JP3272416B2 - 新規サイクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、その製造法及び該酵素を用いるサイクロデキストリンの製造法 - Google Patents
新規サイクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、その製造法及び該酵素を用いるサイクロデキストリンの製造法Info
- Publication number
- JP3272416B2 JP3272416B2 JP29380192A JP29380192A JP3272416B2 JP 3272416 B2 JP3272416 B2 JP 3272416B2 JP 29380192 A JP29380192 A JP 29380192A JP 29380192 A JP29380192 A JP 29380192A JP 3272416 B2 JP3272416 B2 JP 3272416B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cyclodextrin
- producing
- enzyme
- starch
- glucanotransferase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、サイクロデキストリン
・グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.4.1.19、以下C
GTaseという）、その製造方法及びそれを用いるサイク
ロデキストリン（以下ＣＤという）の製造法に関する。
更に詳しくは、CGTase生産能を有するブレビバクテリウ
ム属に属する菌を培養し、培養物中に新規CGTaseを産生
せしめ、これを採取する新規CGTaseの製造法及び該CGTa
seを澱粉溶液に作用せしめ、主としてγ−ＣＤを生成せ
しめるＣＤの製造法に関する。
・グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ 2.4.1.19、以下C
GTaseという）、その製造方法及びそれを用いるサイク
ロデキストリン（以下ＣＤという）の製造法に関する。
更に詳しくは、CGTase生産能を有するブレビバクテリウ
ム属に属する菌を培養し、培養物中に新規CGTaseを産生
せしめ、これを採取する新規CGTaseの製造法及び該CGTa
seを澱粉溶液に作用せしめ、主としてγ−ＣＤを生成せ
しめるＣＤの製造法に関する。
【０００２】ＣＤは、６〜８個のグルコース分子がα−
1,4−グルコシド結合で環状に結合した非還元性のマル
トオリゴ糖であり、その分子空洞内に種々の物質を取り
込んで包接化合物を形成し、取り込まれた物質の物理、
化学的性質を変化させることができ、そのため、酸化し
やすい化合物や光分解し易い化合物の安定化、揮発性化
合物の不揮発化、難溶性化合物の可溶化、臭気性物質の
無臭化が可能であり、医薬品、化粧品、農薬及び食品へ
の広い分野で利用されている。
1,4−グルコシド結合で環状に結合した非還元性のマル
トオリゴ糖であり、その分子空洞内に種々の物質を取り
込んで包接化合物を形成し、取り込まれた物質の物理、
化学的性質を変化させることができ、そのため、酸化し
やすい化合物や光分解し易い化合物の安定化、揮発性化
合物の不揮発化、難溶性化合物の可溶化、臭気性物質の
無臭化が可能であり、医薬品、化粧品、農薬及び食品へ
の広い分野で利用されている。
【０００３】ＣＤには、グルコース分子数が６個からな
るα−ＣＤ、グルコース分子数が７個からなるβ−Ｃ
Ｄ、そしてグルコース分子数が８個からなるγ−ＣＤが
よく知られているが、このうちγ−ＣＤは、溶解度が大
きく、且つ包接能力にも優れているので、医薬品、化粧
品、農薬及び食品工業等への利用が、より有用視されて
いる。
るα−ＣＤ、グルコース分子数が７個からなるβ−Ｃ
Ｄ、そしてグルコース分子数が８個からなるγ−ＣＤが
よく知られているが、このうちγ−ＣＤは、溶解度が大
きく、且つ包接能力にも優れているので、医薬品、化粧
品、農薬及び食品工業等への利用が、より有用視されて
いる。
【０００４】
【従来の技術】これまでに知られたCGTaseは、主として
α−ＣＤ及びβ−ＣＤを生産するものがほとんどであ
り、γ−ＣＤを効果的に生産し得るCGTaseとしては、バ
チルス属の僅かな菌株に知られているに過ぎない。例え
ば、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）AL６のCGTase
（特開昭61-274680：参考文献１）、バチルス・エスピ
ー（Bacillus sp.）No.313 のCGTase（特開昭62-2597
6：参考文献２）及びバチルス・フィルムス（Bacillus
firmus）290-3のCGTase〔New trend in cyclodextrins
and derivatives 25頁（1991年）,サンテ（Sante）社
（フランス，パリ）：参考文献３〕が挙げられるのみで
ある。
α−ＣＤ及びβ−ＣＤを生産するものがほとんどであ
り、γ−ＣＤを効果的に生産し得るCGTaseとしては、バ
チルス属の僅かな菌株に知られているに過ぎない。例え
ば、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）AL６のCGTase
（特開昭61-274680：参考文献１）、バチルス・エスピ
ー（Bacillus sp.）No.313 のCGTase（特開昭62-2597
6：参考文献２）及びバチルス・フィルムス（Bacillus
firmus）290-3のCGTase〔New trend in cyclodextrins
and derivatives 25頁（1991年）,サンテ（Sante）社
（フランス，パリ）：参考文献３〕が挙げられるのみで
ある。
【０００５】それ故、α−ＣＤ及びβ−ＣＤに関して
は、各種分野に利用されているが、γ−ＣＤに関して
は、ほとんど行われていない。
は、各種分野に利用されているが、γ−ＣＤに関して
は、ほとんど行われていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的とすると
ころは、γ−ＣＤを生産するCGTase生産能を有する微生
物を見いだし、該微生物を培養し、培養物中にCGTaseを
産生せしめ、これを採取すると共に、該酵素を使用して
のγ−ＣＤの工業的製造法を提供することにある。
ころは、γ−ＣＤを生産するCGTase生産能を有する微生
物を見いだし、該微生物を培養し、培養物中にCGTaseを
産生せしめ、これを採取すると共に、該酵素を使用して
のγ−ＣＤの工業的製造法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、γ
−ＣＤを生産するCGTase生産能を有する微生物を広く自
然界に求め探索を試みたところ、ブレビバクテリウム属
に属するものと認められる菌株の中に、本目的のCGTase
生産能を有する菌株を見いだした。そして、該微生物を
培養し、培養物中にCGTaseを産生せしめ、これを採取す
ると共に、該酵素が新規酵素であることを知り、且つ該
酵素を使用してのγ−ＣＤの工業的製造法を確立するこ
とにより、本発明を完成した。
−ＣＤを生産するCGTase生産能を有する微生物を広く自
然界に求め探索を試みたところ、ブレビバクテリウム属
に属するものと認められる菌株の中に、本目的のCGTase
生産能を有する菌株を見いだした。そして、該微生物を
培養し、培養物中にCGTaseを産生せしめ、これを採取す
ると共に、該酵素が新規酵素であることを知り、且つ該
酵素を使用してのγ−ＣＤの工業的製造法を確立するこ
とにより、本発明を完成した。
【０００８】本発明において使用される新たに土壌から
発見、分離された菌株の菌学的性質は下記の通りであ
る。
発見、分離された菌株の菌学的性質は下記の通りであ
る。
【０００９】（１）形態 細胞の形および大きさ：細い桿菌（菌端は膨張する） 0.5〜0.7×5.0〜20μ 細胞の多形成の有無：認めらる 運動性の有無：あり（周鞭毛） 胞子の有無：形成しない グラム染色性：陰性 抗酸性：陰性
【００１０】（２）各培地における生育状態 肉汁寒天平板培養：発育はやや弱い、全縁半透明の粘性
あるコロニーで表面平滑（φ2〜3 mm） 肉汁寒天斜面培養：発育やや弱い、直状、生色、半透明 肉汁液体培養：培地は全体に薄く白濁し、底部に粘性の
菌泥沈殿がみられる。 リトマスミルク培養：変化しない
あるコロニーで表面平滑（φ2〜3 mm） 肉汁寒天斜面培養：発育やや弱い、直状、生色、半透明 肉汁液体培養：培地は全体に薄く白濁し、底部に粘性の
菌泥沈殿がみられる。 リトマスミルク培養：変化しない
【００１１】（３）生理学的性質 酸素に対する態度：偏性好気性 カタラーゼ：陽性 オキシダーゼ：陰性 ＯＦテスト：発酵、酸化共になし ブドウ糖からのガスの産生：陰性 インドールの生成：陰性 硝酸塩の還元：陽性 チロシンの加水分解：陰性 澱粉の加水分解：陽性 カゼインの加水分解：陰性 ゼラチンの加水分解：陽性 ジヒドロキシアセトン：陰性 フェニルアラニンデアミナーゼ：陰性 エッグヨーク反応：陰性 0.001％リゾチーム生育：陰性 ウレアーゼ：陰性 ＴＳＩ寒天培地（斜面の酸）：赤／赤 硫化水素の生成：陰性 マッコンキー培地の生育：陰性 ＹＭＡ培地の生育：陰性 ビスマスブイヨンでの生育：陰性 ３−ケト−乳酸の生成：陰性 食塩に対する生育性：（0.5〜15％で陽性、20％で陰
性） 生育温度の範囲：16〜45℃（最適は36〜38℃） 生育ｐＨの範囲：8.0〜11.6（最適は8.5〜9.0） 糖類からの酸生成の有無： Ｌ−アラビノース − キシロース − グルコース − マンニット − サリシン − 澱粉 −
性） 生育温度の範囲：16〜45℃（最適は36〜38℃） 生育ｐＨの範囲：8.0〜11.6（最適は8.5〜9.0） 糖類からの酸生成の有無： Ｌ−アラビノース − キシロース − グルコース − マンニット − サリシン − 澱粉 −
【００１２】以上の菌学的性質について、Bergey's Man
ual of Systematic Bacteriology，第２巻（1986）を参
照し、その性状を比較したところ、本菌はグラム陰性、
チトクロムオキシダーゼ陰性、周鞭毛、無胞子、糖より
酸非産生等の諸性質を有することから、アシネトバクタ
ー（Acinetobater）、リゾビウム（Rhizobium)、アグロ
バクテリウム（Agrobacterium）、ナトロノバクテリウ
ム（Natronobacterium）、バチルス（Bacillus）等のい
ずれの属にも相当せず、コリネフォームタイプ（Coryne
form Type)に属することから、その内の一つの属である
ブレビバクテリウム（Brevibacterium ）属に属するも
のと同定した。
ual of Systematic Bacteriology，第２巻（1986）を参
照し、その性状を比較したところ、本菌はグラム陰性、
チトクロムオキシダーゼ陰性、周鞭毛、無胞子、糖より
酸非産生等の諸性質を有することから、アシネトバクタ
ー（Acinetobater）、リゾビウム（Rhizobium)、アグロ
バクテリウム（Agrobacterium）、ナトロノバクテリウ
ム（Natronobacterium）、バチルス（Bacillus）等のい
ずれの属にも相当せず、コリネフォームタイプ（Coryne
form Type)に属することから、その内の一つの属である
ブレビバクテリウム（Brevibacterium ）属に属するも
のと同定した。
【００１３】しかしながら、上記の菌学的性質を有する
本菌株は、既知のブレビバクテリウム（Brevibacterium
）属の何れの種にも属さず、新菌種であることが判明
した。そして、本菌株をブレビバクテリウム・エスピー
（Brevibacterium sp.）No.9605と命名した。本菌株は
工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第13141
号（FERM P-13141）として寄託されている。
本菌株は、既知のブレビバクテリウム（Brevibacterium
）属の何れの種にも属さず、新菌種であることが判明
した。そして、本菌株をブレビバクテリウム・エスピー
（Brevibacterium sp.）No.9605と命名した。本菌株は
工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第13141
号（FERM P-13141）として寄託されている。
【００１４】尚、これまでにブレビバクテリウム（Brev
ibacterium ）属において、CGTase生産能を有する菌株
は、報告されておらず、本菌株が始めてである。
ibacterium ）属において、CGTase生産能を有する菌株
は、報告されておらず、本菌株が始めてである。
【００１５】本菌株を利用して、CGTaseを製造するため
には、当該微生物が良好に生育し、酵素を順調に生産す
るために必要な炭素源、窒素源、無機塩、必要な栄養源
等を含有する合成培地又は天然培地中でこれを培養す
る。炭素源としては、澱粉又はその組成画分、焙焼デキ
ストリン、加工澱粉、澱粉誘導体、物理処理澱粉及びα
−澱粉等の炭水化物が使用できる。具体例としては、可
溶性澱粉、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、
デキストリン、アミロペクチン、アミロース等があげら
れる。
には、当該微生物が良好に生育し、酵素を順調に生産す
るために必要な炭素源、窒素源、無機塩、必要な栄養源
等を含有する合成培地又は天然培地中でこれを培養す
る。炭素源としては、澱粉又はその組成画分、焙焼デキ
ストリン、加工澱粉、澱粉誘導体、物理処理澱粉及びα
−澱粉等の炭水化物が使用できる。具体例としては、可
溶性澱粉、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、
デキストリン、アミロペクチン、アミロース等があげら
れる。
【００１６】窒素源としては、ポリペプトン、カゼイ
ン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー或
いは大豆又は大豆粕などの抽出物等の有機窒素源物質、
硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機塩窒素
化合物、グルタミン酸等のアミノ酸類が挙げられる。
ン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー或
いは大豆又は大豆粕などの抽出物等の有機窒素源物質、
硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機塩窒素
化合物、グルタミン酸等のアミノ酸類が挙げられる。
【００１７】そして無機塩類としては、リン酸１カリウ
ム、リン酸２カリウム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム
等のマグネシウム塩、塩化カルシウム等のカルシウム
塩、炭酸ナトリウム等のナトリウム塩等が用いられる。
ム、リン酸２カリウム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム
等のマグネシウム塩、塩化カルシウム等のカルシウム
塩、炭酸ナトリウム等のナトリウム塩等が用いられる。
【００１８】培養は、振盪培養若しくは、通気攪拌培養
等の好気的条件下に於いて培地pH7〜11の範囲、好まし
くはpH8〜10の範囲に調製し、温度10〜40℃の範囲、好
ましくは、25〜37℃で実施するのが望ましいが、この条
件以外であっても微生物が生育し、目的とする酵素を生
成する条件であれば特に制限されない。
等の好気的条件下に於いて培地pH7〜11の範囲、好まし
くはpH8〜10の範囲に調製し、温度10〜40℃の範囲、好
ましくは、25〜37℃で実施するのが望ましいが、この条
件以外であっても微生物が生育し、目的とする酵素を生
成する条件であれば特に制限されない。
【００１９】このようにして培養を行うと、通常は培養
を開始して２〜７日間で培養液中にCGTaseが生産され
る。次いで、培養液から菌体を除去し、培養ろ液を得、
限外ろ過膜で脱塩、濃縮した後、硫安塩析又は有機溶媒
沈降等により酵素を回収する。こうして得られた粗製の
CGTaseは、そのままでもＣＤ生成反応に使用できるが、
必要に応じて、更にＤＥＡＥ−セファデックス（ファル
マシア社製）、ブチル−トヨパール（東ソー社製）によ
る吸着溶出、セファデックス（ファルマシア社製）、ト
ヨパール（東ソー社製）による分画、γ−ＣＤ−セファ
ロースによるアフィニティクロマトグラフィー等により
精製して使用する。
を開始して２〜７日間で培養液中にCGTaseが生産され
る。次いで、培養液から菌体を除去し、培養ろ液を得、
限外ろ過膜で脱塩、濃縮した後、硫安塩析又は有機溶媒
沈降等により酵素を回収する。こうして得られた粗製の
CGTaseは、そのままでもＣＤ生成反応に使用できるが、
必要に応じて、更にＤＥＡＥ−セファデックス（ファル
マシア社製）、ブチル−トヨパール（東ソー社製）によ
る吸着溶出、セファデックス（ファルマシア社製）、ト
ヨパール（東ソー社製）による分画、γ−ＣＤ−セファ
ロースによるアフィニティクロマトグラフィー等により
精製して使用する。
【００２０】得られたCGTaseの酵素化学的性質を以下に
述べる。 (1)作用及び基質特異性：２％可溶性澱粉（pH7.0）に本
酵素（５単位）を加えて、40℃で反応を行い、経時的に
ＣＤ生成量を測定した。その結果を図１に示す。図１に
於いて黒四角はγ−ＣＤの生成量を示すものであり、黒
三角は、β−ＣＤの生成量を示すものであり、黒丸はα
−ＣＤの生成を示すものである。図１より明かなように
本酵素は澱粉に作用し、主としてγ−ＣＤを生成し、β
−ＣＤをも生成するが、α−ＣＤを生成しない。
述べる。 (1)作用及び基質特異性：２％可溶性澱粉（pH7.0）に本
酵素（５単位）を加えて、40℃で反応を行い、経時的に
ＣＤ生成量を測定した。その結果を図１に示す。図１に
於いて黒四角はγ−ＣＤの生成量を示すものであり、黒
三角は、β−ＣＤの生成量を示すものであり、黒丸はα
−ＣＤの生成を示すものである。図１より明かなように
本酵素は澱粉に作用し、主としてγ−ＣＤを生成し、β
−ＣＤをも生成するが、α−ＣＤを生成しない。
【００２１】(2)至適pH：本酵素を1.5％可溶性澱粉溶液
に40℃にてｐＨ３〜13のpH条件下で30分間作用させ、そ
れぞれの活性を測定した。その結果は、図２に示され
る。図２から明かなように本酵素の至適ｐＨは、８〜９
である。
に40℃にてｐＨ３〜13のpH条件下で30分間作用させ、そ
れぞれの活性を測定した。その結果は、図２に示され
る。図２から明かなように本酵素の至適ｐＨは、８〜９
である。
【００２２】(3)至適温度：本酵素を1.5％可溶性澱粉溶
液に各種温度にてpH10.0のpH条件下で30分間作用させ、
それぞれの活性を測定した。その結果は、図３に示され
る。図３から明かなように本酵素の至適温度は、45℃付
近である。
液に各種温度にてpH10.0のpH条件下で30分間作用させ、
それぞれの活性を測定した。その結果は、図３に示され
る。図３から明かなように本酵素の至適温度は、45℃付
近である。
【００２３】(4)安定pH：本酵素液をpH３〜13のpH条件
下で、40℃で30分間保持し、その残存活性を測定した。
その結果は、図４に示される。図４から明かなように安
定pH範囲は、ｐＨ６〜８である。
下で、40℃で30分間保持し、その残存活性を測定した。
その結果は、図４に示される。図４から明かなように安
定pH範囲は、ｐＨ６〜８である。
【００２４】(5)温度安定性：本酵素溶液を各種温度下
で、pH9.0（0.1M H3BO3,KCl-NaOH緩衝液）にて30分間放
置後、それぞれの残存活性を測定した。その結果は図５
の実線に示される。図５より明かなように本酵素は、40
℃で85％の残存活性を示した。尚、本酵素は、カルシウ
ム塩の添加により安定化され、20mMの塩化カルシウム添
加により45℃の処理においても、図５の破線に示される
ように100％の残存活性を示した。
で、pH9.0（0.1M H3BO3,KCl-NaOH緩衝液）にて30分間放
置後、それぞれの残存活性を測定した。その結果は図５
の実線に示される。図５より明かなように本酵素は、40
℃で85％の残存活性を示した。尚、本酵素は、カルシウ
ム塩の添加により安定化され、20mMの塩化カルシウム添
加により45℃の処理においても、図５の破線に示される
ように100％の残存活性を示した。
【００２５】(6)活性測定法：基質〔1.5％可溶性澱粉、
0.1Ｍ アトキンス・パンチン（Atkins& Pantin）緩衝液
（pH10.0）〕0.5mlに酵素液0.05mlを添加し、40℃にて3
0分間反応した。その後、0.1Ｎ塩酸５mlを加え反応を停
止し、0.5mlを抜き取り、ヨウ素液５mlを加え。660nmで
の吸光度の減少を測定した。１単位は、本条件下、１分
間に660nmの吸光度を１％減少させる酵素量とした。
0.1Ｍ アトキンス・パンチン（Atkins& Pantin）緩衝液
（pH10.0）〕0.5mlに酵素液0.05mlを添加し、40℃にて3
0分間反応した。その後、0.1Ｎ塩酸５mlを加え反応を停
止し、0.5mlを抜き取り、ヨウ素液５mlを加え。660nmで
の吸光度の減少を測定した。１単位は、本条件下、１分
間に660nmの吸光度を１％減少させる酵素量とした。
【００２６】(7)各種金属塩の影響：本酵素を１mMの各
種金属塩により、0.1M H3BO3,KCl-NaOH緩衝液（pH8.0）
中で、40℃、10分処理し、残存活性を測定した結果は、
表１に示される。表１より明らかなように、本酵素は、
ニッケル、銅、亜鉛、銀により阻害され、水銀及びカド
ミウムにてほぼ失活した。
種金属塩により、0.1M H3BO3,KCl-NaOH緩衝液（pH8.0）
中で、40℃、10分処理し、残存活性を測定した結果は、
表１に示される。表１より明らかなように、本酵素は、
ニッケル、銅、亜鉛、銀により阻害され、水銀及びカド
ミウムにてほぼ失活した。
【００２７】
【表１】
【００２８】(8)各種阻害剤の影響：本酵素を１mMの各
種阻害剤により、0.1M H3BO3,KCl-NaOH緩衝液（pH8.0）
中で、40℃、10分処理し、残存活性を測定した結果は、
表２に示される。表２より明らかなように、本酵素は、
使用したいずれの阻害剤によっても殆ど阻害されない。
尚、表２中のEDTAは（ethylenediaminetetraacetic aci
d）の、SDSは（sodium dodecyl sulfate）の、PCMBは
（p-chloromercuribenzoicacid）の、MIAは（monoiodoa
cetic acid）の、NEMは（N-ethylmaleimide）のそれぞ
れの略である。
種阻害剤により、0.1M H3BO3,KCl-NaOH緩衝液（pH8.0）
中で、40℃、10分処理し、残存活性を測定した結果は、
表２に示される。表２より明らかなように、本酵素は、
使用したいずれの阻害剤によっても殆ど阻害されない。
尚、表２中のEDTAは（ethylenediaminetetraacetic aci
d）の、SDSは（sodium dodecyl sulfate）の、PCMBは
（p-chloromercuribenzoicacid）の、MIAは（monoiodoa
cetic acid）の、NEMは（N-ethylmaleimide）のそれぞ
れの略である。
【００２９】
【表２】
【００３０】(9)分子量：本酵素の分子量は約75,000で
ある（SDS−電気泳動法による）。
ある（SDS−電気泳動法による）。
【００３１】(10)等電点：本酵素の等電点（pI）は2.8
である（焦点電気泳動法による）。
である（焦点電気泳動法による）。
【００３２】本酵素の酵素化学的性質を、既存のγ−Ｃ
Ｄを主として生成するCGTaseと比較し、表３に示す。
Ｄを主として生成するCGTaseと比較し、表３に示す。
【００３３】
【表３】
【００３４】表３中の※は、10mM塩化カルシウム存在下
での安定性を示す。表３より明かのように本酵素は、既
存のγ−ＣＤを主として生成するCGTaseの何れとも異な
る新規酵素である。
での安定性を示す。表３より明かのように本酵素は、既
存のγ−ＣＤを主として生成するCGTaseの何れとも異な
る新規酵素である。
【００３５】本発明方法によりＣＤを製造するには、例
えば、先ず１〜30％の澱粉（澱粉又はその組成画分、加
工澱粉等を含む）を含有する水溶液に本酵素液（精製品
又は粗製品）を0.5〜20単位（乾燥澱粉１ｇ当たり）加
えてpH４〜10、温度20〜70℃にて、１〜50時間酵素反応
を行う。尚、この澱粉は、必要に応じて予め加熱し、液
化処理を施して用いる。
えば、先ず１〜30％の澱粉（澱粉又はその組成画分、加
工澱粉等を含む）を含有する水溶液に本酵素液（精製品
又は粗製品）を0.5〜20単位（乾燥澱粉１ｇ当たり）加
えてpH４〜10、温度20〜70℃にて、１〜50時間酵素反応
を行う。尚、この澱粉は、必要に応じて予め加熱し、液
化処理を施して用いる。
【００３６】以下に試験例及び実施例にて本発明を具体
的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるも
のではない。 試験例 ２％の馬鈴薯澱粉〔0.01Ｍマッキルバイン（McIlvain
e）緩衝液（pH7.0）〕に本酵素液を１、2.5、５及び10
単位（乾燥澱粉１ｇ当たり）それぞれ添加し、40℃にて
３〜44時間反応せしめた。その結果は、表４に示され
る。
的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるも
のではない。 試験例 ２％の馬鈴薯澱粉〔0.01Ｍマッキルバイン（McIlvain
e）緩衝液（pH7.0）〕に本酵素液を１、2.5、５及び10
単位（乾燥澱粉１ｇ当たり）それぞれ添加し、40℃にて
３〜44時間反応せしめた。その結果は、表４に示され
る。
【００３７】
【表４】
【００３８】表４中の u/g.Dsは、乾燥澱粉１ｇ当たり
の酵素単位を示し、又ＣＤ生成率は、基質に対する重量
比（％）で示す。
の酵素単位を示し、又ＣＤ生成率は、基質に対する重量
比（％）で示す。
【００３９】表４より明かなように、本酵素は、γ−Ｃ
Ｄを16〜18％の収率で生成することが分かる。
Ｄを16〜18％の収率で生成することが分かる。
【００４０】
【実施例】実施例１ 可溶性澱粉 1.0％、ポリペプトン 0.5％、酵母エキス
0.25％、硫酸アンモニウム0.1％、K2HPO4 0.05％、MgSO
4・7H2O 0.025％、CaCl2 0.01％、Na2CO3 1.0％（別殺
菌）からなる培地（pH10.0）100 mlを500 ml容坂口フラ
スコに入れ、常法により殺菌後ブレビバクテリウム・エ
スピー（Brevibacterium sp.）No.9605（FERM-P 1314
1）を接種し、37℃で40時間振盪培養した。培養後、培
養菌体を遠心分離にて除去し、除菌液２Ｌを得た。この
除菌液を限外ろ過膜（モジュールＳＩＰ，旭化成社製）
にかけ、濃縮液30mlを得た。得られた濃縮液のCGTase活
性は6.7単位／mlであった。
0.25％、硫酸アンモニウム0.1％、K2HPO4 0.05％、MgSO
4・7H2O 0.025％、CaCl2 0.01％、Na2CO3 1.0％（別殺
菌）からなる培地（pH10.0）100 mlを500 ml容坂口フラ
スコに入れ、常法により殺菌後ブレビバクテリウム・エ
スピー（Brevibacterium sp.）No.9605（FERM-P 1314
1）を接種し、37℃で40時間振盪培養した。培養後、培
養菌体を遠心分離にて除去し、除菌液２Ｌを得た。この
除菌液を限外ろ過膜（モジュールＳＩＰ，旭化成社製）
にかけ、濃縮液30mlを得た。得られた濃縮液のCGTase活
性は6.7単位／mlであった。
【００４１】実施例２ ２％馬鈴薯澱粉溶液〔0.01Ｍマッキルバイン（McIlvain
e）緩衝液（pH7.0）〕10mlに本発明のCGTaseを2.5単位
（固形澱粉１ｇ当たり）を加え、40℃にて20時間反応さ
せた。反応により得られた、γ−ＣＤ及びβ−ＣＤの収
率（基質に対する重量比で示す）は、それぞれ18.1％及
び6.3％であり、α−ＣＤの生成は、認められなかっ
た。反応液を高速液体クロマトグラフィーを用いて分析
したクロマトグラフを図６に示す。
e）緩衝液（pH7.0）〕10mlに本発明のCGTaseを2.5単位
（固形澱粉１ｇ当たり）を加え、40℃にて20時間反応さ
せた。反応により得られた、γ−ＣＤ及びβ−ＣＤの収
率（基質に対する重量比で示す）は、それぞれ18.1％及
び6.3％であり、α−ＣＤの生成は、認められなかっ
た。反応液を高速液体クロマトグラフィーを用いて分析
したクロマトグラフを図６に示す。
【００４２】実施例３ ５％馬鈴薯澱粉溶液〔0.01Ｍ H3BO3,KCl-NaOH緩衝液（p
H8.0）〕10mlに本発明のCGTaseを2.5単位（固形澱粉１
ｇ当たり）加え、55℃にて44時間反応させた。反応によ
り得られた、γ−ＣＤ及びβ−ＣＤの収率（基質に対す
る重量比で示す）は、それぞれ9.0％及び4.9％であり、
α−ＣＤの生成は、認められなかった。
H8.0）〕10mlに本発明のCGTaseを2.5単位（固形澱粉１
ｇ当たり）加え、55℃にて44時間反応させた。反応によ
り得られた、γ−ＣＤ及びβ−ＣＤの収率（基質に対す
る重量比で示す）は、それぞれ9.0％及び4.9％であり、
α−ＣＤの生成は、認められなかった。
【００４３】
【発明の効果】本発明は、CGTase産生能を有するブレビ
バクテリウム属に属する微生物を培養し、培養物中に新
規CGTaseを生産せしめ、これを採取する新規CGTaseの製
造法及び該新規CGTaseを用いるγ−ＣＤの製造法であ
る。本願発明の方法により、γ−ＣＤが安価に製造さ
れ、γ−ＣＤの食品分野、飼料分野への用途がより大き
く開かれた。
バクテリウム属に属する微生物を培養し、培養物中に新
規CGTaseを生産せしめ、これを採取する新規CGTaseの製
造法及び該新規CGTaseを用いるγ−ＣＤの製造法であ
る。本願発明の方法により、γ−ＣＤが安価に製造さ
れ、γ−ＣＤの食品分野、飼料分野への用途がより大き
く開かれた。
【図１】本発明のCGTaseを澱粉に作用させたときの反応
時間と各種サイクロデキストリンの生成量との関係を示
す。
時間と各種サイクロデキストリンの生成量との関係を示
す。
【図２】本発明のCGTaseの至適ｐＨ曲線を示す。図中で
黒丸はマッキルバイン（McIlvaine）緩衝液の、黒三角
はアトキンス・パンチン（Atkins & Pantin）緩衝液
の、黒四角は塩化カリ・水酸化ナトリウム（KCl-NaOH）
緩衝液のそれぞれの曲線を示すものである。
黒丸はマッキルバイン（McIlvaine）緩衝液の、黒三角
はアトキンス・パンチン（Atkins & Pantin）緩衝液
の、黒四角は塩化カリ・水酸化ナトリウム（KCl-NaOH）
緩衝液のそれぞれの曲線を示すものである。
【図３】本発明のCGTaseの至適温度曲線を示す。
【図４】本発明のCGTaseの安定ｐＨ曲線を示す。図中で
黒丸はマッキルバイン（McIlvaine）緩衝液の、黒三角
はアトキンス・パンチン（Atkins & Pantin）緩衝液
の、黒四角は塩化カリ・水酸化ナトリウム（KCl-NaOH）
緩衝液のそれぞれの曲線を示すものである。
黒丸はマッキルバイン（McIlvaine）緩衝液の、黒三角
はアトキンス・パンチン（Atkins & Pantin）緩衝液
の、黒四角は塩化カリ・水酸化ナトリウム（KCl-NaOH）
緩衝液のそれぞれの曲線を示すものである。
【図５】本発明のCGTaseの温度安定曲線を示す。図中で
実線はCGTaseのみの場合であり、破線は塩化カルシウム
20mMを添加した場合である。
実線はCGTaseのみの場合であり、破線は塩化カルシウム
20mMを添加した場合である。
【図６】本発明のCGTaseを澱粉に作用させたときに生成
する各種ＣＤを高速液体クロマトグラフィーを用いて分
析したところのクロマトグラフを示す。図中のはγ−
ＣＤのピークを、はβ−ＣＤのピークを示す。
する各種ＣＤを高速液体クロマトグラフィーを用いて分
析したところのクロマトグラフを示す。図中のはγ−
ＣＤのピークを、はβ−ＣＤのピークを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 19/18 (Ｃ１２Ｐ 19/18 Ｃ１２Ｒ 1:13） Ｃ１２Ｒ 1:13） (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/10 C12N 1/20 C12P 19/18 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】下記の酵素化学的性質を有するサイクロデ
キストリン・グルカノトランスフェラーゼ。 作用及び基質特異性：澱粉、デキストリン、アミロペ
クチン、アミロース等に作用して、主としてγ−サイク
ロデキストリンを生成し、β−サイクロデキストリンを
も生成するが、α−サイクロデキストリンを生成しな
い。 至適ｐＨ：８〜９ 至適温度：５℃付近 安定ｐＨ：６〜８ 温度安定性：４０℃、３０分処理で８５％の残存活性
を示す。尚、２０ｍＭカルシウム塩の添加により、４５
℃、３０分処理でも１００％残存活性を示す。 - 【請求項２】請求項１に規定するサイクロデキストリン
・グルカノトランスフェラーゼ生産能を有するＦＥＲＭ
Ｐ−１３１４１として寄託されたブレビバクテリウム
ｓｐ．Ｎｏ．９６０５を培養し、培養物中に該サイクロ
デキストリン・グルカノトランスフェラーゼを産生せし
め、これを採取することを特徴とする該サイクロデキス
トリン・グルカノトランスフェラーゼの製造法。 - 【請求項３】澱粉、デキストリン、アミロース、アミロ
ペクチン等の溶液にＦＥＲＭ Ｐ−１３１４１として寄
託されたブレビバクテリウム ｓｐ．Ｎｏ．９６０５の
産生する請求項１に規定するサイクロデキストリン・グ
ルカノトランスフェラーゼを反応させ、反応液中に主と
してγ−サイクロデキストリンを生成せしめ、これを採
取することを特徴とするサイクロデキストリンの製造
法。 - 【請求項４】請求項１に規定するサイクロデキストリン
・グルカノトランスフェラーゼ生産能を有するＦＥＲＭ
Ｐ−１３１４１として寄託されたブレビバクテリウム
ｓｐ．Ｎｏ．９６０５。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29380192A JP3272416B2 (ja) | 1992-10-06 | 1992-10-06 | 新規サイクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、その製造法及び該酵素を用いるサイクロデキストリンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29380192A JP3272416B2 (ja) | 1992-10-06 | 1992-10-06 | 新規サイクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、その製造法及び該酵素を用いるサイクロデキストリンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06113842A JPH06113842A (ja) | 1994-04-26 |
| JP3272416B2 true JP3272416B2 (ja) | 2002-04-08 |
Family
ID=17799331
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29380192A Expired - Fee Related JP3272416B2 (ja) | 1992-10-06 | 1992-10-06 | 新規サイクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、その製造法及び該酵素を用いるサイクロデキストリンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3272416B2 (ja) |
-
1992
- 1992-10-06 JP JP29380192A patent/JP3272416B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06113842A (ja) | 1994-04-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0017242B1 (en) | A process for producing cyclodextrins | |
| JP3360291B2 (ja) | γ−サイクロデキストリンの増収方法 | |
| JPS60149399A (ja) | アスパラギン酸アミノトランスフエラ−ゼアイソザイムの測定法 | |
| JP3026857B2 (ja) | 新規プルラナーゼおよびその製造法 | |
| JP3272416B2 (ja) | 新規サイクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、その製造法及び該酵素を用いるサイクロデキストリンの製造法 | |
| Thatai et al. | A single step purification process for cyclodextrin glucanotransferase from a Bacillus sp. isolated from soil | |
| JP3250852B2 (ja) | バチルス・メガテリウムの生産する新規サイクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、その製造法及び該酵素を用いるサイクロデキストリンの製造法 | |
| US5008195A (en) | Some novel producers of cyclodextrin glycosyltransferases | |
| JP2926249B2 (ja) | アルギン酸リアーゼの製造法 | |
| KR920006397B1 (ko) | 내열성 사이클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라제의 제조방법 | |
| JP3027449B2 (ja) | 新規シクロマルトデキストリナーゼ、その製造法及び該酵素を生産する微生物 | |
| JP3100196B2 (ja) | デンプン糖の製造法 | |
| JPH0515387A (ja) | 細菌によるアルギン酸の分解法 | |
| JP3820617B2 (ja) | ε−ポリ−Ｌ−リシン分解酵素とそれを用いた低重合度ε−ポリ−Ｌ−リシンの製造法 | |
| KR830002250B1 (ko) | 사이클로덱스트린(Cyclodextrine)의 제조법 | |
| JP2672959B2 (ja) | マルトテトラオースの製造法 | |
| JPS6248380A (ja) | セフアロスポリンｃアシラ−ゼの製造法 | |
| JPH0614772A (ja) | 新規エステル分解酵素ａおよびその製造方法 | |
| JP2588707B2 (ja) | サルコシン・オキシダーゼの製造法 | |
| KR960007741B1 (ko) | 신규 α-1, 6-글루코시다제 및 그의 제조방법 | |
| JP2812481B2 (ja) | 新規なエステラーゼおよびその製造方法 | |
| JP2623509B2 (ja) | 分岐マルトオリゴ糖の製造法 | |
| JPH08256766A (ja) | サイクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼおよびその製造方法 | |
| JPH0632611B2 (ja) | γ―サイクロデキストリン合成酵素及びその製造法 | |
| JPH0358784A (ja) | 新規なシクロマルトデキストリナーゼ及びその製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090125 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090125 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100125 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110125 Year of fee payment: 9 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |