KR20190141618A - 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소, 상기 효소의 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 전분 또는 말토올리고당 등을 기질로 이용할 수 있는 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소, 상기 효소의 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 내열성 사이클로덱스트란 생성효소를 제조하는 방법, 및 상기 효소를 이용하여 사이클로덱스트란을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 전분 또는 말토올리고당과 같은 저가의 기질을 이용할 수 있을 뿐만 아니라 고온에서도 안정성이 높아 대량 생산공정에 적합한 사이클로덱스트란 생성 효소를 제공할 수 있게 된다. 또한, 이러한 사이클로덱스트란 생성 효소를 이용함으로써 경제적이고 용이하게 사이클로덱스트란을 제공할 수 있어 산업적 가치가 높다.

Description

내열성 사이클로덱스트란 생성 효소, 상기 효소의 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체{Thermostable Cyclodextran Glucanotransferase, Recombinant Vector Containing Gene of the Enzyme, and Transformant Transformed by the Vector}

본 발명은 전분, 말토올리고당, 이소말토올리고당 및 덱스트란 등을 기질로 이용할 수 있는 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소, 상기 효소의 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 내열성 사이클로덱스트란 생성효소를 제조하는 방법, 및 상기 효소를 이용하여 사이클로덱스트란을 제조하는 방법에 관한 것이다.

사이클로덱스트린은 식품의 점착성 및 점도를 증가시키고 유화안정성을 증진하며 식품의 물성 및 촉감을 향상시키기 위하여 주로 이용되는 식품첨가물이다. 착향료 및 착색료의 안정제, 마요네즈의 유화성 개선제, 어육제품의 탈취제 등으로 사용된다. 흰색의 결정 또는 결정성 가루로 냄새가 없고 약간의 단맛이 나는 특성이 있다.

또한, 상기 사이클로덱스트린은 전이효소(Cycloamylose glucano transferase:CGT-Ase)를 작용시켜 생성되는데 6~8개 포도당이 각각 α-1,4 글리코시드결합을 한 고리모양의 올리고당이며, 각각을 α-사이클로덱스트린(6 개의 포도당 고리 분자), β-사이클로덱스트린(7 개의 포도당 고리 분자), γ-사이클로덱스트린(8 개의 포도당 고리 분자)이라 한다.

이러한 사이클로덱스트린은 물에 대한 용해도가 높지 않고, 포도당 6, 7, 8 개로 형성되는 내경이 한정되어 있다는 단점이 있다.

이에 따라, 이를 대체할 수 있는 소재로 사이클로덱스트란이 개발되고 있다.

그러나, 대부분의 사이클로덱스트란 생성 효소는 덱스트란과 같은 고가의 기질을 이용할 뿐만 아니라 고온에서 안정성이 낮아 경제적으로 생산하는 대량 생산공정에 적합하지 않다는 단점이 있다.

JP 4815219 B

본 발명의 주된 목적은 전분 또는 말토올리고당과 같은 저가의 기질을 이용할 수 있을 뿐만 아니라 고온에서도 안정성이 높은 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 효소를 발현하는 재조합 벡터 및 형질전환체를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용하여 사이클로덱스트란 생성 효소를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 효소를 이용하여 전분 또는 말토올리고당과 같은 저가의 기질로부터 고온에서도 안정적으로 사이클로덱스트란을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 전분, 말토올리고당, 이소말토올리고당 및 덱스트란으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 기질로 이용하는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소의 유전자를 도입한 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 벡터가 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양한 배양물을 제조하는 단계; 및 상기 배양물로부터 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소를 수득하는 단계;를 포함하는 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소를 이용하는 것을 특징으로 하는 사이클로덱스트란의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전분, 말토올리고당, 이소말토올리고당 및 덱스트란으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 기질에 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소를 첨가하여 반응시키는 단계;를 포함하는 사이클로덱스트란의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 전분 또는 말토올리고당과 같은 저가의 기질을 이용할 수 있을 뿐만 아니라 고온에서도 안정성이 높아, 대량 생산공정에 적합한 사이클로덱스트란 생성 효소를 제공할 수 있게 된다. 또한, 이러한 사이클로덱스트란 생성 효소를 이용함으로써 경제적이고 용이하게 사이클로덱스트란을 제공할 수 있어 산업적 가치가 높다.

도 1은 본 발명의 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소의 전체 유전자 TPCITase 및 상기 유전자의 C-말단의 1,509 bp가 결손된 유전자 TPCITaseΔC를 간단히 나타내는 모식도이다.
도 2(A)는 상기 C-말단의 1,509 bp가 결손된 유전자 TPCITaseΔC의 PCR 산물(3.1 kb)을 나타내는 이미지이고, 도 2(B)는 상기 결손된 C-말단을 포함하는 유전자 TPCITase C의 PCR 산물(2.4 kb)을 나타내는 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 벡터를 제조하는 과정의 모식도를 나타내는 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 사이클로덱스트란 생성 효소(TPCITase 및 TPCITaseΔC)의 SDS-PAGE 전기영동 분석 결과를 나타내는 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 사이클로덱스트란 생성 효소(TPCITase)의 SDS-PAGE 전기영동 분석 결과를 나타내는 것이다.
도 6은 말토올리고당 또는 전분으로 구성된 기질 및 본 발명에 따른 사이클로덱스트란 생성 효소(TPCITase 및 TPCITaseΔC)의 반응에 의한 반응물의 TLC 분석 결과를 나타내는 것이다.
도 7은 말토올리고당 또는 전분으로 구성된 기질 및 본 발명에 따른 사이클로덱스트란 생성 효소(TPCITase)의 반응에 의한 반응물을 분해효소로 처리한 경우의 TLC 분석 결과를 나타내는 것이다.
도 8은 본 발명의 내열성 TPCITase의 C-말단의 2,463 bp에 해당하는 유전자인 TP-DDase를 간단히 나타내는 모식도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 TP-DDase를 발현하는 재조합 벡터를 제조하는 과정의 모식도를 나타내는 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 TP-DDase의 SDS-PAGE 전기영동 분석 결과를 나타내는 것이다.
도 11은 말토올리고당으로 구성된 기질 및 TP-DDase의 반응에 의한 반응물의 TLC 분석 결과를 나타내는 것이다.
도 12는 이소말토올리고당으로 구성된 기질 및 TP-DDase의 반응에 의한 반응물의 TLC 분석 결과를 나타내는 것이다.
도 13은 본 발명의 사이클로덱스트란 생성 효소 및 전분과의 반응에 의해 생성된 산물의 HPLC 분석 결과를 나타내는 것이다.
도 14는 본 발명의 사이클로덱스트란 생성 효소 및 덱스트란과의 반응에 의해 생성된 산물의 HPLC 분석 결과를 나타내는 것이다.
도 15는 본 발명의 사이클로덱스트란 생성 효소에 의해 생성된 사이클로덱스트란의 MALDI-TOF/TOF MS 분석 결과를 나타내는 것이다.
도 16은 본 발명에 따른 사이클로덱스트란 생성 효소의 온도 변화에 따른 활성 변화를 나타내는 그래프이다.
도 17은 본 발명에 따른 사이클로덱스트란 생성 효소를 다양한 pH에서 장시간 방치한 후의 잔존 활성을 나타내는 그래프이다.
도 18은 본 발명에 따른 사이클로덱스트란 생성 효소의 pH 변화에 따른 활성 변화를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 전분, 말토올리고당, 이소말토올리고당 및 덱스트란으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 기질로 이용하는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소를 제공한다.

본 명세서에 있어서, 상기 "전분"은 쌀 전분, 보리 전분, 콩 전분, 조 전분, 기장 전분, 수수 전분, 밀 전분, 옥수수 전분, 귀리 전분, 메밀 전분, 감자 전분 및 고구마 전분으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 어떠한 염기서열로 이루어질 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 한다. 상기 효소는 써모아나에로박터 써모코프리애(Thermoanaerobacter thermocopriae) 균에서 유래한다.

본 발명에 있어서, 상기 "사이클로덱스트란(cyclodextran)"은 덱스트란으로부터 생성되는 α-1,6 결합 구조의 cyclic form의 올리고당으로서, 고리형 이소말토올리고당(cyclo-isomaltooligosaccharide; "CI")이라고도 한다. 글루코오스 7 분자가 α-1,6 결합에서 연결된 사이클로덱스트란을 CI-7, 글루코스 8 분자가 α-1,6 결합에서 연결된 사이클로덱스트란을 CI-8, 글루코스 9 분자가 α-1,6 결합에서 연결된 사이클로덱스트란을 CI-9라고 한다. 상기 사이클로덱스트란은 α-1,4 결합 구조의 cyclic form의 올리고당인 사이클로덱스트린에 비해 100 배 이상 수용성이 뛰어난 소재이다.

본 명세서에 있어서, "사이클로덱스트란 생성 효소(CITase)"는 고가의 기질인 덱스트란(α-1,6 글루칸) 또는 최소 포도당이 7개 이상 연결된 직쇄형 이소말토올리고당으로부터 사이클로덱스트란을 생성하는 효소를 말한다. 종래에는 상기 사이클로덱스트란 생성 효소(CITase)가 사이클로덱스트란을 생성하기 위한 기질로 주로 덱스트란을 사용하였기 때문에 생산단가가 높을 수밖에 없었다. 본 발명은 상기 덱스트란 대신 전분 또는 말토올리고당과 같은 저가의 기질로부터 사이클로덱스트란을 제공하기 위한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 "사이클로덱스트란 생성 효소"는 사이클로덱스트란 당전이 효소(cyclodextran glucanotransferase), 고리형 이소말토올리고당 당전이 효소(cyclo-isomaltooligosaccharide glucanotransferase)라고도 할 수 있으며, "CITase"라고도 기재할 수 있다.

본 발명의 사이클로덱스트란 생성 효소는 CI-7 내지 CI-9의 저분자 사이클로덱스트란부터 CI-10 내지 CI-20의 고분자 사이클로덱스트란까지 생성할 수 있다.

또한, 본 발명의 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소(TPCITase)는 덱스트란 대신 상기 전분 또는 말토올리고당과 같은 저가의 기질로부터 직쇄형 이소말토올리고당을 생성할 수 있다.

한편, 상기 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소(TPCITase)는 길이가 4,680 bp이며, C-말단의 1,509 bp의 염기서열이 결손된 경우 상기 직쇄형 이소말토올리고당을 생성할 수 없는 것을 구체적 사례를 통해 확인하였다. 이러한 결과로부터, 상기 사이클로덱스트란 생성 효소(TPCITase)에서 상기 C-말단 부위가 전분 또는 말토올리고당과 같은 기질로부터 직쇄형 이소말토올리고당을 생성하는 역할을 한다는 것을 추측할 수 있다.

즉, 본 발명의 효소는 상기 전분 또는 말토올리고당 등의 기질로부터 직쇄형 이소말토올리고당을 생성할 수 있고, 상기 생성된 직쇄형 이소말토올리고당으로부터 사이클로덱스트란을 생성할 수 있다는 것을 유추할 수 있다. 즉, 본 발명의 효소를 이용하면 전분 또는 말토올리고당과 같은 저가의 기질로부터 CI-7 내지 CI-20 중 어느 하나 이상의 사이클로덱스트란을 포함하는 효소 반응물을 제조할 수 있어 매우 경제적이다.

특히, 본 발명에 의하면 거대분자의 가용화에 용이한 CI-15 내지 CI-20 사이클로덱스트란이 전체 사이클로덱스트란 중량에 대하여 0.1 내지 4 중량%으로 포함된 효소 반응물을 제공할 수 있게 된다. 상기 CI-15 내지 CI-20 사이클로덱스트란은 포접능이 높으며, 분자량이 커질수록 거대분자를 포접(inclusion)하기가 매우 용이하다.

본 발명에 있어서, 상기 "사이클로덱스트란 생성 효소"는 사이클로덱스트란 당전이 효소(cyclodextran glucanotransferase), 고리형 이소말토올리고당 당전이 효소(cyclo-isomaltooligosaccharide glucanotransferase)라고도 할 수 있으며, "CITase"라고도 기재할 수 있다.

또한, 상기 사이클로덱스트란 생성 효소는 '변이체'를 포함하며, '변이체'는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 사이클로덱스트란 생성 효소와 90% 이상의 상동성을 가지는 단백질을 말한다.

"상동성"이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 사이클로덱스트란 생성 효소를 코딩하는 아미노산 서열(서열번호 1)과 바람직하게는 90%이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98%이상 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

또한 본 발명의 사이클로덱스트란 생성 효소 또는 이의 상동체는 효소 활성을 가지는 한 아미노산 서열 변이체를 포함한다. 서열 변이체란 천연의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 변이체 단백질은 야생형 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내나, 단백질의 특성이 변형된 변이체일 수 있다. 바람직하게는 아미노산 서열상의 변이와 수식으로 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증대될 수 있다. 예를 들어, 천연의 단백질이 효소 활성을 보이지 않는 강산성에서도 효소 활성을 나타낼 수 있고, 저온이나 고온에서도 효소 활성을 나타낼 수 있다. 또한 아미노산 서열상의 변이와 수식으로 사이클로덱스트란 생성 효소의 기질 특이성을 강화되거나 효소와 반응하는 기질의 종류가 확대된 변이체일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 사이클로덱스트란 생성 효소는 40 내지 50 ℃에서 0.01 내지 24 시간 동안 방치한 후에도 100%의 잔존활성을 나타내는 것을 구체적인 실시예를 통해 확인하였다. 그리고, 상기 효소는 50 내지 60 ℃에서 0.01 내지 24 시간 동안 방치한 후에도 60 % 이상의 잔존활성을 나타내는 것을 구체적인 실시예를 통해 확인하였다.

즉, 본 발명에 따르면, 고온에서도 안정성이 높아 대량 생산공정에 적합한 사이클로덱스트란 생성 효소를 제공할 수 있게 된다.

상기 내열성의 사이클로덱스트란 생성 효소는 40 내지 60 ℃의 고온 영역에서도 높은 활성을 지니고 있어 활용범위가 더욱 넓어질 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소 유전자를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 염기서열은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 어떠한 염기서열일 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열인 것을 특징으로 한다. 상기 유전자는 써모아나에로박터 써모코프리애(Thermoanaerobacter thermocopriae) 균에서 유래한다. 상기 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소 유전자의 full-length cDNA는 1559개 아미노산의 폴리펩타이드를 코딩한다.

상기 유전자는 사이클로덱스트란 생성 효소를 코딩하는 유전자라면 어떤 염기서열을 가지는 것이라도 포함되나 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 유전자이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 사이클로덱스트란 생성 효소 유전자를 도입한 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 사이클로덱스트란 생성 효소는 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 이용하여 유전공학적 방법을 통해 생산되어질 수 있다. 본 발명에서 상기 재조합 벡터는 상기 사이클로덱스트란 생성 효소 유전자의 효율적인 발현을 위해 발현벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 "발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 본 발명의 발현벡터는 적합한 발현벡터가 일반적으로 가지고 있는 요소로서 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈 같은 발현조절 요소들을 포함한다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

또한, 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 융합 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.

발현벡터는 통상의 모든 발현벡터를 다 사용할 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 사용될 수 있다. 플라스미드 DNA의 구체적인 예로는 pET28a, pET 같은 상업적인 플라스미드를 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 플라스미드의 다른 예로는 대장균 유래 플라스미드(pET28a, pET, pGEX, pQE, pDEST 및 pCOLD), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50)가 있다. 파아지 DNA의 구체적인 예로는 λ-파아지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP)가 있다. 또한, 리트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 또는 백시니아 바이러스(vaccinia virus)와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스(baculovirus)와 같은 곤충 바이러스가 또한 사용될 수 있고, 상기 사이클로덱스트란 생성 효소 유전자의 효율적인 발현을 위해서는 상기 대장균 유래 플라스미드(pET28a, pET, pGEX, pQE, pDEST 및 pCOLD)를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 발현벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다.

본 발명의 일 실시예에서는 상기 사이클로덱스트란 생성 효소 유전자를 플라스미드 벡터 pET28a(+)에 도입하여 재조합 발현벡터를 제작하였다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 사이클로덱스트란 생성 효소 유전자가 도입된 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 형질전환체는 본 발명의 재조합벡터를, 상기 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주 속에 도입함으로써 얻게 된다. 숙주의 종류로는 에셰리키아(Esherichia)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 랄스토니아(Ralstonia)속, 알칼리게네스(Alcaligenes)속, 코마모나스(Comamonas)속, 버크홀데리아(Burkholderia)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 플라보박테리움(Flabobacterium)속, 비브리오(Vibrio)속, 엔테로박터(Enterobacter)속, 리조비움(Rhizobium)속, 글루코노박터(Gluconobacter)속, 아시네토박터(Acinetobacter)속, 모라셀라(Moraxella)속, 니트로조모나스(Nitrosomonas)속, 아에로모나스(Aeromonas)속, 파라코커스(Paracoccus)속, 바실루스(Bacillus)속, 클로스트리디움(Clostridium)속, 락토바실루스(Lactobacillus)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 아르트로박터(Arthrobacter)속, 아크로모박터(Achromobacter)속, 미크로코커스(Micrococcus)속, 마이코박테리움(Mycobacterium)속, 스트렙토코커스 (Streptococcus)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 악티노마이세스(Actinomyces)속, 노카르디아(Nocardia)속, 메틸로박테리움(Methylobacterium)속 등의 각종 세균을 들 수 있다. 또, 상기 세균 이외에, 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 칸디다(Candida)속 등의 효모, 또한 각종 곰팡이 등을 숙주로서 들 수 있다. 본 발명에서는 BL21(DE3), Rosetta(DE3), Rosetta2(DE3), ArcticExpress(DE3), STAR(DE3), C41(DE3) 및 C43(DE3)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 대장균을 숙주로 이용하는 것이 보다 바람직하다.

예를 들면, 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우는, 본 발명의 재조합 벡터는, 그 자신이 숙주 속에서 자율 복제가능 한 동시에, 프로모터, 사이클로덱스트란 생성 효소 유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 갖는 것이 바람직하다.

세균에의 재조합 DNA의 도입방법으로서는, 염화칼슘법이나 일렉트로포레이션법(Method Enzymol., 194, 182-187(1990)), 스페로플라스트법(Proc. Natl.Acad. Sci.USA, 84, 1929-1933(1978)), 아세트산리튬법(J. Bacteriol., 153, 163-168(1983)) 등이 이용 가능하다.

또, 재조합벡터에는 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 또는, 균체 밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 또 가진 것도 가능하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 사이클로덱스트란 생성 효소의 제조는 상기 형질전환체를 배양한 배양물(배양균체 또는 배양상청액) 속에 유전자 산물인 사이클로덱스트란 생성 효소를 생성축적시킨 후, 상기 배양물로부터 사이클로덱스트란 생성 효소를 취득함으로써 행하여진다.

본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다.

또 배양방법은, 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등, 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다. 대장균 등의 세균을 숙주로 해서 얻게 된 형질전환체의 배지로서는, 완전배지 또는 합성배지, 예를 들면 LB배지, M9배지 등을 들 수 있다. 또, 배양온도는 상기 언급한 적온의 범위에서 배양함으로써 사이클로덱스트란 생성 효소를 균체 내에 축적시키고, 회수할 수 있다.

탄소원은 미생물의 증식에 필요하고, 예를 들면 글루코스, 프럭토스, 슈크로스, 말토스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 갈락토스, 전분 등의 당류; 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급알콜류; 글리세롤 등의 다가알콜류; 아세트산, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 락트산, 글루콘산 등의 유기산; 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산 등의 지방산 등을 이용할 수 있다.

질소원으로서는, 예를 들면 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄등의 암모늄염 외에, 펩톤, 고기즙, 효모엑기스, 맥아엑기스, 카제인분해물, 옥수수 침지액 등의 천연물유래의 것을 들 수 있다. 또, 무기물로서는, 예를 들면 인산 제1칼륨,인산 제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨 등을 들 수 있다. 배양액에, 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가해도 된다.

또 프로모터가 유도성의 발현벡터를 사용해서 형질전환한 미생물을 배양하는 경우는 프로모터의 종류에 적합한 유도물질을 배지에 첨가하면 된다. 예를 들면, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 테트라사이클린, 인돌아크릴산(IAA) 등을 유도물질로서 들 수 있다. 사이클로덱스트란 생성 효소의 취득 및 정제는 얻게 되는 배양물 중으로부터 균체 또는 상층액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 추출, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피, 겔 여과 등을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 행할 수 있다.

얻게 된 정제물질이 목적의 효소인 것의 확인은, 통상의 방법, 예를 들면 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 웨스턴블로팅 등에 의해 행할 수 있다.

또한, 숙주로서 미생물을 사용한 형질전환체의 배양, 형질전환체에 의한 사이클로덱스트란 생성 효소의 생산과 균체 내에의 축적, 및 균체로부터의 사이클로덱스트란 생성 효소의 회수는, 상기의 방법에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 상기 본 발명의 사이클로덱스트란 생성 효소 유전자가 도입된 플라스미드 벡터 pET28a(+)을 대장균 STAR(DE3) 균주에 형질전환하여 형질전환체를 제작하였다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기의 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소를 이용하는 것을 특징으로 하는 사이클로덱스트란의 제조 방법을 제공한다.

특히, 본 발명은 전분, 말토올리고당, 이소말토올리고당 및 덱스트란으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 기질에 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소를 첨가하여 반응시키는 단계;를 포함하는 사이클로덱스트란의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 사이클로덱스트란의 "제조방법 또는 제조과정"에 대하여 더욱 자세한 설명을 기재해주시면 좋겠습니다. 단지 전분 또는 말토올리고당과 같은 기질에 사이클로덱스트란 생성 효소를 반응시키는 것이 제조방법의 전부인지 아니면 그 외의 어떠한 과정이 더 있을 수 있는지 알려주시면 좋겠습니다.

본 발명에 있어서, 상기 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 어떠한 염기서열로 이루어질 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 한다. 상기 효소는 써모아나에로박터 써모코프리애(Thermoanaerobacter thermocopriae) 균에서 유래한다.

본 명세서에 있어서, "사이클로덱스트란 생성 효소(CITase)"는 고가의 기질인 덱스트란(α-1,6 글루칸) 또는 최소 포도당이 7개 이상 연결된 직쇄형 이소말토올리고당으로부터 사이클로덱스트란을 생성하는 효소를 말한다.

그러나, 본 발명에 의하면 상기 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소(TPCITase)를 이용함으로써 전분 또는 말토올리고당과 같은 저가의 기질로부터 직쇄형 이소말토올리고당을 생성할 수 있게 된다. 그리고, 상기 저가의 기질로부터 생성된 직쇄형 이소말토올리고당으로부터 사이클로덱스트란을 생성할 수 있다.

또한 본 발명에 의하면 하나의 효소를 이용하여 전분 또는 말토올리고당과 같은 저가의 기질로부터 CI-7 내지 CI-20 중 어느 하나 이상의 사이클로덱스트란을 제조할 수 있어 매우 경제적이다.

그리고, 상기 단계에서 얻은 반응물은 전체 중량에 대하여 CI-15 내지 CI-20 사이클로덱스트란 중 어느 하나 이상을 0.1 내지 4 중량%로 포함하는 것일 수 있다. 상기 CI-15 내지 CI-20 사이클로덱스트란은 포접능이 높으며, 분자량이 커질수록 거대분자를 포접(inclusion)하기가 매우 용이하다.

이하, 본 발명에 대해 실시예를 들어 상세히 설명하기로 한다.

<실시예>

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는(중량/중량) %, 고체/액체는(중량/부피) %, 그리고 액체/액체는(부피/부피) %이다.

실시예 1. 사이클로덱스트란 생성 효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 형질전환체의 제조

1-1. 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소 유전자 증폭 - PCR

내열성 사이클로덱스트란 생성 효소 단백질은 상기 효소의 전체 유전자(TPCITase; 4,680 bp; 서열번호 2의 염기서열)를 포함하는 것와 C-말단의 1,509 bp가 결손된 유전자(TPCITaseΔC; 3,171 bp)를 포함하는 것을 각각 준비하였다. 도 1은 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 본 발명의 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소의 전체 유전자 TPCITase 및 상기 유전자의 C-말단의 1,509 bp가 결손된 유전자 TPCITaseΔC를 간단히 나타내는 모식도이다.

도 2(A)는 상기 C-말단의 1,509 bp가 결손된 유전자 TPCITaseΔC의 PCR 산물(3.1 kb)을 나타내는 이미지이고, 도 2(B)는 상기 결손된 C-말단을 포함하는 유전자 TPCITase C의 PCR 산물(2.4 kb)을 나타내는 이미지이다.

도 2에서, 상기 C-말단의 1,509 bp가 결손된 유전자 TPCITaseΔC의 PCR 산물은 써모아나에로박터 써모코프리애(Thermoanaerobacter thermocopriae) 균주(RIKEN, Tokyo, Japan)로부터 분리한 주형 DNA, 제한효소 사이트(NdeⅠ, XhoⅠ)를 포함하는 프라이머 쌍(서열번호 3의 포워드 프라이머(F: 5'-GCAGCCATATGTTGTCTCTTTATAGAAG-3')와 서열번호 4의 리버스 프라이머(R: 5'-GTGCTCGAGTTAGAACTGACCAG-3')), Pfu-Forte polymerase(Enzynomics, 대전, 한국)를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하고 해당 유전자들의 염기서열을 증폭한 것이다. 또한, 상기 결손된 C-말단을 포함하는 유전자 TPCITase C의 PCR 산물은 결손된 부분의 유전자를 증폭하기 위해 제한효소 사이트(HindⅢ, XhoⅠ)를 포함하는 프라이머 쌍(서열번호 5의 포워드 프라이머(F': 5'-AAGCTTAAAGTACTGGGATATG-3')와 서열번호 6의 리버스 프라이머(R': 5'-CTCGAGGTAAAAATCAGG-3')를 이용하여 상기의 방법과 동일하게 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하여 얻은 것이다.

1-2. 재조합 벡터 및 형질전환체의 제조

그리고, C-말단이 결손된 유전자(TPCITaseΔC)의 클로닝을 위해, 상기 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 대량으로 얻은 PCR 산물(3.2 kb, TPCITaseΔC)은 pTOP blunt V2(Enzynomics)을 이용하여 TA cloning한 후, Solgent사(대전, 한국)에서 DNA 염기서열을 분석하였다. 그리고, 발현벡터인 pET28a(+)(Novagen사 제품)의 NdeⅠ와 XhoⅠ 부위에 삽입하여 재조합 벡터(pET28a(+)-TPCITase ΔC(Thermoanaerobacter thermocopriae CITase ΔC)를 제조하였다.

그리고, 상기 사이클로덱스트란 생성 효소의 전체 유전자(TPCITase)를 포함하는 유전자의 재조합을 위해, 상기 PCR 산물(2.4 kb, TPCITase C)을 제한효소인 HindⅢ와 XhoⅠ로 절단한 후 동일하게 절단된 상기 재조합 벡터(pET28a(+)-TPCITase ΔC)에 삽입함으로써, 전체 유전자를 포함하는 재조합 벡터(pET28a(+)-TPCITase)를 제조하였다. 상기 재조합 벡터를 제조하는 과정을 도 3에 나타내었다.

상기와 같이 제작된 재조합 발현벡터들(pET28a(+)/TPCITase 및 pET28a(+)-TPCITase ΔC)을 각각 통상적인 형질전환 방법에 의하여 대장균 STAR(DE3) 균주에 형질전환하였다. 이렇게 제작된 형질전환체들의 사이클로덱스트란 생성 효소 활성을 분석한 후, 가장 높은 활성을 보이는 형질전환체를 분리하였으며, 상기 도입된 TPCITase 유전자의 서열을 분석하여 서열번호 1의 아미노산 서열과 서열번호 2의 염기서열을 획득하였다.

상기 TPCITase ΔC 유전자 또는 상기 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 유전자(TPCITase)가 도입된 형질전환체에 각각 20% 글리세린(glycerin) 용액을 첨가하여 사이클로덱스트란의 생산을 위한 배양을 실시하기 전에 냉동 보관하였다.

실시예 2. 사이클로덱스트란 생성 효소의 제조 및 회수

상기 TPCITase ΔC 유전자 또는 상기 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 유전자(TPCITase)가 도입된 형질전환체를 각각 50 μg/ml의 Kanamycin을 포함하는 500 ml의 LB(Difco, Sparks, MD, USA) 배지가 함유된 플라스크에 도말하여 사이클로덱스트란 생성 효소 유전자를 포함하는 콜로니를 얻었으며, 이 콜로니들은 37 ℃에서 전배양하였다. 본 배양시 배양액의 흡광도가 600 nm에서 0.5가 되었을 때 단백질 발현 유도제인 IPTG(최종 0.1 mM)를 첨가하고, 18 ℃에서 21시간 동안 150 rev/min로 교반하면서 배양하였다. 상기 배양된 세포(배양물)는 원심분리(10,000 rpm, 10분, 4℃)를 통해 회수하였고, 25 mL의 lysis buffer(20 mM sodium phosphate buffer(pH 7.0, 1 mM PMSF)로 현탁하여 sonicater를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄물을 12,000 rpm에서 30분간 원심분리한 후 수득한 상층액(Crude extract)을 DEAE-650M 컬럼에 로딩하여 정제를 시행하였다. 단백질용 흡착에는 20 mM sodium phosphate buffer(pH 7.4)를 사용하였으며, 컬럼에 흡착되지 않은 단백질을 취하여 정제 완료하였다. 상기 정제 결과를 요약하여 하기 표 1에 나타내었다. 최종적으로 정제된 단백질의 순도는 6% SDS-PAGE gel분석으로 확인하였다. 상기 분석 SDS-PAGE 전기영동 분석 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었고, TPCITase 예상 크기인 171 kDa의 재조합 단백질이 성공적으로 생산됨을 확인할 수 있었다.

Purification procedure	Total protein (mg)	Activity (U)	Specific activity(U/mg)	Purification (-fold)	Recovery (%)
Crude extract	877.24	2.94	0.003	1	100
DEAE-650M	97.80	0.84	0.009	2.57	28.60

실시예 3. 사이클로덱스트란 생성 효소에 의한 반응물의 TLC 분석 - 전분 또는 말토스(기질)

말토스 또는 전분으로 구성된 기질을 상기 사이클로덱스트란 생성 효소 TPCITase 또는 TPCITaseΔC와 반응시키는 경우에 어떠한 물질이 생성되는지 확인하고자 하였다.

도 6은 말토스 또는 전분으로 구성된 기질 및 본 발명에 따른 사이클로덱스트란 생성 효소(TPCITase 및 TPCITaseΔC)의 반응에 의한 반응물의 TLC 분석 결과를 나타내는 것이다.

도 6을 살펴보면, 본 발명에 따른 사이클로덱스트란 생성 효소(TPCITase)의 경우 기질인 전분 또는 말토스로부터 직쇄형 이소말토올리고당을 생성하는 반면, C-말단이 결손된 유전자에 의한 사이클로덱스트란 생성 효소(TPCITaseΔC)의 경우에는 전분 또는 말토스로부터 직쇄형 이소말토올리고당을 생성하지 못하는 것을 확인할 수 있다.

이러한 결과로부터, 상기 사이클로덱스트란 생성 효소(TPCITase)에서 상기 C-말단 부위가 직쇄형 이소말토올리고당을 생성하는 역할을 한다는 것을 추측할 수 있다.

실시예 4. 사이클로덱스트란 생성 효소에 의한 반응물의 TLC 분석 - 전분 또는 말토스(기질)

말토스 또는 전분으로 구성된 기질을 상기 사이클로덱스트란 생성 효소 TPCITase와 반응시킨 경우에 생성되는 물질을 알파-아밀라아제(α-amylase; 알파 1,4 결합만을 자르는 효소), 또는 DexB(Streptococcus dextranglucosidase; 알파 1,6 결합만을 자르는 효소) 또는 SusB(Bacteroides thetaimicron α-glucosidase; 알파 1,6 결합만을 자르는 효소)로 처리하여 분해 여부를 확인하고자 하였다.

도 7은 말토스 또는 전분으로 구성된 기질 및 본 발명에 따른 사이클로덱스트란 생성 효소(TPCITase)의 반응에 의한 반응물을 분해효소로 처리한 경우의 TLC 분석 결과를 나타내는 것이다.

도 7을 살펴보면, 알파-아밀라아제(알파 1,4 결합만을 자르는 효소)로 처리하여 생성된 산물(lane 2 또는 lane 5)은 분해되지 않지만, DexB 또는 SubB(알파 1,6 결합만을 자르는 효소)로 처리하여 생성된 산물(lane 3 또는 lane 6)은 분해되는 것을 확인할 수 있다.

상기 결과로부터, 본 발명의 효소에 의한 반응 산물은 알파 1,6 결합을 가지는 것을 알 수 있다.

실시예 5. TP-DDase의 α-1,4 결합 당류로부터 α-1,6 결합 당류로 전환시키는 작용 규명

실시예 5-1. TP-DDase 유전자 증폭 - PCR

본 발명의 명세서에서, TP-DDase는 α-1,4 결합 당류로부터 α-1,6 결합 당류로 전환시키는 효소 단백질을 의미한다.

상기 TP-DDase로서 본 발명의 사이클로덱스트란 생성 효소의 전체 유전자(TPCITase; 4,680 bp; 서열번호 2의 염기서열)의 N-말단의 2,217 bp가 결손된 유전자(TPDDase; 2,463 bp)를 준비하였다. 도 8은 본 발명의 α-1,4 결합 당류로부터 α-1,6 결합 당류로 전환시키는 효소의 전체 유전자 TPCITase, 및 상기 TPCITase 유전자의 N-말단의 2,217bp가 결손된 유전자 TPDDase를 간단히 나타내는 모식도이다.

TPDDase의 PCR 산물은 써모아나에로박터 써모코프리애(Thermoanaerobacter thermocopriae) 균주(RIKEN, Tokyo, Japan)로부터 분리한 주형 DNA, 제한효소 사이트(EcoRⅠ, XhoⅠ)를 포함하는 프라이머 쌍( 포워드 프라이머(F: 5'-GGATCCCCGGAATTCATGATTTATGTAAAGCGTACGATAACCAC'-3')와 리버스 프라이머(R: 5'-ATGCGGCCGCTCGAGTTAAAAATCAGGTAATCGTAGATCAAACC-3')), Pfu-Forte polymerase(Enzynomics, 대전, 한국)를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하고 해당 유전자들의 염기서열을 증폭하여 얻은 것이다.

실시예 5-2. TP-DDase 재조합 벡터 및 형질전환체의 제조

도 8은 본 발명의 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소(TP-CITase)의 N-말단의 2,217 bp가 결손된 유전자(TPDDase; 2,463 bp)를 간단히 나타내는 모식도이다.

본 발명의 TP-DDase의 클로닝을 위해, 상기 TP-DDase를 코딩하는 서열번호 8의 염기서열을 발현벡터인 pGEX6P1의 EcoRⅠ와 XhoⅠ 부위에 삽입하여 재조합 벡터 pGEX6P1-TP-DDase를 제조하였다. 상기 재조합 벡터를 제조하는 과정을 도 9에 나타내었다.

그리고, 상기와 같이 제작된 재조합 발현벡터 pGEX6P1-TP-DDase를 통상적인 형질전환 방법에 의하여 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환하였다. 이렇게 제작된 형질전환체들의 TP-DDase 활성을 분석한 후, 가장 높은 활성을 보이는 형질전환체를 분리하였다.

상기 TP-DDase 유전자가 도입된 형질전환체에 20% 글리세린 용액을 첨가한 후 실험 직전까지 냉동 보관하였다.

실시예 5-3. TP-DDase 효소의 제조 및 회수

상기 TP-DDase 유전자가 도입된 형질전환체를 상기 실시예 2의 방법과 동일하게 실시하여 TP-DDase 효소를 제조, 회수 및 정제하였다.

최종적으로 정제된 TP-DDase를 SDS-PAGE 전기영동 분석하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었으며, TP-DDase 예상 크기인 약 90 kDa의 재조합 단백질이 성공적으로 생산됨을 확인할 수 있었다.

실시예 5-4. TP-DDase에 의한 반응물의 TLC 분석 - 말토올리고당(기질)

α-1,4 결합의 당류인 말토올리고당으로 구성된 기질을 상기 TP-DDase와 반응시키는 경우에 어떠한 물질이 생성되는지를 확인하고자, TP-DDase에 의한 반응물을 TLC 분석하였다.

도 11은 말토올리고당으로 구성된 기질 및 TP-DDase의 반응에 의한 반응물의 TLC 분석 결과를 나타내는 것이다.

도 11을 살펴보면, 상기 TP-DDase의 경우 기질인 말토올리고당(α-1,4)으로부터 α-1,6 결합을 가진 직쇄형 이소말토올리고당을 생성하는 것을 확인할 수 있다.

상기 도 11에서, M2는 말토스(Maltose), M3는 말토트리오스(Maltotriose), M4는 말토테트라오스(Maltotetraose), M5는 말토펜타오스(Maltopentaose)를 의미하고, "상업용"은 상업용 말토올리고당 제품인 말토올리고당 MO40((주)대상)이며, 상기 말토올리고당 MO40은 각각 1% 및 5%(w/v)농도로 실험을 진행하였다. 참고로, 상기 도 11의 "상업용"은 TP-DDase가 실용성이 있는지, 즉 상업용 말토올리고당에도 적절한 작용을 하는지 확인하기 위한 비교군이다. 또한, 상기 도 11에서, "IMO"는 상업용 이소말토올리고당을 의미하고, "IGS"는 이소말토올리고당을 의미한다.

구체적인 실험방법은, 상기 TP-DDase 45.6 mg/mL을 20 mM의 Na-Ac Buffer(pH 4.5)에 첨가한 후, 1%(w/v)의 Glu(Glucose), M2, M3, M4 또는 M5를 기질로 하고, 비교군으로는 1% 및 5%(w/v)의 말토올리고당 MO40을 기질로 하여 60 ℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 상기 효소 반응액을 100 ℃에서 10분 동안 불활성화시켰다. 상기 각각의 효소 반응액을 Whatman K5F 실리카겔 TLC 플레이트에 1 ㎕씩 로딩하고, 니트로메탄, 1-프로판올 및 증류수의 비가 2 : 5 : 1.5(v/v/v)인 전개액에서 1회 전개시켰다. 전개가 끝나면, 상기 플레이트를 잠시 말린 다음, 발색 처리(Phenol sulfuric acid with alpha-naptol)하였다.

실시예 5-5. TP-DDase에 의한 반응물의 TLC 분석 - 이소말토올리고당(기질)

α-1,6 결합의 당류인 이소말토올리고당으로 구성된 기질을 상기 TP-DDase와 반응시키는 경우에 어떠한 물질이 생성되는지를 확인하고자, TP-DDase에 의한 반응물을 TLC 분석하였다.

도 12는 이소말토올리고당으로 구성된 기질 및 TP-DDase의 반응에 의한 반응물의 TLC 분석 결과를 나타내는 것이다.

도 12를 살펴보면, 상기 TP-DDase의 경우 기질인 이소말토올리고당(α-1,6)으로부터 길이가 더 긴 이소말토올리고당(α-1,6)을 생성하는 것을 확인할 수 있다.

상기 도 12에서, IG2는 이소말토스(isomaltose), IG3는 이소말토트리오스(isomaltotriose), IG4는 이소말토테트라오스(isomaltotetraose), IG5는 이소말토펜타오스(isomaltopentaose)를 의미하고, "상업용"은 상업용 이소말토올리고당 제품인 "이소말토올리고당 IMO200((주)대상)"이며, 상기 이소말토올리고당 IMO200은 각각 1% 및 5%(w/v)농도로 실험을 진행하였다. 참고로, 상기 도 12의 "상업용"은 TP-DDase가 실용성이 있는지, 즉 상업용 이소말토올리고당에도 적절한 작용을 하는지 확인하기 위한 비교군이다.

구체적인 실험방법은, 상기 TP-DDase 45.6 mg/mL을 20 mM의 Na-Ac Buffer(pH 4.5)에 첨가한 후, 1%(w/v)의 IG2, IG3, IG4 또는 IG5를 기질로 하고, 비교군으로는 1% 및 5%(w/v)의 이소말토올리고당 IMO200을 기질로 하여 60 ℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 상기 각각의 효소 반응액을 100 ℃에서 10분 동안 불활성화시켰다. 상기 각각의 효소 반응액을 Whatman K5F 실리카겔 TLC 플레이트에 1 ㎕씩 로딩하고, 니트로메탄, 1-프로판올 및 증류수의 비가 2 : 5 : 1.5(v/v/v)인 전개액에서 1회 전개시켰다. 전개가 끝나면, 상기 플레이트를 잠시 말린 다음, 발색 처리(Phenol sulfuric acid with alpha-naptol)하였다.

소결

본 발명의 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소는 값비싼 덱스트란만을 기질로 이용하는 다른 사이클로덱스트란 생성 효소와는 달리 덱스트란으로부터 뿐만 아니라 전분, 말토올리고당 또는 이소말토올리고당으로부터 사이클로덱스트란을 생성할 수 있다.

그 이유는, 상기의 실험결과들로부터 본 발명의 사이클로덱스트란 생성 효소의 C-말단의 2,463 bp에 해당하는 부위(TP-DDase)가 전분 또는 말토올리고당의 α-1,4 결합을 α-1,6 결합으로 전환하여 덱스트란 또는 이소말토올리고당을 생성해주기 때문임을 확인할 수 있었다. 또한, 기질로 α-1,6 결합을 가진 이소말토올리고당을 이용하는 경우에는 길이가 더 긴 이소말토올리고당(α-1,6)을 생성하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6. 사이클로덱스트란 생성 효소에 의한 반응물의 HPLC 분석

상기 본 발명에 따른 사이클로덱스트란 생성 효소(TPCITase) 및 기질의 반응에 의한 반응물을 DexB 또는 SubB(알파 1,6 결합만을 자르는 효소)로 처리하여 생성된 산물이 어떠한 물질인지 구체적으로 확인하고자 하였다.

6-1. 기질 - 전분

본 발명에 의해 제조된 사이클로덱스트란 생성 효소를 20 mM Britton-Robinson buffer pH 6.0에 첨가한 후, 1%(w/v) 전분(soluble starch)을 기질로 하여 50℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 효소 반응액을 100℃에서 10분 동안 불활성화시킨 후, Dex B와 Sus B 두 가지 효소로 처리하여 linear한 반응산물을 분해하였고, 분해되지 않고 남아있는 반응산물(올리고당)을 하기 표 2의 조건으로 HPLC 분석하였다. 상기 HPLC 분석 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13을 보면, 사이클로덱스트란 생성 효소에 의해 생성된 분해 산물이 사이클로덱스트란(CI-7,CI-8 및 CI-9)과 동일한 물질임을 확인할 수 있다.

상기 실험결과로부터 본 발명의 일 실시예에 따른 사이클로덱스트란 생성 효소를 통해 전분으로부터 직쇄형 이소말토올리고당을 거쳐 사이클로덱스트란이 생성된다는 사실을 유추할 수 있다.

6-2. 기질 - 덱스트란

본 발명에 의해 제조된 사이클로덱스트란 생성 효소를 40 mM sodium phosphate buffer pH 6.0에 첨가한 후, 1%(w/v) Dextran을 기질로 하여 50℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 효소 반응액을 100℃에서 15분 동안 불활성화시킨 후, Dex B(GH 13, dextran glucosidase)와 Sus B(GH 97, inverting α-glucoside hydrolase) 두 가지 효소로 처리하여 linear한 반응산물을 분해하였고, 분해되지 않고 남아있는 반응산물(올리고당)을 하기 표 2의 조건으로 HPLC 분석하였다. 상기 HPLC 분석 결과를 도 14에 나타내었다.

도 14를 보면, 사이클로덱스트란 생성 효소에 의해 생성된 반응산물이 사이클로덱스트란(CI-7,CI-8 및 CI-9)과 동일한 물질임을 확인할 수 있다.

Column	TSK-gel Amide 80(4.6 mmㅧ25cm)
Mobile phase	acetonitrile-water(55:45 vol/vol)
Flow rate	1 ml/min
Oven temperature	30 ℃
Detector	RI(refractive index detector)
Running time	25 min

실시예 7. 사이클로덱스트란 생성 효소에 의한 사이클로덱스트란의 MALDI-TOF/TOF MS 분석

생성된 사이클로덱스트란(CI)의 분자량 확인을 위해 올리고당 분석에 적합한 MALDI-TOF/TOF MS분석을 시행하였다.

PDCITase 효소 반응액을 Streptococcus dextran-glucosidase(Dex B), Bacteroides thetaimicron alpha-glucosidase(Sus B)로 처리하여 CI 이외의 linear 반응산물들을 포도당으로 분해한 후, 여분의 전분을 제거하기 위해서 66%(v/v) EtOH로 침전하여 제거하였다. 그 후 환원당을 제거하기 위해 2 M의 NaOH를 이용하여 100℃에서 30분간 처리하였다. 시료에 남아있는 이온성 불순물을 제거하기 위해서 Amberlite MB-3(Sigma사)를 이용하여 불순물을 제거한 후 evaporator로 농축하여 분말화하고 분석 시료로 사용하였다. Sample solution(50% acetonitrile, 0.1% TFA) 2.5 μL으로 상기 분석 시료를 녹여 이 중 1 μL를 0.06 g의 α-cyano-4-hydroxycinnamic acid를 50%(v/v) acetonitrile, 0.1%(v/v) TFA 의 용매조건에서 녹인 메트릭스 1 μL를 혼합하여 MALDI TOF/TOF plate 384 well에 1 μL 올려서 dry를 하여 ABI 4800 Plus TOF-TOF Mass Spectrometer(Applied Biosystems, Framingham, MA, USA)를 이용하여 MALDI-TOF/TOF MS 분석을 하였다. 상기 분석 결과를 도 15 및 표 3에 나타내었다.

상기 도 15 및 표 3를 보면, 사이클로덱스트란 생성 효소에 의해 CI-7에서 CI-20까지 생성되는 것을 알 수 있었다.

Compound	Mass
CI-7	1157(=162×7+23)
CI-8	1319(=162×8+23)
CI-9	1481(=162×9+23)
CI-10	1643(=162×10+23)
CI-11	1805(=162×11+23)
CI-12	1967(=162×12+23)
CI-13	2129(=162×13+23)
CI-14	2291(=162×14+23)
CI-15	2453(=162×15+23)
CI-16	2615(=162×16+23)
CI-17	2777(=162×17+23)
CI-18	2939(=162×18+23)
CI-19	3101(=162×19+23)
CI-20	3227(=162×20+23)

실시예 8. 온도 변화가 사이클로덱스트란 생산 활성에 미치는 영향

본 발명에 의해 제조된 사이클로덱스트란 생성 효소의 온도 안정성 및 온도 변화가 사이클로덱스트란 생산 활성에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.

먼저, 사이클로덱스트란 생성 효소를 40 mM Britton Robinson buffer(pH 6)에 첨가하고, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃ 및 80℃에서 1시간, 3시간, 6시간, 12시간 및 24시간 동안 방치한 후, 50℃에서 1%(w/v) 전분(soluble starch)을 기질로 하여 1시간 동안 반응을 실시하여 잔존 효소 활성을 확인하였다. 상기 반응을 완료한 후 HPLC 분석한 결과를 도 16에 나타내었다.

도 16을 보면, 사이클로덱스트란 생성 효소는 40℃ 및 50℃에서 각각 24 시간 동안 방치하였을 때 각각 100%의 잔존 효소 활성을 나타내었으며, 60℃에서 1시간 방치하였을 때에는 84.5%, 3시간 방치하였을 때에는 74%, 6시간 방치하였을 때에는 73%, 12시간 방치하였을 때에는 69%, 그리고 24시간 방치하였을 때에는 64%의 활성을 유지하는 것을 확인하였다. 한편, 70℃에서는 1시간의 방치만으로도 대부분의 활성을 잃어 6.8%의 활성만 유지하였으며, 3시간 방치 후에는 활성을 나타내지 않았다. 80℃에서는 1시간의 방치만으로도 효소 활성을 잃어버렸다.

즉, 본 발명의 사이클로덱스트란 생성 효소는 40℃ 내지 60℃의 고온에서 장시간 방치한 경우에도 높은 비율로 효소 활성을 유지하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 사이클로덱스트란 생성 효소는 고온에 내성이 강한 효소인 것으로 나타났다.

실시예 9. pH 변화가 사이클로덱스트란 생산 활성에 미치는 영향

본 발명에 의해 제조된 사이클로덱스트란 생성 효소의 pH 안정성 및 pH 변화가 사이클로덱스트란 생산 활성에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.

먼저, 사이클로덱스트란 생성 효소를 100 mM Britton-Robinson buffer(pH 2-12)에 첨가하고, 각각의 pH 조건에서 18시간 동안 효소를 방치하였다. 이후, 110 mM Britton-Robinson buffer(pH 6)에서 1%(w/v) 전분(soluble starch)을 기질로 하여 50℃, 1시간 동안 반응을 실시하였다. 상기 반응을 완료한 후 HPLC 분석한 결과를 도 17에 나타내었다.

도 17을 보면, 본 발명의 사이클로덱스트란 생성 효소가 pH 6.0 내지 pH 9.0에서 100%의 활성을 유지하는 것을 확인할 수 있다.

즉, 본 발명의 사이클로덱스트란 생성 효소는 알칼리에 내성이 강한 효소인 것으로 나타났다.

또한, 본 발명에 의해 제조된 사이클로덱스트란 생성 효소의 최적 pH를 알아보고자 하였다.

먼저, 사이클로덱스트란 생성 효소를 100 mM Britton Robinson buffer(pH 2-12)에 첨가하고, 각각의 pH 조건에서 1%(w/v) 전분(soluble starch)을 기질로 하여 50℃에서 1시간 동안 반응을 실시하였다. 상기 반응을 완료한 후 HPLC 분석한 결과를 도 18에 나타내었다.

도 18을 보면, 본 발명의 사이클로덱스트란 생성 효소는 pH 6.0에서 가장 활성이 좋은 것을 확인할 수 있었다.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한, 첨부된 특허청구범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

<110> Industry Foundation of Chonnam National University <120> Thermostable Cyclodextran Glucanotransferase, Recombinant Vector Containing Gene of the Enzyme, and Transformant Transformed by the Vector <130> HPC-8525 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1559 <212> PRT <213> Thermoanaerobacter thermocopriae <400> 1 Met Leu Ser Leu Tyr Arg Arg Lys Leu Phe Ile Thr Ile Leu Ile Val 1 5 10 15 Ile Phe Val Leu Ser Asn Phe Phe Thr Leu Phe Thr Tyr Pro Ile Ser 20 25 30 Pro Gly Val Ser Val Ala Tyr Ala Ala Ser Thr Gly Asn Leu Ile Gln 35 40 45 Arg Val Tyr Thr Asp Lys Ala Arg Tyr Asn Pro Gly Asp Leu Val Thr 50 55 60 Ile Ser Ala Asp Leu Ile Asn Lys Thr Gly Ser Thr Trp Ser Gly Thr 65 70 75 80 Leu Thr Leu Gln Ile Asn Lys Leu Glu Ser Gln Ile Tyr Thr Ala Ser 85 90 95 Gln Ser Val Thr Leu Ala Asn Gly Asp Ser Thr Thr Ile Thr Phe Thr 100 105 110 Trp Thr Ala Pro Pro Thr Asp Phe Val Gly Tyr Tyr Ala Gly Ile Ala 115 120 125 Ala Gly Ser Thr Asp Phe Asn Gly Thr Gly Ile Asp Val Ser Ser Ser 130 135 140 Pro Leu Arg Phe Pro Arg Tyr Gly Phe Ile Ser Asn Phe Pro Val Ser 145 150 155 160 Gln Thr Ala Gln Gln Ser Thr Asp Ile Val Lys Gln Met Val Glu Asp 165 170 175 Tyr His Leu Asn Ile Phe Gln Phe Tyr Asp Trp Met Trp Arg His Glu 180 185 190 Lys Leu Ile Lys Arg Thr Asn Gly Val Ile Asp Ser Thr Trp Val Asp 195 200 205 Leu Phe Asp Arg Thr Leu Ser Trp Gln Thr Ile Gln Asn Asn Val Ala 210 215 220 Ala Val His Ser Phe Asn Ala Tyr Ala Met Ala Tyr Ala Met Ser Tyr 225 230 235 240 Ala Ala Arg Glu Gly Tyr Glu Gln Met Trp Gly Ile Ser Pro Ser Trp 245 250 255 Gly Ile Phe Gln Asp Thr Ala His Gln Ser Gln Phe Asn Val Asp Phe 260 265 270 His Asn Gly Lys Phe Leu Trp Leu Phe Asn Pro Ala Asn Val Asn Trp 275 280 285 Gln Ser Trp Ile Ile Ser Glu Tyr Lys Asp Ala Ile Asn Thr Ala Gly 290 295 300 Phe Asp Gly Ile Gln Ile Asp Gln Met Gly Gln Arg Asp Asn Val Tyr 305 310 315 320 Asp Tyr Thr Ser Phe Ser Val Thr Leu Pro Ser Thr Phe Ala Gln Phe 325 330 335 Leu Gln Gln Val Lys Ser Glu Leu Glu Ser Asn Asn Ala Lys Lys Asn 340 345 350 Val Val Thr Phe Asn Ile Val Asp Gly Thr Val Asn Gly Trp Gly Ala 355 360 365 Gly Glu Ile Ala Arg Tyr Gly Ala Ser Asp Phe Asp Phe Ser Glu Ile 370 375 380 Trp Trp Lys Ala Asn Thr Tyr Asn Asp Leu Arg Asn Tyr Ile Glu Trp 385 390 395 400 Leu Arg Gln Asn Asn Gly Gly Lys Pro Val Val Leu Ala Ala Tyr Met 405 410 415 Asn Tyr Asn Glu Glu Tyr Gly Pro Ile Tyr Glu Ala Glu Ser Ala Ile 420 425 430 Leu Ser Gly Val Ser Val Asn Thr Asn His Ser Gly Tyr Thr Gly Thr 435 440 445 Gly Phe Val Asp Gly Phe Glu Thr Val Gly Asp Ser Ile Thr Trp Thr 450 455 460 Ile Asp Phe Pro Glu Thr Gly Asp Tyr Ser Phe Val Phe Arg Tyr Ala 465 470 475 480 Asn Ala Thr Gly Ala Thr Ala Thr Arg Asn Val Tyr Val Asp Gly Arg 485 490 495 Phe Leu Gly Gln Val Ser Phe Ala Asn Gln Val Asp Trp Asp Thr Trp 500 505 510 Ala Thr Asp Ala Trp Ile Gln Ile Glu Gly Leu Thr Ala Gly Thr His 515 520 525 Ser Val Thr Leu Lys Tyr Asp Ser Asp Asn Ile Gly Ala Ile Asn Val 530 535 540 Asp His Leu Thr Leu Gly Glu Phe Glu Glu His Ser Val Arg Leu Ala 545 550 555 560 Asp Ala Met Met Phe Ala Ser Gly Ala Thr His Ile Glu Leu Gly Asp 565 570 575 Thr Asn Gln Met Leu Ala His Glu Tyr Tyr Pro Asn Arg Ser Lys Ser 580 585 590 Met Arg Asn Ser Leu Lys Ala Ala Met Arg Asp Tyr Tyr Ser Phe Ala 595 600 605 Thr Ala Tyr Glu Asn Leu Leu Phe Asp Pro Asp Ile Val Pro Ala Asp 610 615 620 Gln Gly Asn Gln Trp Ile Ala Leu Thr Thr Gly Gln Pro Leu Ser Gly 625 630 635 640 Asn Gly Thr Ser Gly Thr Ile Trp Gln Met Ile Lys Arg Lys Ser Asp 645 650 655 Tyr Asp Ile Ile His Leu Ile Asn Leu Met Gly Asn Asp Asp Gln Trp 660 665 670 Arg Asn Pro Ala Val Gln Pro Thr Phe Gln Ser Asn Ile Gly Val Lys 675 680 685 Tyr Tyr Pro Gly Pro Asn Ala Ala Val Ser Gly Val Tyr Leu Ala Ser 690 695 700 Pro Asp Leu Asp His Gly Met Thr Ile Pro Leu Thr Tyr Thr Thr Gly 705 710 715 720 Asn Asp Ser Arg Gly Asn Tyr Ile Gln Phe Val Val Pro Ser Leu Lys 725 730 735 Tyr Trp Asp Met Ile Tyr Val Lys Arg Thr Ile Thr Thr Pro Pro Asp 740 745 750 Gly Gln Tyr Glu Ala Glu Tyr Ala Ile Lys Ser Gly Thr Asn Ile Asn 755 760 765 Thr Asp His Thr Gly Tyr Thr Gly Ser Gly Phe Val Asp Asn Phe Asp 770 775 780 Ala Ser Asp Lys Gly Val Ser Phe Ile Ile Asn Val Pro Thr Ser Asp 785 790 795 800 Thr Tyr Thr Leu Arg Phe Arg Tyr Gly Asn Gly Gly Thr Thr Ile Ala 805 810 815 Thr Arg Thr Leu Phe Ile Asp Gly Gln Tyr Ala Gly Thr Leu Gln Phe 820 825 830 Arg Asn Leu Tyr Asn Trp Asp Val Trp Asp Thr Val Glu Thr Thr Val 835 840 845 Trp Leu Ser Ala Gly Val His Gln Val Val Leu Trp Tyr Ser Ser Glu 850 855 860 Asn Asp Gly Ala Ile Asn Leu Asp Asn Leu Ile Val Leu Gln Gln Thr 865 870 875 880 Thr Pro Thr Arg Thr Ser Ala Arg Ser Phe Trp Met Asn Asn Trp Ser 885 890 895 Asn Leu Ile Gly Ile His Met Ala Ser Lys Leu Ser Pro Thr Asp Asn 900 905 910 Gly Asn Tyr Gly Pro Arg Leu Ala Glu Leu His Phe Arg Gly Asp Trp 915 920 925 Pro Thr Asn Gln Ile Val Asp Ala Thr Ala Phe Phe Arg Asp Glu Thr 930 935 940 Asp Leu Thr Pro Ile Lys Tyr Thr Asn Ala His Ser Phe Asp Ser Glu 945 950 955 960 Ala Trp Phe Glu Asn Asp Gly Thr Leu Thr Val Arg Tyr Leu Thr Tyr 965 970 975 Asn Gly Ser Ala Leu Pro Val Gln Ile Thr Lys Gln Tyr Ala Met Val 980 985 990 Pro Asn Gln Asn Phe Leu Val Ile Lys Tyr Thr Phe Leu Asn Gln Thr 995 1000 1005 Ser Ser Ala Arg Thr Leu Asn Phe Leu Glu Gln Val His Leu Asn Asn 1010 1015 1020 Arg Thr Ser Ser Asp Pro Asn Pro Gly Trp Gln His Gly Trp Trp Asp 1025 1030 1035 1040 Val Ser Arg Asn Ala Leu Gly Thr Asp Met Ser Gln Thr Gly Gln Phe 1045 1050 1055 Tyr Ile Glu Leu Gly Ala Phe Gln Thr Met Asp Ser Tyr Gln Val Gly 1060 1065 1070 Asn Asp Ala Asp Ser Asn Pro Asn Ser Gln Thr Ser Ser Pro Trp Tyr 1075 1080 1085 Gln Phe Asp Ala Asn Gly Val Leu Asn Arg Cys Gly Asp Leu Trp Ser 1090 1095 1100 Gln Asn Leu Ser Met Gly Phe Gln Lys Leu Ile Thr Val Pro Ala Gly 1105 1110 1115 1120 Gly Ser Val Thr Leu Ala Phe Tyr Tyr Ala Ile Gly Ser Thr Gln Glu 1125 1130 1135 Glu Ala Glu Ala Ala Ala Asp Leu Ala Arg Ser Gln Thr Ala Asp Tyr 1140 1145 1150 Trp Phe Thr Gln Thr Ala Ala Glu Tyr Asn Asn Trp Leu Asn Ser Gly 1155 1160 1165 Gln Arg Val Asn Thr Ser Asp Ile Gly Ile Asn Thr Ala Phe Asp Arg 1170 1175 1180 Ser Leu Ile Ile Asn Lys Gln Ala Gln His Pro Glu Phe Gly Ser Trp 1185 1190 1195 1200 Pro Ala Ala Thr Asn Pro Ser Tyr Gln Tyr Lys Val Trp Val Arg Asp 1205 1210 1215 Ser Ala Val Thr Ala Met Gly Met Asp Ala Ala Asn His Leu Ser Glu 1220 1225 1230 Ala Glu Lys Tyr Trp Asn Trp Met Ala Ser Val Gln Asn Thr Asp Gly 1235 1240 1245 Thr Trp His Thr Asn Tyr Asn Val Trp Lys Ala Asn Glu Trp Ile Ser 1250 1255 1260 Phe Val Glu Pro Glu His Asp Ala Ile Gly Leu Phe Leu Ile Gly Val 1265 1270 1275 1280 Tyr Gln His Tyr Ser Leu Leu Lys Ser Arg Asp Ser Ser Ala Ala Thr 1285 1290 1295 Thr Phe Leu Asn Asn Ile Trp Thr Gln Ile Thr Arg Ala Gly Asp Phe 1300 1305 1310 Ile Tyr Lys Asn Ile Gly Ala Ser Gly Phe Gly Pro Ala Asp Ala Ser 1315 1320 1325 Ile Trp Glu Glu Gln Val Glu Tyr Asn Ile Phe Thr Gln Val Thr Tyr 1330 1335 1340 Ala Ala Gly Leu Asn Ala Gly Arg Leu Leu Ala Gln Glu Lys Gly Asp 1345 1350 1355 1360 Ile Thr Arg Ser Asn Asn Tyr Leu Ser Gly Ala Gln Thr Ile Lys Asp 1365 1370 1375 Ala Ile Leu Arg Ser Phe Leu Ser Ser Pro Arg Gly Leu Trp Asn Lys 1380 1385 1390 Ser Asn Arg Tyr Phe Asn Arg Ala Ile Asn Thr Asp Gly Thr Ala Arg 1395 1400 1405 Thr Thr Val Asp Ala Ser Ser Asp Leu Ile Trp Val Phe Gly Leu Leu 1410 1415 1420 Ser Pro Thr Asp Thr Arg Ile Arg Asp His Arg Ile Lys Val Leu Ser 1425 1430 1435 1440 Arg Leu Thr His Asp Arg Tyr Gly Ile Ala Arg Tyr Glu Asn Asp Glu 1445 1450 1455 Phe Tyr Tyr Ser Ser Pro Tyr Ser Pro Gly Gly Gln Tyr Glu Ala Gly 1460 1465 1470 Ala Ala Glu Pro Val Trp Pro Gln Met Thr Met Tyr Ala Ser Met Ile 1475 1480 1485 Glu His Trp Arg Gly Asp Asp Ala Thr Ala Leu Ala Arg Leu Lys Trp 1490 1495 1500 Tyr Val Ser Arg Thr Ala Arg Gly Tyr Val Thr Pro Gly Glu Ala Val 1505 1510 1515 1520 Asp Trp Thr Asn Gly Gln Pro Leu Ile Ser Thr Ala Val Glu Pro Val 1525 1530 1535 Thr Gly Ser Trp Phe Gln Met Ala Val Leu Thr Tyr Leu Asn Arg Phe 1540 1545 1550 Asp Leu Arg Leu Pro Asp Phe 1555 <210> 2 <211> 4680 <212> DNA <213> Thermoanaerobacter thermocopriae <400> 2 atgttgtctc tttatagaag aaaactcttt ataacaattt taatagtaat tttcgtgttg 60 tctaactttt tcacattatt tacttatcct atctcaccag gagtttctgt tgcttatgcc 120 gcttcaacag gtaatttgat tcaacgggtt tatacagata aagctcgata taatccaggg 180 gatcttgtta ccattagtgc tgatttaatt aataaaactg gttcgacatg gtccggcact 240 ttaactcttc agattaataa actagaaagc caaatttaca ctgcaagtca gtcagttact 300 cttgccaatg gggattcaac tacaatcaca tttacatgga ctgctccacc taccgacttt 360 gttggttatt atgccggaat tgcggcagga agtacagatt tcaatggaac aggtatcgat 420 gtaagttcct ctccgcttcg gtttcctcgc tatggtttta tctcaaactt tcctgtttca 480 cagactgccc agcaatccac agatatagtt aaacagatgg tggaagacta tcatcttaat 540 atttttcaat tttacgactg gatgtggcgg catgagaagc taattaagcg aaccaatgga 600 gttatagatt ctacttgggt ggatcttttt gatcgcacac tttcttggca aactatacaa 660 aacaatgttg cagcagttca ttcctttaat gcttatgcca tggcttacgc tatgagttat 720 gcagctcgtg aaggatatga acaaatgtgg ggaatcagcc ctagctgggg tatctttcaa 780 gatacggcac atcaaagcca gtttaacgtg gattttcata atggcaagtt tctgtggctt 840 tttaatccag caaatgtgaa ttggcagagt tggatcatta gtgaatacaa agatgctatc 900 aatacggcag gttttgatgg catacagatc gatcaaatgg ggcagcgaga caatgtttac 960 gattatacta gcttttccgt tactttgcct agtacattcg ctcagtttct tcaacaagtt 1020 aagtcagaat tagaatctaa taatgcaaaa aaaaatgttg ttacttttaa tattgttgat 1080 ggtacagtga acggttgggg ggcgggagaa attgctcgtt atggtgccag cgactttgac 1140 ttcagcgaga tttggtggaa agctaacaca tataatgatc tccgaaatta catcgaatgg 1200 ctcaggcaaa acaatggtgg caagcctgtt gtacttgcag cttatatgaa ttacaacgag 1260 gaatacggtc caatatatga agctgaatcc gctattctat caggcgttag tgtcaataca 1320 aaccattctg gttatacggg cactggcttt gtcgatgggt ttgaaacggt gggtgattct 1380 atcacgtgga caattgactt ccctgagact ggtgattatt cgtttgtttt tcgttatgca 1440 aatgccactg gtgctactgc tactcgtaat gtttatgtag atggacgatt tctgggacaa 1500 gtctcatttg ctaatcaggt ggattgggat acttgggcga cggacgcgtg gattcaaata 1560 gagggactta ctgctggtac tcatagtgtg acattaaagt atgacagtga caatataggc 1620 gctataaacg tcgatcattt aactcttgga gagtttgagg aacattcagt tcgattggca 1680 gatgcaatga tgtttgctag cggtgctaca cacattgagc ttggtgatac taatcagatg 1740 ttagcgcatg aatattatcc gaaccgttcc aagtcaatgc gtaattctct caaggcagcg 1800 atgagagact actatagttt tgctactgct tatgaaaatt tactctttga tcctgatata 1860 gttccagctg accaaggcaa ccaatggatt gcactgacaa ccggacaacc tttaagcggc 1920 aacggaactt ctggtactat ttggcaaatg attaaacgca agtctgatta tgatatcata 1980 catttgatta atctaatggg caatgatgat cagtggcgta acccagctgt tcagcctact 2040 ttccaaagca acattggagt taaatactat ccaggaccta atgccgctgt cagtggcgta 2100 tatcttgcca gtccggatct cgatcacggt atgaccattc cactcactta tacgacgggt 2160 aatgatagcc gaggtaacta tatccagttt gttgtgccaa gcttaaagta ctgggatatg 2220 atttatgtaa agcgtacgat aaccacaccg ccagatggac agtatgaagc agaatatgct 2280 attaaaagtg gcactaacat caataccgat catacaggat atactggcag cggttttgta 2340 gacaactttg atgctagtga taaaggtgta tcgtttatta taaatgttcc aactagtgat 2400 acctacacgc ttcgattccg atatggaaac ggcggtacta ctattgccac gcgaacttta 2460 tttattgatg gtcagtatgc aggtactctc caattccgaa atctttataa ctgggatgtg 2520 tgggatacag tggaaaccac tgtgtggctt tcagcgggtg ttcatcaagt ggtactttgg 2580 tacagttccg aaaatgatgg tgctattaat cttgataacc tgattgttct acaacaaact 2640 actccaacaa gaacttcggc tcgctccttt tggatgaata actggtccaa cttgataggt 2700 attcacatgg ctagcaaatt aagcccgact gataatggaa attatggccc tcgcctggct 2760 gaacttcatt tcagaggcga ttggcctact aatcaaatcg tagatgcaac tgcttttttc 2820 cgagatgaaa cggatcttac tcccataaag tataccaatg ctcatagctt tgattctgaa 2880 gcatggtttg aaaacgacgg gactcttacc gtgagatatc tgacctataa tggctcagcc 2940 ttgccagtac agattaccaa acaatacgcc atggtgccta accaaaattt tcttgtgatc 3000 aaatatactt ttttaaacca gacaagtagc gcacgtactt taaactttct agaacaagtt 3060 catttgaaca acaggactag tagcgatccg aatccagggt ggcaacatgg ctggtgggac 3120 gtgagtcgaa atgcacttgg tactgacatg agccagactg gtcagttcta tattgaattg 3180 ggtgcttttc agactatgga tagttatcag gtgggtaatg acgccgattc caatcctaac 3240 agtcagacgt catcaccgtg gtatcagttc gacgccaacg gtgttctaaa taggtgcggt 3300 gatctttggt cacagaatct tagcatgggt tttcagaaac ttattaccgt gcctgctgga 3360 ggtagtgtaa cattggcttt ttattatgct atcggttcaa ctcaggagga agcggaagca 3420 gcagcagatt tagctcgatc tcagacagct gactactggt ttacccaaac tgctgccgag 3480 tataataatt ggcttaacag cggccagcgg gttaatacgt ctgatattgg tatcaatact 3540 gcctttgatc ggagcctcat cataaacaaa caggcacaac atccggagtt tggttcctgg 3600 cccgcggcta caaatccctc ttatcagtac aaggtgtggg ttcgtgactc agctgtaaca 3660 gctatgggaa tggatgctgc taatcatctt tctgaggcgg aaaagtattg gaactggatg 3720 gcctctgttc aaaatacaga tgggacatgg catacaaatt ataatgtatg gaaggcaaat 3780 gaatggatct cgtttgtgga gcctgaacac gatgccattg gactttttct catcggggtt 3840 tatcaacatt acagtttact caaatcccgc gattcctcgg cagcgacgac ttttctgaat 3900 aacatttgga cgcagataac ccgcgctggt gatttcatct acaaaaacat tggcgcttct 3960 gggtttggtc cggctgatgc ttctatctgg gaggagcagg tcgagtataa tatttttact 4020 caagttactt atgccgcagg attgaatgct ggacggttgt tagcccaaga aaaaggtgat 4080 attactcgtt caaataacta tttgtcgggt gctcaaacca tcaaggatgc gattctacga 4140 tcgtttttgt cttcaccacg aggtctctgg aataaatcta atcgctattt taatcgggcg 4200 atcaatacag acggtacagc gcgaacgacg gttgatgctt catcggactt gatttgggtt 4260 tttggtctcc tttcaccgac tgatactagg attcgagatc accgcattaa ggtactatca 4320 cggctgaccc atgataggta cggcattgct cgatatgaaa acgatgagtt ctattattct 4380 agtccatata gccccggtgg acagtatgag gctggcgcag ccgaaccagt ttggccacaa 4440 atgactatgt acgcgtctat gattgagcat tggaggggtg atgatgccac tgcactggct 4500 cggcttaagt ggtatgtcag ccgaactgct cgcggctatg tcacacccgg tgaagctgtg 4560 gactggacca atggtcaacc gcttatcagt acagcagttg aaccagtaac gggctcctgg 4620 tttcagatgg cggtccttac ttacttaaac cggtttgatc tacgattacc tgatttttaa 4680 4680 <210> 3 <211> 3171 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence for TPCITase delta-C <400> 3 atgttgtctc tttatagaag aaaactcttt ataacaattt taatagtaat tttcgtgttg 60 tctaactttt tcacattatt tacttatcct atctcaccag gagtttctgt tgcttatgcc 120 gcttcaacag gtaatttgat tcaacgggtt tatacagata aagctcgata taatccaggg 180 gatcttgtta ccattagtgc tgatttaatt aataaaactg gttcgacatg gtccggcact 240 ttaactcttc agattaataa actagaaagc caaatttaca ctgcaagtca gtcagttact 300 cttgccaatg gggattcaac tacaatcaca tttacatgga ctgctccacc taccgacttt 360 gttggttatt atgccggaat tgcggcagga agtacagatt tcaatggaac aggtatcgat 420 gtaagttcct ctccgcttcg gtttcctcgc tatggtttta tctcaaactt tcctgtttca 480 cagactgccc agcaatccac agatatagtt aaacagatgg tggaagacta tcatcttaat 540 atttttcaat tttacgactg gatgtggcgg catgagaagc taattaagcg aaccaatgga 600 gttatagatt ctacttgggt ggatcttttt gatcgcacac tttcttggca aactatacaa 660 aacaatgttg cagcagttca ttcctttaat gcttatgcca tggcttacgc tatgagttat 720 gcagctcgtg aaggatatga acaaatgtgg ggaatcagcc ctagctgggg tatctttcaa 780 gatacggcac atcaaagcca gtttaacgtg gattttcata atggcaagtt tctgtggctt 840 tttaatccag caaatgtgaa ttggcagagt tggatcatta gtgaatacaa agatgctatc 900 aatacggcag gttttgatgg catacagatc gatcaaatgg ggcagcgaga caatgtttac 960 gattatacta gcttttccgt tactttgcct agtacattcg ctcagtttct tcaacaagtt 1020 aagtcagaat tagaatctaa taatgcaaaa aaaaatgttg ttacttttaa tattgttgat 1080 ggtacagtga acggttgggg ggcgggagaa attgctcgtt atggtgccag cgactttgac 1140 ttcagcgaga 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Sequence <220> <223> nucleotide sequence for TP-DDase <400> 8 atgatttatg taaagcgtac gataaccaca ccgccagatg gacagtatga agcagaatat 60 gctattaaaa gtggcactaa catcaatacc gatcatacag gatatactgg cagcggtttt 120 gtagacaact ttgatgctag tgataaaggt gtatcgttta ttataaatgt tccaactagt 180 gatacctaca cgcttcgatt ccgatatgga aacggcggta ctactattgc cacgcgaact 240 ttatttattg atggtcagta tgcaggtact ctccaattcc gaaatcttta taactgggat 300 gtgtgggata cagtggaaac cactgtgtgg ctttcagcgg gtgttcatca agtggtactt 360 tggtacagtt ccgaaaatga tggtgctatt aatcttgata acctgattgt tctacaacaa 420 actactccaa caagaacttc ggctcgctcc ttttggatga ataactggtc caacttgata 480 ggtattcaca tggctagcaa attaagcccg actgataatg gaaattatgg ccctcgcctg 540 gctgaacttc atttcagagg cgattggcct actaatcaaa tcgtagatgc aactgctttt 600 ttccgagatg aaacggatct tactcccata aagtatacca atgctcatag ctttgattct 660 gaagcatggt ttgaaaacga cgggactctt accgtgagat atctgaccta taatggctca 720 gccttgccag tacagattac caaacaatac gccatggtgc ctaaccaaaa ttttcttgtg 780 atcaaatata cttttttaaa 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Claims (18)

1. 전분, 말토올리고당, 이소말토올리고당 및 덱스트란으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 기질로 이용하는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소.
2. 제1항에 있어서,
   상기 기질은 쌀 전분, 보리 전분, 콩 전분, 조 전분, 기장 전분, 수수 전분, 밀 전분, 옥수수 전분, 귀리 전분, 메밀 전분, 감자 전분 및 고구마 전분으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 전분인 것을 특징으로 하는 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소.
3. 제1항에 있어서,
   상기 효소는 서열번호 2의 염기서열로부터 코딩되는 것을 특징으로 하는 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소.
4. 제1항에 있어서,
   상기 효소는 써모아나에로박터 써모코프리애(Thermoanaerobacter thermocopriae) 균 유래인 것을 특징으로 하는 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소.
5. 제1항에 있어서,
   40 내지 60 ℃에서 0.01 내지 24 시간 동안 방치한 후에도 60% 이상의 잔존활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소.
6. 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어진 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
7. 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
8. 제7항에 있어서,
   상기 벡터는 pET28a, pET, pGEX, pQE, pDEST 및 pCOLD로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
9. 제7항의 재조합 벡터가 형질전환된 형질전환체.
10. 제9항에 있어서,
    상기 재조합 벡터가 BL21(DE3), Rosetta(DE3), Rosetta2(DE3), ArcticExpress(DE3), STAR(DE3), C41(DE3) 및 C43(DE3)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 대장균에 형질전환된 것을 특징으로 하는 형질전환체.
11. 제9항의 형질전환체를 배양한 배양물을 제조하는 단계; 및
    상기 배양물로부터 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소를 수득하는 단계;를 포함하는 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소의 제조방법.
12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소를 이용하는 것을 특징으로 하는 사이클로덱스트란의 제조 방법.
13. 전분, 말토올리고당, 이소말토올리고당 및 덱스트란으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 기질에 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 내열성 사이클로덱스트란 생성 효소를 첨가하여 반응시키는 단계;를 포함하는 사이클로덱스트란의 제조 방법.
14. 제13항에 있어서,
    상기 효소는 서열번호 2의 염기서열로부터 코딩되는 것을 특징으로 하는 사이클로덱스트란의 제조 방법.
15. 제13항에 있어서,
    상기 효소는 상기 기질로부터 직쇄형 이소말토올리고당을 생성하는 것을 특징으로 하는 사이클로덱스트란의 제조 방법.
16. 제13항에 있어서,
    상기 효소는 40 내지 60 ℃에서 0.01 내지 24 시간 동안 방치한 후에도 60% 이상의 잔존활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 사이클로덱스트란의 제조 방법.
17. 제13항에 있어서,
    상기 효소는 상기 기질로부터 CI-7 내지 CI-20 중 어느 하나 이상의 사이클로덱스트란을 생성하는 것을 특징으로 하는 사이클로덱스트란의 제조 방법.
18. 제13항에 있어서,
    상기 사이클로덱스트란 전체 중량에 대하여 CI-15 내지 CI-20 사이클로덱스트란을 0.1 내지 4 중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 사이클로덱스트란의 제조 방법.

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