KR920006397B1

KR920006397B1 - 내열성 사이클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라제의 제조방법

Info

Publication number: KR920006397B1
Application number: KR1019900013443A
Authority: KR
Inventors: 김승호; 황진봉
Original assignee: 한국식품개발연구원; 권태완
Priority date: 1990-08-30
Filing date: 1990-08-30
Publication date: 1992-08-06
Also published as: KR920004563A

Abstract

내용 없음.

Description

내열성 사이클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라제의 제조방법

제1도는 본 발명 효소의 최적 pH 범위를 표시한 그래프.

제2도는 본 발명 효소의 pH 안정성을 표시한 그래프.

제3도는 본 발명 효소의 최적 온도를 표시한 그래프.

제4도는 본 발명 효소의 온도 안정성을 표시한 그래프.

제5도는 본 발명 효소 생산 균주인 바실루스 스테아로썸머필루스 KCTC 8495P의 균체의 전자현미경 사진(× 8,000)

제6도는 본 발명 효소의 사이클로덱스트린 생산 상황을 표시한 고속액체 크로마토 그래피.

본 발명은 바실루스 스테아로썸머필루스(Bacillus Stearothermophilus) KCTC 8495P로 생성하는 내열성 사이클로말토덱스트린 클루카노트란 스퍼라제(Cyclomaltodextrin glucanotransferase)의 제조방법에 관한것이다. 사이클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라제(이하 CGTase라 함)를 생산하는 균주로는 현재 바실루스 마세란스(Bacillus macerans), 바실루스 써쿨란스(B. Circulans), 바실루스 코아굴란스(B. Coagulans), 바실루스메가터리움(B. megaterium), 바실루스 오흐벤시스(B. ohbensis), 알카리성 바실루스속(alkalophilic B. species)등의 세균에서 얻을 수 있는 효소로 알려지고 있다.

이들의 세균이 분비하는 CGTase는 전분을 분해하여 6 내지 12개의 포도당 분자가 α-1, 4-글루코시드(4-glucoside)결합을 이루고 환상결합한 왕관형태의 비환원당으로 비교적 생성율이 높은 포도당 분자 6,7,8개로구성되어있는 α-,β-, 감마-사이클로덱스트린(γ-Cyclodextrin)(CD라함)와 말토올리고당의 혼합물을 생산하며 공업적으로 매우 유용하다. CD는 그 구조내에 소수성 공동을 가지고 있어서 그 공동내에 유기 및 무기화합물과 포접화합물을 형성함으로서 CD는 빛, 열, 산화에 대한 안정화, 휘발성분의 안정화, 불용물질의 가용화, 유화제로의 기능 등을 가지고 있어서 식품, 의약품, 화장품, 농약, 화학반응의 촉매 등의 공업에서 각광을 받고 있다. 그런데 종래 사용한 대부분의 CGTase는 열안정성이 떨어지므로써 50내지 60℃ 이하의 온도에서 기질과 효소반응을 하므로 공정기간이 길며 효소반응중 다른 세균에 의한 오염이 일어날 수 있고, 또한 CD 수율이 낮은 결점이 있다. 그리나 바실루스 스테아로썸머필루스가 생산하는 CGTase는 다소 내열성을 가지고 있어 70 내지 75℃의 비교적 고온에서도 효소활성이 유지되며 공업적으로 중요한 α-, β-CD를 주로 생산한다.

본 발명자들은 상기와 같은 종래의 CGTase의 결점을 개량하여 내열성이 있는 CGTase생산균을 자연계에서 분리 선별하여 "Bergey's manual of systematic Bacteriology"에 의해 바실루스 스테아로썸머필루스로 동정하였다. 바실루스과에 속하는 바실루스속 신주의 세균 바실루스 스테아로썸머필루스 KCTC 8495P는 다량의 CGTase를 생산하여 이 CGTase는 α-, β-CD를 주로 생산한다.

본 발명의 효소는 중온성 세균으로서 다량 생산할 수 있으며 온도 안정성이 70 내지 75℃로 고온이며 α-, β-CD를 주로 생산한다.

본 발명자들에 의해 반전된 내열성 CGTase생산균주의 일반적인 최적배양조건과 효소성질을 기술하면 다음과 같다.

1)최적배양조건

탄소원으로 가용성 전분 2%, 유기질소원으로는 탈지대두박 0.5%, 인산염으로 NaH₂PO₄.2H₂O 0.1%,금속염으로는 CaCl₂0.015%를 이용하였을때 가장 높은 CGTase생산을 보였으며 배양은 통기 조건하에서 배지의 pH는 7.0, 배양온도 55℃ 그리고 100rpm 정도의 교반속도로 24시간 배양하였다. 이와같은 조건에서 생육시킨 배양액을 원심분리(10,000×G, 20분)하여 얻어진 상징액을 효소액으로 사용하였다,

2)효소활성 측정

효소활성 측정은 dextrinizing activity(이하 D.A.)은 [Sumio Kitahata ct.al, Agr., Biol., Chem., 38, 2413(1974)]으로 측정하였다. 효소액 0.5ml을 가용성 전분 0.55%(0.5M 초산완충용액, PH 5.95)용액 4.5ml에 넣어 55℃에서 10분간 반응시킨 다음 이 반응액 0.5ml을 취하여 0.01M iodine(0.25M KI)용액 4ml에 첨가한 후 증류수로 20ml로 희석하여 660nm에서 투광율을 측정하였다. 이때 1효소 활성단위는 55℃에서 분당 1% 투광율의 직선적 증가를 보이는 효소량으로 하였다.

3)최적 pH와 pH 안정성

pH 3.5 내지 pH 6.0의 범의는 0.1M 초산완충용액, pH 6.0 내지 8.5의 범위는 0.1M 트리스-멀레이트-가성소다완충용액, pH 8.5 내지 10.5의 범위는 0.1M 글라이신-가성소다 완충용액을 사용하였다. 최적 pH는 전항 2)에 기술한 효소화성법에 의하여 측정했으며 제1도에 표시했으며 본 효소의 최척 pH는 6.0이었다. pH 안정성은 0.1M의 각 완충용액을 75℃에서 10분간 효소반응시킨 다음 잔존효소활성을 측정하였다. 결과는 제2도에 표시했으며 본 효소는 pH 5.0 내지 7.5까지 안정했으며 글라이신-가성소다완충용액은 다른 완충용액보다 불안정하였다.

4)최적온도와 온도안정성

최적온도는 전항 2)에 기술한 효소활성측정법에 의거 온도를 변화시키면서 측정하였다. 본 효소의 최척온도는 제3도에 표시한 것과 같이 60-65℃이다. 온도안정성은 0.1M 초샨완충용액 pH 6.0의 각 온도에서 30분간 침지시킨후 잔존 활성 측정은 전항 2)에 의거 효소활성측정을 하였다. 결과는 제4도에 표시한 바와같이 70℃까지 안정하였으며 칼슘이온 4.3mM을 접가한 효소는 70℃에서 15시간 동안 반응시켰을때도 안정하였다.

5) 정제방법

배양액을 균체로부터 원심분리하여 얻은 상징액에 유안첨가, 투석, 흡착, 투석 등으로 정제하였다.

6) 분자량

분자량 측정은 SDS 전기영동법으로 측정했으며 분쟈량은 78,000이었다.

7) 등전점

전기영동법에서 구한 등전점은 4.8이었다.

8) CGTase생산균주의 분리 및 동정

전국 각지에서 채집한 토양에서 발견 분리하였으며 본 균주는 1990년 7월 25일 국내 균주 수탁기관인 한국과학기술원 유전공학센터에 기탁하여 미생물 수탁번호 KCTC 8495P를 부여받았다. 분리한 CGTase생산균주는 광학현미경과 전자현미경으로 관찰한 결과 간균(제5도)이었으며, 크기는 0.37 내지 0.5μm이었다. 또한 운동성을 가졌으며, gram양성으로 판단되었고 포자는 말단에 존재하였다. 한편, 배양학적 특성을 검토하여 본 결과 nutrient broth에서 왕성한 생육이 관찰되었으며 Sabouraud dextrose green broth에서는 전혀 생육을 하지 못하였다. 또한 NaCl 농도에 따른 실험에서 2%, 5%, 7%, 10% NaCl 농도에서는 생육을 못했으며, 호기성으로 관찰되었고 온도별 생육에서는 45 내지 60℃의 온도에서 생육을 나타냈으며 그중 55℃의 온도에서 왕성한 생육을 보였는데 본 균주의 생육 최적 온도로 사료된다.

한편, 생화학적 특성에서는 catalase test는 양성균으로 판정되었으며, VP test는 음성이었다. 또한 전분, 카세인, 젤라틴의 가수분해 실험에서는 모두 분해능력이 있었으나 타이로신 분해실험에서는 분해능력이 없었으며, indol 생성여부는 음성이었다. 따라서 이상과 같은 특성은 "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology"와 "Laboratory Methods in Food and Dairy Microbiology" 및 "Manual of Methods for General Bacteriology" 등에 의해 본 균주는 바실루스 스테아로썸머필루스로 동정되었다.

이하 실시예를 들어 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

[효소의 생산]

산 분리균 바실루스 스테아로썸머필루스 KCTC 8495P를 가용성 전분 2%, 탈지대두박 0.5%, NaH₂PO₄.2H₂O 0.1%, CaCl₂0.015%, 초기 pH 7.0을 무균배지 5ml(시험관, 18×180mm)에 1백금이 따서 55℃에서 4시간 진탕배양하여 종균을 얻은 다음 상기의 종균 1%을 앞서 기술한 무균배지 100ml(500ml, 10개 삼각후라스크)에서 24시간 진탕배양하였다.

진탕배양액은 10,000×G에서 20분간 원심분리하여 투명한 배양액 900ml을 얻었으며 이 배양액의 전 효소활성은 8,298unit이었다.

[실시예 2]

[효소의 정제]

실시예 1에서 언은 배양액을 4℃에서 냉각시켜 유안 결정을 가하여(20% 포화용액)하룻밤 방치한 후 침전물을 원심분리(10,000×G, 20분)에 의해 제거하고 그 상징액에 다시 유안결정을 가하여(80% 포화용액)하룻밤 방치한 후 원심분리하여 얻은 침전물을 0.1M 초산완충용액(pH 6.0)에 용해하여 유안분획액 87ml을 얻었다. 유안분획액은 셀로판 튜브(Cellophane tube)(M.W Cut off 12,000)에 넣어 증류수에서 24시간동안 4℃에서 투석하여, 0.1M초산완충용액(pH6.0)으로 평형시킨 투석액은β-CD Sepharose 6B 친화성 크로마토그래피(disposablc poly-prep Chromatography columns, bed volume; 11ml)에 넣어 동일완충액으로 bed volume 10배 세척한 다음 β-CD가 함유된 동일 완충액(β-CD 10mg/ml)으로 효소를 용출하였다. 용출된 정제효소액 15.5ml를 셀로판 튜브에 넣어 증류수에서 24시간 동안 4℃에서 투석하였다. 표 1는 본 효소의 정제공정의 결과를 표시하였다.

[본 발명 효소의 작용]

[실시예 3]

[본 발명 효소의 기질 특이성]

1% 기질전분(0.1M 인산관충용액, pH 6.0)2.5ml에 본 발명 효소 0.5ml(10 D.A. unit at 55℃/g starch)를 첨가하여 65℃에서 24시간 효소반응후 100℃에서 10분간 열처리하여 불활성화 시킨다음 냉각시켜 고속액체 크로마토그래피로 분석하였다. 본 발명 효소의 기질 특이성은 감자점분, 옥수수 전본, 가용성 전분순으로 총 CD 전환율은 각각 50.1%, 43.0%, 42.7%로 표 2와 같다.

이때 HPLC조건은 다음과 같다.

장치 : Waters HPLC

칼럼 : μ-BONDAPAK-NH

용매 : 아세트나이트일 : 물=65 : 35(V/V)

유속 : 1.5ml/min

검출기 : RI

[실시예 4]

(CD 생성의 경시적 관찰)

6% 가용성 전분(0.1M 인산완충용액, pH 6.0)2.5ml에 본 발명효소 0.5ml(10 D.A. unit at 55℃/g starch)를 첨가하여 65℃에서 반응시간에 따른 경시적인 CD 생성량을 고속액체 크로마토그래피로 분석한 결과는 그림 6에 표시했다. 이 결과에서 본 발명 효소는 반응초기에는 α-CD가 β-CD, γ-CD보다 우선적으로 생성되었으나 시간이 경과함에 따라 β-CD으로의 전환율이 높은 것으로 나타났다.

이상 설명한 것과 같이 본 발명 효소는 산업상 유용한 α-, β-CD를 잡균의 오염없이 공업적인 생산이 가능하므로 산업상 크게 기여할 것이다.

[표 1] 본 발명 효소의 정제 단계

[표 2] 본 발명 효소의 기질 특이성

Claims

바실루스 스테아로썸머필루스 KCTC 8495P를 가용성전분, 탈지대두막, NaH₂PO₄.2H₂O, CaCl₂, pH7.0의 무균배지에서 55℃로 유지하면서 진탕배양, 원심분리, 정제하여서 된 내열성 사이클로말토덱스트린글루카노트랜스퍼라제의 제조방법.