CN102510900A

CN102510900A - 麦芽三糖基转移酶及其制备方法和用途

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Publication number: CN102510900A
Application number: CN2010800293356A
Authority: CN
Inventors: 冈田正通; 山口庄太郎; 长屋美穗
Original assignee: Amano Enzyme Inc
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 2009-07-01
Filing date: 2010-03-20
Publication date: 2012-06-20
Anticipated expiration: 2030-03-20
Also published as: CN102510900B; US8546111B2; CA2766018A1; EP2450435B1; WO2011001722A1; KR20120103545A; EP2450435A4; JPWO2011001722A1; EP2450435A1; JP5762958B2; JP6115921B2; US20120100253A1; JP2015156861A; BRPI1014606A2; US8765434B2; US20140011257A1; US20140004226A1; DK2450435T3

Abstract

本发明的目的在于提供一种新型的糖基转移酶及其用途，其在可用于食品加工等中的条件下催化麦芽三糖单元的糖基转移反应。本发明提供一种麦芽三糖基转移酶，其具有作用于具有α-1，4糖苷键的多糖类和低聚糖类而使麦芽三糖单元转移至糖类的活性，在使之对作为底物的麦芽四糖进行作用时，在底物浓度为0.67％(w/v)～70％(w/v)的整个范围中，麦芽七糖生成速度与麦芽三糖生成速度之比成为9∶1～10∶0。

Description

麦芽三糖基转移酶及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及麦芽三糖基转移酶及其用途。更详细而言，涉及新型麦芽三糖基转移酶及其制备方法、该酶在食品制备·加工中的使用、产生该酶的微生物等。本申请主张基于2009年7月1日提出申请的日本专利申请第2009-156569号的优先权，通过参照而援引该专利申请的所有内容。

背景技术

目前，作为麦芽三糖生成淀粉酶，已知来源于蛾微杆菌(Microbacterium imperiale)的酶、来源于灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)的酶、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的酶、来源于嗜盐碱球菌(Natronococcus sp.)的酶、来源于波比斯链球菌(Streptococcusbovis)的酶(非专利文献1)。然而，其中对糖基转移反应进行报道的酶仅为来源于灰色链霉菌的酶。而且，该酶只有在高底物浓度条件下(给予体底物和受体底物的总计为19％、40％(w/v))才催化糖基转移反应，在低底物浓度(1％(w/v))下只催化水解反应，而不催化糖基转移反应(非专利文献2、3)。此外，由于耐热性也低，所以未被用作食品加工用酶。

另一方面，作为在产业上被利用的糖基转移酶，作为例子可举出例如在制备异麦芽低聚糖或制备黑曲霉低聚糖中使用的α-葡萄糖苷酶、在制备低聚果糖或制备半乳糖苷蔗糖中使用的β-呋喃果糖苷酶、在制备低聚半乳糖中使用的β-半乳糖苷酶、在制备帕拉金糖中使用的α-糖基转移酶、在制备环糊精或制备偶联糖中使用的环糊精葡萄糖基转移酶、在制备高度支化环糊精中使用的分支酶。其中，作为作用于包含α-1，4键的多糖、低聚糖而催化糖基转移反应的酶可举出α-葡萄糖苷酶、分支酶。然而，α-葡萄糖苷酶催化单糖的糖基转移反应，分支酶催化4糖以上的低聚糖或多糖的糖基转移反应，而并不知晓特异性地使作为3糖类的麦芽三糖进行糖基转移的酶。

在包含淀粉的加工食品中，淀粉的老化带来保存性下降等而成为严重的问题。其原因的大部分起因于淀粉中所含直链淀粉分子的老化，即直链淀粉分子的集聚、由此引起的不溶化(非专利文献4)。因此，进行通过使淀粉低分子化而抑制老化的研究，可在一定程度上抑制老化。然而，因低分子化而产生失去原来淀粉具有的性质这样的问题。进而，在这些方法中，分解导致还原力增加，从而当与蛋白质、氨基酸等混合加热时，通过与这些物质进行反应而导致淀粉着色，因此其用途受到限制(专利文献1)。因此，在进行不使这些淀粉低分子化地抑制老化的研究。例如，在研究作为将淀粉的α-1，4键进行分解而利用转移反应合成α-1，6键的酶的分支酶，但其存在耐热性低等问题而尚未被用作食品加工用酶。

专利文献

专利文献1：日本特开2001-294601号公报

非专利文献

非专利文献1：“淀粉科学事典”，朝仓书店，p.279-80(2003)

非专利文献2：若生等，淀粉科学，25(2)，p.155-61(1978)

非专利文献3：Usui等，Carbohydr.Res.250，57-66(1993)

非专利文献4：冈田等，淀粉科学，30(2)，p.223-230(1983)

非专利文献5：Saito，and Miura.Biochim.Biophys.Acta，72，619-629(1963)

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的糖基转移酶及其用途，其在可用于食品加工等中的条件下催化麦芽三糖单元的糖基转移反应。

本发明人等为了解决上述课题反复进行了深入的研究。其结果发现属于土芽胞杆菌(Geobacillus)属的微生物生产具有所需作用的麦芽三糖基转移酶。此外，本发明人等还成功地将该麦芽三糖基转移酶进行分离、纯化，确定其酶化学性质，并对编码该酶的基因(以下称为“本基因”)进行克隆。此外，通过将本基因及本基因的片段导入适当的宿主而确立麦芽三糖基转移酶的制备方法。本发明是基于上述成果完成的，如下所示：

[1]一种麦芽三糖基转移酶，其具有作用于具有α-1，4糖苷键的多糖类和低聚糖类而使麦芽三糖单元转移至糖类的活性，在使该酶对作为底物的麦芽四糖进行作用时，在底物浓度为0.67％(w/v)～70％(w/v)的整个范围中，麦芽七糖生成速度与麦芽三糖生成速度之比成为9∶1～10∶0。

[2]如[1]所述的麦芽三糖基转移酶，其中，麦芽三糖基转移酶为来源于微生物的酶。

[3]如[1]所述的麦芽三糖基转移酶，其中，麦芽三糖基转移酶为来源于土芽孢杆菌属微生物的酶。

[4]如[3]所述的麦芽三糖基转移酶，其中，土芽孢杆菌属微生物为土芽孢杆菌(Geobacillus SP.)APC9669(保藏号NITE BP-770)。

[5]一种麦芽三糖基转移酶，具备下述酶化学性质：

(1)作用：作用于具有α-1，4糖苷键作为键合方式的多糖类及低聚糖类而使麦芽三糖单元转移至糖类；

(2)底物特异性：作用于可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖，而不作用于α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、麦芽三糖、麦芽糖；

(3)分子量：约83000(SDS-PAGE)。

[6]一种酶制剂，以[1]～[5]中任一项所述的麦芽三糖基转移酶为有效成分。

[7]一种具有麦芽三糖基转移酶产生能力的微生物，是土芽孢杆菌(Geobacillus SP.)APC9669(保藏号NITE BP-770)或其突变体。

[8]一种麦芽三糖基转移酶，由序列号8的氨基酸序列、或显示麦芽三糖基转移酶活性的片段所构成。

[9]如[8]所述的麦芽三糖基转移酶，其中，由包含序列号6的序列的DNA所编码。

[10]一种麦芽三糖基转移酶，由选自以下(a)～(e)中的任一种DNA所所构成：

(a)编码序列号7或8的氨基酸序列的DNA；

(b)包含序列号6的序列的DNA；

(c)对于与序列号6的序列互补的序列在严谨性条件下进行杂交的DNA；

(d)作为序列号6的序列的DNA序列简并物的DNA；

(e)由以序列号6的序列为基准而包含1个或多个碱基的取代、缺失、插入、添加或倒位的序列所构成的、编码具有麦芽三糖基转移酶活性的蛋白质的DNA。

[11]一种重组载体，包含[10]所述的麦芽三糖基转移酶基因。

[12]如[11]所述的重组载体，其中，所述重组载体是表达载体。

[13]一种转化体，导入有[10]所述的麦芽三糖基转移酶基因。

[14]一种转化体，导入有[11]或[12]所述的重组载体。

[15]如[13]或[14]所述的转化体，其中，所述转化体是细菌细胞、酵母细胞或真菌细胞。

[16]一种麦芽三糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤(1)和(2)、或步骤(i)和(ii)：

(1)培养具有麦芽三糖基转移酶产生能力的土芽孢杆菌属微生物的步骤，

(2)从培养后的培养液和/或菌体回收麦芽三糖基转移酶的步骤；

(i)将[13]～[15]中任一项所述的转化体在产生上述麦芽三糖基转移酶基因编码的蛋白质的条件下进行培养的步骤，

(ii)回收所产生的上述蛋白质的步骤。

[17]如[16]所述的制备方法，其中，土芽孢杆菌属微生物为土芽孢杆菌(Geobacillus SP.)APC9669。

[18][1]～[5]中任一项所述的酶或[6]所述的酶制剂的使用，用于制备、加工包含具有α-1，4糖苷键的多糖类或低聚糖类的食品。

[19]一种食品或食品材料，通过使用[1]～[5]中任一项所述的酶或[6]所述的酶制剂而功能性得到改善。

附图说明

图1是示出来源于土芽孢杆菌(Geobacillus SP.)APC9669的麦芽三糖基转移酶的最适温度的图表。

图2是示出来源于土芽孢杆菌APC9669的麦芽三糖基转移酶的最适pH的图表。

图3是示出来源于土芽孢杆菌APC9669的麦芽三糖基转移酶的温度稳定性的图表。

图4是示出来源于土芽孢杆菌APC9669的麦芽三糖基转移酶的pH稳定性的图表。

图5是示出麦芽三糖基转移酶的SDS-PAGE结果的图。泳道1：分子量标记，泳道2：麦芽三糖基转移酶。

图6是示出面包柔软性维持效果的实验结果的图。

图7是示出大肠杆菌转化体的细胞破碎物的离心上清的SDS-PAGE结果的图。泳道M：分子量标记，泳道1：大肠杆菌载体转化体的细胞破碎物的离心上清，泳道2：麦芽三糖基转移酶。

具体实施方式

(术语)

在本发明中，所谓“编码蛋白质的DNA”是指在使其表达时得到该蛋白质的DNA，即，是指具有与该蛋白质的氨基酸序列对应的碱基序列的DNA。因此也考虑密码子的简并。

在本说明书中，术语“分离的”可与“纯化的”交换使用。在用于本发明的酶(麦芽三糖基转移酶)时，“分离的”是指当本发明的酶是来源于天然材料的情况下，在该天然材料中基本不含该酶以外的成分(尤其是基本不含杂蛋白质)的状态。具体而言，例如在本发明的分离的酶中，以重量换算，杂蛋白质的含有量大约小于整体的20％，优选大约小于10％，更优选大约小于5％，进一步优选大约小于1％。另一方面，当本发明的酶是通过基因工程学方法调制而得的情况下，术语“分离的”是指，基本不含来源于所使用的宿主细胞的其它成分、培养液等的状态。具体而言，例如本发明的分离的酶中，以重量换算，杂成分的含有量大约小于整体的20％，优选大约小于10％，更优选大约小于5％，进一步优选大约小于1％。应予说明，只要不是明显表示与其不同的意思，在本说明书中简单地记载“麦芽三糖基转移酶”的情况下，其是指“分离状态的麦芽三糖基转移酶”。对用于代替麦芽三糖基转移酶的术语“本酶”也同样。

在用于DNA时的“分离的”在本来天然存在的DNA的情况下典型地是指从在天然状态下共存的其它核酸中分离的状态。但是，可以包含在天然状态下邻接的核酸序列(例如启动子区域的序列、终止子序列等)等的一部分其它核酸成分。例如在基因组DNA时的“分离的”状态下，优选基本不含在天然状态下共存的其它DNA成分。另一方面，在cDNA分子等通过基因工程学方法调制而得的DNA时的“分离的”状态下，优选基本不含细胞成分、培养液等。同样地，通过化学合成调制而得的DNA时的“分离的”状态下，优选基本不含dNTP等前体(原材料)、合成过程中使用的化学物质等。应予说明，只要不是明显表示与其不同的意思，在本说明书中简单地记载“DNA”的情况下，其是指分离状态的DNA。

(麦芽三糖基转移酶及其生产菌)

本发明的第1方面是提供麦芽三糖基转移酶(以下也称为“本酶”)及其生产菌。如后述的实施例所示，本发明人等深入研究的结果发现土芽孢杆菌(Geobacillus SP.)APC9669产生麦芽三糖基转移酶。此外，成功地分离、生成该麦芽三糖基转移酶，并且如下所示，成功地确定其酶化学性质。

(1)作用

本酶是麦芽三糖基转移酶，作用于具有α-1，4糖苷键作为键合方式的多糖类及低聚糖类，而使麦芽三糖单元转移至糖类。

(2)底物特异性

本酶对可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖良好地进行作用。与此相对，对α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、麦芽三糖、麦芽糖不进行作用。

(3)分子量

本酶的分子量约为83000(根据SDS-PAGE)。

(4)最适温度

本酶的最适温度为约50℃。本酶在约45℃～约55℃下显示高活性。最适温度是利用后述的麦芽三糖基转移酶活性测定方法(10mmol/LMES缓冲液(pH6.5)中)进行测定而算出的值。

(5)最适pH

本酶的最适pH为约7.5。本酶在pH为约6.5～约8.0下显示高活性。最适pH例如是基于在通用缓冲液中测定的结果进行判断的。

(6)温度稳定性

本酶在65℃以下的条件下显示稳定的活性。即使在10mmol/LMES缓冲液(pH6.5)中、65℃的条件下进行30分钟处理后，本酶也维持90％以上的活性。

(7)pH稳定性

本酶在pH5.0～10.0这样宽的pH域中显示稳定的活性。即，只要供以处理的酶溶液的pH在该范围内，则在40℃、30分钟的处理后也维持85％以上的活性。

(8)等电点

本酶的等电点为约4.5(根据含两性电解质的电泳法)。

应予说明，如后述实施例所示，可知土芽孢杆菌(Geobacillus SP.)APC9669所产生的麦芽三糖基转移酶在使之对作为底物的麦芽四糖进行作用时，在底物浓度为0.67％(w/v)～70％(w/v)的整个范围中，作为糖基转移产物的麦芽七糖的生成速度和作为分解产物的麦芽三糖的生成速度之比为9∶1～10∶0。换言之，在广泛的底物浓度范围中糖基转移反应的速度压倒性地大，若将麦芽七糖生成速度和麦芽三糖生成速度的总计设为100％，则前者成为90％以上。应予说明，以产物的摩尔比为基准，对速度进行比较。

如上所述，明确了成功取得的本酶的性状的详细情况。其结果可知本酶的耐热性优异、底物特异性优异。因此，本酶适于食品加工用途。

本酶优选为来源于土芽孢杆菌APC9669(Geobacillus sp.APC9669)的麦芽三糖基转移酶。在此的“来源于土芽孢杆菌APC9669的麦芽三糖基转移酶”是指土芽孢杆菌APC9669(野生株和突变体均可)所生产的麦芽三糖基转移酶、或利用土芽孢杆菌APC9669(野生株和突变体均可)的麦芽三糖基转移酶基因而通过基因工程学方法得到的麦芽三糖基转移酶。因此，利用将从土芽孢杆菌APC9669取得的麦芽三糖基转移酶基因(或将该基因进行改变而得的基因)进行导入而得的宿主微生物所生产的重组体也符合“来源于土芽孢杆菌APC9669的麦芽三糖基转移酶”。

为了方便说明，将作为来源于本酶的土芽孢杆菌APC9669称为本酶的生产菌。如下所述，APC9669株保藏于规定的保藏机构，可容易地取得。

保藏机构：独立行政法人制品评价技术基础机构(NITE)专利微生物保藏中心(292-0818，日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8)

保藏日(受理日)：2009年6月2日

保藏号：NITE BP-770

本发明的麦芽三糖基转移酶在一个方式中包含序列号8的氨基酸序列。该氨基酸序列是从序列号7的氨基酸序列去除信号肽部分而成的。应予说明，序列号7的氨基酸序列是对从土芽孢杆菌APC9669克隆而得的基因的碱基序列(序列号6)进行推定而得的氨基酸序列。在此，通常存在对某蛋白质的氨基酸序列的一部分实施改变时，改变后的蛋白质与改变前的蛋白质具有同等功能的情况。即，存在氨基酸序列的改变对蛋白质的功能没有给与实质性影响，蛋白质的功能在改变前后得以维持的情况。因此，本发明作为其它方式提供由与序列号8所示的氨基酸序列等效的氨基酸序列所构成的、具有麦芽三糖基转移酶活性的蛋白质(以下也称为“等效蛋白质”)。在此的“等效氨基酸序列”是指与序列号8所示氨基酸序列一部分不同，但该不同对蛋白质的功能(在此为麦芽三糖基转移酶活性)没有给与实质性影响的氨基酸序列。“具有麦芽三糖基转移酶活性”是指作用于具有α-1，4糖苷键作为键合方式的多糖类及低聚糖类而使麦芽三糖单元转移至糖类的活性，其活性程度只要是能够发挥作为麦芽三糖基转移酶的功能就没有受到特别限定。但优选与由序列号8所示氨基酸序列构成的蛋白质相同程度或比其还高。

“氨基酸序列的一部分不同”典型地是指利用构成氨基酸序列的1个～数个(上限例如为3个、5个、7个、10个)氨基酸的缺失、取代，或1个～数个(上限例如为3个、5个、7个、10个)的氨基酸的添加、插入或其组合而使氨基酸序列产生突变(变化)的情况。在此的氨基酸序列的不同只要是保持麦芽三糖基转移酶的活性就被允许(活性多少可以有变动)。只要满足此条件，氨基酸序列不同的位置就没有受到特别限定，此外还可以在多个位置上产生不同。在此的多个例如是指相当于约小于总氨基酸的30％的数目，优选为相当于约小于20％的数目，更优选为相当于约小于10％的数目，进一步优选为相当于约小于5％的数目，最优选为相当于约小于1％的数目。即，等效蛋白质与序列号8的氨基酸序列例如具有约70％以上、优选约80％以上、更优选约90％以上、进一步优选约95％以上、最优选约99％以上的同源性。

优选通过使保守性氨基酸取代产生在对麦芽三糖基转移酶活性不是必需的氨基酸残基中而获得等效蛋白。在此的“保守性氨基酸取代”是指将某氨基酸残基取代为具有同样性质的侧链的氨基酸残基。氨基酸残基根据其侧链被分为碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天门冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)这几种类别。保守性氨基酸取代优选为同一类别内的氨基酸残基间的取代。

“等效蛋白质”可以具有附加的性质。作为所述性质，例如可举出与由序列号8所示氨基酸序列构成的蛋白质相比稳定性优异这样的性质、只有在低温和/或高温时才发挥不同功能这样的性质、最适pH不同这样的性质等。

在此，两个氨基酸序列的同源性(％)可例如通过如下顺序来确定。首先，以可进行最适比较的方式将两个序列进行排列(例如，可以向第一序列导入空位而使与第二序列的序列的比对达到最造化)。当第一序列的特定位置的分子(氨基酸残基)与第二序列中对应位置的分子相同时可以说该位置的分子相同。序列同源性是该两个序列中共同的相同位置的数目的函数(即，同源性(％)＝相同位置的数目/位置的总数×100)，优选将在比对的最适化中所需要的空位的数目及尺寸也纳入考虑。两个序列的比较及同源性的确定可使用数学算法来实现。作为在序列比较中可利用的数学算法的具体例，有Karlin及Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68中记载的、在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77中进行了改变的算法，但并不限定于此。这种算法已被编入Altschul等在(1990)J.Mol.Biol.215：403-10中记载的NBLAST程序及XBLAST程序(版本2.0)。例如，如果在XBLAST程序中以score＝50、wordlength＝3进行BLAST多肽检索，则可以得到同源性高的氨基酸序列。为了获得用于比较的空位比对，可以利用在Altschul等(1997)Amino Acids Research 25(17)：3389-3402中记载的Gapped BLAST。在利用BLAST及GappedBLAST时，可以使用对应程序(例如XBLAST及NBLAST)的缺省参数。详细而言例如请参考NCBI的网页。作为可用于序列比较中的其它数学算法的示例，有Myers及Miller(1988)Comput Appl Biosci.4：11-17中记载的算法。这种算法例如已被编入可在GENESTREAM网络服务器(IGH Montpellier，法国)或ISREC服务器中利用的ALIGN程序中。在氨基酸序列的比较中使用ALIGN程序时，例如可使用PAM120残基质量表，使空位长罚分＝12、空位罚分＝4。两个氨基酸序列的同源性可如下确定：用GCG软件包的GAP程序，使用Blossom62矩阵或PAM250矩阵，使空位加权＝12、10、8、6或4，使空位长加权＝2、3或4。

本酶可以是更大的蛋白质(例如融合蛋白质)的一部分。作为在融合蛋白质中所添加的序列，例如可举出多重组氨酸残基之类的对纯化有用的序列、确保重组生产时的稳定性的附加序列等。

具有上述氨基酸序列的本酶可通过基因工程学方法容易地进行调制。例如，可用编码本酶的DNA将适当的宿主细胞(例如大肠杆菌)进行转化，回收在转化体内表达的蛋白质，从而进行调制。对回收的蛋白质可根据目的而进行适当调制。如果由此得到本酶作为重组蛋白质，则可进行各种修饰。例如，如果将编码本酶的DNA和其它适当的DNA插入同一载体而使用该载体进行重组蛋白质的生产，则能得到由连接有任意的肽乃至蛋白质的重组蛋白质所构成的本酶。此外，可以实施产生糖链和/或脂质的添加、或N末端或C末端加工之类的修饰。通过如上修饰可提取重组蛋白质、使纯化简化、或添加生物学功能等。

(麦芽三糖基转移酶基因)

本发明的第2方面涉及麦芽三糖基转移酶基因。在一个方式中，本发明的基因包含编码序列号7或8的氨基酸序列的DNA。该方式的具体例是由序列号6的碱基序列所构成的DNA。

但是，通常存在对编码某蛋白质的DNA的一部分实施改变时，改变后的DNA编码的蛋白质与改变前的DNA编码的蛋白质具有同等功能的情况。即，DNA序列的改变对所编码的蛋白质的功能没有给与实质性的影响，所编码的蛋白质的功能在改变前后得以维持的情况。因此，本发明作为其它方式提供具有与序列号6的碱基序列等效的碱基序列的、编码具有麦芽三糖基转移酶活性的蛋白质的DNA(以下，也称为“等效DNA”)。在此的“等效碱基序列”是指虽然与序列号6所示的核酸一部分不同，但不会因该不同而使其编码的蛋白质的功能(在此为麦芽三糖基转移酶活性)受到实质性影响的碱基序列。

等效DNA的具体例是对与序列号6的碱基序列互补的碱基序列在严谨性条件下进行杂交的DNA。在此的“严谨性条件”是指形成所谓特异性杂交而不形成非特异性杂交的条件。这种严谨型条件为本领域技术人员所公知，例如可参考Molecular Cloning(Third Edition，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York)、Current protocols in molecularbiology(edited by Frederick M.Ausubel et al.，1987)进行设定。作为严谨性条件，例如可举出使用杂交液(50％甲酰胺，10×SSC(0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的改性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))在约42℃～约50℃下进行孵育，其后使用0.1×SSC、0.1％SDS在约65℃～约70℃下进行清洗的条件。作为更优选的严谨性条件，例如可举出作为杂交液使用50％甲酰胺、5×SSC(0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的改性鲑鱼精子DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5)的条件。

作为等效DNA的其它具体例，可举出由以序列号6所示的碱基序列为基准而包含1个或多个(优选1个～数个)碱基的取代、缺失、插入、添加或倒位的碱基序列所构成的、编码具有麦芽三糖基转移酶活性的蛋白质的DNA。碱基的取代、缺失等可以发生在多个部位。在此的“多个”因该DNA编码的蛋白质的立体结构中氨基酸残基的位置、种类的不同而异，但例如为2～40个碱基、优选为2～20个碱基、更优选为2～10个碱基。如上所述的等效DNA例如可通过以下得到：利用限制性内切酶处理、基于核酸外切酶或DNA连接酶等的处理、基于定位突变导入法(Molecular Cloning，Third Edition，Chapter 13，C old SpringHarbor Lab oratory Press，New York)或随机突变导入法(MolecularCloning，Third Edition，Chapter 13，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York)的突变导入等，以包含碱基的取代、缺失、插入、添加和/或倒位的方式改变具有序列号6所示的碱基序列的DNA，从而得到。并且，也可以利用紫外泳道照射等其它方法得到等效DNA。

作为等效DNA的进一步的其它示例，可举出由于SNP(单碱基多型态)所代表的多型态而可确认如上碱基的不同的DNA。

本发明的基因可通过参考本说明书或所附序列表公开的序列信息，使用标准的基因工程学方法、分子生物学方法、生化学方法等调制成分离的状态。具体而言，可适当地利用可对本发明的基因特异性杂交的低聚核苷酸探针·引物，从土芽孢杆菌APC9669的基因组DNA文库或cDNA文库、或从土芽孢杆菌APC9669的菌体内提取液进行调制。可使用市售的自动化DNA合成装置等容易地合成低聚核苷酸探针·引物。应予说明，对用于调制本发明的基因的文库的制作方法，例如可参考Molecular Cloning，Third Edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York。

例如，如果为具有序列号6的碱基序列的基因，则可利用以该碱基序列或其互补序列的整体或一部分为探针的杂交法进行分离。此外，可利用核酸扩增反应(例如PCR)进行扩增及分离，该核酸扩增反应使用以对该碱基序列的一部分进行特异性杂交的方式设计而成的合成低聚核苷酸引物。此外，也可以以序列号7所示的氨基酸序列、序列号6的碱基序列的信息为基础，通过化学合成而获得作为目标的基因(参考文献：Gene，60(1)，115-127(1987))。

下面示出本发明的基因的取得方法的具体例。首先，从土芽孢杆菌APC9669分离、纯化本酶(麦芽三糖基转移酶)，得到与其部分氨基酸序列相关的信息。作为确定部分氨基酸序列的方法，例如将纯化的麦芽三糖基转移酶直接按照常规方法供以利用Edman降解法〔The Journalof biological chemistry，第256卷，第7990～7997页(1981)〕进行氨基酸序列分析〔Protein S eq uencer 476A，Applied Biosystems公司制等〕。使蛋白质水解酶作用而进行限制性水解，将所得的肽片段进行分离纯化，对所得的纯化肽片段进行氨基酸序列分析，这是有效的。

以如此得到的部分氨基酸序列信息为基础，将麦芽三糖基转移酶基因进行克隆。例如可利用杂交法或PCR进行克隆。利用杂交法时，例如可使用Molecular Cloning(Third Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York)中记载的方法。

利用PCR法时，可使用以下方法。首先，以产生麦芽三糖基转移酶的微生物的基因组DNA为模板，使用以部分氨基酸序列的信息为基础设计的合成低聚核苷酸引物进行PCR反应，获得目标基因片段。PCR法是以PCR技术〔PCR Technology，Erlich HA编集，Stocktonpress社，1989年发行〕中记载的方法为基准进行的。进而，若对该扩增DNA片段使用通常所用的方法，例如双脱氧链终止法来确定碱基序列，则在经确定的序列中除了合成低聚核苷酸引物的序列以外还发现与麦芽三糖基转移酶的部分氨基酸序列对应的序列，而可获得目标麦芽三糖基转移酶基因的一部分。以所得的基因片段为探针进一步进行杂交法等，从而能够克隆编码麦芽三糖基转移酶全长的基因。

在后述的实施例中，利用PCR法确定了编码土芽孢杆菌APC9669生产的麦芽三糖基转移酶的基因的序列。将编码来源于土芽孢杆菌APC9669的麦芽三糖基转移酶的基因的全碱基序列表示为序列号6。此外，确定了该碱基序列编码的氨基酸序列(序列号7)。应予说明，与序列号7所示的氨基酸序列对应的碱基序列除了序列号6所记载的以外还存在多个。

通过使用全碱基序列得到明确的麦芽三糖基转移酶基因(序列号6)的整体或一部分作为杂交用探针，从而可从其它产生麦芽三糖基转移酶的微生物的基因组DNA文库或cDNA文库中筛选与序列号6的麦芽三糖基转移酶基因同源性高的DNA。

同样可以设计PCR用的引物。通过使用该引物进行PCR反应，能够检测出与上述麦芽三糖基转移酶基因同源性高的基因片段，进而也可得到该基因整体。

通过制备所得基因的蛋白质，测定其麦芽三糖基转移酶活性，从而可确认是否为编码具有麦芽三糖基转移酶活性的蛋白质的基因。此外，通过将所得基因的碱基序列(或其编码的氨基酸序列)与上述麦芽三糖基转移酶基因的碱基序列(或其编码的氨基酸序列)进行比较，从而也可核查基因结构、同源性，判定是否编码具有麦芽三糖基转移酶活性的蛋白质。

由于一级结构及基因结构得到明确，所以可以通过导入随机突变或部位特异性突变而得到改变型麦芽三糖基转移酶(实施有1个或多个氨基酸残基的缺失、添加、插入或取代中的至少一个的基因)。由此，可得到编码具有麦芽三糖基转移酶活性而最适温度、稳定温度、最适pH、稳定pH、底物特异性等性质不同的麦芽三糖基转移酶的基因。此外，可以基因工程学地制备改变型麦芽三糖基转移酶。

在此，导入突变时的计划可例如参考基因序列上的特征性序列进行。特征性序列的参考例如可通过考虑其蛋白质的立体结构预测、与已知蛋白质的同源性而进行。

若例示导入随机突变的方法，则作为化学处理DNA的方法，为使亚硫酸氢钠作用而引发将胞嘧啶碱基变换为尿嘧啶碱基的转换突变的方法〔Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA，第79卷，第1408～1412页(1982)〕，作为生化学方法，为在存在〔α-S〕dNTP的情况下合成双链的过程中引发碱基取代的方法〔Gene，第64卷，第313～319页(1988)〕，作为使用PCR的方法，为向反应系加入锰进行PCR而降低核苷酸获取的正确性的方法〔AnalyticalBiochemistry，第224卷，第347～353页(1995)〕等。

若例示导入部位特异性突变的方法，则为利用琥珀突变的方法〔缺口双链(gapped duplex)法，Nucleic Acids Research，第12卷，第24号，第9441～9456页(1984)〕、利用限制性内切酶的识别部位的方法〔Analytical Biochemistry，第200卷，第81～88页(1992)，Gene、第102卷，第67～70页(1991)〕、利用dut(dUTPase)和ung(尿嘧啶DNA糖苷酶)突变的方法〔Kunkel法，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the USA，第82卷，第488～492页(1985)〕、利用使用了DNA聚合酶和DNA连接酶的琥珀突变的方法〔Oligonucleotide-directed Dual Amber：ODA法，Gene，第152卷，第271～275页(1995)，日本特开平7-289262号公报〕、利用诱导了DNA的修复系统的宿主的方法(日本特开平8-70874号公报)、利用催化DNA链交换反应的蛋白质的方法(日本特开平8-140685号公报)、基于使用添加了限制性内切酶的识别部位的2种突变导入用引物的PCR的方法(美国专利第5,512,463号)、基于使用具有非活化耐药性基因的双链DNA载体和2种引物的PCR的方法〔Gene，第103卷，第73～77页(1991)〕、利用琥珀突变的PCR的方法〔国际公开WO98/02535号公报〕等。

通过使用市售的试剂盒，也能将部位特异性突变容易地导入。作为市售的试剂盒，例如可使用以下试剂盒：使用缺口双链法的Mutan(注册商标)-G(宝酒造公司制)、使用Kunkel法的Mutan(注册商标)-K(宝酒造公司制)、使用ODA法的Mutan(注册商标)-ExpressKm(宝酒造公司制)、使用突变导入用引物和来源于强烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)的DNA聚合酶的QuikChangeTM定点突变试剂盒(Site-Directed Mutagenesis Kit)〔STRATAGENE公司制〕等，此外，作为利用PCR法的试剂盒，可使用TaKaRa LA聚合酶链反应在体外突变试剂盒(PCR in vitro Mutagenesis Kit)(宝酒造公司制)、Mutan(注册商标)-Super Express Km(宝酒造公司制)等。

如此地，通过本发明提供了麦芽三糖基转移酶的一级结构及基因结构，从而可廉价且高纯度地进行具有麦芽三糖基转移酶活性的蛋白质的基因工程学制备。

(重组载体)

本发明的另一方面涉及含有本发明的麦芽三糖基转移酶基因的重组载体。本说明书中的术语“载体”是指能将插入该载体的核酸分子输送至细胞等靶内的核酸分子，对其种类、形态没有特别限定。因此，本发明的载体可以采用质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体、病毒载体(腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体等)的形态。

根据使用目的(克隆、蛋白质的表达)，还考虑宿主细胞的种类，而选择适当的载体。若举出载体的具体例，则有以大肠杆菌为宿主的载体(M13噬菌体或其变异体、λ噬菌体或其变异体、pBR322或其变异体(pB325、pAT153、pUC8等)等)、以酵母为宿主的载体(pYepSec1、pMFa、pYES2等)、以昆虫细胞为宿主的载体(pAc、pVL等)、以哺乳类细胞为宿主的载体(pCDM8、pMT2PC等)等。

本发明的重组载体优选为表达载体。所谓“表达载体”是指能将插入该表达载体的核酸导入到目标细胞(宿主细胞)内，且能在该细胞内使之表达的载体。表达载体通常包含所插入核酸的表达所需的启动子序列、促进表达的增强子序列等。也可以使用包含选择标记的表达载体。在使用所述表达载体时，可利用选择标记确认有无表达载体的导入(及其程度)。

本发明的基因的向载体的插入、选择标记基因的插入(需要的情况下)、启动子的插入(需要的情况下)等可使用标准的重组DNA技术(例如可参考Molecular Cloning，Third Edition，1.84，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，是使用限制性内切酶及DNA连接酶的公知方法)进行。

(转化体)

本发明还涉及导入有本发明的基因的宿主细胞(转化体)。在本发明的转化体中，本发明的基因会作为外源性分子存在。本发明的转化体优选通过使用上述本发明载体的转染乃至转化而调制。转染、转化可通过磷酸钙共沉降法、电穿孔(Potter，H.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，7161-7165(1984))、脂质体(Felgner，P.L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84，7413-7417(1984))、显微注射(Graessmann，M.&Graessmann，A.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.73，366-370(1976))、Hanahan的方法(Hanahan，D.，J.Mol.Biol.166，557-580(1983))、乙酸锂法(Schiestl，R.H.et al.，Curr. Genet.16，339-346(1989))、原生质体-聚乙二醇法(Yelton，M.M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.81，1470-1474(1984))等实施。

宿主细胞只要是能表达本发明的麦芽三糖基转移酶就没有受到特别限定，例如可从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus likemiformis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)等芽孢杆菌(Bacillus)属细菌；乳球菌(Lactococcus)、乳杆菌(Lactobacillus)、链球菌(Streptococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、双歧杆菌(Bifidobacterium)等乳酸菌；大肠杆菌(Escherichia)、链霉菌(Streptomyces)等其它细菌；酵母菌(Saccharomyces)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、念珠菌(Candida)、圆酵母菌(Torula)、球拟酵母属(Torulopsis)等酵母；米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)等曲霉(Aspergillus)属，青霉(Penicillium)属，木霉(Trichoderma)属，镰刀菌(Fusarium)属等丝状菌(真菌)等中进行选择。

(麦芽三糖基转移酶的制备方法)

本发明的另一方面提供麦芽三糖基转移酶的制备方法。本发明的制备方法的一个方式中，进行培养具有生产本酶(麦芽三糖基转移酶)的能力的土芽孢杆菌属的微生物的步骤(步骤(1))、及从培养后的培养液和/或菌体回收麦芽三糖基转移酶的步骤(步骤(2))。

步骤(1)中的土芽孢杆菌属微生物只要具有生产本酶的能力就没有受到特别的限定。例如，可以使用上述土芽孢杆菌APC9669。培养方法及培养条件只要是能够生产目标酶就没有受到特别限定。即，以生产本酶为条件，可适当设定适于培养所用微生物的方法、培养条件。作为培养方法，可为液体培养、固体培养中的任一种，但优选利用液体培养。以液体培养为例对其培养条件进行说明。

作为培养基，只要是所用微生物可生长的培养基就可任意使用。例如，可使用添加有葡萄糖、蔗糖、龙胆二糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖蜜、有机酸等碳源，进而添加有硫酸铵、碳酸铵、磷酸铵、乙酸铵的培养基；或者使用添加有蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、麦糠、肉分离物等氮源，进而添加有钾盐、镁盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、铁盐、锌盐等无机盐的培养基。为了促进所用微生物的生长，可以向培养基中添加维生素、氨基酸等。培养基的pH例如调整为约3～10、优选为约7～8左右，培养温度通常为约10～80℃、优选为约30～65℃左右，在需氧条件下培养1～7天、优选2～4天左右。作为培养方法，例如可利用振荡培养方法，利用发酵罐的需氧深层培养方法。

在以上条件下进行培养后，从培养液或菌体回收麦芽三糖基转移酶(步骤(2))。从培养液回收时，例如可通过将培养上清进行过滤、离心处理等而去除不溶物，然后通过适当组合利用超滤膜的浓缩、硫酸铵沉淀等盐析、透析、离子交换树脂等各种层析等来进行分离、纯化，从而得到本酶。

另一方面，从菌体内回收时，例如可将菌体通过加压处理、超声波处理等进行破碎后，与上述同样地进行分离、纯化，从而得到本酶。应予说明，也可以利用过滤、离心处理等预先从培养液回收菌体，然后进行上述一系列工序(菌体的破碎、分离、纯化)。

应予说明，对表达的确认、表达产物的确认，使用针对麦芽三糖基转移酶的抗体进行是简便的，但也可以通过测定麦芽三糖基转移酶活性而进行表达的确认。

本发明的其它方式中，使用上述转化体制备麦芽三糖基转移酶。在该方式的制备方法中，首先，在产生被导入该转化体的基因所编码的蛋白质的条件下培养上述转化体(步骤(i))。对于各种载体宿主系统，转化体的培养条件是公知的，本领域技术人员可以容易地设定适合的培养条件。培养步骤之后，回收所生产的蛋白质(即，麦芽三糖基转移酶)(步骤(ii))。关于回收及其后的纯化，与上述方式的情况同样地进行即可。

对本酶的纯化度没有受到特别限定。此外，最终形态可以是液体也可以是固体(包括粉体)。

(酶制剂)

本发明的酶例如以酶制剂的方式被提供。酶制剂除了有效成分(本发明的酶)之外还可以含有赋型剂、缓冲剂、悬浮剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等。作为赋型剂，可以使用淀粉、糊精、麦芽糖、海藻糖、乳糖、D-葡萄糖、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖、甘油等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以使用乙醇、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。

(麦芽三糖基转移酶的用途)

本发明的另一方面是提供食品的制备、加工方法作为麦芽三糖基转移酶(本酶)的用途。本发明的制备、加工方法中，使本酶作用于含具有α-1，4糖苷键的多糖类和/或低聚糖类的食品或食品原料，而改善该食品的功能性。作为食品的例子可举出面包、米饭、饼。作为食品原料的例子可举出各种含淀粉、直链淀粉、支链淀粉、麦芽低聚糖的原料。对原料的纯度没有特别限定，也可以使本酶作用于与其它物质混杂状态下的原料。此外，也可以使本酶同时作用于两种以上的原料。

实施例

<麦芽三糖基转移酶活性测定方法>

麦芽三糖基转移酶的活性是如下测定的。即，向含1％麦芽四糖(林原生物化学研究所制)的10mmol/L MES缓冲液(pH6.5)2mL中添加酶溶液0.5mL，在40℃下放置60分钟。放置后，在沸腾水浴中加热5分钟，然后在流水中冷却。将所生成的葡萄糖利用Glucose CII-TestWako(和光纯药制)进行定量。将在本条件下1分钟内在2.5mL反应液中生成1μmol葡萄糖的酶量设为1个单位。

<麦芽三糖基转移酶活性确认方法>

麦芽三糖基转移酶的活性是与上述<麦芽三糖基转移酶活性测定方法>一起如下进行确认的。即，向含10.3mmol/L麦芽四糖(林原生物化学研究所制)的5mmol/L乙酸缓冲液(pH6.0)985μL添加1.0u/mL酶溶液15μL，50℃下放置1、2、3小时。放置后，在沸腾水浴中加热5分钟，然后在流水中冷却。将冷却的反应液使用阳离子树脂、阴离子树脂适当脱盐，以HPLC进行反应液的分析。HPLC装置为岛津制作所制“Prominence UFLC”，柱为三菱化学制“MCI GEL CK04S”，洗脱液为水，流速0.4mL/分钟，利用差示折射计检测，进行分析。将所得底物和产物的面积％换算成摩尔量，计算消耗速度和生成速度。在纯化的麦芽三糖基转移酶的情况下，例如，生成速度比成为7糖∶3糖＝约92∶约8。

1.来源于土芽孢杆菌株APC9669的麦芽三糖基转移酶的生产和纯化

使用表1所示组成的液体培养基，将土芽孢杆菌株APC9669进行45℃、2天的振荡培养。将所得的培养上清液用UF膜(AIP-1013D，旭化成制)浓缩5倍后，以成为50％饱和浓度的方式添加硫酸铵。将沉淀部分再次溶解于含5mmol/L氯化钙的20mmol/L Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)，接着以最终浓度成为0.5mol/L的方式添加硫酸铵。将所生成的沉淀用离心分离去除后，供于用含0.5mol/L硫酸铵和5mmol/L氯化钙的20mmol/L Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)进行了平衡化的HiLoad26/10Phenyl Sepharose HP柱(GE Healthcare制)，利用0.5mol/L到0mol/L的硫酸铵泳道性浓度梯度，使吸附的麦芽三糖基转移酶蛋白质进行洗脱。

[表1]

麦芽三糖基转移酶生产培养基

	(w/v)
		酵母提取物	1.5％
大豆蛋白胨	0.5％
		氯化钠	0.5％
可溶性淀粉	0.4％

将收集的麦芽三糖基转移酶活性部分用UF膜进行浓缩后，在含5mmol/L氯化钙的20mmol/L Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)中进行缓冲交换。将缓冲交换试样供于以含5mmol/L氯化钙的20mmol/L Tris-盐酸缓冲液(pH8.0)进行了平衡化的HiLoad 26/10Q Sepharose HP柱(GEHealthcare制)，利用0mol/L到1mol/L的NaCl泳道性浓度梯度，使吸附的麦芽三糖基转移酶蛋白质进行洗脱。

进而，将收集的麦芽三糖基转移酶活性部分用UF膜进行浓缩后，在含0.15M的NaCl的50mM磷酸缓冲液(pH7.2)中进行缓冲交换后，供于以含0.15M的NaCl的50mM磷酸缓冲液(pH7.2)进行了平衡化的HiLoad 26/60Superdex 200pg柱(GE Healthcare制)，以该缓冲液进行洗脱。收集麦芽三糖基转移酶活性部分，用超滤膜进行脱盐浓缩，得到了纯化酶样品。将所得的本纯化酶供于进行下述各性质的检测。

应予说明，将各阶段的纯化结果示于表2。最终阶段的比活性与粗酶相比约为41倍。图5中示出将纯化工序中的各步骤的试样以10-20％的梯度凝胶进行SDS-PAGE(CBB染色)的结果。可知本纯化酶样品(泳道2)在SDS-PAGE中为单一的蛋白质。

[表2]

2.麦芽三糖基转移酶的各性质

(1)最适反应温度

以上述麦芽三糖基转移酶活性测定方法为基准，将反应温度设为30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃和75℃进行反应。以将显示最高活性的温度下的值设为100％而得的相对活性进行表示。最适反应温度为50℃附近(图1)。

(2)最适反应pH

以上述麦芽三糖基转移酶活性测定方法为基准，在各缓冲液(通用缓冲液pH4.0、pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH9.0、pH10.0、pH11.0)中，在40℃、60分钟的反应条件下进行测定。以将显示最大活性值的pH的值设为100％而得的相对活性进行表示。最适反应pH为约7.5附近(图2)。

(3)温度稳定性

将6u/mL的酶液在30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃和75℃的各温度下，10mmol/L MES缓冲液(pH6.5)中进行30分钟热处理后，用上述麦芽三糖基转移酶活性测定方法测定残余活性。以未用热进行处理的活性设为100％而得的残余活性进行表示。在65℃、30分钟的热处理中，具有90％以上的残余活性，在到达65℃为止稳定(图3)。

(4)pH稳定性

将6u/mL的酶液在各缓冲液(通用缓冲液pH3.0、pH4.0、pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH9.0、pH10.0、pH11.0)中，以40℃处理30分钟后，用上述麦芽三糖基转移酶活性测定方法测定活性。在pH5.0到pH10.0的范围中具有85％以上的残余活性，在pH5.0到pH10.0的范围中稳定(图4)。

(5)利用SDS-PAGE的分子量测定

SDS-PAGE是按照Laemmli等的方法进行的。应予说明，所使用的分子量标记为电泳低分子量标定试剂盒(Low Molecular WeightCalibration Kit for Electrophoresis，GE Healthcare公司制)，作为标准蛋白质含有磷酸化酶b(97,000Da)、白蛋白(66,000Da)、卵清蛋白(45,000Da)、碳酸酐酶(30,000Da)、胰蛋白酶抑制剂(20,100Da)、α-乳清蛋白(14,400Da)。使用凝胶浓度为10-20％的梯度凝胶(和光纯药公司制)，以20mA/凝胶进行约80分钟电泳，求出分子量，结果分子量为约83kDa(图5)。

(6)等电点

通过使用两性电解质的等电点聚焦(600V，4℃，通电48小时)进行测定，其结果本酶的等电点约为4.5。

(7)底物特异性

对针对各底物的麦芽三糖基转移酶活性进行了研究。

a)对于麦芽低聚糖的底物特异性

对于麦芽低聚糖类，通过以下的方法进行了底物特异性的研究。向10mmol/L的各麦芽低聚糖中以成为0.002u/mL的方式添加酶，于50℃放置1、2、3小时。放置后，在沸腾水浴中加热5分钟后，在流水中冷却。将冷却的反应液使用阳离子树脂、阴离子树脂适当地进行脱盐，用HPLC进行反应液的分析。HPLC装置为岛津制作所制“ProminenceUFLC”，柱为三菱化学制“MCI GEL CK04S”，洗脱液为水，流速0.4mL/分钟，用差示折射计检测而进行分析。将所得底物和产物的面积％换算成摩尔量，算出消耗速度和生成速度。对各麦芽低聚糖的反应速度进行如下计算。将对麦芽四糖的速度设为7糖生成速度与3糖生成速度之和。将对麦芽五糖的速度设为8糖生成速度与3糖生成速度之和。求出3糖生成速度与9糖生成速度之差的1/2，进而将该值与9糖生成速度之和设为对麦芽六糖的速度。

[表3]

底物	相对速度(％)
		麦芽糖	0
麦芽三糖	0
		麦芽四糖	83
麦芽五糖	100
		麦芽六糖	89

对于麦芽糖、麦芽三糖，未能确认到反应产物。对于麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖很好地进行作用。

b)对多糖类的底物特异性

对于环糊精、可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉，通过以下的方法研究底物特异性。向10mmol/L的各麦芽低聚糖中以成为0.002u/mL的方式添加酶，将0.1u/mL的酶在50℃下放置0、1、2、3小时。放置后，在沸腾水浴中加热5分钟，然后在流水中冷却。向200μL该液中以1.0单位成为0.03mg的方式添加来源于根霉的葡糖淀粉酶(和光纯药)，在50℃下静置1晚。静置后，在沸腾水浴中加热5分钟，然后在流水中冷却。将冷却的反应液使用阳离子树脂、阴离子树脂适当地进行脱盐，用HPLC进行反应液的分析。HPLC装置为岛津制作所制“ProminenceUFLC”，柱为三菱化学制“MCI GEL CK04S”，洗脱液为水，流速0.4mL/分钟，用差示折射计检测而进行分析。将在酶(麦芽三糖基转移酶)处理区中，与无处理区相比确认到3糖以上的峰经时增加时，判定为有产物(+)，未能确认到增加时判定为无产物(-)。

[表4]

底物	有无产物
		α-环糊精	-
β-环糊精	-
		γ-环糊精	-
直链淀粉	+
		支链淀粉	+
可溶性淀粉	+

对于环糊精，未能确认到反应产物。对于可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉，确认到3糖以上峰的经时增加。可知这些多糖类成为底物。由葡糖淀粉酶水解α-1，4键、α-1，6键可知在这些键合方式以外还生成糖基转移产物。

(8)底物浓度对酶反应产物的影响

关于底物浓度对酶反应产物的影响，以麦芽四糖为底物进行研究。向0.67、1.0、3.0、10、30、70％(w/v)的麦芽四糖中以进行3小时反应后的麦芽四糖残余量成为85％以上的方式添加酶，在50℃下放置1、2、3小时。放置后，在沸腾水浴中加热5分钟，然后在流水中冷却。将冷却的反应液使用阳离子树脂、阴离子树脂适当地脱盐，使用HPLC进行反应液的分析。HPLC装置为岛津制作所制“Prominence UFLC”，柱为三菱化学制“MCI GEL CK04S”，洗脱液为水，流速0.4mL/分，用差示折射计检测而进行分析。将所得底物和产物的面积％换算成摩尔量，算出生成速度。其结果，在所有的底物浓度条件下(0.67～70％(w/v))，糖基转移反应为90％以上。

[表5]

3.面包的制备

将麦芽三糖基转移酶添加于面包坯料中制备面包。将山形面包用基础材料(强力粉260g；砂糖13g；食盐5.2g；起酥油10.4g；L-抗坏血酸0.013g；冷水192g；干酵母3.1g)或对该材料添加120u的麦芽三糖基转移酶而得的材料，供于National自动家庭用面包烤箱SD-BT150(松下产业株式会公司Panasonic制)。烘烤后，将面包在26℃下放置冷却1小时，接着为了防止水分的蒸发而将其放入乙烯袋，然后在26℃下保存。保存1或5天后，将面包切成2cm厚的切片，将面包中央部切成直径为47mm的圆柱状。面包的硬度是使用FUDOH流变仪NRM-2002J(Sun Scientific RHEOTECH制)测定以2mm/分钟的压缩速度压缩1.5cm时的最大载荷。结果示于图6。关于未添加酶区和酶添加区，对分别将其保存1天的面包的硬度设为100％时的保存5天的面包的硬度进行比较。其结果，酶添加区成为125％，与未添加区(207％)相比，面包的硬化得到抑制，柔软性得以维持。

4.煮饭

将75g米水洗后添加水150mL而得的材料、或向该材料中添加麦芽三糖基转移酶40u而得的材料，在室温静置2小时后，以常规方法进行煮饭，得到米饭。将所得的煮饭米在4℃下保存7天。用BAP法测定保存前后的糊化度。对于利用BAP法测定的糊化度，酶添加区刚煮饭之后为96.6％、7天后为69.5％(表6)。与此相对，未添加区刚煮饭之后为95.3％、7天后为59.7％。在酶添加区中抑制了糊化度的下降，即抑制了淀粉老化的发生。

[表6]

5.饼的制备

将水165g加入上新粉200g进行混合，以水蒸气蒸15分钟。接着，将蒸完的材料取至搅拌机(KitchenAid KSM5(FMI公司制))边搅拌，边在坯料约成为65℃时对酶添加区添加、混合麦芽三糖基转移酶30u，装入塑料制培养皿中进行成型，放置冷却，在15℃下保存。保存24小时后，将饼切成10mm厚度的切片，将饼的中央部冲切成直径为25mm的圆柱状。饼的硬度是使用FUDOH流变仪NRM-2002J(RHEOTECH制)测定在压缩速度为2mm/分钟下压缩5mm时的最大载荷。对将未添加酶区的保存24小时的饼的硬度设为100％时的饼的硬度进行比较。此外，对饼的粘性也进行确认。其结果，酶添加区成为35％，饼的硬化得到抑制，柔软性得以维持(表7)。此外，还没有饼的粘性。

[表7]

	硬度	粘性
			酶添加区	35％	无
未添加区	100％	无

6.编码来源于土芽孢杆菌株APC9669的麦芽三糖基转移酶的基因片段的取得

(a)染色体DNA的分离

从土芽孢杆菌株APC9669的菌体利用齐藤、三浦的方法(非专利文献5)调制染色体DNA。

(b)部分氨基酸序列的确定

将在1.中所得的麦芽三糖基转移酶的纯化样品供于氨基酸序列分析，确定了10个残基的N末端氨基酸序列(序列号1)和内部肽氨基酸序列(序列号2、3)。

(c)利用PCR的DNA探针的制作

以N末端氨基酸序列和内部氨基酸序列为基础合成2种混合低聚核苷酸(序列号4、5)作为PCR引物。使用这些引物，以土芽孢杆菌株APC9669的染色体DNA为模板在以下条件下进行PCR反应。

<PCR反应液>

10×PCR反应缓冲液(TaKaRa公司)5.0μl

dNTP混合液(分别2.5mM、TaKaRa公司)8.0μl

25mM MgCl₂5.0μl

50μM正义引物0.5μl

50μM反义引物0.5μl

蒸馏水29.5μl

染色体DNA溶液(100μg/ml)1.0μl

LA Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司)0.5μl

<PCR反应条件>

阶段1：变性(95℃，5分钟)1个循环

阶段2：变性(95℃，1分钟)30个循环

退火(50℃，1分钟)

延伸(72℃，1分钟)

阶段3：延伸(72℃，10分钟)1个循环

将所得的约1.1kb的DNA片段克隆至pGEM-Teasy(Promega公司)后，确认碱基序列，结果在紧邻正义引物的后面和紧邻反义引物的前面发现了编码上述部分氨基酸序列的碱基序列。将本DNA片段作为用于全长基因克隆的DNA探针。

(d)基因文库的制作

土芽孢杆菌株APC9669的染色体DNA的Southern杂交分析的结果是，在EcoRI分解物中确认到与探针DNA进行杂交的约5.2kb的单一条带。为了克隆该约5.2kb的EcoRIDNA片段，如下制作了基因文库。对在上述(a)中调制的染色体DNA进行EcoRI处理。将染色体DNA50μg、10×H缓冲液40μl、蒸馏水342.0μl和EcoRI 8.0μl进行混合，在37℃下处理15小时。将所得的分解物连接于经EcoRI处理的pBluescript II KS+载体(Stratagene公司)，得到基因文库。

(e)基因文库的筛选

将在上述(c)中得到的1.1kb的DNA片段用DIG-High Prime(Roche公司)进行标记。将其作为DNA探针，对在(d)中得到的基因文库通过菌落杂交进行筛选。从所得的阳性菌落得到质粒pBlue-SAS。

(f)碱基序列的确定

按照常规方法确定质粒pBlue-SAS的碱基序列。将编码来源于土芽孢杆菌株APC9669的麦芽三糖基转移酶的碱基序列(2304bp)示于序列号6。此外，将由序列号6所编码的氨基酸序列(767氨基酸)示于序列号7。在该氨基酸序列中发现了在(b)中确定的N末端区域氨基酸序列(序列号1)和内部氨基酸序列(序列号2、3)。应予说明，将从序列号7的氨基酸序列去除了信号肽的氨基酸序列示于序列号8。

7.来源于土芽孢杆菌株APC9669的麦芽三糖基转移酶在大肠杆菌中的表达

(a)麦芽三糖基转移酶在大肠杆菌中的表达质粒的构建

以编码N末端区域氨基酸序列和C末端区域氨基酸序列的DNA序列为基础，合成2种低聚核苷酸(序列号9、10)作为PCR引物。在正义引物中增加SacI限制性内切酶识别部位，在反义引物中添XbaI限制性内切酶识别部位。以具有这些引物和麦芽三糖基转移酶基因的染色体DNA为模板在以下条件下进行PCR反应。

<PCR反应液>

10×PCR反应缓冲液(TOYOBO公司)5.0μl

dNTP混合液(分别2.5mM、TOYOBO公司)5.0μl

10μM正义引物1.5μl

10μM反义引物1.5μl

25mM MgSO₄2.0μl

蒸馏水33.0μl

染色体DNA溶液(200μg/ml)1.0μl

KOD-Plus-DNA聚合酶(TOYOBO公司)1.0μl

<PCR反应条件>

阶段1：变性(94℃，2分钟)1个循环

阶段2：变性(94℃，15秒)30个循环

退火(50℃，30秒)

延伸(68℃，2分30秒)

将所得的PCR产物用电泳进行确认后，利用乙醇沉淀进行脱盐(84μl)。接着添加10μl的10×M缓冲液及SacI 3μl和XbaI 3μl，在37℃下进行15小时酶处理。将限制性内切酶处理液用电泳进行确认，用NucleoSpin ExtractII(Nippon Genetics公司)纯化后，连接于预先以SacI和XbaI进行处理的载体pCold II DNA(Takara Bio公司)，得到表达质粒pColdII-SAS。

(b)麦芽三糖基转移酶在大肠杆菌中的表达

将表达质粒pColdII-SAS导入大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara Bio公司)。作为耐氨苄青霉素性菌株，从所得的转化体中筛选出拥有利用菌落PCR插入有目标麦芽三糖基转移酶基因的pColdII-SAS的菌株。此外，作为对照，还得到具有表达载体pColdIIDNA的大肠杆菌JM109的转化体。将这些转化体接种在含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基1ml中，以37℃、170rpm的条件培养至O.D600＝0.4-1.0为止(预培养)。接着，将预培养液300μl接种在含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基9ml中，以37℃、170rpm的条件培养至O.D600＝0.4-1.0为止。在15℃下放置30分钟后，添加9μl的0.1M IPTG，以15℃、160rpm的条件下培养24小时(主培养)，收集菌。将菌体悬浮于1.0ml的100mM Tris-盐酸缓冲液(pH 6.5)中，添加Φ0.1mm的玻璃珠0.50g，用多珠冲击器(Multi-Beads Shocker，安井机械公司)对菌体进行破碎。破碎条件是将ON 120秒、OFF 60秒重复3.75个循环。将所得的无细胞提取物供于离心分离，得到可溶性成分。

(c)麦芽三糖基转移酶的表达确认

将取得的可溶性成分供于SDS-PAGE。作为电泳装置使用PhastSystem(GE Healthcare公司)，作为分离凝胶使用PhastGelHomogeneous 7.5(GE Healthcare公司)。其结果，如图7所示，确认到在pColdII-SAS中83kDa附近生产被认为是麦芽三糖基转移酶的有意义的蛋白质。在作为对照的pColdII DNA中没有确认到同样蛋白质的生产，所以认为该本蛋白质是因麦芽三糖基转移酶基因的导入而生成的(图7)。

另外，将对于相同试样按照上述麦芽三糖基转移酶活性测定方法进行活性测定的结果示于下表8。

[表8]

	活性(U/ml)	蛋白质(mg/ml)	比活性(U/mg)
				pColdII-SAS	44.3	0.515	86.1
pColdll	0.02	0.875	0.02

与对照相比，检测出明显的麦芽三糖基转移酶活性，确认到目标麦芽三糖基转移酶的表达。

产业上的可利用性

本发明的麦芽三糖基转移酶显示优异的耐热性，适于要求在高温下反应的用途。若使用本发明的麦芽三糖基转移酶，则能够在杂菌污染可能性低的高温下实施酶反应。此外，作用于含淀粉的食品时，可确认抑制淀粉老化的效果。因此，本发明的麦芽三糖基转移酶对食品加工等用途尤其有用。

本发明并不限定于上述发明实施方式和实施例的说明。本发明还包括在不脱离权利要求范围记载而本领域人员容易想到的范围内的各种变型方式。

对于本说明书中记载的论文、专利公开公报和专利公报等内容，通过援引而引用其所有内容。

另外的序列表文本

序列号4、5、9、10：人工序列的说明：引物

PCT/RO/134表

Claims

1.一种麦芽三糖基转移酶，具有作用于具有α-1，4糖苷键的多糖类和低聚糖类而使麦芽三糖单元转移至糖类的活性，在使该酶对作为底物的麦芽四糖进行作用时，在底物浓度为0.67％(w/v)～70％(w/v)的整个范围中，麦芽七糖生成速度与麦芽三糖生成速度之比成为9∶1～10∶0。

2.如权利要求1所述的麦芽三糖基转移酶，其中，麦芽三糖基转移酶为来源于微生物的酶。

3.如权利要求1所述的麦芽三糖基转移酶，其中，麦芽三糖基转移酶为来源于土芽胞杆菌属微生物的酶。

4.如权利要求3所述的麦芽三糖基转移酶，其中，土芽胞杆菌属微生物为土芽胞杆菌(Geobacillus SP.)APC9669，保藏号为NITEBP-770。

5.一种麦芽三糖基转移酶，具备下述的酶化学性质：

(1)作用：作用于具有α-1，4糖苷键作为键合方式的多糖类和低聚糖类而使麦芽三糖单元转移至糖类；

(3)分子量：约83000，SDS-PAGE法。

6.一种酶制剂，以权利要求1～5中任一项所述的麦芽三糖基转移酶为有效成分。

7.一种具有麦芽三糖基转移酶产生能力的微生物，是土芽胞杆菌(Geobacillus SP.)APC9669或其突变菌，土芽胞杆菌APC9669的保藏号为NITE BP-770。

8.一种麦芽三糖基转移酶，由序列号8的氨基酸序列、或显示麦芽三糖基转移活性的片段所构成。

9.如权利要求8所述的麦芽三糖基转移酶，其中，由包含序列号6的序列的DNA所编码。

10.一种麦芽三糖基转移酶，由选自以下(a)～(e)中的任一种DNA所构成：

(a)编码序列号7或8的氨基酸序列的DNA；

(b)包含序列号6的序列的DNA；

(d)作为序列号6的序列的DNA序列简并物的DNA；

11.一种重组载体，包含权利要求10所述的麦芽三糖基转移酶基因。

12.如权利要求11所述的重组载体，其中，所述重组载体是表达载体。

13.一种转化体，导入有权利要求10所述的麦芽三糖基转移酶基因。

14.一种转化体，导入有权利要求11或权利要求12所述的重组载体。

15.如权利要求13或权利要求14所述的转化体，其中，所述转化体是细菌细胞、酵母细胞或真菌细胞。

16.一种麦芽三糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤(1)和(2)、或步骤(i)和(ii)：

(1)培养具有麦芽三糖基转移酶产生能力的土芽胞杆菌属微生物的步骤，

(i)将权利要求13～15中任一项所述的转化体在产生所述麦芽三糖基转移酶基因编码的蛋白质的条件下进行培养的步骤，

(ii)回收所产生的所述蛋白质的步骤。

17.如权利要求16所述的制备方法，其中，土芽孢杆菌属微生物为土芽孢杆菌(Geobacillus SP.)APC9669。

18.权利要求1～5中任一项所述的酶或权利要求6所述的酶制剂的使用，用于制备、加工包含具有α-1，4糖苷键的多糖类或低聚糖类的食品。

19.一种食品或食品材料，通过使用权利要求1～5中任一项所述的酶或权利要求6所述的酶制剂而功能性得到改善。