CN108220362B

CN108220362B - 一种利用环糊精水解酶制备特定聚合度麦芽低聚糖的方法

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Publication number: CN108220362B
Application number: CN201810186988.3A
Authority: CN
Inventors: 金征宇; 柏玉香; 纪杭燕; 李晓晓; 田耀旗; 焦爱权; 周星; 王金鹏; 赵建伟; 谢正军; 徐学明
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-03-07
Filing date: 2018-03-07
Publication date: 2021-07-16
Anticipated expiration: 2038-03-07
Also published as: CN108220362A

Abstract

一种利用环糊精水解酶制备特定聚合度麦芽低聚糖的方法，属于麦芽低聚糖生产技术领域。本发明采用环糊精水解酶催化水解底物环糊精，反应结束后通过酶灭活、脱盐和干燥，制得麦芽低聚糖。本发明采用新的环糊精水解酶对环糊精水解，制备得到特定聚合度的麦芽低聚糖，其制备过程简单环保，所生产的特定聚合度的麦芽低聚糖纯度高，在医学、食品、化学材料等领域应用广泛。

Description

一种利用环糊精水解酶制备特定聚合度麦芽低聚糖的方法

技术领域

本发明涉及一种利用环糊精水解酶制备特定聚合度麦芽低聚糖的方法，属于麦芽低聚糖生产技术领域。

背景技术

麦芽低聚糖主要是由2-10个葡聚糖以α-1,4键连接而成的直链麦芽低聚糖。麦芽低聚糖不仅对人的身体有着多种的有益功能，并且具有十分良好的食品加工适应性，因而在食品行业中，得到广泛的应用。麦芽低聚糖具有低糖度、粘度高及抗结晶性能等，可以替代蔗糖在食品中的应用，使食品获得更良好的感官和质构特性。此外，作为功能性低聚糖它还能促进人体对钙的吸收，抑制人体肠道有害菌的生长，促进有益菌的生长，对人体健康大有裨益。

目前麦芽低聚糖主要的应用是添加在食品中以改善食品的相关性质，如甜度、粘度、吸湿性、渗透性、稳定性、凝胶性以及人体的消化吸收性能等。然而，麦芽低聚糖的生产主要是以淀粉为底物，经酶解、转苷、纯化制备，所得产物也主要是不同聚合度的，从麦芽糖、麦芽三糖到麦芽八糖等的混合物。在改善食品的加工适应性和各类物理和生物性质中，常常需要精确定量，而混合的麦芽低聚糖则很难满足精准改善食品性质的需要。因此，这就需要在了解特定聚合度的麦芽低聚糖理化特性的同时，生产高纯度的麦芽低聚糖，以达到对食品特性的良好控制。此外，特定聚合度的麦芽低聚糖在医疗方面也有很重要的作用，如麦芽五糖可测定血液中的a-淀粉酶活性可以用于诊断疾病。

为了解决上述问题，科研工作者做了大量工作，其主要目的是集中于筛选高特异性的麦芽低聚糖生成酶，如麦芽三糖酶、麦芽四糖酶等。然而此法所得特定聚合度麦芽低聚糖纯度仍不高，且目前六糖、七糖、八糖生成酶还无较多报道。本发明的优势在于，突破以往技术手段，采用现已逐渐产业化的环糊精为底物，利用环糊精水解酶的开环水解作用，来制备高纯度的特定聚合度麦芽低聚糖。在避免了化学制备法的残留污染等问题的同时，为高纯度的特定聚合度麦芽低聚糖制备提供了新思路。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种利用环糊精水解酶制备特定聚合度麦芽低聚糖的方法，所提供的环糊精水解酶对环糊精有着高度的特异性。

本发明的另一个目的是提供一种新环糊精水解酶，该酶能耐受80℃及以上高温，适宜pH范围为5.0~8.0。此外，该酶对环糊精有着高度的特异性，而对可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉以及普鲁兰多糖等相对活性较弱等特性。

本发明的技术方案，一种利用环糊精水解酶制备特定聚合度麦芽低聚糖的方法，步骤为：采用环糊精水解酶催化水解底物环糊精，反应结束后通过酶灭活、脱盐和干燥，制得麦芽低聚糖。

所述环糊精水解酶的氨基酸序列具体如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列为SEQ IDNO.2所示。

所述底物环糊精主要包括以α-1,4键连接，含不同个数的α-D吡喃葡萄糖的环状糊精；底物环糊精聚合度为6-8。

所述底物环糊精具体为α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精。

所述麦芽低聚糖为麦芽六糖、麦芽七糖或麦芽八糖。

制备的具体步骤为：按照底物环糊精/溶液质量浓度为1%-50%(w/w)、pH为5.0-8.0配置底物环糊精的水溶液，按照环糊精水解酶/底物环糊精0.05 -100U/mg添加环糊精水解酶，在40-90℃、pH为5.0-8.0范围内水解反应0.5-48h；将酶灭活，脱盐，干燥，最终得到麦芽低聚糖。

所述酶灭活方法包括酸灭活，碱灭活或高温灭活；

所述酸灭活方式为添加反应总体积0.1%-10%(v/v)，浓度为0.1-5M的酸灭活，再添加等量的浓度为0.1-5M的碱中和至pH为5.0-8.0；

碱灭活方式为添加反应总体积0.1%-10%(v/v)，浓度为0.1-5M的碱灭活，再添加等量的浓度为0.1-5M的酸中和至PH为5.0-8.0；

高温灭活方式为将温度升到100-120℃，保温15-120min。

所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或氢氧化铵；所述酸为盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、高氯酸或甲酸。

所述脱盐方式为透析脱盐或脱盐柱脱盐。

所述干燥方法包括冷冻干燥、常压干燥、减压干燥或喷雾干燥。

本发明的有益效果：本发明采用新的环糊精水解酶对环糊精水解，制备得到特定聚合度的麦芽低聚糖，其制备过程简单环保，所生产的特定聚合度的麦芽低聚糖纯度高，在医学、食品、化学材料等领域应用广泛。

附图说明

图1是实施例1中环糊精水解酶的底物特异性实验结果。

图2-a是实施例3中麦芽七糖产品的HPAEC-PAD图谱。

图2-b是实施例3中麦芽七糖产品的TLC图谱。

其中，G1-G7分别代表葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和麦芽七糖。

具体实施方式

以下实施例中环糊精水解酶经过设计后，由北京六合华大基因科技有限公司合成。

实施例1环糊精水解酶的底物特异性证明实验

分别配置pH=6，质量浓度为1%的α-CD、β- CD、γ- CD、可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉和普鲁兰多糖为底物，分别各取450μL底物，各加入5U环糊精水解酶，用缓冲液定容至500μL，在最适条件下反应10min，用DNS法分别测定对不同底物的酶反应活性，最终结果如图1所示。

从图1可知环糊精水解酶对环糊精水解有着高度的特异性，且水解作用为α-CD>β-CD>γ-CD。

该酶对可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉和普鲁兰多糖水解作用微弱，其中对可溶性淀粉、支链淀粉和普鲁兰多糖几乎无作用，而对直链淀粉有着微弱的水解作用。

实施例2

本实施例以麦芽六糖的制备举例说明上述方法制备特定聚合度的麦芽低聚糖。

配置质量浓度为100mg/g的pH=5的α-CD溶液30mL为底物，加入30U的环糊精水解酶，在60℃条件下反应8h，反应结束用反应液体积2%、5M的盐酸将酶灭活，随后采用等量的5M的NaOH进行中和；脱盐柱脱盐；最后将产物-80℃下冻干24h，最终得到高纯度的麦芽六糖产品。

实施例3

本实施例以麦芽七糖的制备举例说明上述方法制备特定聚合度的麦芽低聚糖。

配置质量浓度为30mg/g的pH=7的β-CD溶液30mL为底物，加入50U的环糊精水解酶，在40℃条件下反应24h，反应结束后用反应液体积5%、0.4M的KOH将酶灭活，随后采用等量的0.4M的硫酸进行中和；脱盐柱脱盐；最后将产物置于60℃，真空干燥48h。

将产品粉末复溶后，采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法（HPAEC-PAD）测定样品的组分与含量，如图2-a所示，麦芽七糖产品的TLC图谱如图2-b所示，产品中主产物为麦芽七糖。

实施例4

本实施例以麦芽八糖的制备举例说明上述方法制备特定聚合度的麦芽低聚糖。

配置质量浓度为200mg/g的pH=8的γ-CD溶液30mL为底物，加入80U的环糊精水解酶，在90℃条件下反应2h，反应结束后采用高温煮沸60min，将酶灭活；透析脱盐；最后将产物置于40℃下，热风干燥72h，最终得到高纯度的麦芽八糖产品。

虽然本发明以巳实施例公开如上，但并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种利用环糊精水解酶制备特定聚合度麦芽低聚糖的方法

<141> 2018-03-07

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 665

<212> PRT

<213> 环糊精水解酶氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 1

Met Tyr Lys Ile Phe Gly Phe Arg Asp Asp Lys Tyr Leu Gly Arg Val

1 5 10 15

Gly Glu Val Glu Phe Ser Ile Pro Lys Glu Gly Arg Tyr Ala Tyr Leu

20 25 30

Leu Gly Asn Phe Asn Ala Phe Asn Glu Gly Ser Phe Arg Met Arg Glu

35 40 45

Asp Gly Asp Arg Trp Arg Ile Arg Val Glu Leu Pro Glu Gly Ile Trp

50 55 60

Tyr Tyr Leu Phe Ser Ile Glu Gly Glu Ile Ser Leu Asp Ser Glu Asn

65 70 75 80

His Val Thr Ala Leu Tyr Lys Arg Arg Ala Tyr Asp Phe Glu Lys Lys

85 90 95

Val Ser Val Ala Glu Val Leu Ser Phe Asp Leu Asn Asp Trp Glu Lys

100 105 110

Ala Leu Tyr His His Pro Ser Leu Val Tyr Ala Tyr Pro Phe Glu Asp

115 120 125

Trp Ile Phe Ile Arg Leu Arg Thr Leu Arg Asp Ser Val Asp Ala Val

130 135 140

Asn Leu Leu Leu Glu Asp Asp Arg Thr His Met Lys Arg Lys Ala His

145 150 155 160

Asp Asp Val Phe Asp Tyr Tyr Glu Ala Thr Leu Pro Tyr Ser Glu Glu

165 170 175

Leu Ser Tyr Ser Phe Glu Val Val Lys Asn Gly Glu Lys Val Tyr Tyr

180 185 190

Gly Asp Phe Asp Val Asp Phe Arg Glu Leu Glu Lys Leu Tyr Glu Leu

195 200 205

Pro Lys Trp Val Leu Thr Arg Val Phe Tyr Gln Ile Met Pro Asp Arg

210 215 220

Phe Ala Asn Gly Asn Pro Asn Asn Asp Pro Asn Asp Arg Asp Ile Ile

225 230 235 240

Gly Asn Lys Trp Ala Ser His Phe Gly Gly Asp Leu Glu Gly Ile Thr

245 250 255

Gln Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Ser Leu Gly Val Asn Ala Leu Tyr Leu

260 265 270

Thr Pro Ile Phe Glu Ser Arg Thr Tyr His Ser Tyr Asp Val Glu Asp

275 280 285

Tyr Phe His Val Ala Lys Lys Phe Gly Gly Asp Ser Ala Leu Lys Gln

290 295 300

Leu Val Glu Lys Ala Gly Glu Leu Asp Ile Arg Leu Ile Leu Asp Gly

305 310 315 320

Val Phe His His Thr Ser Phe Phe His Pro Tyr Phe Gln Asp Val Leu

325 330 335

Glu Asn Gly Glu Asn Ser Lys Tyr Lys Asp Phe Tyr Arg Ile Leu Gly

340 345 350

Phe Pro Val Val Ser Glu Glu Phe Leu Lys Val Leu His Ser Asn Met

355 360 365

Ser Trp Ile Glu Lys Ser Lys Ala Leu Lys Arg Ile Pro Lys Asn Tyr

370 375 380

Glu Thr Phe Phe Gly Val Trp Leu Met Pro Arg Leu Asn His Asp Ser

385 390 395 400

Gly Lys Val Arg Glu Leu Ile Val Asn Val Gly Lys Tyr Trp Val Glu

405 410 415

Arg Phe Gly Ile Ser Gly Trp Arg Leu Asp Val Ala Ser Gly Val Pro

420 425 430

Ile Asp Val Trp Glu Thr Phe Lys Asp Ser Leu Pro Asn Glu Val Tyr

435 440 445

Leu Ile Gly Glu Ile Met Asp Asp Ala Arg Leu Trp Leu Phe Asn Lys

450 455 460

Phe His Gly Val Met Asn Tyr Leu Leu Tyr Asp Ala Leu Leu Arg Phe

465 470 475 480

Phe Val Tyr Gln Glu Ile Ser Ala Gln Glu Phe Leu Asn Trp Leu Glu

485 490 495

Leu Leu Ser Val Tyr Tyr Gly Lys Ala Glu Tyr Ala Met Tyr Asn Phe

500 505 510

Leu Asp Asn His Asp Met Ser Arg Phe Leu Gly Leu Val Lys Asn Lys

515 520 525

Gln Lys Tyr Lys Cys Ala Leu Ala Phe Ile Phe Thr Tyr Lys Gly Ile

530 535 540

Pro Ser Ile Phe Tyr Gly Asp Glu Val Gly Leu Lys Gly Val Arg Glu

545 550 555 560

His Trp Ile Glu Thr Gln Arg Glu Glu Met Pro Trp Asp Glu Lys Arg

565 570 575

Trp Asp Lys Glu Leu Leu Glu Leu Thr Arg Glu Leu Ile Lys Leu Arg

580 585 590

Gln Lys Ser Gln Ala Leu Gln Val Gly His Phe Ile Pro Ile Ile Phe

595 600 605

Glu Asp Gly Leu Leu Val Tyr Lys Arg Thr Phe Arg Asp Glu Asn Ile

610 615 620

Phe Val Ala Ile Asn Tyr Ser Gln Lys Arg Ala Arg Leu Glu Gln Leu

625 630 635 640

Lys Glu Tyr Glu Val Leu Leu Gly Gln Phe Asp Gly Lys Tyr Leu Glu

645 650 655

Pro Phe Ser Phe Phe Ile Ala Ser Leu

660 665

<210> 2

<211> 1998

<212> DNA

<213> 环糊精水解酶核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)

<400> 2

atgtataaaa ttttcggctt tagagatgat aagtatcttg gaagagttgg agaagtggaa 60

ttcagcattc caaaagaggg gagatatgca tatttattag ggaacttcaa cgctttcaat 120

gagggcagtt ttagaatgag agaagatgga gataggtgga gaattagagt tgaactgccg 180

gagggcatct ggtattacct gttttcaata gaaggagaaa tctctttgga ctccgaaaac 240

catgtaacgg ctttgtacaa gcggagagcg tatgattttg agaagaaagt tagcgttgca 300

gaggttctaa gctttgatct gaatgactgg gagaaagctc tttaccatca tccgtctcta 360

gtttacgcat atccctttga ggattggatt tttataaggc ttaggacatt gagggatagt 420

gtagatgctg ttaacctcct tcttgaggat gatagaactc acatgaaaag gaaagcccat 480

gatgatgtat ttgattacta tgaagctact cttccctact cggaagagct ctcttatagt 540

tttgaagtag ttaaaaacgg agagaaggtt tactacggcg actttgatgt ggattttagg 600

gagcttgaga agctctatga acttcctaaa tgggtgctta caagggtctt ttatcaaata 660

atgcctgacc gctttgctaa tggaaatcca aacaacgatc caaatgatag agacatcatt 720

ggtaacaaat gggcttcaca cttcggtggt gatttggagg ggataaccca aaaattagac 780

tatctaaaat ctttaggagt aaacgccctc tatttgactc caatttttga gtcgagaacg 840

tatcacagtt atgatgtcga ggactacttt catgttgcta aaaaattcgg gggagatagc 900

gctctaaaac agctcgttga aaaagctgga gaacttgaca taaggcttat tttagacggt 960

gtttttcacc ataccagctt tttccacccg tacttccaag atgtcttgga gaacggtgaa 1020

aactctaagt acaaggattt ttacaggatt ttaggattcc ctgttgtttc agaggagttt 1080

ttgaaggtat tacattcgaa tatgtcttgg atagaaaaat caaaagcttt aaagaggata 1140

cctaaaaact acgagacctt ctttggtgta tggctcatgc ctaggttaaa tcacgacagc 1200

gggaaagtta gagagctaat tgttaatgtt ggtaagtatt gggtggagcg ttttggaata 1260

agcgggtggc ggttagatgt tgccagcggc gtccctattg atgtctggga gacatttaaa 1320

gacagcctgc cgaatgaggt ttatttaatc ggtgaaatca tggatgatgc ccgtttgtgg 1380

ctctttaata agttccacgg tgttatgaac tacttgcttt atgacgccct cctaagattt 1440

tttgtttatc aggaaatcag tgcccaagag ttcctgaact ggcttgagct tctaagcgtg 1500

tattatggaa aagcagagta tgccatgtac aactttttag acaaccacga tatgagcagg 1560

tttttgggct tagtgaaaaa caagcaaaag tacaagtgtg cattggcttt tatcttcaca 1620

tataagggca ttccttccat attctacggg gatgaagtgg gtcttaaggg ggttagggag 1680

cactggatcg agacccagag agaggagatg ccgtgggatg agaaacgttg ggacaaagag 1740

ctcttagagc ttactagaga gcttataaaa ttgaggcaaa aaagtcaagc tttacaggtt 1800

gggcacttta tacccataat ttttgaagat gggcttttag tgtataagcg cacatttagg 1860

gatgaaaata tcttcgttgc aataaactac tctcaaaaaa gagctaggtt ggagcagtta 1920

aaggaatatg aggttttact tgggcaattt gatggtaaat acttagaacc attttccttt 1980

tttattgctt ctctgtga 1998

Claims

1.一种利用环糊精水解酶制备特定聚合度麦芽低聚糖的方法，其特征在于步骤为：采用环糊精水解酶催化水解底物环糊精，反应结束后通过酶灭活、脱盐和干燥，制得麦芽低聚糖；具体步骤为：按照配置质量浓度为30mg/g的pH=7的β-CD溶液30mL为底物，加入50U的环糊精水解酶，在40℃条件下反应24h；随后将酶灭活，脱盐，干燥，最终得到麦芽七糖；

所述环糊精水解酶的氨基酸序列具体如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；

所述底物环糊精具体为α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精；包括以α-1,4键连接，含不同个数的α-D吡喃葡萄糖的环状糊精；底物环糊精聚合度为7。

2.根据权利要求1所述利用环糊精水解酶制备特定聚合度麦芽低聚糖的方法，其特征在于具体步骤为：配置质量浓度为30mg/g的pH=7的β-CD溶液30mL为底物，加入50U的环糊精水解酶，在40℃条件下反应24h，反应结束后用反应液体积5%、0.4M的KOH将酶灭活，随后采用等量的0.4M的硫酸进行中和；脱盐柱脱盐；最后将产物置于60℃，真空干燥48h，产品中主产物为麦芽七糖。

3.根据权利要求1所述利用环糊精水解酶制备特定聚合度麦芽低聚糖的方法，其特征在于：所述酶灭活方法包括酸灭活，碱灭活或高温灭活；

所述酸灭活方式为添加反应总体积0.1%-10% v/v，浓度为0.1-5M的酸灭活，再添加等量的浓度为0.1-5M的碱中和至pH为5.0-8.0；

碱灭活方式为添加反应总体积0.1%-10% v/v，浓度为0.1-5M的碱灭活，再添加等量的浓度为0.1-5M的酸中和至pH为5.0-8.0；

高温灭活方式为将温度升到100-120℃，保温15-120min。

4.根据权利要求3所述利用环糊精水解酶制备特定聚合度麦芽低聚糖的方法，其特征在于：所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或氢氧化铵；所述酸为盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、高氯酸或甲酸。

5.根据权利要求1所述利用环糊精水解酶制备特定聚合度麦芽低聚糖的方法，其特征在于：所述脱盐方式为透析脱盐或脱盐柱脱盐。

6.根据权利要求1所述利用环糊精水解酶制备特定聚合度麦芽低聚糖的方法，其特征在于：所述干燥方法包括冷冻干燥、常压干燥、减压干燥或喷雾干燥。