KR102320952B1 - 고중합 이소말토올리고당 제조용 당전이효소를 이용한 이소말툴로오스 유래 올리고당 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고중합 이소말토올리고당 제조용 당전이효소(TP-DDase)를 이용한 이소말툴로오스 유래 올리고당 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 고중합 이소말토올리고당 제조효소는 이소말툴로오스와 반응하여 신규한 올리고당 생성 활성이 있으며, 이로부터 이소말툴로오스 유래 α-1,6 결합으로만 이루어진 고중합 올리고당 제조가 가능하다.

Description

고중합 이소말토올리고당 제조용 당전이효소를 이용한 이소말툴로오스 유래 올리고당 제조방법{Method for producing oligosaccharides derived from isomaltulose using sugar transferase for preparing highly polymerized isomaltooligosaccharide}

본 발명은 고중합 이소말토올리고당 제조용 당전이효소를 이용한 이소말툴로오스 유래 올리고당 제조 방법에 관한 것이다.

단맛을 내는 물질인 당류는 당분자의 갯수에 따라 단당류, 이당류, 다당류로 나뉜다. 포도당(glucose)과 과당(fructose)은 분자가 하나로 된 단당류이고, 설탕(sucrose sugar)은 분자가 2개인 이당류, 올리고당(oligosaccharide)은 3개 이상의 분자가 뭉쳐진 다당류에 속한다. 당류는 대부분의 과일, 유제품, 곡류 등에 함유되어 있기 때문에 식품을 통하여 섭취될 수 있으며 에너지를 공급하고, 정신적인 만족감을 주는 기능을 한다. 입자가 작은 단당류일수록 소화와 섭취가 빠르나, 다당류는 소화와 섭취가 어려워 설탕의 3분의 1 수준으로 칼로리가 낮은데다 장내에 공생하는 또는 유리한 미생물의 성장을 자극시켜 개인에 생물학적 효과를 발휘하는 프리바이오틱스로 불리우기도 하며, 체내에서 수용성 식이섬유와 같은 작용을 한다고 알려져 있다.

당류 중 많은 양을 차지하는 설탕과 과당의 과잉 섭취는 열량을 높여 비만을 유발하거나, 혈중 중성 지방을 높여 심혈관질환 등 성인병 발생 위험성을 증가시킬 수 있고, 어린이의 경우에는 충치, 과잉행동장애와 같은 질병 발생 위험과 관련이 있는 것으로 보고되고 있는등 유해성 논란이 계속되면서, 건강을 위해 단맛을 내기 위한 설탕의 대체제로 올리고당을 사용하는 소비자가 늘어나고 있다. 국내에서 쉽게 접할 수 있는 올리고당의 예로는 프락토올리고당과 이소말토올리고당이 있다.

프락토올리고당(fructo-oligosaccharide)은 설탕의 과당(Fructose) 잔기에 1~3개의 과당이 결합된, 설탕과 유사한 구조를 가진 당류의 혼합물을 말한다. 그 구성 성분은 1-케스토스 (1-Kestose, GF2), 니스토스 (Nystose, GF3), 프락토실 니스토스 (Fructosyl nystose, GF4)이다. 이소말토올리고당(Isomalto-oligosaccharide, IMO)은 포도당이 α-(1,4)- 및/또는 α-(1,6)-글루코시드 결합 형태의 분지결합으로 중합도(degree of polymerization, DP) 2 내지 10 인 당류를 말하는 것으로 이소말토스 (isomaltose), 파노스(panose), 이소말토트리오스(isomaltotriose), 이소말토테트라오스(isomaltotetraose) 및 이소파노스(isopanose)와 같은 기타 고급 분지형 올리고당을 포함하며 장내 유용균으로 대표되는 비피더스균의 증식인자로 알려져 있다. 프락토올리고당과 이소말토올리고당은 모두 다당류인 올리고당에 속하지만 둘의 차이는 올리고당을 구성하는 성분에서 나타난다. 프락토올리고당은 설탕(과당+포도당)을 가공해 포도당을 연결하여 제조하고, 이소말토올리고당은 쌀이나 옥수수 등의 녹말가루(포도당+포도당)를 가공해 포도당을 연결하여 만든 것이다.

장내의 비피더스균은 영양, 면역, 노화, 장내 부패물질 억제, 비타민 합성 등 숙주의 건강과 밀접한 관계를 갖고 있다. 비피더스균을 증식시키기 위해 비피더스 균 및 비피더스 생육 촉진물질을 식품에 첨가한 식품이 판매되고 있으며 비피더스의 촉진물질로서 여러 종류의 올리고당이 개발되고 있다. 프락토올리고당은 대부분 난소화성으로 소장에서 분해되지 않고 대장까지 도달하여 장내 서식하는 비피더스 균에 선택적으로 이용됨으로써 증식을 촉진하는데, 과다복용시는 설사를 유발하는 것으로 알려져 있다. 그에 반해 이소말토올리고당은 난소화성과 소화성의 중간 위치에 있으므로 장관에 대한 자극이 약하여 최대 무작용량이 설탕과 유사한 수준인 1.5g/kg 정도로 안전성이 뛰어난 것으로 알려져 있다. 최근에는 국내에도 올리고당 및 비피더스균에 대한 인식이 확대됨에 따라 음료, 유제품, 장류 등 다양한 종류의 식품에 올리고당이 첨가되고 있다. 특히, 중합도가 높은 이소말토올리고당은 건강기능성 효능이 있는 것으로 알려져 있다(Toshiyuki Kaneko et al. Biosci. Biotech. Biochem., 58(12): 2288-2290, 1994).

한편, 이소말툴로오스는 팔라티노오스(palatinose)라고도 불리우며, 덱스트로오스와 프룩토오스가 알파-1,6 결합을 하고 있는 이당류로서, 난충치성이고 느리게 소화 및 흡수되는 특성을 가지는 감미제 성분이다. 당 전이활성이 있는 일반 올리고당 제조효소는 이소말툴로오스를 기질로 하여 올리고당을 제조하는 활성이 없는 것으로 알려져 있다.

이에, 본 발명자들은 이소말툴로오스를 기질로 하여 올리고당을 제조하는 방법에 대해 연구한 결과, 고중합 이소말토올리고당 제조효소가 이소말툴로오스와 반응하여 신규한 올리고당 생성 활성이 있으며, 이로부터 이소말툴로스 유래 올리고당 제조가 가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 고중합 이소말토올리고당 제조용 당전이효소를 이용하여 이소말툴로오스로부터 올리고당을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

1) 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열로 이루어진 당전이효소(TP-DDase)의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양한 배양물을 제조하는 단계;

2) 상기 배양물로부터 당전이효소(TP-DDase)를 수득하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)에서 수득한 당전이효소(TP-DDase)를 이소말툴로오스에 첨가하여 반응시키는 단계; 를 포함하는 이소말툴로오스 유래 올리고당 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 고중합 이소말토올리고당 제조용 당전이효소(TP-DDase)를 이용한 이소말툴로오스 유래 올리고당 제조방법에 관한 것으로 상기 고중합 이소말토올리고당 제조효소는 이소말툴로오스와 반응하여 올리고당 생성 활성이 있으며, 이로부터 이소말툴로오스 유래 α-1,6 결합으로만 이루어진 올리고당 제조가 가능하다.

도 1은 써모안아에로박터 써모코프리애 (Thermoanaerobacter thermocopriae) 균주 유래의 이소말툴로오스 유래 올리고당 생산효소(Tt-LIMO)를 암호화하는 염기 서열을 나타내는 모식도이다.
도 2는 이소말툴로오스 유래 올리고당 생산효소(Tt-LIMO)를 암호화하는 염기 서열이 클로닝된 이소말툴로오스 유래 올리고당 생산효소(Tt-LIMO) 재조합 벡터를 나타내는 이미지이다.
도 3은 이소말툴로오스 유래 올리고당 효소(Tt-LIMO) SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 이소말툴로오스 유래 올리고당 효소(Tt-LIMO)의 반응 기질 종류별 얇은막 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography, TLC) 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 이소말툴로오스 및 덱스트린과 이소말툴로오스 유래 올리고당 효소(Tt-LIMO)를 반응시켜 생성된 생성물의 구성 당 함량을 분석하기 위한 HPAEC-PAD 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 말토올리고당 표준품(A), 이소말토올리고당 표준품(B), 이소말툴로오스 표준품(C) 및 올리고당 효소(Tt-LIMO)를 반응시켜 생성된 생성물(D)의 HPAEC-PAD 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 Panose 및 IG 2 내지 7 RT를 확인하기 위한 표준품 크로마토그램을 나타낸 도이다(IG2: isomaltose, IG3: isomaltotriose, IG4: isomaltotetraose, P: Panose).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 1) 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열로 이루어진 당전이효소(TP-DDase)의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양한 배양물을 제조하는 단계;

2) 상기 배양물로부터 당전이효소(TP-DDase)를 수득하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)에서 수득한 당전이효소(TP-DDase)를 이소말툴로오스에 첨가하여 반응시키는 단계; 를 포함하는 이소말툴로오스 유래 올리고당 제조 방법을 제공한다.

상기 이소말툴로오스(Isomaltulose)의 다른 이름은 팔라티노스(Palatinose)로 하기 화학식 1의 구조를 가진다. 이소말툴로오스는 글루코스(glucose)와 프럭토스(fructose)가 α-1,6 결합을 이루고 있는 설탕의 구조이성질체로 섭취시 충치를 일으키지 않고, 혈중 인슐린 농도의 증감이 완만히 이루어져 당뇨병식으로 적용이 가능하다는 장점이 있다.

<화학식 1>

상기 단계 3)의 반응은 당전이효소에 의해 수행되는 반응을 지칭한다. 반응 용액은 일반적으로 기질인 이소말툴로오스와 가용화 전분, 물, 임의의 다른 성분을 포함하는 용액 중 적어도 하나 이상을 포함하고 여기에 활성 당전이효소를 더 포함하는 용액을 지칭한다. 물, 기질로서 이소말툴로오스와 가용화 전분 및 당전이효소를 접촉시키는 단계가 수행되는 곳은 반응 용액이다. 상기 반응에서는 당전이효소의 활성을 통해 이소말툴로오스에 가용화 전분을 전달하여 결합을 형성시켜 이소말툴로오스 유래 올리고당을 생성하는 반응이 일어난다.

상기 단계 3)의 기질들과 당전이효소의 반응은 20 내지 60℃에서 이루어지는 것일 수 있고, 바람직하게는 30 내지 50℃에서 이루어지는 것일 수 있다.

상기 단계 3)의 기질과 당전이효소의 반응은 2 내지 10시간 동안 이루어지는 것일 수 있고, 바람직하게는 3 내지 9시간 동안 이루어지는 것일 수 있으며, 더 바람직하게는 4 내지 8시간 동안 이루어지는 것일 수 있다.

상기 단계 3)의 당전이효소는 20 내지 80㎕ 첨가될 수 있고, 바람직하게는 30 내지 70㎕ 첨가될 수 있으며, 더 바람직하게는 40 내지 60㎕ 첨가될 수 있다.

상기 이소말툴로오스의 농도는 2 내지 10mM 일 수 있고, 바람직하게는 3 내지 8mM일 수 있으며, 더 바람직하게는 4 내지 6mM 일 수 있다.

상기 방법으로 생성된 올리고당은 중합도(Degree of polymerization)가 7 내지 10인 올리고당일 수 있다.

상기 방법으로 생성된 올리고당은 α-1,6 결합으로만 구성된 올리고당 일 수 있다.

상기 단계 3)에서 얻은 생성물은 중합도가 4 내지 10인 올리고당일 수 있고, 중합도가 5 내지 9일 수 있고, 중합도가 6 내지 8일 수 있고, 바람직하게는 중합도가 7일 수 있다.

또한, 상기 단계 3)에서 얻은 생성물은 전체 중량에 대하여 0.3 내지 11.5 중량 % 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 3 내지 11.5 중량 % 포함하는 것일 수 있고, 더 바람직하게는 6 내지 11.4 % 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 단계 3)에서 얻은 생성물은 <화학식 1>의 이소말툴로오스(팔라티노스)가 가장 오른쪽에 배열되고, 왼쪽 6번 탄소에 포도당이 하나씩 α-1,6 결합으로 연결되어 중합되는 올리고당일 수 있다.

본 발명에 있어서 이소말툴로오스 유래 올리고당 제조효소(Tt-LIMO)는 고중합 이소말토올리고당 제조용 당전이효소(TP-DDase)와 같은 의미로 사용된다.

상기 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 고중합 이소말토올리고당 제조용 당전이효소(TP-DDase)는 이소말툴로오스를 기질로 이용하여 올리고당을 제조할 수 있다.

상기 올리고당은 중합도가 2인 이소말토오스는 화학식 1, 중합도가 3인 이소말토트리오스는 화학식 2 또는 중합도가 4 내지 10인 올리고당은 화학식 3의 구조를 갖는 것이 바람직하다.

<화학식 2>

<화학식 3>

<화학식 4>

상기 당전이효소는 덱스트란 덱스트리나아제(Dextran dextrinase)일 수 있다.

상기 올리고당은 중합도(Degree of polymerization)가 7 내지 10일 수 있다.

상기 당전이효소는 써모안아에로박터 써모코프리애 (Thermoanaerobacter thermocopriae) 균주 유래일 수 있다.

당 전이 반응이 일어나는 탄수화물 활성 효소로는 크게 glycosyl transferase(GTase), transglucosidases(TGase), glycoside phosphorylase(GPase) 및 glycoside hydrolases(GHase) 등 네 가지로 분류되며 이 중 glycosyl transferase(GTase)는 당 전이 효율이 좋고 다양한 수용체에 당을 전이할 수 있는 능력이 뛰어나다.

덱스트란 덱스트리나아제(Dextran dextrinase, DDase)는 상기 당전이효소(glycosyl transferase, GTase)의 일종으로 비환원 말단인 α-1,4 결합의 글루코실기 말단을 α-1,6 결합으로 전이한다.

상기 α-1,4 결합은 α-D 포도당 분자가 인접한 α-D 포도당 분자 고리와 탄소 1 및 4를 통해 서로 연결된 공유 결합의 유형을 지칭한다.

상기 α-1,6 결합은 α-D 포도당 분자가 인접한 α-D 포도당 분자 고리와 탄소 1 및 6을 통해 서로 연결된 공유 결합의 유형을 지칭한다.

본 발명의 올리고당은 포도당이 α-(1,4)- 및/또는 α-(1,6)-글루코시드의 분지결합으로 이루어진 중합도가 3 내지 10인 다당류를 지칭한다.

본 발명의 올리고당의 분자량은 중량 평균 중합도(DPw) 또는 수 평균 중합도(DPn)로 나타낼 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 덱스트란 덱스트리나아제는 당전이효소라고도 할 수 있으며, DDase 또는 TP-DDase라고 기재할 수 있다.

본 발명에 있어서 당전이효소(TP-DDase)는 중합도 2 내지 6의 중합도가 낮은 올리고당 뿐만 아니라 중합도가 7 내지 10인 중합도가 높은 고중합 올리고당까지 생성할 수 있다.

또한, 상기 당전이효소(TP-DDase)는 '변이체'를 포함하며, '변이체'는 상기 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 당전이효소(TP-DDase)와 90% 이상의 상동성을 가지는 단백질을 말한다.

"상동성"이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 당전이효소(TP-DDase)를 코딩하는 아미노산 서열(서열번호 5)과 바람직하게는 90%이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98%이상 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

또한, 본 발명의 당전이효소(TP-DDase) 또는 이의 상동체는 효소 활성을 가지는 한 아미노산 서열 변이체를 포함한다. 서열 변이체란 천연의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 변이체 단백질은 야생형 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내나, 단백질의 특성이 변형된 변이체일 수 있다. 바람직하게는 아미노산 서열상의 변이와 수식으로 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증대될 수 있다. 예를 들어, 천연의 단백질이 효소 활성을 보이지 않는 강산성에서도 효소 활성을 나타낼 수 있고, 저온이나 고온에서도 효소 활성을 나타낼 수 있다. 또한 아미노산 서열상의 변이와 수식으로 당전이효소의 기질 특이성을 강화되거나 효소와 반응하는 기질의 종류가 확대된 변이체일 수 있다.

본 발명의 당전이효소(TP-DDase)는 서열번호 5로 나타내는 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 이용하여 유전공학적 방법을 통해 생산될 수 있다. 본 발명에서 상기 재조합 벡터는 상기 당전이효소(TP-DDase) 유전자의 효율적인 발현을 위해 발현벡터를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 "발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 본 발명의 발현벡터는 적합한 발현 벡터가 일반적으로 가지고 있는 요소로서 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈 같은 발현조절 요소들을 포함한다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 융합 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.

발현벡터는 통상의 모든 발현벡터를 다 사용할 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 사용될 수 있다. 플라스미드 DNA의 구체적인 예로는 pET28a, pET 같은 상업적인 플라스미드를 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 플라스미드의 다른 예로는 대장균 유래 플라스미드(pET28a, pET, pGEX, pQE, pDEST 및 pCOLD), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50)가 있다. 파아지 DNA의 구체적인 예로는 λ-파아지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP)가 있다. 또한, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 또는 백시니아 바이러스(vaccinia virus)와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스(baculovirus)와 같은 곤충 바이러스가 또한 사용될 수 있고, 상기 당전이효소(TP-DDase) 유전자의 효율적인 발현을 위해서는 상기 대장균 유래 플라스미드(pET28a, pET, pGEX, pQE, pDEST 및 pCOLD)를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 발현벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로,목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다.

본 발명에 있어서 형질전환체는 본 발명의 재조합벡터를, 상기 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주 속에 도입함으로써 얻게 된다. 숙주의 종류로는 에셰리키아(Esherichia)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 랄스토니아(Ralstonia)속, 알칼리게네스(Alcaligenes)속, 코마모나스(Comamonas)속, 버크홀데리아(Burkholderia)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 플라보박테리움(Flabobacterium)속, 비브리오(Vibrio)속, 엔테로박터(Enterobacter)속, 리조비움(Rhizobium)속, 글루코노박터(Gluconobacter)속, 아시네토박터(Acinetobacter)속, 라셀라(Moraxella)속, 트로조모나스(Nitrosomonas)속, 아에로모나스(Aeromonas)속, 파라코커스(Paracoccus)속, 바실루스(Bacillus)속, 클로스트리디움(Clostridium)속, 락토바실루스(Lactobacillus)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 아르트로박터(Arthrobacter)속, 아크로모박터(Achromobacter)속, 미크로코커스(Micrococcus)속, 마이코박테리움(Mycobacterium)속, 스트렙토코커스 (Streptococcus)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 악티노마이세스(Actinomyces)속, 노카르디아(Nocardia)속, 메틸로박테리움(Methylobacterium)속 등의 각종 세균을 사용할 수 있다. 또, 상기 세균 이외에, 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 칸디다(Candida)속 등의 효모, 또한 각종 곰팡이 등을 숙주로 사용할 수 있다. 본 발명에서는 BL21(DE3), Rosetta(DE3), Rosetta2(DE3), ArcticExpress(DE3), STAR(DE3), C41(DE3) 및 C43(DE3)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 대장균을 숙주로 이용하는 것이 보다 바람직하다. 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우는, 본 발명의 재조합 벡터는, 그 자신이 숙주 속에서 자율 복제가능 한 동시에, 프로모터, 당전이효소 유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 갖는 것이 바람직하다. 세균에의 재조합 DNA의 도입방법으로서는, 염화칼슘법이나 일렉트로포레이션법(Method Enzymol., 194, 182-187(1990)), 스페로플라스트법(Proc. atl.Acad. Sci.USA, 84, 1929-1933(1978)), 아세트산리튬법(J. Bacteriol., 153, 63-168(1983)) 등이 이용 가능하다.

또한, 재조합벡터는 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자 또는 균체 밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 포함하는 것도 가능하다.

본 발명에 있어서 당전이효소(TP-DDase)의 제조는 상기 형질전환체를 배양한 배양물(배양균체 또는 배양상층액) 속에 유전자 산물인 당전이효소(TP-DDase)를 생성, 축적시킨 후, 상기 배양물로부터 당전이효소(TP-DDase)를 취득함으로써 행하여진다.

본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다.

또 배양방법은, 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다. 대장균 등의 세균을 숙주로 해서 얻게 된 형질전환체의 배지로서는, 완전배지 또는 합성배지, 예를 들면 LB배지, M9배지 등을 들 수 있다. 또, 배양온도는 상기 언급한 적정 온도의 범위에서 배양함으로써 당전이효소를 균체 내에 축적시키고 회수할 수 있다.

미생물의 증식에 필요한 탄소원은 예를 들면 글루코스, 프럭토스, 슈크로스, 말토스, 갈락토스, 전분 등의 당류; 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급알콜류;글리세롤 등의 다가알콜류; 아세트산, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 락트산, 글루콘산 등의 유기산; 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산 등의 지방산 등을 이용할 수 있다.

질소원으로서는, 예를 들면 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄등의 암모늄염 외에, 펩톤, 고기즙, 효모엑기스, 맥아엑기스, 카제인분해물, 옥수수 침지액 등의 천연물유래의 것을 들 수 있다. 또, 무기물로서는, 예를 들면 인산 제1칼륨,인산 제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨 등을 들 수 있다. 또한, 배양액에, 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가할 수 있다.

형질전환한 미생물을 배양하는 경우는 프로모터의 종류에 적합한 유도물질을 배지에 첨가하여 목적하는 단백질을 생산할 수 있다. 유도물질의 예로, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 테트라사이클린, 인돌아크릴산(IAA) 등을 유도물질로 사용할 수 있다. 당전이효소의 취득 및 정제는 얻게 되는 배양물 중으로부터 균체 또는 상층액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 추출, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피, 겔 여과 등을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 행할 수 있다. 얻게 된 정제물질이 목적의 효소인 것의 확인은, 통상의 방법, 예를 들면 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE), 웨스턴블랏팅(western blotting) 등에 의해 행할 수 있다.

또한, 숙주로서 미생물을 사용한 형질전환체의 배양, 형질전환체에 의한 당전이효소(TP-DDase)의 생산과 균체 내에의 축적, 및 균체로부터의 당전이효소(TP-DDase)의 회수는 상기의 방법에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 써모안아에로박터 써모코프리애 균주로부터 분리한 해당효소 Tt-LIMO를 코딩하는 유전자를 이용하여 제한효소 EcoRI 및 XhoI로 절단한 2463bp의 Tt-ILMO를 코딩하는 염기 서열을 포함한 재조합 벡터를 제작하고(도 1 및 도 2 참조), 상기 재조합 벡터를 대장균에 도입하여 제작한 형질전환체에서 당전이효소(TP-DDase)인 이소말툴로오스 유래 올리고당 제조효소를 생산하였다. 상기 당전이효소를 이소말툴로오스 기질 및 가용성 전분과 반응시킨 결과, α-1,6 결합으로만 이루어지고, 중합도가 7인 구성 당의 중합도가 긴 올리고당을 생성할 수 있는 것을 확인하였다(도 4 내지 도 6 참조).

따라서, 이소말툴로오스를 기질로 하여 올리고당을 제조하는 활성이 없는 일반 올리고당 제조효소와 달리 본 발명의 당전이효소인 이소말툴로오스 유래 올리고당 제조효소를 이용한 올리고당 제조방법은 이소말툴로오스를 기질로 하여 α-1,6 결합으로만 이루어진 중합도가 2 내지 7인 고가의 고중합도의 올리고당을 제조할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 이소말툴로오스 유래 이소말토올리고당 제조효소(Tt-LIMO)를 암호화하는 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환체의 제조

<1-1> 이소말툴로오스 유래 이소말토올리고당 제조효소(Tt-LIMO)를 암호화하는 염기 서열의 증폭

당전이효소(TP-DDase)인 이소말툴로오스 유래 이소말토올리고당 제조효소(Tt-LIMO) 단백질을 생산하기 위해 상기 효소를 암호화하는 염기 서열을 증폭하였다.

구체적으로, 써모아나에로박터 써모코프리애(Thermoanaerobacter thermocopriae) 균주(RIKEN, Tokyo, Japan)로부터 분리한 DNA를 주형으로 사용하여, 제한효소 사이트(EcoRI, XhoI)를 포함하는 하기 표 1의 염기 서열을 가지는 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다.

그 결과, 전체 유전자(고리형 이소말토올리고당 당전이효소, cyclo-isomaltooligosacharride glucanotransferase, TPCITase ; 4680bp)(서열번호 1) 중 C-말단의 2463bp(서열번호 2)를 포함하는 TP-DDase를 암호화하는 염기서열의 PCR 산물을 수득하였다(도 1).

서열번호	서열(5'-3')
서열번호3 (정방향)	GGATCCCCGGAATTCATGATTTATGTAAAGCGTACGATAACCAC
서열번호4 (역방향)	ATGCGGCCGCTCGAGTTAAAAATCAGGTAATCGTAGATCAAACC

<1-2> 재조합 벡터 및 형질전환체의 제조

당전이효소(TP-DDase)의 클로닝을 위해 상기 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 대량으로 수득한 PCR 산물(TP-DDase)을 발현벡터인 pET28a()에 제한효소인 NdeI와 XhoI을 이용하여 재조합 벡터(Tt-LIMO plasmid vector)를 제작하였다.

제작한 재조합 벡터를 통상적인 형질전환 방법에 이하여 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환하였다. 제작된 형질전환체의 이소말툴로오스 유래 이소말토올리고당 제조효소(Tt-LIMO)의 활성을 분석한 후, 가장 높은 활성을 보이는 형질전환체를 분리하였으며, 상기 도입된 이소말툴로오스 유래 이소말토올리고당 제조효소(Tt-LIMO)를 암호화하는 염기 서열을 분석하여 서열번호 5의 아미노산 서열을 획득하였다.

<실시예 2> 이소말툴로오스 유래 이소말토올리고당 제조효소(Tt-LIMO) 의 제조 및 회수

상기 <실시예 1-2>에서 제작한 이소말툴로오스 유래 이소말토올리고당 제조효소(Tt-LIMO)를 암호화하는 염기 서열이 도입된 형질전환체를 50㎍/㎖의 카나마이신을 포함하는 500㎖의 LB(Difco, Sparks, MD, USA) 배지가 함유된 플라스크에 도말하고 이소말툴로오스 유래 이소말토올리고당 제조효소를 암호화하는 염기서열을 포함하는 형질전환체의 콜로니를 수득하여 37℃에서 전배양하였다. 배양시 배양액의 흡광도(optical density, OD)가 600nm에서 0.5가 되었을 때, 단백질 발현 유도제인 0.1mM의 IPTG(isoprophyl-β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하고, 18℃에서 21시간 동안 150rev/min으로 교반하면서 배양하였다. 상기 배양된 세포는 10000rpm, 4℃ 조건에서 10분간 원심분리하여 회수하였고, 25㎖의 lysis 완충용액로 현탁하여 초음파분쇄기(sonicator)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄물을 12,000rpm에서 30분간 원심분리한 후 수득한 상층액을 DEAE-650M 컬럼에 로딩하여 정제하였다. 단백질용 흡착제는 20mM sodium phosphate buffer(pH 7.4)를 사용하였으며, 컬럼에 흡착되지 않은 단백질을 취하여 정제를 완료하였다. 최종적으로 정제된 단백질의 순도는 10% Tris-Glycine SDS-PAGE Gel 분석으로 확인하였다. 상기 분석 SDS-PAGE 전기영동 분석 결과를 도 3에 나타내었고, 이소말툴로오스 유래 이소말토올리고당 제조효소(Tt-LIMO) 예상 크기인 92.4kDa의 재조합 단백질이 성공적으로 생산됨을 확인할 수 있었다(도 3).

<실시예 3> 얇은막 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography, TLC) 분석을 이용한 이소말툴로오스 유래 이소말토올리고당 제조효소(Tt-LIMO)에 의한 생성물 분석

<3-1> 이소말툴로오스 유래 이소말토올리고당 제조효소(Tt-LIMO)와 기질의 반응

다양한 단당류와 이당류를 기질(acceptor)로 이용하여 효소 활성 자리(enzyme active site)에 결합된 상태에서 가용화 전분(soluble starch)를 또 다른 기질(donor)로 당이 전이됨에 따라 결합의 종류 및 중합도별 반응성을 확인하였다.

기질로는 글루코스(glucose), 마노스(mannose), 프럭토스(fructose), 갈락토스(galactose), 람노스(rhamnose), 아라비노스(arabinose), 리보스(ribose), 팔라티노스(palatinose), 멜리바이오스(melibiose)을 사용하였으며, 각 기질 농도가 최종 5mM 함유된 80 mM의 B-R 완충용액 (pH 5.5) 50 μL에 상기 <실시예 2>에서 제조한 이소말툴로오스 유래 이소말토올리고당 제조효소(Tt-LIMO) 50 μL를 첨가하고, 40℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 이후 100℃에서 5분간 가열하여 반응을 정지시킨 후 얇은막 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography, TLC)로 분석하였다.

<3-2> 얇은막 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography, TLC) 분석

기질 특이성을 측정하기 위해 기질 1 % soluble starch에 4 mM acceptor (glucose, mannose, fructose, galactose, rhamnose, arabinose, ribose, palatinose, melibiose, kojibiose, sophorose, maltose, cellobiose, isomaltose, gentiobiose, trehalose, sucrose, raffinose, lactose)를 각각 첨가하고 효소를 넣어 40℃에서 3시간 반응시켰다. 이후, 100℃에서 5분간 처리하여 반응을 정지시킨 후 TLC로 분석하였다. 60F254 silica gel plate에 점적한 후 nitromethane/1-propanol/water (2:5:1.5, v/v/v) 조성의 용매를 사용하여 전개하였다. 전개한 TLC는 0.03 g naphthol과 100 mL의 H2SO4, 900 mL의 메탄올을 첨가한 용액으로 발색하고 양상을 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 사용한 기질 중 이소말툴로오스 유래 이소말토올리고당 제조효소(Tt-LIMO)에 팔라티노스(palatinose)가 기질(acceptor)로 작용하여 또 다른 기질(donor)인 가용성 전분(soluble starch)과 반응함으로써 올리고당 중합 반응이 일어나는 것을 확인하였다(도 4).

<실시예 4> HPAEC-PAD(High Performance Anion Exchange Chromatography with pulsed amperometric detection) 분석을 이용한 이소말툴로오스 유래 이소말토올리고당 제조효소(Tt-LIMO)에 의한 생성물 분석

상기 <실시예 3-1>에서 실시한 방법으로 각 기질을 처리한 후, HPAEC-PAD 분석을 수행하였다.

<4-1> HPAEC-PAD 분석

분석 기기로는 DIONEX ICS-5000+ SP(Thermo Fisher Scientific, 미국) 및 DIONEX ICS-5000+ DC(Thermo Fisher Scientific)를 사용하였고, 하기 표 2의 분석 조건에 따라 HPAEC-PAD 분석을 수행하였다.

컬럼(Column)	CarboPacPA-200
용리액 1 (eluent 1)	D.W.
용리액 2 (eluent 2)	500mM NaOH
용리액 3 (eluent 3)	1M Na-Acetate
기울기 조건(Gradient)	시간	E1	E2	E3
	0.00	78.0	22.0	00.0
	20.00	80.0	18.0	02.0
	30.00	65.0	20.0	15.0
	70.00	00.0	30.0	70.0
	80.00	78.0	22.0	00.0
유속(Flow Rate)	0.5㎖/min
검출(Detection)	Pulsed amperometry, gold electrode

그 결과, 하기 표 3의 머무름 시간(RT)를 확인하여 생성물의 모든 구성 당 분리가 가능한 분석조건을 설정함으로써 기질 종류별로 이소말툴로오스 유래 이소말토올리고당 제조효소(Tt-LIMO) 처리를 한 후 반응물의 정성, 정량 분석을 실시하였으며 표준품으로 사용한 물질의 RT값을 표 3에 나타내었다.

구성 당	머무름 시간(Retention Time, RT)(min)
글루코오스(glucose, G1)	2.767
이소말토오스(isomaltose, IM2)	3.484
이소말토트리오스(isomaltotriose, IM3)	4.900
말토오스(maltose, M2)	6.00
이소말토테트라오스(isomaltotetraose, IM4)	7.400
파노스(panose)	9.899
이소말토펜타오스(isomaltopentaose, IM5)	10.500
말토트리오스(maltotriose, M3)	13.217
이소말토헥사오스(isomaltohexaose, IM6)	13.967
이소말토헵타오스(isomaltoheptaose, IM7)	16.834
19.667	22.80
말토펜타오스(maltopentaose, M5)	27.32
말토헥사오스(maltohexaose, M6)	31.63
말토헵타오스(maltoheptaose, M7)	35.08

<3-2> 이소말툴로오스 기질의 생성물 분석

일반적인 이소말토올리고당 제조를 위하여 사용하는 당전이효소(Transglucosidease)는 말토오스를 기질로하여 주로 짧은 이소말토올리고당(IMO, DP 2-3) 제조에 사용되며 이는 이소말툴로스(팔라티노스)를 기질로 하여 당전이 활성을 가지는 것으로 보고되어 있지 않으며, 개발한 고중합 이소말토올리고당 제조효소를 적용하여 기질특이성 반응 결과 전분을 전달체(donor)로 하여 중합활성을 보이는 것을 확인하였다. 반응 생성물의 HPAEC-PAD 분석결과 표준품으로 넣어준 말토올리고당계열(MOs)과 이소말토올리고당계열(IMOs)의 물질과 다른 위치에서 생성물의 peak가 확인되었으며 이는 TLC반응결과를 통해서도 유추해볼 수있다. 따라서 고온성 균주 유래 고중합 이소말토올리고당 제호효소(Tt-LIMO) 및 기질혼합물의 반응물의 구성당은 단일성분의 이소말툴로스 기질(acceptor)이 TP-LIMO 작용에 의해 soluble starch의 NRE(non-reducing end)가수분해 및 당전이 반응 결과 isomaltulose(palatinose)의 NRE 포도당 6번 탄소에 포도당이 1분자 이상 중합된 생성물인 이소말툴로스 유래 올리고당(G⁶+¹palatinos(6.96), G⁶+¹G⁶+¹palatinose(10.03), G⁶+¹G⁶+¹G⁶+¹palatinose(14.33))을 확인할 수 있었다.

<3-3> 말토올리고당 계열 기질의 생성물 분석

말토올리고당 계열 기질(G2: maltose, G3: maltotriose, G4: maltotetraose, G5: maltopentaose)과 이소말툴로오스 유래 이소말토올리고당 제조효소(Tt-LIMO)를 반응시킨 경우의 생성물의 머무름 시간을 이용하여 구성 당의 중합도를 분석하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 말토올리고당의 α-1,4 결합이 가수분해되어 포도당이 생성되었고, 비환원말단으로의 당 전이 반응을 통해 α-1,6 결합이 생성되어 반응액 내 구성 당 중 포도당이 44~51% 생성되었다. 하기 표 4에 나타낸 바와 같이 중합도가 6 이하인 이소말토올리고당은 전체 생성물의 38 내지 40%, 중합도 7 이상인 이소말토올리고당은 2.1 내지 6.3% 비율을 차지하였다. 또한, 생성물 중 이소말토올리고당의 비율이 가장 높은 기질은 말토테트라오스(maltotetraose, M4)였다. 말토올리고당 계열 기질을 사용한 경우 중합도가 6 이상인 이소말토올리고당 생성시 이중, 삼중 피크가 발견되어 이는 순수한 α-1,6 결합으로 이루어진 이소말토올리고당이 아닌 α-1,4 결합이 동시에 존재하는 이소말토올리고당인 것으로 확인되었다.

기질/생성물	비 이소말토올리고당(%)	DP 6 이하 이소말토올리고당(%)	DP 7 이상 이소말토올리고당(%)
말토오스	58.8188	38.0334	3.1478
말토트리오스	58.077	39.7637	2.1593
말토테트라오스	53.8184	39.8555	6.3261
말토펜타오스	59.5695	38.2983	2.1322

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Method for producing oligosaccharides derived from isomaltulose using sugar transferase for preparing highly polymerized isomaltooligosaccharide <130> 2019p-09-026 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4680 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TPCITase coding sequence <400> 1 atgttgtctc tttatagaag aaaactcttt ataacaattt taatagtaat tttcgtgttg 60 tctaactttt tcacattatt tacttatcct atctcaccag gagtttctgt tgcttatgcc 120 gcttcaacag gtaatttgat tcaacgggtt tatacagata aagctcgata taatccaggg 180 gatcttgtta ccattagtgc tgatttaatt aataaaactg gttcgacatg gtccggcact 240 ttaactcttc agattaataa actagaaagc caaatttaca ctgcaagtca gtcagttact 300 cttgccaatg gggattcaac tacaatcaca tttacatgga ctgctccacc taccgacttt 360 gttggttatt atgccggaat tgcggcagga agtacagatt tcaatggaac aggtatcgat 420 gtaagttcct ctccgcttcg gtttcctcgc tatggtttta tctcaaactt tcctgtttca 480 cagactgccc agcaatccac agatatagtt aaacagatgg tggaagacta tcatcttaat 540 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cgcagataac ccgcgctggt gatttcatct acaaaaacat tggcgcttct 3960 gggtttggtc cggctgatgc ttctatctgg gaggagcagg tcgagtataa tatttttact 4020 caagttactt atgccgcagg attgaatgct ggacggttgt tagcccaaga aaaaggtgat 4080 attactcgtt caaataacta tttgtcgggt gctcaaacca tcaaggatgc gattctacga 4140 tcgtttttgt cttcaccacg aggtctctgg aataaatcta atcgctattt taatcgggcg 4200 atcaatacag acggtacagc gcgaacgacg gttgatgctt catcggactt gatttgggtt 4260 tttggtctcc tttcaccgac tgatactagg attcgagatc accgcattaa ggtactatca 4320 cggctgaccc atgataggta cggcattgct cgatatgaaa acgatgagtt ctattattct 4380 agtccatata gccccggtgg acagtatgag gctggcgcag ccgaaccagt ttggccacaa 4440 atgactatgt acgcgtctat gattgagcat tggaggggtg atgatgccac tgcactggct 4500 cggcttaagt ggtatgtcag ccgaactgct cgcggctatg tcacacccgg tgaagctgtg 4560 gactggacca atggtcaacc gcttatcagt acagcagttg aaccagtaac gggctcctgg 4620 tttcagatgg cggtccttac ttacttaaac cggtttgatc tacgattacc tgatttttaa 4680 4680 <210> 2 <211> 2463 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DDase coding sequence <400> 2 atgatttatg taaagcgtac gataaccaca ccgccagatg gacagtatga agcagaatat 60 gctattaaaa gtggcactaa catcaatacc gatcatacag gatatactgg cagcggtttt 120 gtagacaact ttgatgctag tgataaaggt gtatcgttta ttataaatgt tccaactagt 180 gatacctaca cgcttcgatt ccgatatgga aacggcggta ctactattgc cacgcgaact 240 ttatttattg atggtcagta tgcaggtact ctccaattcc gaaatcttta taactgggat 300 gtgtgggata cagtggaaac cactgtgtgg ctttcagcgg gtgttcatca agtggtactt 360 tggtacagtt ccgaaaatga tggtgctatt aatcttgata acctgattgt tctacaacaa 420 actactccaa caagaacttc ggctcgctcc ttttggatga ataactggtc caacttgata 480 ggtattcaca tggctagcaa attaagcccg actgataatg gaaattatgg ccctcgcctg 540 gctgaacttc atttcagagg cgattggcct actaatcaaa tcgtagatgc aactgctttt 600 ttccgagatg aaacggatct tactcccata aagtatacca atgctcatag ctttgattct 660 gaagcatggt ttgaaaacga cgggactctt accgtgagat atctgaccta taatggctca 720 gccttgccag tacagattac caaacaatac gccatggtgc ctaaccaaaa ttttcttgtg 780 atcaaatata cttttttaaa ccagacaagt agcgcacgta ctttaaactt tctagaacaa 840 gttcatttga acaacaggac tagtagcgat ccgaatccag ggtggcaaca tggctggtgg 900 gacgtgagtc gaaatgcact tggtactgac atgagccaga ctggtcagtt ctatattgaa 960 ttgggtgctt ttcagactat ggatagttat caggtgggta atgacgccga ttccaatcct 1020 aacagtcaga cgtcatcacc gtggtatcag ttcgacgcca acggtgttct aaataggtgc 1080 ggtgatcttt ggtcacagaa tcttagcatg ggttttcaga aacttattac cgtgcctgct 1140 ggaggtagtg taacattggc tttttattat gctatcggtt caactcagga ggaagcggaa 1200 gcagcagcag atttagctcg atctcagaca gctgactact ggtttaccca aactgctgcc 1260 gagtataata attggcttaa cagcggccag cgggttaata cgtctgatat tggtatcaat 1320 actgcctttg atcggagcct catcataaac aaacaggcac aacatccgga gtttggttcc 1380 tggcccgcgg ctacaaatcc ctcttatcag tacaaggtgt gggttcgtga ctcagctgta 1440 acagctatgg gaatggatgc tgctaatcat ctttctgagg cggaaaagta ttggaactgg 1500 atggcctctg ttcaaaatac agatgggaca tggcatacaa attataatgt atggaaggca 1560 aatgaatgga tctcgtttgt ggagcctgaa cacgatgcca ttggactttt tctcatcggg 1620 gtttatcaac attacagttt actcaaatcc cgcgattcct cggcagcgac gacttttctg 1680 aataacattt ggacgcagat aacccgcgct ggtgatttca tctacaaaaa cattggcgct 1740 tctgggtttg gtccggctga tgcttctatc tgggaggagc aggtcgagta taatattttt 1800 actcaagtta cttatgccgc aggattgaat gctggacggt tgttagccca agaaaaaggt 1860 gatattactc gttcaaataa ctatttgtcg ggtgctcaaa ccatcaagga tgcgattcta 1920 cgatcgtttt tgtcttcacc acgaggtctc tggaataaat ctaatcgcta ttttaatcgg 1980 gcgatcaata cagacggtac agcgcgaacg acggttgatg cttcatcgga cttgatttgg 2040 gtttttggtc tcctttcacc gactgatact aggattcgag atcaccgcat taaggtacta 2100 tcacggctga cccatgatag gtacggcatt gctcgatatg aaaacgatga gttctattat 2160 tctagtccat atagccccgg tggacagtat gaggctggcg cagccgaacc agtttggcca 2220 caaatgacta tgtacgcgtc tatgattgag cattggaggg gtgatgatgc cactgcactg 2280 gctcggctta agtggtatgt cagccgaact gctcgcggct atgtcacacc cggtgaagct 2340 gtggactgga ccaatggtca accgcttatc agtacagcag ttgaaccagt aacgggctcc 2400 tggtttcaga tggcggtcct tacttactta aaccggtttg atctacgatt acctgatttt 2460 taa 2463 <210> 3 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer1 forward <400> 3 ggatccccgg aattcatgat ttatgtaaag cgtacgataa ccac 44 <210> 4 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer2 reverse <400> 4 atgcggccgc tcgagttaaa aatcaggtaa tcgtagatca aacc 44 <210> 5 <211> 821 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TP-DDase <400> 5 Asp Met Ile Tyr Val Lys Arg Thr Ile Thr Thr Pro Pro Asp Gly Gln 1 5 10 15 Tyr Glu Ala Glu Tyr Ala Ile Lys Ser Gly Thr Asn Ile Asn Thr Asp 20 25 30 His Thr Gly Tyr Thr Gly Ser Gly Phe Val Asp Asn Phe Asp Ala Ser 35 40 45 Asp Lys Gly Val Ser Phe Ile Ile Asn Val Pro Thr Ser Asp Thr Tyr 50 55 60 Thr Leu Arg Phe Arg Tyr Gly Asn Gly Gly Thr Thr Ile Ala Thr Arg 65 70 75 80 Thr Leu Phe Ile Asp Gly Gln Tyr Ala Gly Thr Leu Gln Phe Arg Asn 85 90 95 Leu Tyr Asn Trp Asp Val Trp Asp Thr Val Glu Thr Thr Val Trp Leu 100 105 110 Ser Ala Gly Val His Gln Val Val Leu Trp Tyr Ser Ser Glu Asn Asp 115 120 125 Gly Ala Ile Asn Leu Asp Asn Leu Ile Val Leu Gln Gln Thr Thr Pro 130 135 140 Thr Arg Thr Ser Ala Arg Ser Phe Trp Met Asn Asn Trp Ser Asn Leu 145 150 155 160 Ile Gly Ile His Met Ala Ser Lys Leu Ser Pro Thr Asp Asn Gly Asn 165 170 175 Tyr Gly Pro Arg Leu Ala Glu Leu His Phe Arg Gly Asp Trp Pro Thr 180 185 190 Asn Gln Ile Val Asp Ala Thr Ala Phe Phe Arg Asp Glu Thr Asp Leu 195 200 205 Thr Pro Ile Lys Tyr Thr Asn Ala His Ser Phe Asp Ser Glu Ala Trp 210 215 220 Phe Glu Asn Asp Gly Thr Leu Thr Val Arg Tyr Leu Thr Tyr Asn Gly 225 230 235 240 Ser Ala Leu Pro Val Gln Ile Thr Lys Gln Tyr Ala Met Val Pro Asn 245 250 255 Gln Asn Phe Leu Val Ile Lys Tyr Thr Phe Leu Asn Gln Thr Ser Ser 260 265 270 Ala Arg Thr Leu Asn Phe Leu Glu Gln Val His Leu Asn Asn Arg Thr 275 280 285 Ser Ser Asp Pro Asn Pro Gly Trp Gln His Gly Trp Trp Asp Val Ser 290 295 300 Arg Asn Ala Leu Gly Thr Asp Met Ser Gln Thr Gly Gln Phe Tyr Ile 305 310 315 320 Glu Leu Gly Ala Phe Gln Thr Met Asp Ser Tyr Gln Val Gly Asn Asp 325 330 335 Ala Asp Ser Asn Pro Asn Ser Gln Thr Ser Ser Pro Trp Tyr Gln Phe 340 345 350 Asp Ala Asn Gly Val Leu Asn Arg Cys Gly Asp Leu Trp Ser Gln Asn 355 360 365 Leu Ser Met Gly Phe Gln Lys Leu Ile Thr Val Pro Ala Gly Gly Ser 370 375 380 Val Thr Leu Ala Phe Tyr Tyr Ala Ile Gly Ser Thr Gln Glu Glu Ala 385 390 395 400 Glu Ala Ala Ala Asp Leu Ala Arg Ser Gln Thr Ala Asp Tyr Trp Phe 405 410 415 Thr Gln Thr Ala Ala Glu Tyr Asn Asn Trp Leu Asn Ser Gly Gln Arg 420 425 430 Val Asn Thr Ser Asp Ile Gly Ile Asn Thr Ala Phe Asp Arg Ser Leu 435 440 445 Ile Ile Asn Lys Gln Ala Gln His Pro Glu Phe Gly Ser Trp Pro Ala 450 455 460 Ala Thr Asn Pro Ser Tyr Gln Tyr Lys Val Trp Val Arg Asp Ser Ala 465 470 475 480 Val Thr Ala Met Gly Met Asp Ala Ala Asn His Leu Ser Glu Ala Glu 485 490 495 Lys Tyr Trp Asn Trp Met Ala Ser Val Gln Asn Thr Asp Gly Thr Trp 500 505 510 His Thr Asn Tyr Asn Val Trp Lys Ala Asn Glu Trp Ile Ser Phe Val 515 520 525 Glu Pro Glu His Asp Ala Ile Gly Leu Phe Leu Ile Gly Val Tyr Gln 530 535 540 His Tyr Ser Leu Leu Lys Ser Arg Asp Ser Ser Ala Ala Thr Thr Phe 545 550 555 560 Leu Asn Asn Ile Trp Thr Gln Ile Thr Arg Ala Gly Asp Phe Ile Tyr 565 570 575 Lys Asn Ile Gly Ala Ser Gly Phe Gly Pro Ala Asp Ala Ser Ile Trp 580 585 590 Glu Glu Gln Val Glu Tyr Asn Ile Phe Thr Gln Val Thr Tyr Ala Ala 595 600 605 Gly Leu Asn Ala Gly Arg Leu Leu Ala Gln Glu Lys Gly Asp Ile Thr 610 615 620 Arg Ser Asn Asn Tyr Leu Ser Gly Ala Gln Thr Ile Lys Asp Ala Ile 625 630 635 640 Leu Arg Ser Phe Leu Ser Ser Pro Arg Gly Leu Trp Asn Lys Ser Asn 645 650 655 Arg Tyr Phe Asn Arg Ala Ile Asn Thr Asp Gly Thr Ala Arg Thr Thr 660 665 670 Val Asp Ala Ser Ser Asp Leu Ile Trp Val Phe Gly Leu Leu Ser Pro 675 680 685 Thr Asp Thr Arg Ile Arg Asp His Arg Ile Lys Val Leu Ser Arg Leu 690 695 700 Thr His Asp Arg Tyr Gly Ile Ala Arg Tyr Glu Asn Asp Glu Phe Tyr 705 710 715 720 Tyr Ser Ser Pro Tyr Ser Pro Gly Gly Gln Tyr Glu Ala Gly Ala Ala 725 730 735 Glu Pro Val Trp Pro Gln Met Thr Met Tyr Ala Ser Met Ile Glu His 740 745 750 Trp Arg Gly Asp Asp Ala Thr Ala Leu Ala Arg Leu Lys Trp Tyr Val 755 760 765 Ser Arg Thr Ala Arg Gly Tyr Val Thr Pro Gly Glu Ala Val Asp Trp 770 775 780 Thr Asn Gly Gln Pro Leu Ile Ser Thr Ala Val Glu Pro Val Thr Gly 785 790 795 800 Ser Trp Phe Gln Met Ala Val Leu Thr Tyr Leu Asn Arg Phe Asp Leu 805 810 815 Arg Leu Pro Asp Phe 820

Claims (6)

1) 덱스트란 덱스트리나아제 (Dextran dextrinase)의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양한 배양물을 제조하는 단계;
2) 상기 배양물로부터 덱스트란 덱스트리나아제를 수득하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 수득한 덱스트란 덱스트리나아제를 이소말툴로오스에 첨가하여 반응시키는 단계; 를 포함하는,
이소말툴로오스 유래 올리고당 (isomaltulose based oligomer) 제조 방법.

삭제

제1항에 있어서, 상기 덱스트란 덱스트리나아제는 써모안아에로박터 써모코프리애 (Thermoanaerobacter thermocopriae) 균주 유래인 것을 특징으로 하는, 이소말툴로오스 유래 올리고당 제조 방법.

제1항에 있어서, 단계 1)의 재조합 벡터는 pET28a, pET, pGEX, pQE, pDEST 및 pCOLD로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 벡터인 것을 특징으로 하는, 이소말툴로오스 유래 올리고당 제조 방법.

제1항에 있어서, 단계 1)의 형질전환체는 BL21(DE3), Rosetta(DE3), Rosetta2(DE3), ArcticExpress(DE3), STAR(DE3), C41(DE3) 및 C43(DE3)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 대장균에 형질전환된 것인 것을 특징으로 하는, 이소말툴로오스 유래 올리고당 제조 방법.

제1항에 있어서, 상기 단계 3)에서 얻은 생성물은 중합도가 5 내지 9 인 이소말토올리고당을 전체 중량에 대하여 0.3 내지 11.5 중량 % 포함하는 것을 특징으로 하는, 이소말툴로오스 유래 올리고당 제조 방법.

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