KR910002852B1

KR910002852B1 - 시클로말토덱스트린 글루카노트랜스퍼라제 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR910002852B1
Application number: KR1019890001328A
Authority: KR
Inventors: 고끼 호리꼬시
Original assignee: 리까가꾸 겡뀨쇼; 오다 미노루
Priority date: 1988-02-04
Filing date: 1989-02-04
Publication date: 1991-05-06
Also published as: EP0327099A3; EP0327099A2; DK50889D0; JPH01199575A; US5019507A; KR890013173A; EP0327099B1; DE68909625D1; DK50889A; DE68909625T2; US5102800A

Abstract

내용 없음.

Description

시클로말토덱스트린 글루카노트랜스퍼라제 및 그의 제조방법

제1도는 본 발명의 CGT 아제 사용시 α, β, γ 및 총 CD의 시간-경과에 따른 변화를 나타낸다.

제2도 및 제4도는 CGT 아제 활성에 대한 pH 효과 및 온도 효과를 각각 나타낸다.

제3도 및 제5도는 효소의 pH- 및 열-안정성의 프로필을 나타낸다.

제6도는 본 발명 CGT 아제의 열안정성에 대한 Ca²⁺농도 효과를 나타낸다.

제7도는 SDS-PAGE에 의한 본 발명 CGT 아제의 분자량 추정방법을 나타낸다.

제8도는 본 발명 CGT 아제의 등전점이 4.8±0.1임을 나타내는 도면이다.

본 발명은 전분으로부터 베타-시클로덱스트린(이하 β-CD로 약침함)을 우세하게 제조하는 신규 시클로말토덱스트린 트랜스퍼라제(EC. 2, 4, 1, 19; 이하 CGT 아제로 약칭함) 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 바실루스 코아굴란스(Bacillus coagulans)의 배양으로 수득되고 전분 또는 그의 부분 가수분해물로부터 β-CD를 주성분으로 함유하는 탄수화물을 형성시켜 β-CD를 우세하게 제조하는 신규 CGT 아제 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

CGT 아제는 전분, 아밀로스, 아밀로펙틴 및 글리코겐과 같은 α-1,4-글루칸 또는 그의 부분 가수분해물의 α-1,4-글루코피라노시드 결합에 작용함으로써 시클로덱스트린(이하 CDs로 약칭함)을 제조하는 CD 제조반응; CDs를 절단하고 그의 글리코실 잔기를 슈크로스 및 말토올리고사카라이드와 같은 몇몇 글리코실 수용체에 전이시키는 커플링 반응; 및 각종 말토올리고사카라이드의 분자간 전이 반응에 의해 다양한 분자량의 말토올리고사카라이드를 제조하는 불균화 반응을 촉매하는 효소이다. 6개의 글루코스 유닛으로 이루어진 α-CD(시클로헥사아밀로스), 7개의 글루코스 유닛으로 이루어진 β-CD(시클로헵타아밀로스) 및 8개의 글루코스 유닛으로 이루어진 γ-CD(시클로옥타아밀로스)는 CDs로서 널리 공지되어 있을뿐만 아니라 CDs의 글루코스중 6번째-위치에 α-1,6-글루코피라노시드 결합을 통하여 분지된 CDs도 또한 제조된다.

이 CDs는 소수성을 나타내는 그의 특이적 구조 때문에 CDs의 공동(cavities)에 각종 유기 화합물[이하 게스트(guest) 화합물로 약칭함]을 합체(incorporating)시킴으로써 봉입 복합체를 만드는 특성을 갖는다. 결과적으로, CDs는 열, 산소 또는 자외선에 대한 안정성 및 물 및 각종 용매에서의 용해성과 같은 게스트 화합물의 성질을 유리하게 개선시킨다. 그리하여 CDs는 식품 분야에서 뿐만아니라 제약, 화장품, 살충제 및 각조 다른 분야에서도 이용된다.

상술했듯이, CDs는 전분과 같은 α-1,4-글루칸 또는 각종 CDs 및 말토올리고사카라이드의 혼합물인 그의 부분 가수분해물에 CGT 아제가 작용하여 각종 CDs 및 말토올리고사카라이드의 혼합물로 수득되지만, CDs의 생산량 및 수율은 CGT 아제의 원(origin)에 따라 다소 다양하다. 몇가지 미생물이 CGT 아제의 원으로 공지되어 있지만 바실루스에 속하는 미생물이 특히 CGT 아제의 우수한 생산원으로 공지되어 있다. 예를 들면, 비. 마세란스(B. macerans, Biochemistry, vol. 7, p 114, 1968 및 Agric. Biol. Chem., vol. 38, p 387, 1974 및 상동, vol. 38, p 2413, 1974); 비.시트쿨란스(B. circulans, Amylase Symposium, vol. 8, p 21, 1973); 비. 메가테리움(B. megaterium, Agric. Biol. Chem., vol. 38, p 387, 1974 및 상동, vol. 38, p 2413, 1974); 비. 스테아로테르모필루스(B. stearothermophilus, 일본국 특허 제947335호, J. Jap. Soc. Starch Sci., vol. 29, p 7, 1982); 및 친알칼리성 바실루스 sp.(Die starke, vol. 27, p 410, 1975, Agric. Biol. Chem., vol. 40, p 935, 1976 및 상동, vol. 40, p 1785, 1976)의 미생물이 공지되어 있다.

바실루스에 속하는 미생물과는 별도로, 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae, Arch. Microbiology, vol. 111, p 271, 1977, Carbohydr. Res., vol. 78, p 133, 1980 및 상동, vol. 78, p 147, 1980)가 CGT 아제를 생산한다고 보고되어 있다. 각종 미생물에 의해 생산된 CGT 아제는 전분으로부터 제조된 초기 반응 생성물을 기준으로 α-CD 및 β-CD-생성형으로 구분된다. 비. 마세란스 및 케이. 뉴모니아에는 α-CD-생성형을 생산하고 비. 시르쿨란스, 비. 메가테리움 및 친알칼리성 바실루스 sp.는 β-CD-생성형을 생산한다. 또한 비. 스테케아로테르모필루스의 CGT 아제에 의해 전분으로부터 제조된 반응 생성물중 CDs 함량은 β-CD〉α-CD〉γ-CD이다. 그러나, 이 CGT 아제의 초기 반응 생성물이 α-CD이기 때문에, 이 CGT 아제는 당연히 α-CD형이다(일본국 특허 제947335호 및 J. Jap. Soc. Starch Sci., vol. 29, p 13, 1982).

γ-CD-생성형의 CGT 아제는 최근에 발견되었지만, 그의 γ-CD 생산성이 매우 낮아, 실용성에 있어서 부적절하다(Denpun Kagaku, vol. 33, p 137, 1986 및 일본국 특허공고 제61-274680호).

다음 원으로부터의 CGT 아제는 전분으로부터의 CDs의 생산량 및 수율이 다를뿐만아니라, pH 및 온도에 따라 다른 작용을 나타내기 때문에 목적에 따른 CGT 아제의 적절한 사용이 유리하다. 그러나, 적당한 최적 온도 및 pH 또는 온도 및 pH에 대해 더 우수한 안정성을 갖는 CGT 아제를 상업적으로 사용하는 것이 더 용이하다. 일반적으로, 아밀라제와 같은 전분당의 제조에 유용한 효소의 최적 온도는 65∼70℃인 것이 바람직하며, 그의 최적 pH도 4.5∼6.5의 약산 범위인 것이 바람직하다. 최적 온도를 65∼70℃으로 맞추는 한가지 이유는 반응 용액의 미생물 오염을 방지하기 위해서이다. 미생물 오염은 오염으로 인한 반응 용액의 pH 감소를 상쇄시키기 위해 수산화나트륨과 같은 알칼리성 시약을 다량으로 사용해야할 필요가 있으며 또한 예를 들면, 탈이온 및 탈색에 의한 정제를 요구하여, 공정을 비싸고 어렵게 만든다. 또한, 더 높은 최적 온도 및 안정 온도를 갖는 CGT 아제의 사용은 반응 용기의 온도를 유지하고 효소를 불활성화시키기 위해 더 많은 에너지를 요구하기 때문에 경제적이지 못하다.

또한, 알칼리 범위의 최적 pH를 CGT 아제를 사용하면, 효소 반응 및 착색 반응과 동시에 일어나는 이성화 반응이 생산량을 감소시키고 정제 과정을 복잡하게 만든다. 그러므로 이러한 CGT 아제의 사용은 경제적이지 못하다.

상술했듯이, 상업적 제조방법으로 유용한 CGT 아제는 전분으로부터의 높은 CDs 수율 뿐만아니라, 실용성 있는 적당한 최적 온도, 최적 pH 및 온도 안정성을 나타내야만 한다.

본 발명의 목적은 전분으로부터 저렴하고 높은 생산성으로 CDs를 제조할 수 있는 β-CD 형 CGT 아제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 반응 동안 미생물에 의한 오염을 방지할 수 있는 약 65℃의 최적 온도를 갖고, 약 80℃에서 불활성화 될 수 있으며, 약산 범위의 최적 pH를 갖는 β-CD형 CGT 아제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 특징으로 갖는 신규 CGT 아제의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적들은 하기 발명의 상세한 설명에서 명백해진다.

본 발명의 상기 목적은 하기 물리적 특성을 갖는 CGT 아제를 제공하므로써 수행될 수 있다 : (a) 작용 : 전분 및 글리코겐과 같은 α-1,4-글루칸, 또는 그의 부분 가수분해물의 α-1,4-글루코피라노시드 결합을 절단하고, 그것을 시클로덱스트린을 형성하도록 전이시켜 그의 전이의 초기 반응 생성물로서 β-시클로덱스트린을 제조함; (b) 기질 특이성 : 사슬 길이가 말토트리오스의 길이보다 짧지 않은 α-1,4-글루코피라노시드 연결을 갖는 말토올리고사카라이드와 반응하여 기질간의 분자간 불균화 반응에 의해 다양한 분자량을 갖는 각종 말토올리고사카라이드 및 시클로덱스트린을 제조함; (c) 최적 pH : 약 6.5; (d) 안정 pH : pH 6∼9, 40℃에서 2시간 동안 안정함; (e) 최적 온도 : 약 65℃ ; (f) 불활성화 조건 : pH 4.5 및 11.5, 40℃의 온도에서 2시간의 처리로 및 pH 6, 75℃에서 15분간의 처리로 완전히 불활성화됨; (g) 열 안정성 : PH 6의 조건하에서 15분 동안 50℃까지 안정하며 동일 조건하, 60℃ 및 70℃에서 잔류 활성이 각각 95% 및 20% 임; (h) 억제 : 수은(Ⅱ) 또는 구리(Ⅱ)에 의해 억제됨 ; (i) 활성화 및 안정성 : 칼슘에 의해 안정화됨; (j) 분자량 (SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동); 36,000±1,000; (k) 등전점(크로마토포커싱) 4.8±0.1.

본 발명의 CGT 아제는 토양으로부터 수득된 온건한 호열성 세균인 바실루스 코아굴란스에 속하는 CGT 아제 생산 미생물을 배양하고, 배양액에 세포의 생산된 CGT 아제를 수집함으로써 제조할 수 있다.

본 발명의 발명가들에 의해 토양에서 발견 및 분리되었으며, 본 발명에서 사용된 CGT 아제 생산 미생물은 호기성이고, 그람-양성이며, 포자-형성 간상균이고, 운동성이 있으며, 페리트리코우스 편모를 갖는다는 사실로부터 바실루스 코아굴란스로 동정되었다. 분리된 균주의 분류학적 연구가 문헌[Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol. 1, Williams 및 Willkius, Baltimore/London 출판 및 The Genus Bacillus, U. S. Department of Agriculture 출판]을 참고로 이루어졌다. 또한 분리된 균주는 65℃에서는 성장하지 않지만 30∼60℃의 온도에서 성장하고 0.02%의 아지드화나트륨의 존재하에서 우레아로부터 암모니아를 생산하지 않으며, 디히드록시아세톤을 생산한다는 사실로부터 바실루스 코아굴란스로 동정되었다.

일본국 특허 제947335호에는 비.스테아로테르모필루스에 속하는 CGT 아제 생산 미생물(FERM P-2219)이 60℃에서 성장하고 65℃에서는 성장하지 않는다고 기재되어 있다. 그러나, 본 발명의 분리된 균주(YH-1306)는 3% 염화나트륨의 존재하에서 성장하고, 무기 질소 화합물을 이용할 수 없으며, 포자낭이 FERM P-2219의 포자낭과 다르므로, 본 발명의 분리된 세균 균주는 신규의 CGT 아제 생산 미생물이라는 결론에 도달할 수 있다. 또한, 후술된대로 균주(YH-1306)에 의해 생산된 CGT 아제의 효소 특성 및 기질 특이성이 일본국 특허 제947335호에 기술된 것과 다르므로, 균주(YH-1306)는 신규일 것으로 여겨진다. 분리된 균주(YH-1306)는 친알칼리성 조건하에서 성장하지 않고 시트르산을 동화하지 않으므로, 비.메가테리움 및 비. 시트쿨란스와 명백히 다르다. 결론적으로, 본 발명 균주(YH-1306)는 비. 코아굴란스에 속하는 미생물로 동정된다. 균주(YH-1306)의 분리학적 특성을 하기 표 1에 기재한다.

[표 1 YH-1306의 분류학적 특징]

+ : 양성 또는 잘 성장함

- : 음성 또는 성장하지 않음

본 발명에서 사용되는 균주(YH-1306)는 부다페스트 조약에 따라서 FERM BP-2258의 수탁 번호로 일본국 통상 산업성 공업 기술원 미생물 공업 기술연구소(FRI)에 기탁되었다.

이제 본 발명의 신규 CGT 아제를 상세히 설명하겠다. 비. 코아굴란스에 속하는 CGT 아제 생산 미생물을 pH가 5.8∼7.5, 바람직하게는 6.5∼7.0으로 조절된 배양액에 접종한후, 접종 배양액을 30∼60℃, 바람직하게는 45∼50℃에서 30∼80시간 동안 호기적으로 배양하여, 배양액에 세포외 효소인 CGT 아제를 생산 및 축적하도록 한다.

공지되었다고 저렴하게 구입할 수 있는 각종 물질을 본 발명에서 사용되는 배양액에 적용시킬 수 있다. 질소원의 예로는 옥수수 침지액, 폴리펩톤, 소이빈 밀, 겨, 육즙, 효모 추출액 및 아미노산 용액이 포함된다. 탄소원의 예로는 옥수수 시럽, 말토스, 각종 전분, 가용성 전분, 액화 전분, 덱스트린 및 풀루란이 포함된다.

질소 및 탄소원에 더하여, 무기염(예를 들면 마그네슘염, 칼륨염, 인산염, 제이철 염)과 같은 각종염 및 각종 비타민을 임의로 배양액에 가할 수 있다.

상기 배양에 적당한 배양액의 예는 5% 옥수수 침지액, 0.1% K₂HPO₂, 0.02% MgSO₄·7H₂O 및 0.005% CaCl₂·2H₂O를 함유하는 액체 배양액이다.

본 발명에서 사용되는 CGT 아제 생산 미생물(FERM BP-2258)은 세포외 효소를 생산한다. 배양 상층액에 축적된 세포의 효소를 원심 분리하여 미생물 세포를 제거하고 조(crude) 효소를 수득한다. 생성 조 효소를 정제하기 않고 사용하는 것이 경제적이다. 그러나, 조 효소를 정제할 수 있으며, 이 정제는, 예를 들면 황산 암모늄을 사용하는 염석, 에탄올, 아세톤 또는 이소-프로판올을 사용하는 용매 침전, 한외 여과 또는 이온 교환수지를 사용하는 일반적인 효소 정제방법으로 수행할 수 있다.

본 발명의 순수한 CGT 아제의 제조방법의 바람직한 예를 설명하겠다.

온건한 호열성 바실루스 코아굴란스(YH-1306)를 5%(w/v) 옥수수 침지액, 0.1% K₂PO₄, 0.02% MgSO₄·7H₂O 및 0.005% CaCl₂·2H₂O를 함유하는 배지에 접종시킨 후, 45℃, 1 v.v.m의 통기 속도 및 250r.p.m.의 교반속도에서 72시간 동안 호기적으로 배양한다. 생성 배양액을 4℃, 10,000r.p.m.에서 연속적으로 원심 분리하여, 세균 세포를 제거하고 상층액(조 효소 용액)을 수득한다. 그런후 고체 황산 암모늄을 조 효소 용액에 가하여 약 20%로 포화시킨다. 용액을 옥수수 전분층에 통과시켜 용액으로부터 효소를 흡착시킨 후, 효소를 과부피의 40mM 인산 수소 이나트륨 용액으로 추출한다. 생성된 추출액을 한외 여과막(평균 분획 분자량 : 10,000)을 사용하여 농축시킨 후, 농축액을 1mM CaCl₂를 함유하는 10mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)으로 4℃에서 하룻밤 동안 투석한다. 투석 동안 형성된 침전을 원심분리로 제거한다. 생성된 상층액을, 예를 들면 10mM 아세테이트 완충액으로 평형시킨 DEAE-도요펄 650M 컬럼에 흡착시키고, 효소를 0∼0.7M NaCl을 함유하는 동일한 완충액을 사용하여 직선 구배법으로 용출시킨다. 용출된 활성 분획을 상기 한외여과막을 사용하여 수집 및 농축시킨다. 그런후, 농축 분획을 0.1M NaCl을 함유하는 동일한 완충액으로 평형시킨 세파크릴 S-200 컬럼에 넣고 완충액으로 용출시킨다.

용출 활성 분획을 상기 한외여과막으로 수집 및 농축한다. 농축 분획을 쇼덱스 WS-2003 컬럼을 사용하는 고성능 액체 크로마토그래피시켜 활성 분획을 수집한다. 생성된 정제 효소를 폴리아크릴아미드 겔 디스크 전기영동(PAGE, 겔 농도 : 7.5%)으로 분석하여, 정제 효소가 균질하며 이 정제에 의한 효소 활성의 수율이 약 25%임을 밝혔다.

β-CD-생성 활성은 하기와 같이 카네코등의 방법(Kaneko et al, J. Jpm. Soc. Starch Sci., vol. 34, p 45∼48, 1987)으로 결정할 수 있다. 0.1M 아세테이트 완충액(pH 6.0)에 용해시킨 1.0㎖의 4%(w/v) 가용성 전분 용액 및 0.1㎖의 효소 용액을 함유하는 반응 혼합물을 60℃에서 20분 동안 보온한 후, 3.5㎖의 30mM NaOH 용액을 가하여 반응을 중지시킨다. 그런후, 50mM Na₂CO₃용액에 용해시킨 0.5㎖의 0.02%(w/v) 페놀프탈레인을 반응 혼합물에 가하고 실온에서 약 15분 동안 유지한 후 생성 용액의 색을 페놀프탈레인 용액으로 동시에 처리된 0.1㎖의 0.5㎎/㎖ β-CD 용액을 표준으로 하여 필터 No. 54(550㎚)를 사용하는 광전 비색계(Klett-Summerson type)로 측정한다. 효소 활성의 1 유닛은 상기 조건하에서 1분당 1㎎의 β-CD를 생성하기 위해 요구되는 효소의 양으로 정의한다.

본 발명의 방법에 의해 수득된 CGT 아제의 물리적 및 효소학적 특징을 공지된 세균으로부터 수득된 CGT 아제의 특징과 비교하여 표 2에 제시한다.

[효소학적 특징의 비교]

[표 2a]

[표 2b]

표 2에 제시되었듯이, 본 발명의 CGT아제는 전분으로부터의 초기 생성물에 있어서 비.스테아로테르모필루스 및 비.마세란스의 CGT아제와 다르다. 또한, 본 발명의 CGT아제는 최종 생성물의 CDs 조성에 있어서 친알칼리성 바실루스 sp.의 효소와 다르다.

비록 본 발명의 CGT아제의 초기 생성물 및 최종 생성물의 CDs조성이 비.메가테리움의 CGT아제의 것과 같을지라도, 그것은 활성 및 안정성에 대한 pH 및 온도의 프로필에 있어서 다르다. 상업적 관점에서 볼때, α-CD의 제조를 위해서는 비.마세란스의효소의 사용이 바람직하며, β-CD의 제조를 위해서는 친알칼리성 바실루스 sp.의 효소의 사용이 바람직하지만, 이 두가지 효소 모두 최적온도 및 온도 안정성에 있어서 불리하다.

α, β 및 γ-CD를 양호한 비율로 제조하기 위해서는 비.메가테리움 및 비스테아로테르모필루스의 CGT아제의 사용이 적당하다. 그러나, 비.메가테리움의 CGT아제는 최적온도 및 온도 안정성에 있어서 불리하며 반응 혼합물의 세균에 의한 오염을 충분히 막을 수 없다. 비.스테아로테르모필루스의 CGT아제는 높은 최적온도를 가지며, 우수한 온도 안정성을 나타낸다.

효소의 최적온도 및 온도 안정성을 일반적으로 기질 없이 또는 낮은 기질 농도에서 측정하지만, 반응은 실제로 경제적인 관점에서 10∼20%(w/v)와 같은 높은 기질 농도를 사용하여 수행한다. 고 농도의 기질을 함유하는 용액에서, 효소는 일반적으로 기질의 보호 작용에 의해 안정화된다. 유사하게, CGT 아제는 기질 용액에서 안정화되며, 기질이 없는 용액에서 보다 더 높은 온도 안정성을 나타낸다. CGT아제의전분과의 반응에 의해 수득된 CDs는 일반적으로 결정화, 막분리 또는 이온 교환 수지 또는 겔 여과 수지를 사용하는 크로마토그래피로 정제하지만, CGT아제의 반응후에 CGT아제의 기질 특이성 때문에 상당한 양의 고분자량 덱스트린 및 말로올리고 사카라이드가 반응용액에 남게된다. 이 잔류 성분이 실제로 탈이온 및 여과와 같은 조작을 불가능하게 만드므로, 반응용액에 α-아밀라제, β-아밀라제, 글루코아밀라제 및 α-1,6-글루코시다제와 같은 전분분해 효소를 작용시켜, 고분자량 덱스트린 및 말토올리고 사카라이드를 가수분해 및 분해시키고 반응용액의 점도를 감소시킨다. CDs 제조반응에 사용된 CGT아제가 반응 후 여전히 활성이 있을때, 상술한대로 제조된 CDs는 당화 단계동안에 CGT아제의 커플링 및 불균화 작용에 의해 가수분해되어 용액의 점도가 감소된다.

상기 이유로, CGT아제는 각종 전분 분해 효소가 CDs는 제외하고 올리고사카라이드 및 덱스트린을 재-당화 하기전에 완전히 불활성화 시켜야 한다. 산성 및 알칼리성 시약의 사용은 다음과 같은 이유에서 경제적이지 않다 : 가수분해 및 이성화 반응과 같은 바람직하지 못한 부반응이 일어나며, 재-당화 전에 pH를 알칼리성 시약 또는 산을 사용하여 재-당화에 사용되는 효소의 최적 pH에 재-조정해야 하기 때문에 탈이온 및 탈색과 같은 정제를 위한 많은 에너지 및 수고가 필요하다. 따라서 일반적으로 열 불활성화가 CGT아제를 불활성화 시키기 위해 사용된다. 그라나, 비.스테아로테르모필루스는 높은 열 안정성을 가지므로 그것의 CGT아제의 불활성화를 위해서는 열 불활성화가 경제적이지 않다. 이런 상황하에서, 본 발명 CGT아제의 사용은 반응용기의 미생물 오염을 방지하는데 적합한 최적온도 및 열 불활성화에 적합한 열 안정성을 가질 뿐만 아니라, 덱스트린 및 올리고사카라이드의 재-당화를 위해 사용되는 각종 아밀라제의 최적 pH와 유사한 최적 pH를 갖기 때문에 아주 경제적이다.

본 발명의 방법에 따르면, 전분으로부터의 CDs 제조에 유용한 CGT아제를 저렴하게 다량으로 제공할 수 있다. 또한 α, β 및 γ-CDs를 양호한 비율로 함유하는 탄수화물을 CGT아제에 의해 대규모로 제조할 수 있다.

이제, 본 발명의 신규 CGT 아제 및 그의 제조방법을 하기 실시예를 참조하여 설명하겠다. 그러나, 본 발명의 범위가 이 실시예에 의해 제한되지 않는다.

[실시예 1]

온건한 호열성 바실루스 YH-1306(FERM BP-2258) 균주를, 홈이 있는 2ℓ 원추형 플라스크에 담기고 가용성 전분 1%, 폴리펩톤 1.5%, 효모 추출액 0.5%, K₂HPO₄0.1%, MgSO₄·7H₂O 0.02% 및 CaCl₂·2H₂O를 함유하는 300㎖의 배지(pH 6.8)에 접종시키고, 45℃, 200r.p.m.에서 20시간동안 배양하여, 종 용액을 수득한다. 290㎖의 종 용액을, 30ℓ자르 발효기에 담기고 상기에서 사용된 배지와 동일한 조성을 갖는 15ℓ의 배지에 가하고, 45℃ 및 1.5v.v.m.의 통기 속도에서 48시간동안 250r.p.m으로 교반하면서 호기적으로 배양한다. 배양 후, 세균 세포를 원심분리(12,000g, 4℃)로 제거하고 상층액을 한외여과(평균 분자량 : 10,000)로 농축하여 상층액 농도의 약 10배로 만들어, 180단위/㎖의 CGT아제를 갖는 약 1.5ℓ의 조 효소용액을 수득한다.

그런 후, 고체 황산 암모늄을 조 효소 용액에 가하고 20%로 포화시킨다. 용액을 옥수수 전분층에 통과시켜 용액으로부터 효소를 흡착시킨 후, 효소를 과부피의 40mM 인산 수소 이나트륨 용액으로 추출한다. 추출액을 한외여과막(평균 분획 분자량 : 10,000)을 사용하여 농축시킨 후, 농축액을 1mM CaCl₂를 함유하는 10mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)으로 4℃에서 하룻밤 동안 투석한다. 투석 동안 형성된 침전을 원심분리로 제거한다. 수득된 상층액을 10mM 아세테이트 완충액으로 평형시킨 DEAE-도요펄 650M 컬럼에 흡착시키고, 효소를 0∼0.7M NaCl을 함유하는 동일한 완충액을 사용하여 직선 구배법으로 용출시킨다. 용출된 활성 분획을 상기 한외여과막을 사용하여 수집하고 농축시킨다.

수득된 조 효소 용액을 0.1M 염화 나트륨을 함유하는 10mM 아세테이트 완충액(pH 6.0)으로 평형된 세파크릴 S-200컬럼에 넣고, 동일한 완충액으로 용출시킨다. 용출된 활성 분획을 상기 한외여과막을 사용하여 수집하고 농축시킨다. 농축액을 쇼덱스 WS-2003 컬럼을 사용하는 고성능 액체 크로마토그래피시켜 활성 분획을 수집한다. 생성된 정제효소를 폴리아크릴아미드 겔 디스크 전기 영동(겔 농도 : 7.5%)으로 분석하여, 정제효소가 한가지 성분이며, 활성 수율이 약 25%임을 밝혔다.

[실시예 2]

(a) 3mM CaCl₂·2H₂O를 함유하는 100㎖의 13%(w/v) 감자 전분 현탁액(pH 6.5)을 세균 액화형 α-아밀라제(Daiwa Kasei K.K., Chrystase L-1)를 90∼92℃에서 사용하여 액화시키고, 바로 125℃에서 30분동안 가열하여, 1.2의 D.E.(덱스트로스 당량 : 직접 환원당에 대한 총 고체의 비)를 갖는 전분 액화 용액을 수득한다. 그런 후, 실시예 1에서 수득된 정제 CGT아제를 전분액화 용액 1g당 3유닛의 양으로 전분액화 용액에 가하고, 70℃ 및 pH 6.5에서 반응시킨다. 이 반응혼합물을 시간-경과에 따라 샘플링하고 샘플링 반응 혼합물을 HPX-42A 컬럼(Bio-Rad Lab.제조)을 사용하는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 측정한다. 결과를 제1도에 제시한다.

[(b) 특이성]

55㎎의 올리고사카라이드(말토스, 말토트리오스 또는 말토테트라오스) 및 1mM CaCl₂·2H₂O를 1.0㎖의 물에 용해시킨다. 수득된 용액에 5유닛의 본 발명의 정제 CGT아제를 가하고, 반응을 65℃에서 24시간 동안 수행한다. 수득된 반응혼합물을 HPLC로 측정하여 결과를 표 3에 기재한다.

[표 3 각종 올리고사카라이드에 대한 작용]

Sub : 기질, G₁: 글루코스, G₂: 말토스, G₃: 말토트리오스, G₄: 말토테트라오스, G₅: 말토펜타오스, G₆: 말토헥사오스, ND : 검출되지 않음

[(c) 최적 pH]

본 발명의 정제 CGt아제를 1mM EDTA용액으로 하룻밤 동안 투석한 후 물로 하룻밤 동안 투석한다. 탈이온수로 적당히 희석된 CGT아제 용액(0.1㎖)을 0.1M 아세트산 완충액(pH 4.2, 5.0, 5.5 및 6.0) 또는 0.1M 인산염 완충액(pH 6.0, 6.5, 7.0 및 8.0)에 용해시킨 1㎖의 4%(w/v) 가용성 전분과 혼합하고, CGT 아제의 활성을 상기와 같이 측정한다. pH 6.5에서의 상대 활성을 100%로하여 CGT아제의 상대활성의 pH 의존성을 제2도에 제시한다.

[(d) 안정 pH]

(c)와 동일한 방법으로 수득된 본 발명의 투석된 CGT아제를 40℃, 다양한 pH값(4∼10)에서 2시간 동안 열처리한다. 그런 후, CGT아제의 잔류 활성을 측정한다. pH 6.5에서 가열하기 전의 활성을 100%로 하여 잔류 활성의 pH의존성을 제3도에 제시한다. 상기 방법에서, 아세테이트 완충액(pH4∼6), 인산염 완충액(6∼8) 및 글리신 -NaOH-NaCl 완충액(pH 9 및 10)을 사용한다.

[(e) 작용에 대한 최적온도]

상기(c)와 동일한 방법으로 수득된 본 발명의 투석된 CGT아제의 활성을 다양한 온도에서 측정한다. CGT아제의 상대활성의 온도의존성(65℃에서의 상대 활성 : 100%)을 제4도에 제시한다.

[(f) 불활성화 및 (g) 열 안정성]

(c)와 동일한 방법으로 수득된 본 발명의 투석된 CGT 아제를 5mM CaCl₁·2H₂O의 존재하 또는 부재하에서 15분동안 다양한 온도(40∼80℃)에서 처리한 후, 잔류 활성을 측정한다. 결과를 제5도에 제시한다.

[(h) 억제]

각종 금속의 염화물 형태를 (c)와 동일한 방법으로 수득된 본 발명의 투석된 CGT 아제를 함유하는 용액에 가하여 그 농도를 1mM(수은 : 0.1mM)로 만든 후, CGT아제의 활성을 측정한다. 결과를 표 4에 상대활성(금속 부재하에서 CGT아제의 상대활성을 100%로 한다)으로 제시한다.

[표 4 효소활성에 대한 금속염의 효과]

[(i) 안정화]

각종 CaCl₂용액(CaCl₂농도 : 0∼3mM)을 (c)와 동일한 방법으로 수득된 본 발명의 투석된 CGT아제 용액에 가하고, 75℃에서 15분동안 유지한다. 그런 후, CGT아제의 잔류 활성을 측정하고, 제6도에 상대활성(3mM CaCl₂존재하에서의 상대활성을 100%로 한다)으로 제시한다.

[(j) 분자량]

본 발명의 CGT아제의 분자량을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE, 문헌 K.Weber 및 M.Osborn, J.Biol.Chem., vol.244, p4406, 1969을 참조)으로 측정한다(제7도). 본 발명의 분자량은 36,000±1,000이다.

[(k) 등전점]

본 발명의 CGT아제의 등전점을 PBE 94 겔 및 폴리버퍼 74(Pharmacia 제품)를 사용하는 크로마토포커싱 방법으로 측정하는데 등전점은 4.8±0.1이다.

상술했듯이, 본 발명에 따르면, 효소 반응의 최적온도가 약 65℃이고, 약 80℃에서 완전히 불활성화 되며, CDs 제조반응 후 재-당화를 위해 사용되는 각종 전분분해 효소의 최적 pH와 유사한 최적 pH를 갖는 CGT아제가 제공된다.

CGT아제는 전분으로부터 주성분인 β-CD와 함께 적당량의 α-CD 및 γ-CD를 함유하는 말토올리고사카라이드를 제조한다. 또한, 본 발명의 CGT아제를 사용하는 CDs의 제조방법은 시약이 필요하지 않고, 탈이온과 같은 추가 처리가 간단해질 수 있으며, 열 에너지가 절약될 수 있으므로 경제적이다.

그러므로, 본 발명은 CDs를 대규모로 저렴하게 제조할 수 있게하며, 본 발명은 상업적으로 중요성을 갖는다.

Claims

(a) 작용 : 전분 및 글리코겐과 같은 α-1,4-글루칸, 또는 그의 부분 가수분해물의 α-1,4-글루코피라노시드 결합을 절단하고 그것을 시클로덱스트린을 형성하도록 전이시켜 CDs-생성 반응의 초기 반응 생성물로서 β-시클로덱스트린을 제조함; (b) 기질특이성 : 사슬 길이가 말토트리오스의 길이 보다 짧지않은 α-1,4-글루코피라노시드 결합을 갖는 말토올리고사카라이드와 반응하여 기질간의 분자간 커플링 및 불균화 반응에 의해 다양한 분자량을 갖는 각종 말토올리고사카라이드 및 시클로덱스트린을 제조함; (c) 최적 pH : 약 6.5; (d) 안정 pH : pH 6∼9, 40℃에서 2시간동안 안정함; (e) 최적온도 : 약 65℃; (f) 불활성화 조건 : pH4.5 및 11.5, 40℃의 온도에서 2시간의 처리로 및 pH 6, 75℃에서 15분간의 처리로 완전히 불활성화됨; (g) 열안정성 : pH 6의 조건하에서 15분동안 50℃까지 안정하며 60℃ 및 70℃에서의 잔류활성이 동일조건하에서 각각 95% 및 20% 임; (h) 억제 : 수은(Ⅱ) 또는 구리(Ⅱ)에 의해 억제됨; (i) 활성화 및 안정화 : 칼슘에 의해 안정화됨; (j) 분자량(SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동) : 36000±1000; (k) 등전점(크로마토포커싱) : 4.8±0.1의 물리적 특성을 갖는 시클로말토덱스트린 글루카노트랜스퍼라제.
바실루스 코아굴란스(Bacillus coagulans)에 속하는 시클로말토덱스틘 글루카노트랜스퍼라제 생산 미생물을 배양하고 수득된 배양 브로쓰로부터 시클로말토덱스트린 글루카노트랜스퍼라제를 수집함을 특징으로 하는 시클로말토덱스트린 글루카노트랜스퍼라제의 제조방법.
제2항에 있어서, 바실루스 코아굴란스에 속하는 시클로말토덱스트린 글루카노트랜스퍼라제 생산 미생물이 세균 FERM BP-2258인 제조방법.
제2항에 있어서, 배양을 30∼60℃에서 호기적으로 수행하는 제조방법.
제2항에 있어서, 배양을 위해 사용되는 배양액의 pH가 5.8∼7.5의 범위인 제조방법.