KR100270911B1

KR100270911B1 - 플루라나제를생산하는클레브시엘라속미생물및이를이용한말토실베타-사이클로덱스트린제조방법

Info

Publication number: KR100270911B1
Application number: KR1019980002920A
Authority: KR
Inventors: 박용하; 임동구; 윤정훈; 박영근; 헬리아 하루미 사토
Original assignee: 박호군; 한국과학기술연구원
Priority date: 1998-02-03
Filing date: 1998-02-03
Publication date: 2000-11-01
Also published as: KR19990068972A

Abstract

본 발명은 플루라나제 (pullulanase)를 이용하여 말토실 β-사이클로덱스트린 (maltosyl β-cyclodextrin)을 제조하는 방법 및 상기 플루라나제를 생산하는 클레브시엘라 속 (Klebsiella sp.) 미생물에 관한 것으로, 본 발명의 제조방법은 클레브시엘라 속 미생물로부터 유래된 플루라나제를 효소로 하여 β-사이클로덱스트린과 말토스의 농도, 반응 온도 및 pH 범위를 조절하여 최적의 조건에서 말토실 β-사이클로덱스트린을 제조하는 보다 효과적이고 경제적인 방법이다.

Description

플루라나제를 생산하는 클레브시엘라 속 미생물 및 이를 이용한 말토실 베타-사이클로덱스트린 제조방법{Klebsiella sp. producing pullulanase and process for preparation of maltosyl beta0cyclodextrin}

본 발명은 플루라나제 (pullulanase)를 이용하여 말토실 β-사이클로덱스트린을 제조하는 방법 및 상기 플루라나제를 생산하는 클레브시엘라 속 (Klebsiella sp.) 미생물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 클레브시엘라 속 미생물로부터 유래된 플루라나제를 이용하여 적정 농도의 말토스와 β-사이클로덱스트린 혼합물로부터 말토실 β-사이클로덱스트린을 제조하는 방법에 관한 것이다.

클레브시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae)에서 처음으로 발견된 플루라나제는 (Bender, H. et al., Enzym. Biochem. Z., 334, 79-94, 1961) 플루란에 있는 α-1,6-글루코시딕 (α-1,6-glucosidic) 연결을 가수분해하여 최종산물로 말토트리오스 (maltotriose)를 만드는데 관여하는 효소로서 (Abdullah, M. et al., Nature, 210, 200, 1966), 플루란 뿐만 아니라 아밀로펙틴, 글리코겐과 같은 가지를 지닌 다당류에서 α-1,6-글루코시딕 연결을 자르기도 한다.

사이클로덱스트린 (cyclodextrin, 이하 "CD"라 약칭함)은 α-1,4-결합으로 6개 내지 8개의 클루코실기가 환상으로 결합된 물질로서, 극성을 띄지 않는 중앙부는 소수성을 형성하여 유기물 등을 포접하는 능력을 가지며, 이러한 성질 때문에 의약품, 화장품 및 식품 분야에서 널리 사용되고 있다 (Pszczola, D. E., Food Technol., 42, 96, 1988).

CD 은 CD 생합성 효소에 의해 전분으로부터 만들어지며, 생합성 효소를 생산하는 미생물의 종류에 따라 α-, β- 또는 γ-CD 의 비율이 달라진다 (DePinto ＆ Campbell, Arch. Biochem. Biophys., 125, 253, 1968; French et al., J. Am. Chem. Soc., 76, 2387, 1954; Staff article, Food Technol., 42, 1189, 1988). 이 때 α-, β- 및 γ-CD 은 글루코실기의 수가 각각 6개, 7개 및 8개로 이루어져 있으며, 물에 대한 용해도가 비교적 낮은 β-CD 이 주로 산업적으로 사용되고 있다.

그러나 많은 경우 물에 더 잘 녹는 β-CD 가 필요하며 이런 경우에는 β-CD 의 용해도가 증가되어야 한다. 이러한 용해도 증가는 CD 가장자리의 히드록시기(-OH)에 다양한 그룹이 치환됨으로써 가능한데, 분지성 CD 는 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈 (cyclodextrin glycosyltransferase, 이하 "CGTase"로 약칭함)에 의해 만들어진다. 예를 들어 β-CD 의 물에 대한 용해도는 α-CD 및 γ-CD 에 비해 극히 낮으나 말토실 β-CD 의 용해도는 151.6 g/100 ml (25℃)로 증가한다.

CGTase 에는 여러 종류가 있는데, 바실러스 (Bacillus)속 유래의 플루라나제를 사용하여 말토스와 α-CD 혼합물로부터 말토실-α-CD 가 합성된 것이 보고되었고 (Sakano et al., Agric. Biol. Chem., 49, 3391, 1985), 이후 클레브시엘라 에어로게네스 (Klebsiella aerogenes)의 플루라나제 또는 슈도모나스 (Pseudomonas)속 미생물의 이소아밀라제 (isoamylase)를 사용하여 말토스나 말토트리오스와 CD 의 혼합물로부터 말토실 CD 나 말토트리오실 CD 가 합성된 것이 보고된 바 있다 (Hizukuri et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 11, 60, 1989).

또한 바실러스 애시도플루리티쿠스 (Bacillus acidopullulyticus)의 플루라나제를 사용하여 말토스 존재하에 투입한 β-CD 의 48% 를 말토실화한 것이 보고되었다 (Shiraishi et al., Agric. Biol. Chem., 53, 2181, 1989).

한편 용해도를 증가시키기 위해 CD 가장자리의 히드록시기 (-OH)를 치환시킨 분지성 CD 를 제조할 때, β-CD 와 말토스를 사용하여 말토실 β-CD 를 제조하는 것이 다른 CD (α-CD 및 γ-CD)와 말토트리오스 등을 사용하여 기타 다른 분지성 CD 를 제조하는 것 보다 훨씬 경제적이다.

말토실 β-CD 의 용도는 기존의 β-CD 와 동일하나, 용해도가 증가함에 따라 디곡신, 디기톡신, 니트라제팜, 비타민 D, 비타민 K 등 물에 녹지 않는 물질을 주사약으로 개발하는 데 사용되는 등 그 용도는 더욱 확대될 것이다 (Okada et al., Chem. Pharm. Bull., 36, 2176, 1988; Koizumi, ibid, 35, 3413, 1987).

이상에서 볼 때 말토실 β-CD 에 대한 연구는 그 용도를 확대하는 방향과 말토실 β-CD 를 보다 경제적으로 생산할 수 있도록 새로운 효소를 선발하거나, 공정을 개선하는 방향에 집중되고 있다.

이에 본 발명자들은 말토실 β-CD 를 보다 효과적이고 경제적으로 제조하기 위하여 그 제조공정을 개선하고자 연구를 계속하여 오던 중, 토양으로부터 클레브시엘라 속 미생물을 분리 및 동정하여 이로부터 유래된 플루라나제가 말토실 β-CD 을 제조하는데 적합한 효소라는 것을 발견하고, β-CD 와 말토스의 농도, 반응 온도 및 pH 범위를 조절하면 최적의 조건에서 말토실 β-CD 을 제조할 수 있음을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 본 발명은 플루라나제를 이용하여 말토실 β-CD 를 제조하는 방법 및 상기 플루라나제를 생산하는 클레브시엘라 속 미생물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 토양으로부터 클레브시엘라 속 미생물을 분리 및 동정한 다음, 이로부터 유래된 플루라나제를 이용하고 β-CD 와 말토스의 농도, 반응 온도 및 pH 범위를 조절하여 최적의 조건에서 효과적이고 경제적으로 말토실 β-CD 을 제조하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 클레브시엘라 속 미생물로부터 유래된 플루라나제를 이용하여 말토실 β-CD 을 제조하는 방법을 제공한다.

우선 플루라나제를 생산하는 미생물을 브라질의 토양으로부터 채집하고, 상기 미생물의 형태, 각종 배지에서의 생육 상태, 생리적 특성 등을 조사하여 클레브시엘라 속 미생물로 동정하였다.

본 발명은 플루라나제를 생산하는 모든 클레브시엘라 속 미생물을 포함하며, 이 중 특히 생산성이 우수한 미생물을 클레브시엘라 속 192 (Klebsiella sp. 192) 균주로 명명하고, 1997년 8월 8일에 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 8820P).

본 발명에서는 상기 클레브시엘라 속 미생물로부터 플루라나제를 정제하였는데, 클레브시엘라 속 미생물을 배양한 다음 원심분리하여 상등액을 취하고 이 상등액을 한외여과막에 통과시켜 분자량 3만 이상의 분획을 얻고, 이 분획을 투석막을 이용하여 투석하고 동결 건조한 다음 희석시켜 이를 효소액으로 사용하였다.

한편 플루라나제는 전술한 바와 같이 풀루란을 말토트리오스로 분해하는 효소이지만, 기질인 CD 나 말토스의 농도가 높을 때에는 역반응으로 말토스 CD 를 합성한다.

본 발명의 효소액인 플루라나제의 효소활성을 다음 실험예와 같은 방법으로 측정하였다.

＜실험예＞ 효소 활성 측정방법

플루라나제의 효소 활성은 효소액 0.5 ml 을 0.7 % 풀루란액 (0.1 M 인산완충액에 녹인다. pH 6.0) 0.5 ml 와 혼합하고, 40 ℃ 에서 10분간 반응시킨 다음, 넬슨 소모기법으로 말토트리오스를 정량하는 방법을 이용하여 측정할 수 있다.

상기에서 언급한 조건에서 1분 동안 1μM 말토트리오스를 형성하는 활성을 효소의 1 단위 (unit)로 결정하였다.

본 발명의 말토실 β-CD 를 제조하는 방법은 말토스 및 β-CD 를 상기에서 얻은 플루라나제와 일정 온도 및 pH 범위에서 반응시킨 다음 반응물을 고압액체크로마토그래피 등을 수행하여 분리하는 과정으로 이루어진다. 이 때 상기 β-CD 의 농도가 낮고, 말토스 농도가 높을 때 말토실 β-CD 의 생성능이 증가한다.

또한 상기 반응은 pH 4.0∼5.0 범위, 온도 45∼55 ℃ 범위에서 22∼26 시간 동안 수행하는 것이 바람직하며, 말토스의 농도는 500∼700 mg/ml 범위이고, β-CD 의 농도는 80∼150 mg/ml 범위에서 적절한 비율로 조정하는 것이 바람직하다. 특히 pH 4, 온도 50 ℃ 에서 24 시간 동안 반응을 수행하는 것은 더욱 바람직하며 말토스의 농도는 600 mg/ml, β-CD 의 농도는 100 mg/ml 인 것이 말토실 β-CD 를 제조하는데 더욱 바람직하다.

본 발명의 제조방법에 따라 β-CD 100 mg/ml, 말토스 600 mg/ml 로부터 말토실 β-CD 를 35.0 mg/ml 까지 생산할 수 있으며, 이렇게 생성된 말토실 β-CD 는 소수성이 요구되는 의약품, 화장품 및 식품분야에 널리 이용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하고자 한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

＜실시예 1＞ 클레브시엘라 속 미생물의 분리 및 동정

브라질의 토양에서 보통의 방법으로 미생물을 채취하여 플루라나제를 생산하는 클레브시엘라 속 (Klebsiella sp.) 미생물을 분리하였다.

상기 미생물은 현미경으로 관찰한 결과 그람 음성 간균으로 나타났으며, 배지상에서 생육 가능 온도는 25∼35 ℃였고, 생육 최적 온도는 28∼32 ℃였다. 또한 보제 프로스카우어 테스트 (Voges-Proskauer test) 및 메틸 레드 테스트 (Methyl red test)의 결과는 음성으로 나타났으며, 옥시데이즈 (oxidase), 아르기닌 디하이드롤레이즈 (Arginine dihydrolase), 오르니틴 디카복실레이즈 (Ornithine decarboxylase) 및 페닐알라닌 디아미네이즈 (Phenylalnine deaminase) 활성 역시 음성으로 나타났다. 한편 카탈레이즈 (Catalase), 라이신 디카복실레이즈 (Lysine decarboxylase) 및 우레아제 (urease) 활성은 양성으로 나타났다.

본 발명의 미생물은 또한 인돌 (indole)과 H₂S 는 생산하지 않았고, 젤라틴 (gelatin) 및 카제인 (casein)은 가수분해하지 못하였으며, 전분과 펙틴은 가수분해할 수 있는 특성을 가지고 있음을 알 수 있었다.

따라서 본 발명의 미생물을 클레브시엘라 속 미생물로 동정하고 클레브시엘라 속 192 (Klebsiella sp. 192) 균주로 명명하여, 본 균주를 1997년 8월 8일에 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 8820P).

＜실시예 2＞ 효소액 (플루라나제)의 제조

클레브시엘라 속 미생물 (KCTC 8820P)을 생산배지 [아밀로펙틴 2 %, 소디움 글루코네이트 (Na gluconate) 0.4 %, K₂HPO₄0.1 %, MgSO₄-7H₂O 0.05 %, (NH₄)₂HPO₄0.15 %, FeCl₃-6H₂O 0.001 %, MnCl₂-4H₂O 0.001 %, NaCl 0.001 %, pH 7.0]에서 30 ℃ 온도에서 76시간 동안 배양한 다음, 원심분리하여 상등액을 취하였다.

상기 상등액을 분자량 3만의 한외여과막에 통과시켜 분자량 3만 이상의 분획을 얻은 다음, 증류수에서 투석막을 이용하여 5 ℃ 온도로 48시간 동안 투석한 후 이를 동결건조하고 희석하여 효소액으로 사용하였다.

[비교 실시예] 플루라나제를 이용하여 말토실화된 CD 의 정량분석

플루라나제 10 단위, 말토스 600 mg, α-, β- 및 γ-CD 100 mg 를 50 mM 트리스-HCl (pH 4) 1 ml 에 각각 녹이고, 50 ℃ 에서 24 시간 동안 반응시킨 다음, 반응물을 고압액체크로마토그래피 (시마즈사 제품, 모델 CG 480C)를 사용하여 반응물인 CD 및 말토실 CD 를 정량하였다.

분석조건은 YMC-팩 폴리아민-Ⅱ (YMC-Pack Polyamine-Ⅱ) 칼럼에, 아세토니트릴과 물 (75:25, 부피/부피)을 분당 1.5 ml 의 속도로 흘려서, 디퍼렌셜 리프렉토미터 디텍터 [differential refractometer detector (RI detector) ; differential IR-CG 410] 로 확인하였다.

말토실화된 CD 의 양은 α-CD 의 경우 50.4 mg, β-CD 의 경우 35.0 mg, γ-CD 의 경우 55.4 mg 이었다 (표 1 참조).

말토스 사용량	CD 종류 (사용량)	말토실화된 CD 의 생성량
600 mg	α-CD (100 mg)	50.4 mg
	β-CD (100 mg)	35.0 mg
	γ-CD (100 mg)	55.4 mg

＜실시예 3＞

비교실시예의 조건에서 β-CD 를 100 mg 으로 고정하고, 말토스의 농도를 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 mg 으로 증가시켰다.

생성된 말토실 β-CD 의 양은 6.5, 11, 16,5, 21, 24, 33.5, 31.5 mg/ml 이었다 (표 2 참조).

말토스 사용량 (mg)	β-CD 사용량 (mg)	말토실 β-CD 생성량 (mg)
100	100	6.5
200		11
300		16.5
400		21
500		24
600		33.5
700		31.5

＜실시예 4＞

비교실시예의 조건에서 β-CD 100, 200, 300, 400 mg; 말토스 600, 500, 400, 300 mg 을 각각 혼합하였을 때, 생성된 말토실 β-CD 는 35.0, 29.3, 24.8, 8.9 mg/ml 이었다 (표 3 참조).

말토스 사용량 (mg)	β-CD 사용량 (mg)	말토실 β-CD 생성량 (mg)
600	100	35.0
500	200	29.3
400	300	24.8
300	400	8.9

상기 실시예의 결과에서 볼 수 있듯이, 사용되는 β-CD 의 농도가 낮고, 말토스 농도가 높을 때 말토실 β-CD 의 생성능이 증가함을 알 수 있었다.

＜실시예 5＞

비교실시예의 조건에서 β-CD 100 mg 및 말토스 600 mg 을 혼합하고 pH 만을 달리하였을 때, 생성된 말토실 β-CD 의 양을 표 4에 나타내었다.

pH	말토실 β-CD 생성량 (mg)
3.5	29.8
4.0	35.0
4.5	35.0
5.0	35.0
5.5	33.25
6.0	30.8
6.5	29.1
7.0	28.0

＜실시예 6＞

비교실시예의 조건에서 β-CD 100 mg 및 말토스 600 mg 을 혼합하고 반응 온도만을 달리하였을 때, 생성된 말토실 β-CD 의 양을 표 5에 나타내었다.

온도 (℃)	말토실 β-CD 생성량 (mg)
40	28.0
45	33.3
50	35.0
55	32.6
60	29.6
65	20.3
70	7.5

상기 실시예 5 및 실시예 6의 결과에서 볼 수 있듯이, 반응이 pH 4.0∼5.0 범위 및 온도 45∼55 ℃의 범위에서 수행될 때 말토실 β-CD 의 생성능이 증가함을 알 수 있었다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 제조방법은 클레브시엘라 속 미생물 (KCTC 8820P)로부터 유래된 플루라나제를 사용하고 반응 온도, 적용 pH, β-CD 의 농도 및 말토스의 농도 등의 반응 조건을 최적의 상태로 유지하여 보다 효과적이고 경제적으로 말토실 β-CD 를 제조할 수 있는 방법이다. 구체적으로 β-CD 100 mg/ml, 말토스 600 mg/ml 로부터 말토실 β-CD 를 35.0 mg/ml 까지 생산할 수 있어 소수성이 요구되는 의약품, 화장품 및 식품분야에 널리 이용될 수 있다.

Claims

ⅰ) 클레브시엘라 속 192(Klebsiella sp. 192) 균주로부터 플루라나제(pullulanase)를 정제하는 단계;

ⅱ) 상기 단계 ⅰ)의 플루라나제를 포함하는 효소액과 말토스 및 베타-사이클로덱스트린을 적정 온도 및 pH 조건에서 반응시키는 단계; 및,

ⅲ) 반응물을 크로마토그라피를 수행하여 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 말토실 베타-사이클로덱스트린(maltosyl β-cyclodextrin)을 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 반응은 pH 4.0∼5.0 범위, 온도 45∼55 ℃ 범위에서 수행되는 것을 특징으로 하는 말토실 베타-사이클로덱스트린을 제조하는 방법.
제 1항에 있어서, 말토스의 농도는 500∼700 mg/ml 범위이고, 베타-사이클로덱스트린의 농도는 80∼150 mg/ml 범위 인 것을 특징으로 하는 말토실 베타-사이클로덱스트린을 제조하는 방법.
플루라나제를 생산하는 클레브시엘라 속 192(Klebsiella sp. 192) 균주(수탁번호 : KCTC 8820P).