KR20230124995A - 6'-시알릴락토스의 생산을 위한 시알릴트랜스퍼라제 - Google Patents

6'-시알릴락토스의 생산을 위한 시알릴트랜스퍼라제 Download PDF

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스테판 제네와인
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크리스찬 한센 에이치엠오 게엠베하
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Abstract

6'-시알릴락토스의 발효적 생산을 위한 효소, 조성물, 유전자 조작된 세포 및 방법이 개시되어 있다.

Description

6'-시알릴락토스의 생산을 위한 시알릴트랜스퍼라제
본 발명은 시알릴트랜스퍼라제 및 시알릴화 올리고당의 생산에서의 이의 용도에 관한 것이다.
현재까지 150개 이상의 구조적으로 구별되는 모유 올리고당(HMO)이 확인되었다. HMO는 총 모유 영양소의 미량만을 나타내지만, 지난 수십 년 동안 모유 수유 영아의 발달에 미치는 이들의 유익한 영향이 분명해졌다.
HMO 중에서, 시알릴화 HMO(SHMO)는 장내 병원성 박테리아 및 바이러스에 대한 유아의 내성을 지원하는 것으로 관찰되었다. 흥미롭게도, 최근 연구에서는 조산아에서 가장 흔하고 치명적인 질병 중 하나인 괴사성 소장-결장염(necrotizing entero-colitis)에 대한 장쇄 SHMO의 보호 효과를 추가로 입증하였다. 또한, SHMO는 유아의 두뇌 발달 및 이의 인지 능력을 지원하는 것으로 믿어진다. 또한, 시알릴화 올리고당은 대장균( Escherichia coli ), 비브리오 콜레라( Vibrio cholerae ) 및 살모넬라(Salmonella)를 포함한 다양한 병원성 미생물의 장독소를 중화시키는 것으로 나타났다. 또한, 시알릴화 올리고당은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)에 의한 장(gut)의 집락화(colonization)를 방해하여 위 및 십이지장 궤양을 예방하거나 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
모유의 시알릴화 올리고당 중, 3'-시알릴락토스, 6'-시알릴락토스, 시알릴락토-N-테트라오스 a, 시알릴락토-N-테트라오스 b, 시알릴락토-N-테트라오스 c 및 디시알릴락토-N-테트라오스가 가장 널리 퍼진 구성원이다.
시알릴화 올리고당은 복잡한 구조를 가지고 있기 때문에, 이들의 화학적 또는 (화학-)효소적 합성이 까다롭고 광범위한 어려움, 예를 들어, 입체화학 제어, 특정 연결 형성, 공급원료 가용성 등과 관련이 있다. 결과적으로, 상업적으로 이용 가능한 시알릴화 올리고당은 천연 공급원의 양이 적기 때문에 매우 비쌌다.
SHMOS의 상업적 이용 가능성의 부족을 극복하기 위해, 시알릴화 올리고당을 생산하기 위한 미생물의 대사 공학에 대한 노력이 이루어졌으며, 이는 이러한 접근 방식이 산업적 규모에서 HMO를 생산하는 가장 유망한 방법인 것으로 보이기 때문이다.
미생물 발효는 적어도 하나의 이종 글리코실트랜스퍼라제를 (과-)발현하는 유전자 변형 미생물을 사용한다. 배지에서 및 미생물이 상기 이종 글리코실트랜스퍼라제를 발현하도록 허용된 조건하에서 이러한 미생물의 배양시, 상기 미생물에 의해 HMO가 생산되고 배양 배지 또는 세포 용해물로부터 회수될 수 있다.
그러나, 시알릴트랜스퍼라제를 포함한 글리코실트랜스퍼라제는 전형적으로 원하는 올리고당의 생산을 위한 이들의 (과-)발현이 통상적으로 바람직하지 않은 부산물을 유도하도록 광범위한 기질을 사용한다. 전형적으로, 이러한 부산물도 올리고당이지만, 생성물의 상업적 사용을 위해 원하는 올리고당 제제로부터 제거되어야 한다. 그러나, 원하는 올리고당으로부터 이러한 부산물을 제거하는 것은 어렵고 번거로울 수 있다.
박테리아 종으로부터, 예를 들어 나이세리아 ( Neisseria ), 캄필로박터 (Campylobacter), 파스퇴렐라 ( Pasteurella ), 헬리코박터( Helico - bacter ) 및 포토박테리움(Photobacterium)으로부터 뿐만 아니라 포유류 및 바이러스로부터 여러 시알릴트랜스퍼라제(SiaT)가 현재까지 확인되고 특성화되었다. 시알릴트랜스퍼라제는 일반적으로 단백질 서열 유사성에 기초하여 6개의 글리코실트랜스퍼라제(GT) 패밀리로 분류된다. 모든 진핵 및 바이러스 시알릴트랜스퍼라제는 GT 계열 29로 그룹화되는 반면, 박테리아 SiaT는 GT4, GT38, GT42, GT52 또는 GT80 계열 하나로 그룹화된다. 게다가, 시알릴트랜스퍼라제 및 폴리시알릴트랜스퍼라제는 이들이 형성하는 글리코시드 결합으로 인해, 예를 들어 α-2,3-, α-2,6- 및 α-2,8-시알릴트랜스퍼라제로 구별될 수 있다. 이러한 모든 시알릴트랜스퍼라제는 시티딘 5'-모노포스페이트 시알산(예를 들어 CMP-NeuNAc)으로부터의 시알산 잔기를 다양한 수용체 분자, 통상적으로 갈락토스(Gal) 모이어티(moiety), N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 모이어티 또는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 모이어티 또는 또 다른 시알산(Sia) 모이어티로 전달한다.
몇몇 박테리아 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제는 과거에 잘 특성화되었으며 이미 6'-시알릴락토스(6'-SL)의 생산에 적합한 것으로 입증되었다. 미생물 6'-SL 생산을 위해 가장 일반적으로 사용되는 효소는 해양 박테리아로부터 유래된다: 포토박테리움 종( Photobacterium sp .) JT-ISH-224의 Pst-6, 포토박테리움 담셀라(Photobacterium damselae ) JT0160의 St0160, 포토박테리움 레이오그나티 (Photobacterium leiognathi ) JT-SHIZ-119의 PlsT6 및 포토박테리움 레이오그나티 (Photobacterium leiognathi ) JT-SHIZ-145의 PlsT6. 그러나, 이러한 알려진 박테리아 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제는 또한 바람직하지 않은 부산물로서 디시알릴락토스를 생성한다.
Drouillard 등(Carbohydrate Research 345 (2010) 1394-1399)은 해양 박테리아 포토박테리움 종( Photobacterium sp .) JT-ISH-224의 시알릴트랜스퍼라제 유전자를 암호화하는 조작된 대장균 세포에 의한 6'-시알릴락토스의 생산을 개시한다. 이 효소의 무차별성(promiscuity)(넓은 수용자/공여자 기질 수용)으로 인해 6,6'-디시알릴락토스 및 KDO-락토스와 같은 부산물이 배양 동안 형성된다. 시알릴트랜스퍼라제 유전자의 발현을 하향조절함으로써만, 이들 탄수화물 부산물의 축적이 제한될 수 있다. 그러나, 시알릴트랜스퍼라제 유전자 발현의 하향조절은 생산 공정의 생산성 뿐만 아니라 이의 산업적 적용 가능성을 제한하기 때문에 바람직하지 않은 절충안이다.
Mehr 및 Withers(Glycobiology 26 (2016): 353-359)는 대표적인 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제 포토박테리움 담셀라( Photobacterium damselae ) JT0160의 St0160 및 포토박테리움 종( Photobacterium sp .) JT-ISH-224의 Pst-6을 사용하여 글리코실트랜스퍼라제 패밀리 80으로부터의 박테리아 시알릴트랜스퍼라제의 시알리다제 활성(시알릴화 탄수화물의 탈시알릴화/가수분해) 및 트랜스-시알리다제 활성(시알릴화 탄수화물로부터 수용자 기질로의 시알산 잔기의 전달)을 기술한다. 6'-시알릴락토스와 같은 별개의 시알릴화 생성물의 생산을 위한 공정에서 시알릴트랜스퍼라제의 바람직한 적용을 고려할 때, 생성물 전환 및/또는 분해를 유도하는 효소 활성은 분명히 역효과를 낳는다.
선행 기술은 산업적 규모에서 6'-시알릴락토스와 같은 시알릴화 올리고당의 경제적 생산에 대한 주요한 한계를 명백히 개시한다. 특히, 선행 기술은 6'-시알릴락토스 생산 박테리아 균주에 의한 디시알릴락토스의 형성을 실현 가능한 방식으로 방지하는 방법을 교시하지 않는다.
따라서, 본 발명의 목적은 산업적 규모에서 미생물 발효에 의한 6'-시알릴락토스의 생산을 위한 개선된 방법을 제공하는 것이었으며, 여기서 디시알릴락토스와 같은 바람직하지 않은 부산물의 수반되는 형성은 방지되거나 적어도 상당히 감소된다.
상기 목적은 효소에 의해 촉매되는 시알릴화 반응에 대한 기질로서의 시알릴락토스에 대한 특이성이 낮거나 전혀 없는 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제의 확인, 및 6'-시알릴락토스의 생산에서의 이들의 사용의 제공에 의해 해결된다. 따라서, 본원에는 특히 6'-시알릴락토스의 생산을 위한 효소, 조성물, 유전자 조작된 세포, 및 방법이 제공된다.
제1 측면에 따르면, 6'-시알릴락토스의 생산에 사용하기 위한 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제가 제공되며, 여기서 상기 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제는 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 하나와 적어도 100개 아미노산의 스트레치(stretch)에 걸쳐 적어도 25% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 락토스-수용(lactose-accepting) α-2,6-시알릴트랜스퍼라제이다.
제2 측면에 따르면, 6'-시알릴락토스의 생산을 위한 유전자 조작된 세포가 제공되고, 여기서 상기 세포는 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 하나와 적어도 100개 아미노산의 스트레치에 걸쳐 적어도 25% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 락토스-수용 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제를 보유하도록 유전적으로 조작되었다.
제3 측면에 따르면, 6'-시알릴락토스의 발효 생산을 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 6'-시알릴락토스의 생산을 위한 유전자 조작된 세포를 제공하는 단계로서, 상기 세포는 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 하나와 적어도 100개 아미노산의 스트레치에 걸쳐 적어도 25% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 락토스-수용 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제를 보유하도록 유전적으로 조작된 단계; 및 상기 세포를 배양 배지에서 및 6'-시알릴락토스 생산에 허용적인 조건하에서 배양하는 단계; 및 임의로 상기 6'-시알릴락토스를 회수하는 단계를 포함한다.
도 1은 6'-시알릴락토스를 나타내는 구조식을 보여준다.
도 2는 시알릴트랜스퍼라제 plsT6 (F)를 암호화(encoding)하는 조작된 대장균 균주(실시예 2에 기재된 바와 같음)의 배양 후 검출가능한 탄수화물을 나타내는 박층 크로마토그래피의 결과를 보여준다. S: 표준 물질.
도 3은 CMP-NeuNAc를 공여자 기질로 제공하고 20mM 락토스를 수용자 기질로 제공할 때 다양한 효소의 시알릴트랜스퍼라제 활성을 보여주는 예시적인 시험관내 분석으로부터의 박층 크로마토그래피의 결과를 나타낸다.
도 4는 CMP-NeuNAc를 공여자 기질로 제공하고 20mM 6'-SL을 수용자 기질로 제공할 때 다양한 효소의 시알릴트랜스퍼라제 활성을 보여주는 예시적인 시험관내 분석으로부터의 박층 크로마토그래피의 결과를 나타낸다.
도 5는 CMP-NeuNAc를 공여자 기질로 제공하고 20mM 락토스 또는 20mM 6'-SL을 수용자 기질로 제공할 때 스트렙토코커스 수이스(S. suis)로부터의 시알릴트랜스퍼라제의 시알릴트랜스퍼라제 활성을 보여주는 예시적인 시험관내 분석으로부터의 박층 크로마토그래피의 결과를 나타낸다.
제1 측면에 따르면, 6'-시알릴-락토스의 생산을 위한 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제가 제공된다.
본원에 사용된 용어 "6'-시알릴락토스"(6'-SL)는 삼당류를 지칭하며, 여기서 상기 삼당류는 단당류 잔기 글루코스(Glc), 갈락토스(Gal) 및 N-아세틸뉴라민산/시알산(NeuNAc)으로 구성되어 도 1에 나타낸 바와 같은 화학 구조 NeuNAc(α2,6)Gal(β1,4)Glc를 갖는 화합물을 형성한다.
본원에 사용된 용어 "시알릴트랜스퍼라제"는 시알릴트랜스퍼라제 활성을 보유할 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. "시알릴트랜스퍼라제 활성"은 N-아세틸뉴라민산(NeuNAc) 잔기를 공여자 기질, 전형적으로 CMP-NeuNAc에서 수용자 분자로 전달하는 것을 지칭한다. 용어 "시알릴트랜스퍼라제"는 본원에 기재된 시알릴트랜스퍼라제의 기능적 단편, 본원에 기재된 시알릴트랜스퍼라제의 기능적 변이체, 및 기능적 변이체의 기능적 단편을 포함한다. 이와 관련하여 "기능적"은 단편 및/또는 변이체가 시알릴트랜스퍼라제 활성을 보유한다는 것을 의미한다. 시알릴트랜스퍼라제의 기능적 단편은 이의 자연 발생 유전자에 의해 암호화된 바와 같은 시알릴트랜스퍼라제의 절단된 버전을 포함하며, 이러한 절단된 버전은 시알릴트랜스퍼라제 활성을 보유할 수 있다. 절단된 버전의 예는 전형적으로 폴리펩티드를 특정 세포이하 국소화(subcellular localization)로 지시하는 소위 리더 서열을 포함하지 않는 시알릴트랜스퍼라제이다. 전형적으로, 이러한 리더 서열은 이의 세포이하 수송 동안 폴리펩티드로부터 제거되고, 자연적으로 발생하는 성숙 시알릴트랜스퍼라제에는 존재하지 않는다.
본 개시내용의 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제는 N-아세틸뉴라민산 잔기를 공여자 기질로부터 수용자 분자로 전달할 수 있다. 이종 시알릴트랜스퍼라제와 관련하여 용어 "할 수 있는(capable of)"은 이종 시알릴트랜스퍼라제의 시알릴트랜스퍼라제 활성 및 시알릴트랜스퍼라제가 이의 효소 활성을 보유하기 위해 적합한 반응 조건이 요구된다는 규정을 지칭한다. 적절한 반응 조건의 부재하에서, 이종 시알릴트랜스퍼라제는 이의 효소 활성을 보유하지 않지만 이의 효소 활성을 유지하고 적절한 반응 조건이 회복될 때 효소 활성을 보유한다. 적합한 반응 조건은 적합한 공여자 기질의 존재, 적합한 수용자 분자의 존재, 필수 보조인자의 존재 - 예를 들어 - 1가 또는 2가 이온, 적절한 범위의 pH 값, 적절한 온도 등을 포함한다. 이종 시알릴트랜스퍼라제의 효소 반응에 영향을 미치는 각각의 및 모든 인자에 대한 최적 값이 충족될 필요는 없지만, 반응 조건은 이종 시알릴트랜스퍼라제가 이의 효소 활성을 수행하도록 이루어져야 한다. 따라서, 용어 "할 수 있는"은 이종 시알릴트랜스퍼라제의 효소 활성이 비가역적으로 손상된 임의의 조건을 배제하고, 또한 임의의 이러한 조건에 대한 이종 시알릴트랜스퍼라제의 노출을 배제한다. 대신, "할 수 있는"은 허용 반응 조건(시알릴트랜스퍼라제가 이의 효소 활성을 수행하는 데 필요한 모든 요건)이 시알릴트랜스퍼라제에 제공되는 경우 시알릴트랜스퍼라제가 효소적으로 활성이고, 즉 이의 시알릴트랜스퍼라제 활성을 보유한다는 것을 의미한다.
시알릴트랜스퍼라제는 이들이 형성하는 글리코시드 결합의 유형에 따라 구별될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "α-2,3-시알릴트랜스퍼라제" 및 "α-2,3-시알릴트랜스퍼라제 활성"은 갈락토스 또는 수용자 분자의 갈락토스 잔기에 알파-2,3 결합으로 시알산을 첨가하는 폴리펩티드 및 이들의 효소 활성을 지칭한다. 마찬가지로, 용어 "α-2,6-시알릴트랜스퍼라제" 및 "α-2,6-시알릴트랜스퍼라제 활성"은 갈락토스 또는 수용자 분자의 갈락토스 잔기에 알파-2,6 결합으로 시알산을 첨가하는 폴리펩티드 및 이들의 효소 활성을 지칭한다.
본 개시내용의 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제는 락토스-수용 시알릴트랜스퍼라제이다. 따라서, 이당류 락토스는 공여자 기질 CMP-NeuNAc로부터 NeuNAc 모이어티의 전달을 위한 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제의 수용자 기질이다.
본 개시내용의 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제는 시알릴락토스, 즉 3'-SL 또는 6'-SL을 기질로 수용하지 않는다. 보다 구체적으로, 본 개시내용의 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제는 아래 실시예 3에서 본원에 기재된 바와 같은 시험관내 시알릴화 반응에 의해 결정된 바와 같이 공여자 기질로서 CMP-NeuNAc로부터 NeuNAc 모이어티의 전달을 위한 수용자 기질로서 또는 상기 시알릴락토스로부터 수용자 기질로서의 락토스로의 NeuNAc 모이어티의 전달을 위한 공여자 기질로서도 시알릴락토스를 수용하지 않는다. 따라서, 본 개시내용의 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제는 디시알릴락토스의 형성을 촉매할 수 없다. 또한, 본 개시내용의 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제는 트랜스-시알리다제 활성을 보유하지 않는다.
본 개시내용의 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제는 적어도 100개 아미노산의 스트레치에 걸쳐 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 하나와 적어도 25% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, α-2,6-시알릴트랜스퍼라제는 적어도 100개 아미노산의 스트레치에 걸쳐 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 하나와 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
서열 번호 1 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열은 추정 시알릴트랜스퍼라제에 대해 검색된 게놈 데이터베이스로부터 밝혀졌다. 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열은 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis)로부터의 추정 유전자에 의해 암호화되는 것으로 밝혀졌다.
다양한 실시양태에서, α-2,6-시알릴트랜스퍼라제는 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 하나와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개 또는 적어도 300개의 아미노산으로 이루어진 아미노산의 스트레치를 포함한다.
한 실시양태에서, α-2,6-시알릴트랜스퍼라제는 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 하나와 적어도 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, α-2,6-시알릴트랜스퍼라제는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
서열 번호 1 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열은 추정 시알릴트랜스퍼라제에 대해 검색된 게놈 데이터베이스로부터 검색되었다. 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열은 스트렙토코커스 수이스 (Streptococcus suis ) 속의 박테리아 세포의 게놈에 존재하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것으로 밝혀졌다. 상기 뉴클레오티드 서열은 데이터베이스에서 검색할 때 주석이 달려있지 않았지만, 그 동안 추정 시알릴트랜스퍼라제로 주석이 달렸다. 그러나, 추정 시알릴트랜스퍼라제로서의 주석은 이들의 효소 활성의 식별 또는 분류 없이 발생하였다.
제2 측면에 따르면, 세포에서 6'-시알릴락토스를 생산하기 위한 유전자 조작된 세포가 제공되며, 여기서 상기 세포는 본원에 앞서 기재된 바와 같은 락토스-수용 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제를 보유한다. 다양한 실시양태에서, 세포는 상기 락토스-수용 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제를 보유하도록 유전적으로 조작되었다.
본원에 사용된 용어 "유전자 조작된"은 분자 생물학적 방법을 사용한 세포의 유전자 구성의 변형을 지칭한다. 세포의 유전자 구성의 변형은 종 경계 내 및/또는 종 경계를 가로지르는 유전자의 전달, 뉴클레오티드, 삼중항, 유전자, 개방 판독 프레임, 프로모터, 인핸서, 터미네이터 및 유전자 발현을 매개 및/또는 조절하는 다른 뉴클레오티드 서열의 삽입, 결실, 대체 및/또는 변형을 포함할 수 있다. 세포의 유전자 구성의 변형은 특정하고 원하는 특성을 가진 유전자 변형 유기체를 생성하는 것을 목표로 한다. 유전자 조작된 세포는 세포의 본래(유전자 조작되지 않은) 형태로 존재하지 않는 하나 이상의 유전자를 함유할 수 있다. 외인성 핵산 분자를 도입 및/또는 외인성 핵산 분자(재조합, 이종성)를 세포의 유전 정보에 삽입하여 세포의 유전 정보의 뉴클레오티드 서열을 삽입, 결실 또는 변경하는 기술은 숙련된 기술자에게 알려져 있다. 유전자 조작된 세포는 세포의 천연 형태로 존재하는 하나 이상의 유전자를 함유할 수 있으며, 여기서 상기 유전자는 변형되어 인위적인 수단에 의해 세포 내로 재도입된다. 용어 "유전자 조작된"은 또한 세포에 내인성인 핵산 분자를 함유하고 세포로부터 핵산 분자를 제거하지 않고 변형된 세포를 포함한다. 이러한 변형은 유전자 대체, 부위-특이적 돌연변이, 및 관련 기술에 의해 수득된 것들을 포함한다.
일부 실시양태에서, 락토스-수용 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제는 이종 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제이다.
본원에 사용된 용어 "이종"은 세포 또는 유기체에 대해 외래성인 폴리펩티드, 아미노산 서열, 핵산 분자 또는 뉴클레오티드 서열, 즉 상기 세포 또는 유기체에서 자연적으로 발생하지 않는 폴리펩티드, 아미노산 서열, 핵산 분자 또는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본원에서 사용되는 "이종 서열" 또는 "이종 핵산" 또는 "이종 폴리펩티드"는 특정 숙주 세포에 외래성인 공급원으로부터(예를 들어 상이한 종으로부터) 유래하거나, 동일한 공급원으로부터 유래한 것이라면, 이의 본래 형태로부터 변형된다. 따라서, 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종 핵산은 프로모터가 유래된 것과 상이한 공급원으로부터, 또는 동일한 공급원으로부터 유래된 경우, 이의 본래 형태로부터 변형된다. 이종 서열은 예를 들어 형질감염, 형질전환, 접합 또는 형질도입에 의해 숙주 미생물 숙주 세포의 게놈 내로 안정적으로 도입될 수 있으며, 따라서 유전적으로 변형된 숙주 세포를 나타낸다. 서열이 도입될 숙주 세포에 의존하는 기술들이 적용될 수 있다. 다양한 기술이 당업계의 숙련가들에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 개시되어 있다. 따라서, "이종 폴리펩티드"는 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 폴리펩티드이고, "이종 시알릴트랜스퍼라제"는 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 시알릴트랜스퍼라제이다.
유전자 조작된 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이다. 바람직하게는, 유전자 조작된 세포는 미생물 세포이다. 적절한 미생물 세포는 효모 세포, 박테리아 세포, 고세균 세포(archaebacterial cell), 조류 세포(algae cell) 및 진균 세포를 포함한다.
추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, 미생물 세포는 원핵 세포, 바람직하게는 박테리아 세포, 보다 바람직하게는 바실러스 (Bacillus), 락토바실러스 (Lactobacillus), 락토코커스 ( Lactococcus ), 엔테로코커스 ( Enterococcus ), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 스포로락토바실러스 종( Sporolactobacillus spp.), 마이크로모모스포라 종( Micromomospora spp.), 마이크로코커스 종( Micrococcus spp.), 로도코커스 종( Rhodococcus spp.), 및 슈도모나스( Pseudomonas )이다. 적합한 박테리아 종은 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis ), 바실러스 코아귤런스 (Bacillus coagulans ), 바실러스 써모필러스 (Bacillus thermophilus ), 바실러스 라테로스포러스 (Bacillus laterosporus), 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium ), 바실러스 마이코이데스 (Bacillus mycoides ), 바실러스 푸밀러스 (Bacillus pumilus ), 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus ), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus ), 바실러스 서큘란스 (Bacillus circulans ), 비피도박테리움 롱검 ( Bifidobacterium longum ), 비피도박테리움 인판티스 ( Bifidobacterium infantis ), 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum ), 시트로박터 프룬디이 ( Citrobacter freundii ), 클로스트리디움 셀룰로리티쿰 (Clostridium cellulolyticum ), 클로스트리디움 룽달리이 (Clostridium ljungdahlii ), 클로스트리디움 아우토에타노게눔Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum ), 코리네박테리움 글루타미쿰 ( Corynebacterium glutamicum ), 엔테로코커스 패시움 (Enterococcus faecium ), 엔테로코커스 써모필레스 ( Enterococcus thermophiles ), 대장균(Escherichia coli), 에르위니아 허비콜라( Erwinia herbicola )( 판토에아 아글로메란스((Pantoea agglomerans)), 락토바실러스 애시도필러스 (Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius ), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum ), 락토바실러스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 델브루에키 (Lactobacillus delbrueckii ), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus ), 락토바실러스 불가리쿠스 (Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 크리스파투스 (Lactobacillus crispatus ), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri ), 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei ), 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri ), 락토바실러스 젠세니 (Lactobacillus jensenii), 락토코커스 락티스 ( Lactococcus lactis ), 판토에아 시트레아 ( Pantoea citrea), 펙토박테리움 카로토보룸 ( Pectobacterium carotovorum), 프로프리오니박테리움 프로이덴레이치 ( Proprionibacterium freudenreichii ), 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens ), 슈도모나스 아에루기노사 ( Pseudomonas aeruginosa), 스트렙토코커스 써모필레스 (Streptococcus thermophiles ) 및 크산토모나스 캄페스티리스(Xanthomonas campestris)이다.
대안적인 실시양태에서, 진핵 세포는 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포이다. 효모 세포는 바람직하게는 사카로마이세스 종( Saccharomyces sp.), 특히 사카로마이세스 세레비시에 ( Saccharomyces cerevisiae ), 사카로마이콥시스 종( Saccharomycopsis sp .), 피치아 종( Pichia sp .), 특히 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris ), 한세눌라 종( Hansenula sp .), 클루이베로마이세스 종(Kluyveromyces sp .), 야로위아 종( Yarrowia sp .), 로도토룰라 종( Rhodotorula sp.), 및 스키조사카로마이세스 종( Schizosaccharomyces sp .)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, 유전자 조작된 세포는 본원에 앞서 기재된 바와 같은 락토스-수용 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 함유 및 발현하도록 형질전환되었다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
a) 적어도 100개 아미노산의 스트레치에 걸쳐 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 하나와 적어도 25% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 락토스 수용 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;
b) 서열 번호 1 및 2 중 어느 하나로 표시되는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;
c) 서열 번호 3 및 서열 번호 4로 표시되는 뉴클레오티드 서열;
d) a) 내지 c)에 제시된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 상보적인 뉴클레오티드 서열; 및
e) a) 내지 d)에 제시된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열.
본원에서 사용되는 용어 "혼성화"는 Sambrook 등(Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd edition, 1989)에 기재된 바와 같은 통상의 조건하에서, 바람직하게는 엄격한 조건(stringent condition)하에서의 혼성화를 의미한다. 엄격한 하이브리드화 조건은 예를 들어, 65℃에서 4 X SSC에서 혼성화한 다음 65℃에서 0.1 X SSC에서 총 1시간 동안 다중 세척하는 것이다. 덜 엄격한 혼성화 조건은 예를 들어, 37℃에서 4 X SSC에서 혼성화한 다음 실온에서 1 X SSC에서 다중 세척하는 것이다. 본원에 사용된 용어 "엄격한 혼성화 조건"은 또한 0.25 M 인산나트륨, pH 7.2, 7% SDS, 1 mM EDTA 및 1% BSA 중에서 68℃에서 16시간 동안 혼성화한 다음 68℃에서 2 X SSC 및 0.1% SDS로 2회 세척하는 것을 의미할 수 있다.
유전자 조작된 세포에서, 락토스-수용 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 유전자 조작된 세포에서 락토스-수용 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 상기 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역에 영향을 미치는 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된다.
본원에서 사용되는 용어 "작동가능하게 연결된"은 락토스-수용 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열, 핵산 발현 조절 서열(예를 들어 프로모터, 오퍼레이터, 인핸서, 조절자, 전사 인자 결합 부위의 배열, 전사 종결자, 리보솜 결합 부위 등) 사이의 기능적 결합을 지칭하며, 여기서 발현 조절 서열은 락토스-수용 α-2,6-시알릴-트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 상응하는 핵산의 전사 및/또는 번역에 영향을 미친다. 따라서, 용어 "프로모터"는 DNA 중합체에서 유전자를 일반적으로 "선행"하고 mRNA로의 전사를 개시하기 위한 부위를 제공하는 DNA 서열을 지칭한다. "조절자" DNA 서열은, 또한 일반적으로 주어진 DNA 중합체 내의 유전자의 "상류"(즉, 선행)이며, 전사 개시의 빈도(또는 속도)를 결정하는 단백질에 결합한다. 총칭하여 "프로모터/조절자" 또는 "조절" DNA 서열로 지칭되며, 기능적 DNA 중합체에서 선택된 유전자(또는 일련의 유전자)에 선행하는 이러한 서열은 유전자의 전사(및 최종 발현)가 발생하는지 여부를 결정하기 위해 협력한다. DNA 중합체에서 유전자를 "추적"하고 mRNA로의 전사의 종결을 위한 신호를 제공하는 DNA 서열은 전사 "종결자" 서열로 지칭된다.
일부 실시양태에서, 유전자 조작된 세포는 CMP-N-아세틸뉴라민산, UDP-N-아세틸글루코사민, UDP-갈락토스 및 GDP-푸코스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드-활성화된 당의 증가된 생산을 보유한다. 바람직하게는, 적어도 하나의 유전자 조작된 세포는 상기 뉴클레오티드-활성화된 당 중 하나 이상의 증가된 생산을 보유하도록 유전적으로 조작되었다. 상기 뉴클레오티드 활성화된 당 중 적어도 하나의 생산은 상기 뉴클레오티드-활성화된 당 중 적어도 하나의 증가된 생산을 보유하도록 유전적으로 조작되기 전에 세포에서 동일한 뉴클레오티드-활성화된 당(들)의 생산과 비교하여 유전자 조작된 세포에서 증가된다.
추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, 세포는 유전자 조작되기 전의 세포와 비교하여, L-글루타민:D-프럭토스-6-포스페이트 아미노트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제, 글루코사민-1-포스페이트 아세틸 트랜스퍼라제, 포스포르-글루코사민 뮤타제, 글루코사민-6-포스페이트-N-아세틸트랜스퍼라제, N-아세틸-글루코사민-2-에피머라제, UDP-N-아세틸글루코사민-2-에피머라제, 시알산 합성효소, 포스포에놀피루베이트 합성효소, CMP-시알산 합성효소, UDP-갈락토스-4-에피머라제, 갈락토스-1-포스페이트 우리딜릴트랜스퍼라제, 포스포글루코-뮤타제, 글루코스-1-포스페이트 우리딜릴트랜스퍼라제, 포스포만노뮤타제, 만노스-1-포스페이트 구아노실트랜스퍼라제, GDP-만노스-4,6-탈수효소, GDP-L-푸코스 합성효소 및 푸코스키나제/L-푸코스-1-포스페이트-구아닐트랜스퍼라제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 효소 활성을 보유할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 과발현하도록 유전적으로 조작되었다.
상기 유전자 중 하나 이상의 과발현은 유전자 조작된 세포에서 상응하는 효소(들)의 양을 증가시키고, 따라서 세포에서 상응하는 효소 활성을 증가시켜 상기 뉴클레오티드-활성화된 당 중 적어도 하나의 세포내 생산을 향상시킨다.
바람직하게는, 상기 뉴클레오티드 서열은 유전자 조작된 세포에서 상기 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역에 영향을 미치는 적어도 하나의 핵산 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된다.
추가의 및/또는 대안적 실시양태에서, 유전자 조작된 세포는 글루타민:프럭토스-6-포스페이트 아미노트랜스퍼라제(GlmS), 바람직하게는 이종 글루타민:프럭토스-6-포스페이트 아미노트랜스퍼라제, 보다 바람직하게는 대장균으로부터 유래된 글루타민:프럭토스-6-포스페이트 아미노트랜스퍼라제(acc. no. NP_418185), 또는 대장균 GlmS의 기능적 변이체를 보유한다. 가장 바람직하게는, 기능적 변이체는 예를 들어 돌연변이체 glm S 유전자에 의해 암호화된 바와 같이 야생형 효소가 그러한 것처럼 글루코사민-6-포스페이트 억제에 대해 상당히 감소된 민감성을 나타내는 대장균 GlmS의 버전이다(Deng et al. , Metab Eng. 7 (2005):201-2 14).
효소 글루타민:프럭토스-6-포스페이트 아미노트랜스퍼라제(EC 2.6.1.16)는 글루타민을 사용하여 프럭토스-6-포스페이트를 글루코사민-6-포스페이트로 전환하는 것을 촉매한다. 이 효소 반응은 전형적으로 헥소사민 생합성 경로의 첫 번째 단계인 것으로 간주된다. 글루타민:프럭토스-6-포스페이트 아미노트랜스퍼라제의 대안적인 명칭은 D-프럭토스-6-포스페이트 아미도트랜스퍼라제, GFAT, 글루코사민-6-포스페이트 합성효소, 헥소스포스페이트 아미노트랜스퍼라제 및 L-글루타민-D-프럭토스-6-포스페이트 아미도트랜스퍼라제이다.
추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, 유전자 조작된 세포는 글루코사민-6-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제(Gna1), 바람직하게는 이종 글루코사민-6-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제, 보다 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시에(S. cerevisiae)(acc. no. NP_116637)로부터 유래된 글루코사민-6-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제, 또는 사카로마이세스 세레비시에 Gna1의 기능적 변이체를 포함한다. 그러나, 글루코사민-6-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제, 이들의 추론된 아미노산 서열 및 이들 글루코사민-6-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 다양한 상이한 종으로부터 공지되어 있으며, 또한 적합한 글루코사민-6-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제로서 사용될 수 있다.
추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, 유전자 조작된 세포는 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 포스파타제, 바람직하게는 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 (GlcNAc6P)의 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)으로의 전환을 촉매하는 HAD-유사 슈퍼패밀리의 당 포스파타제를 발현한다. HAD-유사 슈퍼패밀리는 박테리아 효소 할로산 탈수소효소의 이름을 따서 명명되었으며 포스파타제를 포함한다. GlcNAc6P의 GlcNAc로의 전환을 촉매하는 HAD-유사 슈퍼패밀리의 적합한 포스파타제는 프럭토스-1-포스페이트 포스파타제(YqaB, acc. no. NP_417175) 및 알파-D-글루코스 1-포스페이트 포스파타제(YihX, acc. no. NP_418321)로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 대장균 YqaB 및 대장균 YihX 효소는 또한 GlcNAc6P에 작용하는 것으로 간주된다(Lee, S.-W. and Oh, M.-K. (2015) Metabolic Engineering 28: 143-150). 한 실시양태에서, GlcNAc-6-포스페이트의 GlcNAc로의 전환을 촉매하는 HAD-유사 슈퍼패밀리의 당 포스파타제는 유전자 조작된 세포에서 이종 효소이다. 추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, GlcNAc6P의 GlcNAc로의 전환을 촉매하는 HAD-유사 슈퍼패밀리의 당 포스파타제는 대장균 YqaB, 대장균 YihX, 및 이의 기능적 변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, 유전자 조작된 세포는 GlcNAc6P의 GlcNAc로의 전환을 촉매하는 HAD-유사 슈퍼패밀리의 당 포스파타제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 함유한다. 추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, GlcNAc6P의 GlcNAc로의 전환을 촉매하는 HAD-유사 슈퍼패밀리의 당 포스파타제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 이종 뉴클레오티드 서열이다. 추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, GlcNAc6P의 GlcNAc로의 전환을 촉매하는 HAD-유사 슈퍼패밀리의 당 포스파타제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 대장균 프럭토스-1-포스페이트 포스파타제 또는 대장균 알파-D-글루코스 1-포스페이트 포스파타제 또는 이들 2개의 효소 중 하나의 기능적 단편을 암호화한다.
추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, 비-자연 발생 세포는 GlcNAc6P의 GlcNAc로의 전환을 촉매하는 HAD-유사 슈퍼패밀리의 당 포스파타제 또는 상기 HAD 포스파타제의 기능적 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 함유하도록 및/또는 GlcNAc6P의 GlcNAc로의 전환을 촉매하는 HAD-유사 슈퍼패밀리의 당 포스파타제 또는 이의 기능적 변이체를 포함하도록 유전적으로 조작되었다.
GlcNAc6P의 GlcNAc로의 전환을 촉매하는 HAD-유사 슈퍼패밀리의 적합한 당 포스파타제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 대장균 YqaB, 대장균 YihX 및 이의 기능적 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 그룹으로부터 선택될 수 있다.
추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, 유전자 조작된 세포는 N-아세틸글루코사민 2-에피머라제, 바람직하게는 시네코시스티스 종( Synechocystis sp .) PCC 6803(acc. no. BAL35720)의 이종 N-아세틸글루코사민 2-에피머라제 Slr1975를 보유한다.
N-아세틸글루코사민 2-에피머라제(EC 5.1.3.8)는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)의 N-아세틸만노사민(ManNAc)으로의 전환을 촉매하는 효소이다. 효소는 탄수화물과 이의 유도체에 작용하는 라세미화효소이다. 이 효소 종류의 계통명은 N-아실-D-글루코사민 2-에피머라제이다. 이 효소는 아미노-당 대사 및 뉴클레오티드-당 대사에 참여한다.
추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, 유전자 조작된 세포는 시알산 합성효소 또는 이의 기능적 변이체, 바람직하게는 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)의 이종 시알산 합성효소 NeuB(acc. no. AF305571)를 포함한다.
시알산 합성효소 또는 N-아세틸뉴라미네이트 합성효소 또는 N-아세틸뉴라민산 합성효소(EC 2.5.1.56)는 포스포에놀-피루베이트(PEP)를 사용하여 N-아세틸만노사민을 N-아세틸뉴라민산으로 전환하는 것을 촉매하는 효소이다. N-아세틸뉴라민산 합성효소(NeuB)는 neuB 유전자에 의해 암호화된다.
추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, 유전자 조작된 세포는 세포의 야생형보다 더 많은 PEP를 합성한다. 추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, 유전자 조작된 세포는 강화된 PEP 생합성 경로를 보유하도록 유전적으로 조작되었다. 바람직하게는, 유전자 조작된 세포는, 예를 들어 포스포에놀피루베이트 합성효소를 암호화하는 ppsA 유전자(acc. no. ACT43527)는 과발현되고/되거나 유전자 조작된 세포는 포스포에놀피루베이트 합성효소 또는 이의 기능적 변이체의 발현을 허용하는 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 추가 카피를 함유한다는 점에서, 증가된 포스포에놀피루베이트 합성효소 활성을 보유하도록 유전적으로 조작되었다. ppsA의 과발현은 시알산 생산에 더 많은 PEP가 이용 가능하도록 세포내 PEP 합성을 향상시킨다. 예를 들어, 적합한 포스포에놀피루베이트 합성효소는 대장균의 PpsA이다.
추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, 유전자 조작된 세포는 CMP-시알산 합성효소 또는 이의 기능적 변이체, 바람직하게는 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)의 이종 CMP-시알산 합성효소 NeuA(acc. no. AF305571)를 포함한다.
세포에서 과발현되는 상기 CMP-시알산 합성효소는 CMP-활성화 시알산(CMP-Neu5Ac)을 생성하기 위해 CMP 잔기를 시알산 상으로 전달할 수 있다.
추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, 적어도 하나의 유전자 조작된 세포는, 유전적으로 조작되기 전의 세포와 비교하여, β-갈락토시다제 활성, 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제, N-아세틸만노사민 키나제, N-아세틸만노사민-6-포스페이트 에피머라제 및 N-아세틸뉴라민산 알돌라제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 효소 활성이 부족하거나 감소된 활성을 보유한다.
추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, β-갈락토시다제, 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제, N-아세틸만노사민 키나제, N-아세틸만노사민-6-포스페이트 에피머라제 및 N-아세틸뉴라민산 알돌라제를 암호화하는 유전자 중 하나 이상이 유전자 조작된 세포의 게놈으로부터 결실되었거나, β-갈락토시다제, 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제, N-아세틸만노사민 키나제, N-아세틸만노사민-6-포스페이트 에피머라제 및 N-아세틸뉴라민산 알돌라제를 암호화하는 유전자 중 하나 이상의 발현이 유전자 조작된 세포에서 비활성화되었다.
추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, 적어도 하나의 유전자 조작된 세포는 기능적 락토스 투과효소, 기능적 푸코스 투과효소 및 기능적 시알산 수송체(임포터)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하고, 바람직하게는 기능적 락토스 투과효소, 기능적 푸코스 투과효소 및 기능적 시알산 수송체(임포터)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것을 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 발현한다.
추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, 유전자 조작된 세포는 β-1,3-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제, β-1,3-갈락토실트랜스퍼라제, β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제, α-2,3-시알릴트랜스퍼라제 및 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 글리코실트랜스퍼라제의 활성을 보유한다.
제3 측면에 따르면, 세포에서 6'-시알릴-락토스를 생산하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은 다음을 포함한다:
- 6'-시알릴락토스의 생산을 위한 유전자 조작된 세포를 제공하는 단계(여기서, 상기 세포는 본원에 앞서 기재된 바와 같은 락토스-수용 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제, 즉 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 하나와 적어도 100개 아미노산의 스트레치에 걸쳐 적어도 25% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 락토스-수용 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제를 보유하도록 유전적으로 조작되었다);
- 상기 세포를 배양 배지에서 및 6'-시알릴락토스 생산에 허용적인 조건하에서 배양하는 단계; 및
- 임의로 상기 6'-시알릴락토스를 회수하는 단계.
6'-시알릴락토스의 생산을 위해, 적어도 하나의 유전자 조작된 세포는 배양 배지에서 및 상기 세포에서 6'-시알릴락토스의 생산에 허용적인 조건하에서 배양된다.
배양 배지는 유전자 조작된 세포를 위한 적어도 하나의 탄소원(carbon source)을 함유한다. 적어도 하나의 탄소원은 바람직하게는 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 글리세롤 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가의 및/또는 대안적인 실시양태에서, 배양 배지는 갈락토스, 락토스 및 시알산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 함유한다.
상기 방법은 배양 배지에서 배양하는 동안 적어도 하나의 유전자 조작된 세포에서/에 의해 생산된 6'-시알릴락토스를 회수하는 단계를 포함한다. 6'-시알릴락토스는 유전자 조작된 세포(들)가 예를 들어 원심분리에 의해 제거된 후 발효 브로스로부터 회수될 수 있고/있거나, 예를 들어 세포가 원심분리에 의해 발효 브로스로부터 수확되고, 세포 용해 단계를 거친다는 점에서 세포로부터 회수될 수 있다. 이어서, 6'-SL은 숙련된 기술자에게 공지된 적합한 기술에 의해 배양 배지 및/또는 세포 용해물로부터 추가로 정제될 수 있다. 적합한 기술은 정밀여과, 한외여과, 정용여과, 모의 이동층 유형 크로마토그래피, 전기투석, 역삼투압, 겔 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 등을 포함한다.
본 발명은 특정 실시양태에 대하여 도면을 참조하여 설명될 것이지만, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니라 특허청구범위에 의해서만 제한된다. 더욱이, 명세서 및 청구항들에서 제1, 제2 등의 용어들은 유사한 요소들을 구별하기 위해 사용되며, 시간적으로, 공간적으로, 순위적으로 또는 임의의 다른 방식으로 순서를 기재하기 위해 반드시 사용되는 것은 아니다. 이와 같이 사용된 용어들은 적절한 상황하에서 상호교환가능하며, 본원에 기재된 본 발명의 실시양태는 본원에 기재되거나 예시된 것 이외의 다른 순서로 동작할 수 있다는 것을 이해해야 한다.
청구항에서 사용된 용어 "포함하는(comprising)"은 그 이후에 열거된 수단으로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다는 것을 주지해야 한다; 이것은 다른 요소 또는 단계를 제외하지 않는다. 따라서, 이것은 언급된 특징, 정수, 단계 또는 구성요소의 존재를 특정하는 것으로 해석되어야 하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계 또는 구성요소, 또는 이들의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 따라서, "수단 A 및 B를 포함하는 장치"라는 표현의 범위는 구성요소 A 및 B만으로 구성되는 장치에 제한되어서는 안 된다. 이는 본 발명과 관련하여, 장치의 유일한 관련 구성요소가 A 및 B라는 것을 의미한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 "한 실시형태(one embodiment)" 또는 "실시형태(an embodiment)"에 대한 언급은 실시형태와 관련하여 기재된 특정 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시형태에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 장소에서 "한 실시형태에서(in one embodiment)" 또는 "실시형태에서(in an embodiment)"라는 어구의 출현은 반드시 모두 동일한 실시형태를 지칭하는 것은 아니지만, 그럴 수도 있다. 더욱이, 특정 특징, 구조 또는 특성은 본 개시내용으로부터 당업계의 통상의 숙련가에게 명백한 바와 같이, 하나 이상의 실시양태에서 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다.
유사하게, 본 발명의 예시적인 실시양태의 설명에서, 본 발명의 다양한 특징들은 개시내용을 간소화하고 다양한 발명적 측면들 중 하나 이상의 이해를 돕기 위한 목적으로 때때로 단일의 실시형태, 도면 또는 이의 설명으로 함께 그룹화된다는 것을 인지해야 한다. 그러나, 이러한 개시내용의 방법은 청구된 발명이 각 청구항에서 명백히 인용된 것보다 더 많은 특징을 요구한다는 의도를 반영하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 오히려, 후술하는 청구항들이 반영하는 바와 같이, 본 발명의 측면들은 전술한 단일 개시된 실시양태들의 모든 특징들보다 덜 놓여 있다. 따라서, 상세한 설명에 뒤따르는 청구항들은 본원에서 이러한 상세한 설명에 명백히 포함되며, 각각의 청구항은 본 발명의 별개의 실시양태로서 그 자체로 존재한다.
더욱이, 본원에 기재된 일부 실시양태는 다른 실시양태에 포함된 일부 특징은 포함하고 다른 실시양태에 포함된 다른 특징은 포함하지 않지만, 당업자가 이해하는 바와 같이 상이한 실시양태의 특징의 조합은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도되고, 상이한 실시양태를 형성한다. 예를 들어, 다음 청구범위에서, 청구된 실시양태 중 임의의 것이 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
더욱이, 실시양태들 중 일부는 컴퓨터 시스템의 프로세서에 의해 또는 기능을 수행하는 다른 수단에 의해 구현될 수 있는 방법 또는 방법의 요소들의 조합으로서 본원에 기재된다. 따라서, 이러한 방법 또는 방법의 요소를 수행하기 위해 필요한 명령을 가진 프로세서는 방법 또는 방법의 요소를 수행하기 위한 수단을 형성한다. 또한, 장치 실시양태의 본원에 기재된 요소는 본 발명을 수행하기 위한 목적으로 요소에 의해 수행되는 기능을 수행하기 위한 수단의 예이다.
본원에 제공된 설명 및 도면에는, 다수의 구체적인 세부사항이 제시된다. 그러나, 본 발명의 실시양태는 이러한 구체적인 세부사항 없이 실시될 수 있는 것으로 이해된다. 다른 예들에서, 잘 알려진 방법들, 구조들 및 기술들은 이러한 설명의 이해를 모호하게 하지 않기 위해 상세히 도시되지 않았다.
본 발명은 이제 본 발명의 여러 실시양태의 상세한 설명에 의해 기재될 것이다. 본 발명의 다른 실시양태는 본 발명의 진정한 사상 또는 기술적 교시를 벗어나지 않으면서 숙련가의 지식에 따라 구성될 수 있음이 명백하며, 본 발명은 첨부된 특허청구범위의 용어에 의해서만 제한된다.
실시예 1: α-2,6-시알릴트랜스퍼라제의 식별
특성화된 또는 추정 시알릴트랜스퍼라제의 유전자 서열은 문헌 및 공개 데이터베이스로부터 제공받았다. 또한, 공지된 시알릴트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 주형 서열로 사용하여 서열 유사성 검색을 수행하였다. 단백질 코딩(coding) 뉴클레오티드 서열은 주석이 달린 전장 형태로 또는, 신호 펩티드가 예측되는 경우, N-말단 신호 펩티드가 결여된 절단된 변이체로 GenScript cooperation에 의해 합성되었다.
추정 신호 펩티드의 식별을 가능하게 하는 적절한 소프트웨어 도구는 숙련된 기술자에게 알려져 있다.
시알릴트랜스퍼라제는 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 SLIC에 의해 pDEST14로 neuA가 있는 오페론으로서 서브클로닝되어 일반적인 종류의 플라스미드인 pDEST14-siaT-neuA를 생성하거나, 제한 부위 NdeI 및 Bam HI를 사용하여 플라스미드 pET11a로 GenScript cooperation에 의해 직접 서브클로닝되었다. 두 발현 시스템 모두 IPTG-유도성 유전자 발현을 허용한다. 생체내 활성 스크리닝을 위해, 플라스미드는 시알산의 데 노보 합성(de novo synthesis)이 가능한 대장균 균주 또는 시알산 임포터(예를 들어 대장균 nanT) 뿐만 아니라 CMP-시알산 합성효소를 암호화하는 균주(예를 들어 C. 제주니 neuA)로 형질전환되었다. 시험관내 분석을 위해 대장균 BL21(DE3) 야생형 또는 이의 lacZ-결여된 변이체가 사용되었다.
스크리닝된 효소의 활성은 박막 크로마토그래피 및/또는 질량 분광 분석을 사용한 생성물 식별에 의해 결정되었다.
박층 크로마토그래피(TLC)에 의해 분석된 샘플을 실리카겔 60 F254(Merck KGaA, Darmstadt, Germany) 상에 적용하였다. 부탄올:아세톤:아세트산:H2O (35/35/7/23 (v/v/v/v))의 혼합물을 이동상으로 사용하였다. 분리된 물질의 검출을 위해, TLC 플레이트를 티몰 시약(95 ml 에탄올에 용해된 티몰 0.5 g, 황산 5 ml 첨가)에 적시고 가열하였다.
질량 분광 분석은 LC Triple-Quadrupole MS 검출 시스템을 사용하여 MRM(multiple reaction monitoring)에 의해 수행하였다. 전구체 이온을 사중극 1에서 선택 및 분석하고, CID 가스로서 아르곤을 사용하여 충돌 세포에서 단편화를 일으키며, 단편 이온의 선택은 사중극 3에서 수행한다. 탄수화물의 크로마토그래피 분리는 XBridge Amide guard 카트리지(3.5μm, 2.1 x 10mm)(Waters, USA)를 갖는 XBridge Amide HPLC 컬럼(3.5μm, 2.1 x 50mm(Waters, USA))에서 수행하였다. HPLC 시스템의 컬럼 오븐 온도는 50℃였다. 이동상은 아세토니트릴:10mM 아세트산암모늄을 가진 H2O로 구성되었다. 1μl 샘플을 기기에 주입하였다; 실행은 400μL/min의 유속으로 3.60분 동안 수행하였다. 탄수화물은 ESI 양성 이온화 모드에서 MRM에 의해 분석하였다. 락토스는 m/z 341.00 [MH]의 이온을 형성한다. 락토스의 전구체 이온은 충돌 세포에서 단편 이온 m/z 179.15, m/z 161.15 및 m/z 101.05로 추가로 단편화되었다.
[표 1]
입증된 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제 활성을 갖는 효소 (GT: 글리코실트랜스퍼라제; AA: 아미노산; NA: 핵산)
시알릴락토스는 m/z 656.2 [M+Na]의 이온을 형성한다. 시알릴락토스의 전구체 이온은 충돌 세포에서 단편 이온 m/z 612.15, m/z 365.15 및 m/z 314.15로 추가로 단편화되었다. 디시알릴락토스는 m/z 942.4 [M+H+NH3]의 이온을 형성한다. 디시알릴락토스의 전구체 이온은 충돌 세포에서 단편 이온 m/z 292.30, m/z 274.30 및 m/z 634.05로 추가로 단편화되었다. 충돌 에너지, Q1 및 Q3 Pre Bias는 각 분석물에 대해 개별적으로 최적화되었다.
표 1에 열거된 모든 효소에 대해, 6'-SL의 형성은 락토스의 존재하에서 발현 및/또는 분석될 때 검증될 수 있었다.
실시예 2: 포토박테리움 레이오그나티 ( Photobacterium leiognathi ) 의 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제 plsT6을 암호화하는 조작된 대장균 균 주를 사용한 6'- SL의 발효적 생산
포토박테리움 레이오그나티 ( Photobacterium leiognathi )(acc. No. BAI49484)로부터의 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제 유전자의 게놈 통합을 포함하는 재조합 6'-시알릴락토스 합성 대장균 균주(대장균 BL21(DE3)- lacZ)를 사용하여 6'-시알릴락토스 유가식 발효를 수행하였다. CMP-시알산의 생합성을 가능하게 하기/향상시키기 위해, 대장균으로부터의 글루코사민-6-포스페이트 합성효소 GlmS, 시네코시스티스 종(Synechocystis sp .)으로부터의 N-아세틸글루코사민-2-에피머라제 Slr1975, 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)로부터의 글루코사민 6-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제 Gna1, 대장균으로부터의 포스포에놀피루베이트 합성효소 PpsA. 둘 다 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)로부터의 N-아세틸뉴라미네이트 합성효소 NeuB 및 CMP-시알산 합성효소 NeuA를 암호화하는 유전자를 대장균 BL21(DE3) 숙주에 염색체적으로 통합하였다. 또한, 대장균으로부터의 락토스 투과효소 LacY를 암호화하는 유전자, 및 대장균 W로부터의 유전자 cscB(수크로스 투과효소), cscK(프럭토키나제), cscA(수크로스 가수분해효소) 및 cscR(전사 조절자)를 BL21 게놈에 통합하였다. 통합된 유전자의 전사는 테트라사이클린 프로모터 Ptet 또는 PT5 프로모터 중 하나인 구성적 프로모터로부터 개시된다. 유전자 galE(UDP-글루코스-4-에피머라제), galT(갈락토스-1-포스페이트 우리딜릴트랜스퍼라제), galK(갈락토키나제) 및 galM(갈락토스-1-에피머라제)으로 구성된 기능적 gal-오페론을 대장균 K12에서 BL21 균주의 게놈으로 옮겼다.
N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제(NagA)를 코딩하는 N-아세틸글루코사민 6-포스페이트 유전자의 분해를 방지하기 위해, 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제(NagB) 및 N-아세틸글루코사민 특이적 PTS 단백질 IIABC(NagE)를 염색체로부터 결실시켰다. 또한, 만노스, 글루코스, 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민에 대한 대장균 PTS 시스템의 당 수송체를 암호화하는 오페론 manXYZ 뿐만 아니라 각각 N-아세틸뉴라미네이트 리아제, N-아세틸만노사민 키나제, N-아세틸만노사민-6-포스페이트 에피머라제 및 시알산 수송체를 암호화하는 유전자 nanA, nanK, nanE, 및 nanT를 결실시켰다. N-아세틸갈락토사민-6-포스페이트 데아세틸라제(AgaA)를 암호화하는 유전자도 결실시켰다.
6'-시알릴락토스의 발효적 생산을 위해, 균주를 7 g l-1 NH4H2PO4, 7 g l-1 K2HPO4, 2 g l-1 KOH, 0.3g l-1 시트르산, 5 g l-1 NH4Cl, 1 ml l-1 소포제 (Struktol J673, Schill + Seilacher), 0.1 mM CaCl2, 8 mM MgSO4, 미량 원소 (0.101 g l-1 니트릴로트리아세트산, pH 6.5, 0.056 g l-1 시트르산제2철암모늄, 0.01 g l-1 MnCl2 x 4 H2O, 0.002 g l-1 CoCl2 x 6 H2O, 0.001g l-1 CuCl2 x 2 H2O, 0.002 g l-1 붕산, 0.009 g l-1 ZnSO4 x 7 H2O, 0.001 g l-1 Na2MoO4 x 2 H2O, 0.002 g l-1 Na2SeO3, 0.002 g l-1 NiSO4 x 6 H2O) 및 탄소원으로서의 2% 수크로스를 포함하는 정의된 무기염 배지에서 성장시켰다.
수크로스 공급물(500 g l-1)에 8 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2, 미량 원소 및 5 g l-1 NH4Cl을 보충하였다. 6'-시알릴락토스 형성을 위해, 216 g l-1의 락토스 공급물을 사용하였다. pH는 암모니아 용액(25% v/v)을 사용하여 조절하였다. 유가식 발효는 출발 용적을 기준으로 5.5 - 7 mL L-1 h-1의 수크로스 공급 속도를 적용하여 72시간 동안 일정한 통기 및 교반하에 30℃에서 수행하였다. 생산 과정 말기에 6'-시알릴락토스로 전환되지 않은 락토스는 β-갈락토시다제의 첨가에 의해 분해되었고 락토스의 가수분해로부터의 단당류는 생산 균주에 의해 대사되었다. 상당한 양의 6'-SL이 박테리아 세포에 의해 배양 상청액으로 배출되었다. 그러나, 또한, 디시알릴락토스가 형성되었으며(도 2), 이는 박층 크로마토그래피 뿐만 아니라 질량 분광 분석에 의해 확인할 수 있었다. HPLC에 의해 결정된 배양 브로스에서의 6'6-디-SL 대 6'-SL의 비율은 대략 8%였다.
HPLC 시스템(Shimadzu, Germany)에 연결된 굴절률 검출기(RID-10A)(Shimadzu, Germany) 및 Waters XBridge Amide 컬럼 3.5μm(250 x 4.6mm)(Eschborn, Germany)를 사용한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석을 수행하여 발효 브로스 내의 6'6-디시알릴락토스 대 6'-시알릴락토스의 비율을 추정하였다. 용리는 35℃에서 1.4 ml·min-1의 유속으로 ddH2O(아세트산으로 pH 4.2로 조정됨) 중 71%(v/v) ACN으로 등용매로 수행하였다. HPLC 샘플을 멸균 여과하고(0.22μm 공극 크기) 주입 전에 5분 동안 80℃로 가열하였다. 10μl의 샘플을 컬럼에 적용하였다. 6'-SL 및 6'6-디-SL의 체류 시간은 정제된 표준을 적용하여 결정하였다. 6'6-디-SL 대 6'-SL의 비율은 크로마토그램에서 해당 피크의 AUC(곡선하 면적) 몫을 구축하여 결정할 수 있다.
실시예 3: 6 '- 시알릴락토스의 생산을 위한 신규한 α-2,6- 시알릴트랜스퍼라제
스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis)로부터 기원하는 시알릴트랜스퍼라제는 갈락토시드(예를 들어 갈락토스 또는 락토스)를 수용자 기질로 사용할 때 우수한 시알릴트랜스퍼라제 활성을 입증하여, 해양 박테리아로부터 기원하는 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제에 대한 대안으로 밝혀졌다. 주석이 달린/추정 스트렙토코커스 수이스 (S. suis ) 시알릴트랜스퍼라제는 이전에 락토스 수용 효소로 특성화된 적이 없으므로 지금까지 스트렙토코커스 수이스 (S. suis ) 시알릴트랜스퍼라제가 6'-SL 생산에 적용된 적은 없다.
심층적인 특성화를 위해, 시험관내 효소 분석을 수행하였다. 따라서, 시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 대장균 BL21(DE3) 보유 플라스미드를 암피실린 100 μg ml-1이 보충된 2YT 배지 20ml로 채워진 100ml 진탕 플라스크에서 30℃에서 성장시켰다. 배양물이 0.1 내지 0.3의 OD600에 도달했을 때, 0.3 mM IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하고, 12 내지 16시간 동안 배양을 계속하였다. 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 유리 비드를 사용하여 정의된 용적의 50 mM Tris-HCl pH 7.5에서 기계적으로 파쇄하였다. 단백질 추출물은 분석이 시작될 때까지 얼음 위에 보관하였다.
[표 2]
생체내 및/또는 시험관내 분석 동안 시알릴화를 위해 상이한 탄수화물을 수용하는 능력에 대해 시험된 후보 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제의 요약. 각 시알릴트랜스퍼라제의 활성을, 각 수용자 기질에 대해 개별적으로, Pst-6에 반정량적으로 비교하였다.
이들의 시알릴트랜스퍼라제 특성을 결정하기 위해, 시험관내 분석은 50 mM Tris-HCl pH7.5, 5 mM MgCl2, 10 mM CMP-Neu5Ac 및 락토스, 3'-SL 또는 6'-SL과 같은 다양한 농도의 수용자 기질을 포함하는 25 μl의 총 용적에서 수행하였다. 분석은 3 μl 단백질 추출물의 첨가로 시작하여 최대 16 시간 동안 계속되었다. 생성물 형성은 박층 크로마토그래피에 의해 결정되었고, 질량 분광법에 의해 검증되었다. 이러한 시험관내 분석의 예시적인 결과는 도 3, 4 및 도 5에 도시되어 있다. 포토박테리움 (Photobacterium) α-2,6-시알릴트랜스퍼라제는 락토스 뿐만 아니라 6'-SL을 각각 6'-SL 및 디-SL로 전환시킬 수 있는 반면, 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis ) 효소는 락토스가 수용자 기질로 제공될 때 검출 가능한 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제 활성을 단독으로 입증한다. 요약된 결과는 표 2에서 발견할 수 있다. 놀랍게도, 스트렙토코커스 수이스 (S. suis ) 시알릴트랜스퍼라제 중 어느 것도 디시알릴락토스 형성이 가능하지 않았다.
시알리다제/트랜스-시알리다제 활성의 결정을 위해, 시험관내 분석은 50 mM Tris-HCl pH7.5, 5 mM MgCl2 및 다양한 농도의 3'-SL 또는 6'-SL를 포함하는 총 용적 25 μl에서 수행하였다. 분석은 3 μl 단백질 추출물의 첨가로 시작하여 최대 16 시간 동안 계속되었다. 락토스 및/또는 디시알릴락토스 형성은 박층 크로마토그래피 및/또는 질량 분광법에 의해 결정되었다. 해양 박테리아로부터 기원하는 시알릴트랜스퍼라제와 달리, 스트렙토코커스 수이스 (S. suis ) 시알릴트랜스퍼라제 중 어느 것도 3'-SL 및/또는 6'-SL을 락토스 및/또는 디시알릴락토스로 전환할 수 없었다(표 3).
[표 3]
시험관내 분석 동안 시알리다제/트랜스-시알리다제 활성에 대해 시험된 후보 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제의 요약. 각 효소의 활성을 Pst-6에 반정량적으로 비교하였다.
실시예 4: 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis) 의 α-2,6- 시알릴트랜스퍼라제 cps16Q 를 암호화하는 조작된 대장균 균주를 사용한 6'- SL의 발효적 생산
실시예 2에 기재된 바와 같이 대사적으로 조작되었지만 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis)(acc. No. AGL48117)로부터의 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제 유전자의 게놈 통합을 함유하는 대장균 균주를 유가식 발효에 적용하였다. 배양 조건은 실시예 2에 기재되어 있다. 배양 중단 후, 실시예 2에 기재된 공정에 필적하는 상당한 양의 6'-SL이 배양 상청액에서 검출 가능하였지만 디시알릴락토스는 검출되지 않았다.
SEQUENCE LISTING <110> Jennewein Biotechnologie GmbH <120> Sialyltransferases for the production of 6'-sialyllactose <130> P 1905 WO2 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 317 <212> PRT <213> Streptococcus suis <400> 1 Met Lys Arg Ile Tyr Ile Cys His Thr Val Tyr Gln Val Leu Ile Ser 1 5 10 15 Leu Leu Lys Met Asp Ile Lys Asn Asp Thr Leu Leu Ser Val Gly Ile 20 25 30 Val Lys Asn Phe Pro Asn Met Arg Asn Glu Leu Met Ala Tyr Val Asn 35 40 45 Leu Val Glu Val Glu Glu Tyr Thr Phe Gly Leu Arg Ser Met Ile His 50 55 60 Thr Leu Glu Thr Lys Asn Trp Phe Ser Phe Phe Lys Asn Phe Glu Glu 65 70 75 80 Ile Ile Ile Phe Leu Asp His Arg Gln Val Gly His Phe Leu Asn Lys 85 90 95 His Lys Leu Pro Tyr Phe Leu Ile Glu Asp Gly Tyr Asn Phe Phe Lys 100 105 110 Asp Lys Arg Val Cys His Leu Glu Ser Ile Gln Ser Ser Trp Lys Arg 115 120 125 Ile Leu Tyr Arg Trp Tyr Phe Arg Pro Ala Thr Leu Ile Gly Ser Ser 130 135 140 Pro Tyr Cys Gln Ser Ile Glu Val Asn Asp Leu Ser Leu Val His Pro 145 150 155 160 Glu Gln Ala Tyr Lys Pro Phe Val Glu Val Pro Arg Lys Lys Leu Phe 165 170 175 Asp Ser Ile Ser Gln Glu Arg Leu Glu Ala Ile Val Gln Ile Phe Gly 180 185 190 Val Lys Ser Leu Phe Asn Asn Glu Val Ile Lys Glu Arg Arg Val Leu 195 200 205 Leu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Trp Glu Phe Tyr Val Thr Asp Glu Glu 210 215 220 Arg Leu Glu Ile Tyr Leu Ala Gly Leu Arg Pro Tyr Tyr Lys Asp Tyr 225 230 235 240 Lys Ile Tyr Ile Lys Pro His Pro Arg Asp Ser Phe Asp Tyr Ser Ser 245 250 255 Leu Gly Asp Gly Ile Ile Ile Phe Pro Gln Asp Ile Pro Ile Glu Leu 260 265 270 Phe Glu Leu Ala Gly Tyr Met Asn Phe Asp Val Gly Ile Thr Tyr Ser 275 280 285 Ser Ser Ser Met Asp Tyr Leu Asp Cys Phe Asp Glu Lys Val Tyr Leu 290 295 300 His Glu Lys Phe Pro Leu Pro Ser Lys Thr Lys Ile Asp 305 310 315 <210> 2 <211> 322 <212> PRT <213> Streptococcus suis <400> 2 Met Arg Arg Ile Tyr Ile Cys His Thr Met Tyr Gln Ile Leu Ile Ser 1 5 10 15 Leu Leu Lys Met Asp Val Glu Arg Asp Ser Leu Met Ser Val Asp Ile 20 25 30 Ile Gly His Phe Pro Asp Val Arg Glu Gln Leu Gln His Val His Leu 35 40 45 Ile Glu Glu Thr Glu Arg Ser Phe Asp Leu Tyr Ser Leu Ile Ala Arg 50 55 60 Ser Lys Thr Lys Glu Arg Leu Ser Leu Leu Gln Ser Tyr Asp Glu Val 65 70 75 80 Ile Ile Phe Gln Asp His Arg Gln Val Gly His Phe Leu Asn Lys His 85 90 95 Arg Ile Pro Tyr Ser Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Phe Phe Lys Asp 100 105 110 Lys Arg Val Cys Asp Leu Glu Ser Ile His Ser Ser Val Trp Lys Arg 115 120 125 Leu Phe Tyr Gln Trp Tyr Phe Lys Pro Thr Tyr Leu Ile Gly Ser Ser 130 135 140 Leu Tyr Cys Gln Ser Ile Glu Val Asn Asp Leu Ser Leu Val Gln Phe 145 150 155 160 Asp Glu Ala Tyr Lys Pro Phe Val Glu Val Pro Arg Lys Gln Leu Phe 165 170 175 Asp Gln Ala Ser Pro Glu Lys Val Gln Ala Leu Leu Gln Ile Phe Gly 180 185 190 Ala Arg Ala Ile Val Ala Asp Glu Glu Ser Ser Gln Lys Arg Leu Leu 195 200 205 Leu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Trp Asp Tyr His Val Thr Glu Glu Glu 210 215 220 Leu Leu Glu Ile Tyr Val Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Arg Glu Asp Tyr 225 230 235 240 Thr Ile Tyr Ile Lys Pro His Pro Arg Asp Gly Val Asp Tyr Ser Phe 245 250 255 Leu Gly Lys Ala Val Val Leu Leu Pro Gln Gly Ile Pro Phe Glu Leu 260 265 270 Phe Glu Met Ala Gly Ser Ile Arg Phe Asp Ile Gly Met Thr Tyr Ser 275 280 285 Ser Ser Ala Leu Asp Phe Leu Asn Cys Phe Glu Glu Lys Val Tyr Leu 290 295 300 Lys Asp Thr Phe Pro Leu Leu Ser Lys Asn Asp Ile Leu Arg Glu Gly 305 310 315 320 Ile Glu <210> 3 <211> 954 <212> DNA <213> Streptococcus suis <400> 3 atgaaacgca tctacatctg tcacacggtc taccaagttc tgattagcct gctgaaaatg 60 gatattaaaa atgatacgct gctgtcggtt ggcattgtca aaaacttccc gaatatgcgc 120 aacgaactga tggcgtatgt gaatctggtg gaagttgaag aatacacctt tggtctgcgt 180 agtatgatcc acaccctgga aacgaaaaac tggttctcct ttttcaaaaa cttcgaagaa 240 atcatcattt ttctggatca tcgccaagtg ggccacttcc tgaacaaaca taaactgccg 300 tattttctga tcgaagatgg ttacaacttt ttcaaagaca aacgtgtttg ccacctggaa 360 agtattcaaa gctcttggaa acgtatcctg tatcgctggt actttcgtcc ggcaacgctg 420 attggcagtt ccccgtattg tcagagcatc gaagtcaacg atctgtctct ggtgcatccg 480 gaacaagcgt acaaaccgtt cgtcgaagtg ccgcgcaaaa aactgtttga ctcaatttcg 540 caggaacgtc tggaagccat tgtgcaaatc ttcggcgtta aatctctgtt caacaacgaa 600 gttatcaaag aacgtcgcgt cctgctgctg acccagccgc tgagctggga attttatgtc 660 acggatgaag aacgcctgga aatttacctg gcaggtctgc gtccgtacta caaagactac 720 aaaatttaca tcaaaccgca tccgcgcgat agcttcgact attcatcgct gggcgatggt 780 atcattatct ttccgcagga cattccgatc gaactgttcg aactggctgg ctacatgaac 840 ttcgatgttg gtatcaccta tagcagcagc agcatggatt acctggactg ctttgatgaa 900 aaagtgtatc tgcacgaaaa attcccgctg ccgtcaaaaa ccaaaatcga ctaa 954 <210> 4 <211> 969 <212> DNA <213> Streptococcus suis <400> 4 atgcgtcgta tctatatctg ccacaccatg taccaaattc tgatctcgct gctgaaaatg 60 gatgttgaac gtgacagtct gatgagcgtg gatattatcg gccactttcc ggacgtgcgt 120 gaacagctgc aacatgttca cctgattgaa gaaaccgaac gctcgttcga tctgtatagc 180 ctgatcgcac gttctaaaac gaaagaacgc ctgtccctgc tgcagtcata cgatgaagtc 240 attatctttc aggaccatcg tcaagtgggc cacttcctga acaaacatcg cattccgtat 300 tcactgctgg aagatggtta caactttttc aaagataaac gtgtttgcga cctggaatcg 360 atccatagct ctgtctggaa acgcctgttt tatcagtggt acttcaaacc gacctatctg 420 attggcagtt ccctgtactg tcagagtatc gaagttaacg atctgtccct ggtccaattt 480 gacgaagcgt ataaaccgtt cgtcgaagtg ccgcgtaaac agctgtttga tcaagcgagc 540 ccggaaaaag tccaggccct gctgcaaatt ttcggtgcgc gtgccatcgt tgccgatgaa 600 gaatcatcgc agaaacgcct gctgctgctg acccaaccgc tgagctggga ctatcacgtg 660 acggaagaag aactgctgga aatttatgtt gcaggcctgg ctccgtaccg tgaagattat 720 accatttaca tcaaaccgca tccgcgcgat ggcgtggact atagctttct gggtaaagcg 780 gtggttctgc tgccgcaggg tattccgttt gaactgttcg aaatggcagg ctctattcgc 840 tttgatatcg gtatgacgta tagctctagt gctctggact ttctgaattg cttcgaagaa 900 aaagtttacc tgaaagacac gttcccgctg ctgagtaaaa atgacatcct gcgtgaaggt 960 attgaataa 969

Claims (12)

  1. 6'-시알릴락토스의 생산에 사용하기 위한 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제로서, 상기 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제가 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 하나와 적어도 100개 아미노산의 스트레치(stretch)에 걸쳐 적어도 25% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 락토스-수용(lactose-accepting) α-2,6-시알릴트랜스퍼라제인, α-2,6-시알릴트랜스퍼라제.
  2. 제1항에 있어서, α-2,6-시알릴-트랜스퍼라제가 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개 또는 적어도 300개 아미노산의 스트레치에 걸쳐 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 하나와 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제.
  3. 제1항에 있어서, α-2,6-시알릴트랜스퍼라제가 서열 번호 1 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제.
  4. 6'-시알릴락토스의 생산을 위한 유전자 조작된 세포로서, 상기 세포가 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 하나와 적어도 100개 아미노산의 스트레치에 걸쳐 적어도 25% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 락토스-수용 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제를 보유하도록 유전적으로 조작된 유전자 조작된 세포.
  5. 제4항에 있어서, 세포가 원핵 세포 및 진핵 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 효모 세포, 박테리아 세포, 고세균 세포(archaebacterial cell), 조류 세포(algae cell) 및 진균 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 유전자 조작된 세포.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, α-2,6-시알릴트랜스퍼라제가 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개 또는 적어도 300개 아미노산의 스트레치에 걸쳐 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 하나와 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 유전자 조작된 세포.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, α-2,6-시알릴트랜스퍼라제가 서열 번호 1 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 유전자 조작된 세포.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 본원에 앞서 기재된 락토스-수용 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 함유하고, 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열이 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 유전자 조작된 세포:
    a) 적어도 100개 아미노산의 스트레치에 걸쳐 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 하나와 적어도 25% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 락토스 수용 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;
    b) 서열 번호 1 및 2 중 어느 하나로 표시되는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;
    c) 서열 번호 3 및 서열 번호 4로 표시되는 뉴클레오티드 서열;
    d) a) 내지 c)에 제시된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 상보적인 뉴클레오티드 서열; 및
    e) 엄격한 조건(stringent condition)하에서 a) 내지 d)에 제시된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열.
  9. - 6'-시알릴락토스의 생산을 위한 유전자 조작된 세포를 제공하는 단계로서, 여기서, 상기 세포는 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 하나와 적어도 100개 아미노산의 스트레치에 걸쳐 적어도 25% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 락토스-수용 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제를 보유하도록 유전적으로 조작된 단계;
    - 상기 세포를 배양 배지에서 및 6'-시알릴락토스 생산에 허용적인 조건하에서 배양하는 단계; 및
    - 임의로 상기 6'-시알릴락토스를 회수하는 단계를 포함하여, 세포에서 6'-시알릴락토스를 생산하기 위한 방법.
  10. 제9항에 있어서, 배양 배지가 글루코스, 프럭토스, 수크로스 및 글리세롤로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 탄소원(carbon source)을 함유하는 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 배양 배지가 락토스, 갈락토스 및 시알산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 함유하는 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 6'-시알릴락토스가 배양 배지 및/또는 박테리아 세포로부터 회수되는 방법.
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