JPH0260584A

JPH0260584A - 新規β−ハイドロオキシステロイドオキシダーゼ及びその調製法

Info

Publication number: JPH0260584A
Application number: JP63209442A
Authority: JP
Inventors: Mitsugi Iida; 飯田　貢; Makoto Yoshihama; 誠吉浜; Nobuo Miyata; 信夫宮田
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1988-08-25
Filing date: 1988-08-25
Publication date: 1990-03-01
Anticipated expiration: 2012-12-10
Also published as: JP2689140B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産呈上ｑ剋里立互本発明は、新規なβ−ハイドロオキシステロイドオキシ
ダーゼ（β−１（ｙｄｒｏｘｙ　５ｔｅｒｏｉｄ　ｏｘ
ｉｄａｓｅ）及びその調製法に関し、この酵素はステロ
イドの変換、コレステロールの定量に利用される。

茨土煎ｌ員ステロイドは、ステロイド核を有する化合物の総称であ
って、胆汁酸、性ホルモン、副腎皮質ホルモン及びコレ
ステロールなどの生物学的にきわめて重要な物質を多数
含有しており、医薬品や医薬合成中間体としての需要が
大きい。

現在のところ、羊毛脂から抽出したコレステロールや大
豆脂肪などから抽出した植物ステロールがステロイド合
成の出発物質として使用されている。近年、ステロイド
の合成にあたっては、微生物を、使用した変換が有馬ら
により開発され〔有馬啓他［アグリカルテュアルエンド
バイオロジカルケミストリイ」（八ｇｒｉｃ、　Ｂｉｏ
ｌ、　Ｃｈｅｍ、）３３巻１６３６頁、（１９６９年）
〕、この方法が工業的に採用されている。

この反応は、コレステロールを３β−ハイドロオキシス
テロイドオキシダーゼ（Ｈｙｄｒｏｘｙ　５ｔｅｒｏｉ
ｄｏｘｉｄａｓｅ）の作用によりコレスト−４−エン３
−オンに変換する反応が出発となる。反応は下記のよう
に表わされる。

ステロイドオキシダーゼコレスト−４−エン−３−オン微生物によるステロイド反応の多くは酸化還元反応であ
り、これに関係する補酵素を反応系に供給する必要から
、工業的に酵素単体を使用している例はなく、酵素系と
して微生物菌体が使用されてきた。このため、ステロイ
ド変換に関係する酵素を単離し、反応機構を詳細に解析
するなどの試みは殆ど行われなかった。

一方、臨床検査、生化学分析などの分野に於いてはコレ
ステロールを定量し、高脂血症や動豚硬化症の診断に利
用することが行われてきた。このコレステロールの酵素
的測定方法としてコレステロールオキシダーゼが用いら
れている。しかし、この酵素は、従来アースロバフタ−
属、ブレビバクテリウム属、ノカルデイア属、ミクロバ
クテリウム属、シュードモナス属並びにストレプトミセ
ス属に、属する微生物の菌体内、又は菌体外に生産する
酵素を抽出した粗酵素がそのまま使用されていた。しか
して、この酵素学的な性質などを明らかにし、精製酵素
を使用した例は未だみられない。

又ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅ
ｑｕｉ）　Ｎ０２３株を培養してコレステロールオキシ
ダーゼを得る方法が特開昭６１−２４７３８１号に開示
されているが、この方法では、精製酵素は得られておら
ず、又、反応系に補酵素系が必要か、否かも明らかにさ
れていない。

発　が解“　しようとする課題上述のように、これまでのステロイドの変換では精製さ
れた酵素を使用して進められた例はなく、又工業的に使
用可能で、かつ補酵素の供給を必要としない３−β−ハ
イドロオキシステロイドオキシダーゼは得られていない
。更に、コレステロールの測定に於いても精製されたコ
レステロールオキシダーゼを使用した例もなく、使用し
ている酵素の基質特異性も広いものであって、測定の信
頼度にも問題があった。

本発明は、工業的にも、臨床検査用にも使用可能な、補
酵素系の供給を必要としない精製されたロドコッカス・
エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ）に属する
菌株の生産する新規な３−β−ハイドロオキシステロイ
ドオキシダーゼを提供することを課題とする。

以下本発明の詳細な説明する。

課−を解ｌするための手段本発明者らは、上述の課題を解決するため、ステロイド
分解微生物の生産する酵素について研究を進めた結果、
土壌より分離したロドコッカス・エクイＣＲｈｏｄｏｃ
ｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ）旧Ｌ　１０３７株が菌体外に新
規な３−β−ハイドロオキシステロイドオキシダーゼを
産生ずることを見出し、本発明をなすに至った。

本発明に用いる菌株ロドコッカス・エクイＭＩＬ１０３
７株（以下１０３７株という）は、本発明者らにより分
離され、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄
託第１０１７９号として寄託されている。

この１０３７株を用いて所望の３−β−ハイドロオキシ
ステロイドオキシダーゼを得るには、液体培地中に該菌
株を接種し、常法に従って培養し、培養液より採取すれ
ばよい。又、培地中にコレステロル等のステロイド化合
物を添加し、酵素生産を誘導することも可能である。

培養に用いる培地としては、１０３７株が利用可能な栄
養源を含むものであればいずれでもよいが、特に好まし
い培地としては、ニュートリエンド培地、変法ニュート
リエンド培地として一般的に知られている培地を挙げる
ことができる。又、木株の保存用スラントとしては２％
寒天を加えた培地を使用し得る。上記変法ニュートリエ
ンド培地の組成としては、例えばコーンステープリカー
１．０重量％、ビーフエキス０．５重量％、グルコース
０．５重量％及びリン酸カリウム０．２重量％を含有す
るもの（ｐｌ＋　７．０に調整）を例示し得る。

培養の方法としては、静置培養、振盪培養及びジャーフ
ァーメンタ−培養などが挙げられるが、大量に行うには
、ジャーファーメンタ−が好ましい。培養の条件は、培
地及び培養容器によって異なるが、２０℃〜３５℃、好
ましくは２５℃〜３０℃の培養温度で２４時間〜９６時
間、好ましくは２４時間〜４８時間培養を行うとよい。

培養終了後は、常法に従って、菌体と培養上清を分離す
る。例えば、遠心分離、あるいは濾過などの方法を例示
できる。菌体を除いた培養上清は、周知の精製手段によ
り、３−β−ハイドロオキシステロイドオキシダーゼを
分離、採取する。例えば、培養物から遠心分離により菌
体を除去した後、上清に硫酸アンモニウムを加え塩析を
行う。次いで、遠心分離により、塩析で沈澱した蛋白質
画分を集め、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐｉｆ
　７．０）に懸濁し、さらに同じ緩衝液中で透析し粗酵
素溶液とする。この粗酵素溶液でも、所望のステロイド
変換や、診断薬用酵素として使用が可能である。

この粗酵素液を、さらに１０ｍＭ　トリス−塩１Ｍ緩衝
液（ｐＨ８，０）で透析し、その後ＤＥＡＥ−セルロス
カラムクロマトグラフィー及びＣＭ−セルロスカラムク
ロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトカラムクロマ
トグラフィーを順次通過させ、分画精製することができ
る。さらに、セファデックス６−７５を使用したゲル濾
過を行い、最終精製酵素を得ることができる。このよう
に精製した３β−ハイドロオキシステロイドオキシダー
ゼは、ＳＤＳ電気泳動により単一のスポットを示す。

このようにして得られた酵素の活性は次のようにして測
定する。

（１１酵素活性の測定酵素検定液を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩ｆＪｉ液
（ｐＨ７，０）　１ｍ／を反応槽（１ｍｌ容）に入れ、
溶存酸素を飽和させた後、コレステロール（１μｍｏｌ
／２０μｌエタノール液）を添加し３０℃で反応を行い
、１分後の溶存酸素の消費量を求める。尚、溶存酸素の
測定には生化学用溶存酸素計オキシグラフ８　（セント
ラル科学製）を使用し、酵素活性は、３０℃で１分間に
１μｍｏｌの溶存酸素を消費させる酵素量を１ユニツ）
　（Ｕ）と決め、比活性は蛋白質１ｍｇに対しての酵素
単位（Ｕ／ｍｇ）として表わす。

（２）蛋白質の定量方法蛋白質の定量は、牛血清アルブミン（シグマ社製）を標
準としたローリ−法（Ｌｏｗｒｙ法）により行う。

このようにして測定した精製酵素の比活性は２０　Ｕ　
／ｍｇ蛋白以上を示す。

上述のようにして精製された３−β−ハイドロオキシス
テロイドオキシダーゼは以下に示す酵素化学的性質を有
する。

０作用各種ステロイド化合物を基質として用い、酵素活性を測
定した。コレステロールを基質とした際の溶存酸素消費
量を１００として各基質の酸素消費量を測定したところ
、表１に示す結果が得られた。

３β水酸基を有する基質にのみ本酵素は活性を示す。

表　　１注）コレステロールの酸化率（０，２ｐ　ｍｏｌ／ｍ１
ｎ）は１００％として表わした。

■分子量ＳＤＳポリアクリルアミドゲルデスク電気泳動により分
子量を測定したところ、４８，０００±２，０００の分
子量を示した。

■等電点ショ糖密度勾配等電点電気泳動の結果、等電点はｐＨ９
，２±０．１であった。

■至適ｐＨ至適ｐｕは７．５を示した。（第１図参照）■ｐＨｐＨ
性４℃で１時間、４℃で２４時間、それぞれの処理に於い
て、ｐｔ＋　７．０〜ｐｉ　９．０の範囲で安定であっ
た。（第２図参照） ■至適温度作用温度は５℃から５５℃の範囲に亘り、至適温度は４
５℃であった。（第３図参照） ■熱安定性ｐｌ＋　７．０での処理に於いて、５０℃、１時間の加
熱で３０％の残存活性を示し、６０℃、５分間の加熱で
は１５％の残存活性を示した。（第４図参照）■金属結
合ＥＤＴＡＸｏ−フェナントロリン、α−α′−ジピリジ
ルー８−キノリツール、シアン化カリ、硝酸ナトリウム
などのキレート試薬によって活性は阻害されない。この
ことから、酵素中に金属イオンが存在しないことがＩＩ
Ｉ　Ｌｆｆｌされた。

■金属塩の影響各金属塩ＣａＣ１２、ＭＥＣＩ２、ＦｅＣｌ２、ＦｅＳ
Ｏ４、Ｃｕ５Ｏａ、Ｎａ２ＭｏＯ，、ＣＯＣｌ２、Ｎｉ
Ｃｌ２、ＭｎＣｌ２、ＡｇＮ（ｈ並びに１１ｇＣ１，を
１０−２．１０−３．１０−’Ｍ／ｍ　Ｒｆｆ５度にそ
れぞれ調整したものを酵素活性測定時に１ｍｎを加え影
響を検討した。結果は表２に示すとおり、ＡｇＮ（ｈと
ＩＩｇＣＩ□は酵素活性を強く抑制した。又、この抑制
は１０ｍＭのグルタチオンとジチオスレイトルの添加に
より回復した。

表　　２ＣａＣＩ□ ＭｇＣｌ。

ＦｅＣｌ□ ｅＳＯ４ｕＳＯｎＮａ２ＭｏＯ。

ＣｏＣ１□ １ＣＩ２ｎＣＩｚ八ｇＮｏ３へｇＮＯ３＋１０ｍＭグ／レタチオンＡｇＮＯ３＋　１０ｍＭジチオスレイト１（ｇＣ１２１１ｇｃＩ　２　＋　１０ｍＭグルタチオン１１ｇｃｈ
　＋　１０ｍＭジチオスレイト注）本金属塩を添加しな
い場合の酸化率をとして表わした。

１００％［相］にｍ、　Ｖｍａｘ値コレステロールを基質とした際のＫｍ値は３．２７ｘｌ
Ｏ−’Ｍ　、本酵素濃度５　ｐ　ｇ／ｍ　１の時のνｍ
ａｘは１．３３　Ｘ　１０−’Ｍである。

■吸収スペクトル日立１００−６０型ダブルビ一ム分光光度計（日立製作
断裂）を使用した吸収スペクトルでは２８０ｎｍに極大
吸収を有し、それ以外には吸収を有しなかった。　（第
５図参照）本酵素にはＦＡＤの吸収が存在しないことがら、ＦＤＡ
依存性の３β−ハイドロオキシステロイドオキシダーゼ
とは性質が異なることが明らかである。

以下実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。

実施例１府炙喪ｑ里袈ロドコッカス・エクイ　ＭＩＬ　１０３７株（微工研閑
寄第１０１７９）を保存用スラントから１白金耳をシー
ド用スラント培地に植菌し、３０℃で２４時間静置培養
を行い、これをシード用スラントとした。このシード用
スラントから３白金耳を下記組成のニュトリエント培地
（１００ｍ　ｌ！　１５００ｍ　ｊ！容三角コルベン）
に接種し、２７℃で２４時間回転振盪培養（２０Ｏｒｐ
ｍ）を行い、これを前培養とした。さらに、前培養から
３ｍｆを変法ニュートリエンド培地Ｌｏｏｍ　ｌに接種
し、２７℃で同様に回転振盪培養を行い、培養液を得た
。

変法ニュートリエンド培地組成：コーンステープリカー　　　１．０阿ｔ％ビーフエキス
　　　　　　　０．５賀【％グルコース　　　　　　　
　Ｑ、５　ｗｔ％ＫｇｌｌＰＯ４０，２響ｔ％ｐＨ７，２住量ｑ拵袈上述のようにして得られた培養液を集め１２，０ＯＯＧ
で１５分間遠心分離し、培養上滑１０７！を得た。この
上清液に硫酸アンモニウムを加え飽和分画を行った。硫
酸アンモニウムを２０．３０．４０．５０．６０．７０
および８０−ｔ％でそれぞれ飽和分画を行った。蛋白質
の沈澱を１２．０００　Ｇで１５分間４℃にて遠心分離
を行って集め、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝？＆（ｐ
Ｈ７，０）に懸濁した。懸濁液は、同じ緩衝液５ｐで５
回、４８時間透析した後、酵素活性及び蛋白質量の測定
を行った。活性の高い５０％、６０％の各飽和画分を合
わせて粗酵素溶液とし、１０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液
（ｐｌ＋　８．０）　５　Ｉｔで５回、４８時間透析を
行った。

この酵素溶液を粗酵素液とした。

粗酵素溶液５５０ｍ　ｌを１０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８，０）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースの
カラム（内径２．６ｃｍｘ長さ６０ｃｍ）に流し、同し
緩衝液で）８出した。全活性２Ｕ／１０ｎ＋ｆｆを越え
る両分をあわせ、３０℃でエバポレーター濃縮し、１０
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）　５　Ｎで
４回、４８時間透析し、１５０ｍ　Ｉｔの酵素液を得た
。この酵素液を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７，０）で平衡化したＣＭ−セルロースカラム（内径２
．６ｃｍＸ長さ６０ｃ鋼）に流した。このカラムに１０
ｍＭの同緩衝液を流し、洗浄した後、２５１ＩＩＭの同
緩衝液（ｐＨ７，０）を１．Ｏｎ＋Ｊ／分の流速で通し
溶出した。活性画分・を集め、３０℃でエバポレーター
濃縮後、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０
）　３Ｎで４回、４８時間透析し、５０１１１１の酵素
溶液を得た。この５０ｍ　ｊ！の酵素溶液を１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝１（ｐＨ７，０）で平衡化したヒド
ロキシアパタイトカラム　（内径０．５ｃｍｘ長さ１５
ｃｍ）に流した。不活性蛋白質を取り除くため、５０ｎ
＋Ｈの同緩衝液（ｐＨ７，０）を流した後、１００ｍＭ
の同緩衝液（ρ１１７．０）で溶出させた。活性画分を
集め、３０℃でエバポレーターを使用し濃縮後、ｐｌ＋
　７．０の１０ｍＭ’Ｊン酸ナトリウム緩衝’ｔ＆３１
で４回、４８時間透析し５ｍＮの酵素液を回収した。

ヒドロキシアパタイトカラムにより得た酵素液５ｍＡを
、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）で膨
潤平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（内径２．
６ｃｍｘ長さ６０ｃｍ）にかけ、同緩衝液で溶出した。

活性画分（第６図参照）を集め、濃縮液１０ｍＭ’Ｊン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）　３　Ｉ！で４回、
４８時間透析した。その後、凍結乾燥を行い、精製酵素
２２ｍｇを得た。また、この酵素の比活性は２１．４０
０／ｍｇであった。

各精製ステップの精製度と回収率は表３に示す通りであ
った。

酢１ｊ■ｌしλ団定酵素蛋白質５０μｇについて、ポリアクリルアミドを用
いたゲルデスク電気泳動を行った。ｐＨ９，４，７，５
％Ｔゲルを用いて４＋ｎＡで２時間行い、電気泳動後、
０．２５％クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で
染色した。（第７図参照）図にみられるとおり、単一バンドを示し、均一に精製さ
れたことを確認された。

光凱皇四ス本発明によると、新規な３β−ハイドロオキシステロイ
ドオキシダーゼを得ることができ、本酵素は、補酵素Ｆ
ＡＤの非存在下で、コレステロールをステロイド合成の
出発物質であるコレスト４エン−３−オンに変換する作
用を有するので、ステロイドの変換、コレステロールの
定量に有効に利用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に係る酵素の至適ｐｎを示し、第２図
は本酵素のｐＨ安定性を示し、第３図は本酵素の至適温
度を示し、第４図は本酵素の熱安定性を示し、第５図は
本酵素の吸収スペクトルを示す。また、第６図はセファデックスＧカラムから溶出した本
酵素の活性画分を示し、第７図は本酵素蛋白質の電気泳
動による染色バンドを示す。

Claims

【特許請求の範囲】（１）下記の酵素学的性質を有するβ−ハイドロオキシ
ステロイドオキシダーゼ、（１）作用：３β−水酸基を有するステロイドに対して
特異的に作用して３−オキソステロイドを生成する。（２）分子量：４８，０００±２，０００（３）等電点：ｐＨ９．２±０．１（４）至適ｐＨ：７．５（５）ｐＨ安定性：４℃で２４時間の処理に於いて、ｐ
Ｈ７．０〜９．０の範囲で安定。（６）至適温度：４５
℃ （７）熱安定性：ｐＨ７．０で１時間の処理に於いて、
４０℃で９０％以上の活性を保持する。（８）金属結合：酵素分子内に金属イオンが存在しない
。（９）金属塩の影響：硝酸銀（ＡｇＮＯ＿３）、塩化第
二水銀（ＨｇＣｌ＿２）によつて酵素活性が阻害され、
グルタチオン、ジチオスレイトールの添加により活性が
回復する。（１０）Ｋｍ、Ｖｍａｘ値：コレステロール
を基質とした際のＫｍ値は３．２７×１０＾−＾４Ｍ、
酵素濃度５μｇ／ｍｌ時のＶｍａｘ値は１．３３×１０
＾−＾４Ｍ。（１１）吸収スペクトル：紫外、可視部吸収スペクトル
に於いて蛋白質以外の吸収が認められない。（２）ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ
　ｅｑｕｉ）により生産される請求項（１）に記載のβ
−ハイドロオキシステロイドオキシダーゼ。（３）ロドコッカス・エクイを培養し、得られた培養液
より請求項（１）に記載の酵素学的性質を有するβ−ハ
イドロオキシステロイドオキシダーゼを分離、採取する
ことを特徴とするβ−ハイドロオキシステロイドオキシ
ダーゼの調製法。（４）ロドコッカス・エクイはロドコッカス・エクイＭ
ＩＬ１０３７株である請求項（３）に記載の調製法。