhodococcus equi）に属する菌株の生産する
新規な３−β−ハイドロオキシステロイドオキシダーゼ
を提供することを課題とする。
以下本発明を詳しく説明する。
課題を解決するための手段 本発明者らは、上述の課題を解決するため、ステロイ
ド分解微生物の生産する酵素について研究を進めた結
果、土壌より分離したロドコッカス・エクイ（Rhodococ
cus equi）MIL 1037株が菌体外に新規な３−β−ハイド
ロオキシステロイドオキシダーゼを産生することを見出
し、本発明をなすに至つた。
ド分解微生物の生産する酵素について研究を進めた結
果、土壌より分離したロドコッカス・エクイ（Rhodococ
cus equi）MIL 1037株が菌体外に新規な３−β−ハイド
ロオキシステロイドオキシダーゼを産生することを見出
し、本発明をなすに至つた。
本発明に用いる菌株ロドコッカス・エクイMIL 1037株
（以下1037株という）は、本発明者らにより分離され、
工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄託第1017
9号として寄託されている。
（以下1037株という）は、本発明者らにより分離され、
工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄託第1017
9号として寄託されている。
この1037株を用いて所望の３−β−ハイドロオキシス
テロイドオキシダーゼを得るには、液体培地中に該菌株
を接種し、常法に従つて培養し、培養液より採取すれば
よい。又、培地中にコレステロール等のステロイド化合
物を添加し、酵素生産を誘導することも可能である。
テロイドオキシダーゼを得るには、液体培地中に該菌株
を接種し、常法に従つて培養し、培養液より採取すれば
よい。又、培地中にコレステロール等のステロイド化合
物を添加し、酵素生産を誘導することも可能である。
培養に用いる培地としては、1037株が利用可能な栄養
源を含むものであればいずれでもよいが、特に好ましい
培地としては、ニュートリエント培地、変法ニュートリ
エント培地として一般的に知られている培地を挙げるこ
とができる。又、本株の保存用スラントとしては２％寒
天を加えた培地を使用し得る。上記変法ニュートリエン
ト培地の組成としては、例えばコーンステープリカー1.
0重量％、ビーフエキス0.5重量％、グルコース0.5重量
％及びリン酸カリウム0.2重量％を含有するもの（pH7.0
に調整）を例示し得る。
源を含むものであればいずれでもよいが、特に好ましい
培地としては、ニュートリエント培地、変法ニュートリ
エント培地として一般的に知られている培地を挙げるこ
とができる。又、本株の保存用スラントとしては２％寒
天を加えた培地を使用し得る。上記変法ニュートリエン
ト培地の組成としては、例えばコーンステープリカー1.
0重量％、ビーフエキス0.5重量％、グルコース0.5重量
％及びリン酸カリウム0.2重量％を含有するもの（pH7.0
に調整）を例示し得る。
培養の方法としては、静値培養、振盪培養及びジヤー
ファーメンター培養などが挙げられるが、大量に行うに
は、ジヤーファーメンターが好ましい。培養の条件は、
培地及び培養容器によつて異なるが、20℃〜35℃、好ま
しくは25℃〜30℃の培養温度で24時間〜96時間、好まし
くは24時間〜48時間培養を行うとよい。
ファーメンター培養などが挙げられるが、大量に行うに
は、ジヤーファーメンターが好ましい。培養の条件は、
培地及び培養容器によつて異なるが、20℃〜35℃、好ま
しくは25℃〜30℃の培養温度で24時間〜96時間、好まし
くは24時間〜48時間培養を行うとよい。
培養終了後は、常法に従つて、菌体と培養上清を分離
する。例えば、遠心分離、あるいは濾過などの方法を例
示できる。菌体を除いた培養上清は、周知の精製手段に
より、３−β−ハイドロオキシステロイドオキシダーゼ
を分離、採取する。例えば、培養物から遠心分離により
菌体を除去した後、上清に硫酸アンモニウムを加え塩析
を行う。次いで、遠心分離により、塩析で沈澱した蛋白
質画分を集め、10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）
に懸濁し、さらに同じ緩衝液中で透析し粗酵素溶液とす
る。この粗酵素溶液でも、所望のステロイド変換や、診
断薬用酵素として使用が可能である。
する。例えば、遠心分離、あるいは濾過などの方法を例
示できる。菌体を除いた培養上清は、周知の精製手段に
より、３−β−ハイドロオキシステロイドオキシダーゼ
を分離、採取する。例えば、培養物から遠心分離により
菌体を除去した後、上清に硫酸アンモニウムを加え塩析
を行う。次いで、遠心分離により、塩析で沈澱した蛋白
質画分を集め、10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）
に懸濁し、さらに同じ緩衝液中で透析し粗酵素溶液とす
る。この粗酵素溶液でも、所望のステロイド変換や、診
断薬用酵素として使用が可能である。
この粗酵素液を、さらに10mMトリス−塩酸緩衝液（pH
8.0）で透析し、その後DEAE−セルロースカラムクロマ
トグラフイー及びCM−セルロースカラムクロマトグラフ
イー、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフイー
を順次通過させ、分画精製することができる。さらに、
セファデックスG-75を使用したゲル濾過を行い、最終精
製酵素を得ることができる。このように精製した３−β
−ハイドロオキシステロイドオキシダーゼは、SDS電気
泳動により単一のスポットを示す。
8.0）で透析し、その後DEAE−セルロースカラムクロマ
トグラフイー及びCM−セルロースカラムクロマトグラフ
イー、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフイー
を順次通過させ、分画精製することができる。さらに、
セファデックスG-75を使用したゲル濾過を行い、最終精
製酵素を得ることができる。このように精製した３−β
−ハイドロオキシステロイドオキシダーゼは、SDS電気
泳動により単一のスポットを示す。
このようにして得られた酵素の活性は次のようにして
測定する。
測定する。
（１）酵素活性の測定 酵素検定液を含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
0）1mlを反応槽（1ml容）に入れ、溶存酸素を飽和され
た後、コレステロール（１μmol/20μｌエタノール液）
を添加し30℃で反応を行い、１分後の溶存酸素の消費量
を求める。尚、溶存酸素の測定には生化学用溶存酸素計
オキシグラフ８（セントラル科学製）を使用し、酵素活
性は、30℃で１分間に１μmolの溶存酸素を消費させる
酵素量を１ユニット（Ｕ）と決め、比活性は蛋白質1mg
に対しての酵素単位（U/mg）として表わす。
0）1mlを反応槽（1ml容）に入れ、溶存酸素を飽和され
た後、コレステロール（１μmol/20μｌエタノール液）
を添加し30℃で反応を行い、１分後の溶存酸素の消費量
を求める。尚、溶存酸素の測定には生化学用溶存酸素計
オキシグラフ８（セントラル科学製）を使用し、酵素活
性は、30℃で１分間に１μmolの溶存酸素を消費させる
酵素量を１ユニット（Ｕ）と決め、比活性は蛋白質1mg
に対しての酵素単位（U/mg）として表わす。
（２）蛋白質の定量方法 蛋白質の定量は、牛血清アルブミン（シグマ社製）を
標準としたローリー法（Lowry法）により行う。
標準としたローリー法（Lowry法）により行う。
このようにして測定した精製酵素の比活性は20U/mg蛋
白以上を示す。
白以上を示す。
上述のようにして精製された３−β−ハイドロオキシ
ステロイドオキシダーゼは以下に示す酵素化学的性質を
有する。
ステロイドオキシダーゼは以下に示す酵素化学的性質を
有する。
作用 各種ステロイド化合物を基質として用い、酵素活性を
測定した。コレステロールを基質とした際の溶存酸素消
費量を100として各基質の酸素消費量を測定したとこ
ろ、表１に示す結果が得られた。３β水酸基を有する基
質にのみ本酵素は活性を示す。
測定した。コレステロールを基質とした際の溶存酸素消
費量を100として各基質の酸素消費量を測定したとこ
ろ、表１に示す結果が得られた。３β水酸基を有する基
質にのみ本酵素は活性を示す。
分子量 SDSポリアクリルアミドゲルデスク電気泳動により分子
量を測定したところ、48,000±2,000の分子量を示し
た。
量を測定したところ、48,000±2,000の分子量を示し
た。
等電点 ショ糖密度勾配等電点電気泳動の結果、等電点はpH9.2
±0.1であつた。
±0.1であつた。
至適pH 至適pHは7.5を示した。（第１図参照） pH安定性 ４℃で１時間、４℃で24時間、それぞれの処理に於い
て、pH7.0〜pH9.0の範囲で安定であつた。（第２図参
照） 至適温度 作用温度は５℃から55℃の範囲に亘り、至適温度は45℃
であつた。（第３図参照） 熱安定性 pH7.0での処理に於いて、50℃、１時間の加熱で30％の
残存活性を示し、60℃、５分間の加熱では15％の残存活
性を示した。（第４図参照） 金属結合 EDTA、ｏ−フエナントロリン、α−α′−ジピリジル−
８−キノリノール、シアン化カリ、硝酸ナトリウムなど
のキレート試薬によつて活性は阻害されない。このこと
から、酵素中に金属イオンが存在しないことが確認され
た。
て、pH7.0〜pH9.0の範囲で安定であつた。（第２図参
照） 至適温度 作用温度は５℃から55℃の範囲に亘り、至適温度は45℃
であつた。（第３図参照） 熱安定性 pH7.0での処理に於いて、50℃、１時間の加熱で30％の
残存活性を示し、60℃、５分間の加熱では15％の残存活
性を示した。（第４図参照） 金属結合 EDTA、ｏ−フエナントロリン、α−α′−ジピリジル−
８−キノリノール、シアン化カリ、硝酸ナトリウムなど
のキレート試薬によつて活性は阻害されない。このこと
から、酵素中に金属イオンが存在しないことが確認され
た。
金属塩の影響 各金属塩CaCl2、MgCl2、FeCl2、FeSO4、CuSO4、Na2Mo
O4、CoCl2、NiCl2、MnCl2、AgNO3並びにHgCl2を10-2、1
0-3、10-4M/ml濃度にそれぞれ調整したものを酵素活性
測定時に1mlを加え影響を検討した。結果は表２に示す
とおり、AgNO3とHgCl2は酵素活性を強く抑制した。又、
この抑制は10mMのグルタチオンとジチオスレイトールの
添加により回復した。
O4、CoCl2、NiCl2、MnCl2、AgNO3並びにHgCl2を10-2、1
0-3、10-4M/ml濃度にそれぞれ調整したものを酵素活性
測定時に1mlを加え影響を検討した。結果は表２に示す
とおり、AgNO3とHgCl2は酵素活性を強く抑制した。又、
この抑制は10mMのグルタチオンとジチオスレイトールの
添加により回復した。
Km、Vmax値 コレステロールを基質とした際のKm値は3.27×10-4M、
本酵素濃度５μg/mlの時のVmaxは1.33×10-4Mである。
本酵素濃度５μg/mlの時のVmaxは1.33×10-4Mである。
吸収スペクトル 日立100-60型ダブルビーム分光光度計（日立製作所製）
を使用した吸収スペクトルでは280nmに極大吸収を有
し、それ以外には吸収を有しなかつた。（第５図参照） 本酵素にはFADの吸収が存在しないことから、FDA依存性
の３β−ハイドロオキシステロイドオキシダーゼとは性
質が異なることが明らかである。
を使用した吸収スペクトルでは280nmに極大吸収を有
し、それ以外には吸収を有しなかつた。（第５図参照） 本酵素にはFADの吸収が存在しないことから、FDA依存性
の３β−ハイドロオキシステロイドオキシダーゼとは性
質が異なることが明らかである。
以下実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明す
る。
る。
実施例１ 培養液の調製 ロドコッカス・エクイMIL 1037株（微工研菌寄第1017
9）を保存用スラントから１白金耳をシード用スラント
培地に植菌し、30℃で24時間静置培養を行い、これをシ
ード用スラントとした。このシード用スラントから３白
金耳を下記組成のニュートリエント培地（100ml/500ml
容三角コルベン）に接種し、27℃で24時間回転振盪培養
（200rpm）を行い、これを前培養とした。さらに、前培
養から3mlを変法ニュートリエント培地100mlに接種し、
27℃で同様に回転振盪培養を行い、培養液を得た。
9）を保存用スラントから１白金耳をシード用スラント
培地に植菌し、30℃で24時間静置培養を行い、これをシ
ード用スラントとした。このシード用スラントから３白
金耳を下記組成のニュートリエント培地（100ml/500ml
容三角コルベン）に接種し、27℃で24時間回転振盪培養
（200rpm）を行い、これを前培養とした。さらに、前培
養から3mlを変法ニュートリエント培地100mlに接種し、
27℃で同様に回転振盪培養を行い、培養液を得た。
変法ニュートリエント培地組成： コーンステープリカー 1.0wt％ ビーフエキス 0.5wt％ グルコース 0.5wt％ K2HPO4 0.2wt% pH 7.2 酵素の精製 上述のようにして得られた培養液を集め12,000Gで15
分間遠心分離し、培養上清10lを得た。この上清液に硫
酸アンモニウムを加え飽和分画を行った。硫酸アンモニ
ウム20、30、40、50、60、70および80wt％でそれぞれ飽
和分画を行つた。蛋白質の沈澱を12,000Gで15分間４℃
にて遠心分離を行つて集め、10mMリン酸ナトリウム緩衝
液（pH7.0）に懸濁した。懸濁液は、同じ緩衝液5lで５
回、48時間透析した後、酵素活性及び蛋白質量の測定を
行つた。活性の高い50％、60％の各飽和画分を合わせて
粗酵素溶液とし、10mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）5l
で５回、48時間透析を行つた。
分間遠心分離し、培養上清10lを得た。この上清液に硫
酸アンモニウムを加え飽和分画を行った。硫酸アンモニ
ウム20、30、40、50、60、70および80wt％でそれぞれ飽
和分画を行つた。蛋白質の沈澱を12,000Gで15分間４℃
にて遠心分離を行つて集め、10mMリン酸ナトリウム緩衝
液（pH7.0）に懸濁した。懸濁液は、同じ緩衝液5lで５
回、48時間透析した後、酵素活性及び蛋白質量の測定を
行つた。活性の高い50％、60％の各飽和画分を合わせて
粗酵素溶液とし、10mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）5l
で５回、48時間透析を行つた。
この酵素溶液を粗酵素液とした。
粗酵素溶液550mlを10mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）
で平衡化したDEAE−セルロースのカラム（内径2.6cm×
長さ60cm）に流し、同じ緩衝液で溶出した。全活性2U/1
0mlを越える画分をあわせ、30℃でエバポレーター濃縮
し、10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）5lで４回、4
8時間透析し、150mlの酵素液を得た。この酵素液を10mM
リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）で平衡化したCM−セ
ルロースカラム（内径2.6cm×長さ60cm）に流した。こ
のカラムに10mMの同緩衝液を流し、洗浄した後、25mMの
同緩衝液（pH7.0）を1.0ml/分の流速で通し溶出した。
活性画分を集め、30℃でエバポレーター濃縮後、10mMリ
ン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）3lで４回、48時間透析
し、50mlの酵素溶液を得た。この50mlの酵素溶液を10mM
リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）で平衡化したヒドロ
キシアパタイトカラム（内径0.5cm×長さ15cm）に流し
た。不活性蛋白質を取り除くため、50mMの同緩衝液（pH
7.0）を流した後、100mMの同緩衝液（pH7.0）で溶出さ
せた。活性画分を集め、30℃でエバポレーターを使用し
濃縮後、pH7.0の10mMリン酸ナトリウム緩衝液3lで４
回、48時間透析し5mlの酵素液を回収した。
で平衡化したDEAE−セルロースのカラム（内径2.6cm×
長さ60cm）に流し、同じ緩衝液で溶出した。全活性2U/1
0mlを越える画分をあわせ、30℃でエバポレーター濃縮
し、10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）5lで４回、4
8時間透析し、150mlの酵素液を得た。この酵素液を10mM
リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）で平衡化したCM−セ
ルロースカラム（内径2.6cm×長さ60cm）に流した。こ
のカラムに10mMの同緩衝液を流し、洗浄した後、25mMの
同緩衝液（pH7.0）を1.0ml/分の流速で通し溶出した。
活性画分を集め、30℃でエバポレーター濃縮後、10mMリ
ン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）3lで４回、48時間透析
し、50mlの酵素溶液を得た。この50mlの酵素溶液を10mM
リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）で平衡化したヒドロ
キシアパタイトカラム（内径0.5cm×長さ15cm）に流し
た。不活性蛋白質を取り除くため、50mMの同緩衝液（pH
7.0）を流した後、100mMの同緩衝液（pH7.0）で溶出さ
せた。活性画分を集め、30℃でエバポレーターを使用し
濃縮後、pH7.0の10mMリン酸ナトリウム緩衝液3lで４
回、48時間透析し5mlの酵素液を回収した。
ヒドロキシアパタイトカラムにより得た酵素液5ml
を、10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）で膨潤平衡
化したセファデックスG-25カラム（内径2.6cm×長さ60c
m）にかけ、同緩衝液で溶出した。活性画分（第６図参
照）を集め、濃縮液10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
0）3lで４回、48時間透析した。その後、凍結乾燥を行
い、精製酵素22mgを得た。また、この酵素比活性は21.4
0U/mgであつた。
を、10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）で膨潤平衡
化したセファデックスG-25カラム（内径2.6cm×長さ60c
m）にかけ、同緩衝液で溶出した。活性画分（第６図参
照）を集め、濃縮液10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
0）3lで４回、48時間透析した。その後、凍結乾燥を行
い、精製酵素22mgを得た。また、この酵素比活性は21.4
0U/mgであつた。
各精製ステップの精製度と回収率は表３に示す通りで
あつた。
あつた。
酵素蛋白質の同定 酵素蛋白質50μｇについて、ポリアクリルアミドを用
いたゲルデスク電気泳動を行つた。pH9.4、7.5％Ｔゲル
を用いて4mAで２時間行い、電気泳動後、0.25％クーマ
シーブリリアントブルーR-250で染色した。（第７図参
照） 図にみられるとおり、単一バンドを示し、均一に精製
されたことを確認された。
いたゲルデスク電気泳動を行つた。pH9.4、7.5％Ｔゲル
を用いて4mAで２時間行い、電気泳動後、0.25％クーマ
シーブリリアントブルーR-250で染色した。（第７図参
照） 図にみられるとおり、単一バンドを示し、均一に精製
されたことを確認された。
発明の効果 本発明によると、新規な３β−ハイドロオキシステロ
イドオキシダーゼを得ることができ、本酵素は、補酵素
FADの非存在下で、コレステロールをステロイド合成の
出発物質であるコレスト−４−エン−３−オンに変換す
る作用を有するので、ステロイドの変換、コレステロー
ルの定量に有効に利用することができる。
イドオキシダーゼを得ることができ、本酵素は、補酵素
FADの非存在下で、コレステロールをステロイド合成の
出発物質であるコレスト−４−エン−３−オンに変換す
る作用を有するので、ステロイドの変換、コレステロー
ルの定量に有効に利用することができる。
第１図は、本発明に係る酵素の至適pHを示し、第２図は
本酵素のpH安定性を示し、第３図は本酵素の至適温度を
示し、第４図は本酵素の熱安定性を示し、第５図は本酵
素の吸収スペクトルを示す。 また、第６図はセファデックスＧカラムから溶出した本
酵素の活性画分を示し、第７図は本酵素蛋白質の電気泳
動による染色バンドを示す。
本酵素のpH安定性を示し、第３図は本酵素の至適温度を
示し、第４図は本酵素の熱安定性を示し、第５図は本酵
素の吸収スペクトルを示す。 また、第６図はセファデックスＧカラムから溶出した本
酵素の活性画分を示し、第７図は本酵素蛋白質の電気泳
動による染色バンドを示す。
Claims (4)
- 【請求項１】下記の酵素学的性質を有するβ−ハイドロ
オキシステロイドオキシダーゼ、 作用:3β−水酸基を有するステロイドに対して特異的
に作用して３−オキソステロイドを生成する。 分子量:48,000±2,000 等電点:pH9.2±0.1 至適pH:7.5 pH安定性:4℃で24時間の処理に於いて、pH7.0〜9.0の
範囲で安定。 至適温度:45℃ 熱安定性:pH7.0で１時間の処理に於いて、40℃で90％
以上の活性を保持する。 金属結合：酵素分子内に金属イオンが存在しない。 金属塩の影響：硝酸銀（AgNO3）、塩化第二水銀（HgC
l2）によって酵素活性が阻害され、グルタチオン、ジチ
オスレイトールの添加により活性が回復する。 Km、Vmax値：コレステロールを基質とした際のKm値は
3.27×10-4M、酵素濃度５μg/ml時のVmax値は1.33×10
-4M。 吸収スペクトル：紫外、可視部吸収スペクトルに於い
て蛋白質以外の吸収が認められない。 - 【請求項２】ロドコッカス・エクイ（Rhodococcus equ
i）により生産される請求項（１）に記載のβ−ハイド
ロオキシステロイドオキシダーゼ。 - 【請求項３】ロドコッカス・エクイを培養し、得られた
培養液より請求項（１）に記載の酵素学的性質を有する
β−ハイドロオキシステロイドオキシダーゼを分離、採
取することを特徴とする、請求項（１）に記載されるβ
−ハイドロオキシステロイドオキシダーゼの調製法。 - 【請求項４】ロドコッカス・エクイはロドコッカス・エ
クイMIL1037株（微工研菌寄第10179）である請求項
（３）に記載の調製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63209442A JP2689140B2 (ja) | 1988-08-25 | 1988-08-25 | 新規β−ハイドロオキシステロイドオキシダーゼ及びその調製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63209442A JP2689140B2 (ja) | 1988-08-25 | 1988-08-25 | 新規β−ハイドロオキシステロイドオキシダーゼ及びその調製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0260584A JPH0260584A (ja) | 1990-03-01 |
| JP2689140B2 true JP2689140B2 (ja) | 1997-12-10 |
Family
ID=16572931
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63209442A Expired - Lifetime JP2689140B2 (ja) | 1988-08-25 | 1988-08-25 | 新規β−ハイドロオキシステロイドオキシダーゼ及びその調製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2689140B2 (ja) |
-
1988
- 1988-08-25 JP JP63209442A patent/JP2689140B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0260584A (ja) | 1990-03-01 |
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