CN114015667A - 一种热稳定性提高的蔗糖磷酸化酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种热稳定性提高的蔗糖磷酸化酶突变体及其应用,属于生物技术领域。本发明提供的蔗糖磷酸化酶的热稳定性较野生型有明显提高,利用此方法生产的蔗糖磷酸化酶突变体在45℃下具有较好的热稳定性,其中,突变体Y334F、突变体P443T及突变体S444D的半衰期相比较于野生型来说有很大的提高,突变体P443T的半衰期大约为170min,比野生型(半衰期为96min)提高了77%。本发明属于酶工程和微生物工程技术领域,其有益效果是得到热稳定性优于野生型蔗糖磷酸化酶的突变体,以便更好地适应工业生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种热稳定性提高的蔗糖磷酸化酶突变体及其应用,属于生物技术领域。
背景技术
蔗糖磷酸化酶(SPase,EC 2.4.1.7)属于GH13家族,主要存在于长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)以及嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)中。
蔗糖磷酸化酶是一种催化转移葡萄糖苷键的酶,能够催化蔗糖和无机磷酸盐合成1-磷酸-葡萄糖。该酶主要以蔗糖、1-磷酸-葡萄糖为供体,多类物质如多羟基的糖和糖醇、酚羟基、羧基等为受体,催化合成各种糖苷。蔗糖磷酸化酶具有广泛的应用价值,人们主要利用葡糖基极性强、结构稳定这一特性,将其转移至蔗糖磷酸化酶特异性受体,对底物进行化学修饰及改性,来提高底物水溶性,增加光和热稳定性。
对于工业应用,为了避免微生物污染,碳水化合物的转化最好在60℃或更高温度下进行。但是目前嗜热来源的蔗糖磷酸化酶较少,大多数蔗糖磷酸化酶的热稳定性都较差。人们通过各种方法来提高蔗糖磷酸化酶的热稳定性,例如2010年,Karel De Winter等人通过多点共价固定的方法提高了蔗糖磷酸化酶的热稳定性,使得青春双歧杆菌来源的蔗糖磷酸化酶在60℃孵育16小时后仍能保留65%的活性。(具体可见参考文献:Tom Desmet,KarelDe Winter,Jo Maertens,et al.Increasing the thermostability of sucrosephosphorylase by multipoint covalent immobilization[J].Journal ofBiotechnology,2010,150(1):125-130.)他们还在2011年通过基于序列和结构的突变增加青春双歧杆菌来源的蔗糖磷酸化酶的热稳定性,产生的突变酶在60℃时的半衰期是野生型酶的两倍以上。(具体可见参考文献:An Cerdobbel,Karel De Winter,Dirk Aerts,etal.Increasing the thermostability of sucrose phosphorylase by a combinationof sequence-and structure-based mutagenesis[J].Protein Engineering,Design&Selection,2011,24(11):829-834.),此外还有随机诱变等方法来提高蔗糖磷酸化酶的热稳定性。但是,目前的大多数蔗糖磷酸化酶的热稳定性还是较差。
因此,急需找到一种提高蔗糖磷酸化酶热稳定性的方法。
发明内容
本发明提供了一种蔗糖磷酸化酶突变体,所述突变体是将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的蔗糖磷酸化酶的第334位、第443位、第444位的氨基酸中的任意一个进行突变得到的。
在本发明的一种实施方式中,所述蔗糖磷酸化酶来源于肠膜明串珠(Leuconostocmesenteroides ATCC 8293)。
在本发明的一种实施方式中,编码所述蔗糖磷酸化酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
在本发明的一种实施方式中,所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的第334位的酪氨酸突变为苯丙氨酸得到的,命名为Y334F;
或,所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的第443位的脯氨酸突变为苏氨酸得到的,命名为P443T;
或,所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的第444位的丝氨酸突变为天冬氨酸得到的,命名为S444D。
本发明还提供了编码上述突变体的基因。
本发明还提供了携带上述基因的重组载体。
在本发明的一种实施方式中,以pET-28a(+)质粒为表达载体。
本发明还提供了表达上述突变体,或携带上述基因,或携带上述重组载体的重组细胞。
在本发明的一种实施方式中,所述重组细胞以细菌或真菌为宿主细胞。
本发明还提供了一种重组大肠杆菌,所述重组大肠杆菌表达了上述突变体。
在本发明的一种实施方式中,所述重组大肠杆菌是以E.coli BL21(DE3)为表达宿主,以pET-28a(+)为表达载体。
本发明还提供了一种生产上述蔗糖磷酸化酶突变体的方法,所述方法为将上述重组大肠杆菌接种至含有卡那霉素的发酵培养基中,于37℃、120-180rpm的条件下进行培养,培养至培养液中的OD600为0.6~0.9后,在培养液中加入IPTG,继续于25℃、120-180rpm的条件下进行诱导培养,得到发酵液;将发酵液进行离心,收集菌体;将菌体进行破碎,获得细胞破碎液;将细胞破碎液进行离心,获得细胞破碎液上清液;将细胞破碎液上清液进行分离,获得蔗糖磷酸化酶。
在本发明的一种实施方式中,所述卡那霉素在培养液中的添加量为50μg/mL。
在本发明的一种实施方式中,所述IPTG在培养液中的添加量为0.02mM。
在本发明的一种实施方式中,所述诱导培养的时间为12h。
本发明还提供了上述重组大肠杆菌在生产蔗糖磷酸化酶中的应用。
本发明还提供了一种提高蔗糖磷酸化酶热稳定性的方法,所述方法为,将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的第334位的酪氨酸突变为苯丙氨酸;
或,将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的第443位的脯氨酸突变为苏氨酸;
或,将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的第444位的丝氨酸突变为天冬氨酸。
本发明还提供了一种生产果糖的方法,所述方法为,将上述突变体,或将上述重组细胞添加至含有蔗糖的反应体系中,进行反应制备得到。
在本发明的一种实施方式中,所述突变体的添加量为:0.01mg/mL。
在本发明的一种实施方式中,所述反应的反应条件为:50℃,pH7.0。
在本发明的一种实施方式中,所述反应的底物的添加量为:50mM。
本发明还提供了上述突变体,或上述基因,或上述重组质粒,或上述重组细胞,在制备含有果糖产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中,所述产品为食品或化学品。
有益效果
本发明提供的蔗糖磷酸化酶的热稳定性较野生型有明显提高,利用此方法生产的蔗糖磷酸化酶突变体在45℃下具有较好的热稳定性,其中,突变体Y334F、突变体P443T及突变体S444D的半衰期相比较于野生型来说有很大的提高,突变体P443T的半衰期大约为170min,比野生型(半衰期为96min)提高了77%。
附图说明
图1:野生型蔗糖磷酸化酶和突变体蔗糖磷酸化酶诱导培养获得的细胞破碎上清液和沉淀的SDS-PAGE分析,其中,M:Blue PlusⅡProtein Marker;1:野生型上清;2:Y334F上清;3:Y334W上清;4:Y334P上清;5:P443K上清;6:P443S上清;7:P443T上清;8:S444D上清。
图2:野生型和突变体粗酶液在45℃下的相对活力以及孵育30min后的相对残余活力。
图3:野生型和突变体纯酶液在45℃下的半衰期。
具体实施方式
下述实施例中涉及的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)和pET-28a(+)质粒购自Takara公司。
下述实施例中涉及的培养基如下:
LB液体培养基:酵母粉5.0g·L-1、蛋白胨10.0g·L-1、NaCl 10.0g·L-1、卡那霉素50mg·L-1。
LB固体培养基:酵母粉5.0g·L-1、蛋白胨10.0g·L-1、NaCl 10.0g·L-1、琼脂粉15g·L-1、卡那霉素50mg·L-1。
下述实施例中涉及的蔗糖磷酸化酶酶活和比酶活的检测方法如下:
DNS测还原糖法:1.5mL反应体系中含有1090μL PBS缓冲液(pH=7.0)、1.48mol/L蔗糖溶液400μL、浓度为0.1mg/mL的纯酶液10μL,50℃水浴反应10min;加入DNS后沸水浴加热终止反应,然后测定其生成果糖的量;
其中,果糖标准曲线的绘制:取若7支具有刻度的试管,分别加入不同体积的浓度为1mg/mL的果糖标准液,DNS试剂,蒸馏水(具体如表1所示);将各管摇匀,沸水浴中加热10min,冷却至室温,加蒸馏水定容至10mL,加塞上下颠倒,以1号试管为对照校零点,用分光光度计在波长540nm测吸光度;以OD540为纵坐标,果糖含量为横坐标,绘制标准曲线;
果糖标准液的配制:准备称取100g 70℃烘干至恒重果糖,置于小烧杯中,先加入少量的水溶解,然后容量瓶定容至100mL,混匀;
3,5-二硝基水杨酸(DNS)的配制:将10.6g DNS和19.8g NaOH加到一定体积的含有306g的酒石酸钾钠热水溶液中,再加入7.6mL苯酚和8.3g焦亚硫酸钠,置于棕色瓶中保存,七天后方能使用;
酶活计算公式:根据果糖标准曲线计算得出果糖含量m,单位体积酶活(U/mL)=m/180×1000/10/V;
比酶活计算公式:比酶活(U/mg)=单位体积酶活/蛋白浓度。
蔗糖磷酸化酶酶活的定义:50℃,pH 7.0时,1min游离酶水解蔗糖生成1μmol果糖为一个活力单位(1U)。
蔗糖磷酸化酶比酶活的定义:单位重量(mg)蛋白质所具有的酶活力单位数。
表1不同试管编号成分含量表
管号 | 葡萄糖标准液(mL) | 蒸馏水(mL) | DNS(mL) |
1 | 0 | 1.5 | 3 |
2 | 0.05 | 1.45 | 3 |
3 | 0.1 | 1.4 | 3 |
4 | 0.15 | 1.35 | 3 |
5 | 0.2 | 1.3 | 3 |
6 | 0.25 | 1.25 | 3 |
7 | 0.3 | 1.2 | 3 |
下述实施例中所涉及的SDS-PAGE电泳分析方法为:
取样品各80μL,加入20μL巯基乙醇,混匀后置于100℃加热10min,12000r·min-1离心5min后取上清10μL上样;上样电泳条件分别为130V、15min压平条带,200V、45min分离蛋白;电泳结束后,取出蛋白胶用水冲洗干净,浸没在考马斯亮蓝染色液后并放置在万向摇床中染色;倒去染色液,将蛋白胶冲洗干净后浸没在考马斯亮蓝脱色液中并放置在万向摇床中脱色;将脱色完成的蛋白胶放至凝胶成像仪中,观察电泳图蛋白条带。
实施例1:可表达蔗糖磷酸化酶野生酶的重组质粒及重组菌株的构建
具体步骤如下:
从NCBI中获取肠膜明串珠菌的SPase基因(Reference Sequence登录号为:WP_011679246.1),根据大肠杆菌密码子的偏好性,对其进行优化,化学合成核苷酸序列如SEQID NO.2所示的蔗糖磷酸化酶的基因;将获得的基因与pET-28a(+)质粒经双酶切(BamH I和Xho I)后进行连接,连接产物转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),转化产物涂布于LB固体培养基,于37℃培养8~10h,在LB固体培养基上挑取转化子,并接入LB液体培养基培养,于37℃培养10h后提取质粒,将此质粒进行序列测定,测序正确即获得重组质粒pET28a-SPase,及含有重组质粒的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-SPase。
实施例2:蔗糖磷酸化酶突变体的制备
1、蔗糖磷酸化酶突变体的构建
具体步骤如下:
利用全质粒PCR技术,以实施例1获得的重组质粒pET-28a-SPase为模板进行定点突变,获得携带编码蔗糖磷酸化酶突变体Y334P、Y334F、P443T、S444D、Y334W、P443K、P443S的基因的重组质粒pET-28a-Y334P、pET-28a-Y334F、pET-28a-P443T、pET-28a-S444D、pET-28a-Y334W、pET-28a-P443K、pET-28a-P443S;
其中,突变Y334F是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的第334位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸得到的,所用引物如下:
Y334F-1:5’-TCCAGTGCCAGCTTTAACAATTTA-3’;
Y334F-2:5’-GTCTAAATTGTTAAAGCTGGCACT-3’。
突变P443T是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的第443位氨基酸由脯氨酸突变为苏氨酸得到的,所用引物如下:
P443T-1:5’-GACGTTGAGACCACCTCCGATACC-3’;
P443T-2:5’-TGTGGTATCGGAGGTGGTCTCAAC-3’。
突变S444D是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的第444位氨基酸由丝氨酸突变为天冬氨酸得到的,所用引物如下:
S444D-1:5’-GTTGAGACCCCTGATGATACCACA-3’;
S444D-2:5’-AATTGTGGTATCATCAGGGGTCTC-3’。
突变Y334W是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的第334位氨基酸由酪氨酸突变为色氨酸得到,所用引物如下:
Y334W-1:5’-TCCAGTGCCAGCTGGAACAATTTA-3’;
Y334W-2:5’-GTCTAAATTGTTCCAGCTGGCACT-3’。
突变Y334P是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的第334位氨基酸由酪氨酸突变为脯氨酸得到,所用引物如下:
Y334P-1:5’-TCCAGTGCCAGCCCGAACAATTTA-3’;
Y334P-2:5’-GTCTAAATTGTCGGAGCTGGCACT-3’。
突变P443K是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的第443位氨基酸由脯氨酸突变为赖氨酸得到,所用引物如下:
P443K-1:5’-GACGTTGAGACCAAATCCGATACC-3’;
P443K-2:5’-TGTGGTATCGGATTTGGTCTCAAC-3’。
突变P443S是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的第443位氨基酸由脯氨酸突变为丝氨酸得到,所用引物如下:
P443S-1:5’-GACGTTGAGACCAGCTCCGATACC-3’;
P443S-2:5’-TGTGGTATCGGAGCTGGTCTCAAC-3’。
定点突变PCR程序:94℃预变性5min;98℃变性10s;55℃退火30s;68℃延伸3min,循环30次;68℃延伸10min,16℃保温。
DpnI消化PCR产物,体系如下:PCR产物2μL,Buffer 2μL,DpnI 1μL,加双蒸水补足至20μL。放置于37℃培养箱1h。
将重组载体pET-28a-Y334P、pET-28a-Y334F、pET-28a-P443T、pET-28a-S444D、pET-28a-Y334W、pET-28a-P443K、pET-28a-P443S转入大肠杆菌BL21(DE3)中表达,挑取转化子进行菌落PCR验证,分别制备得到重组大肠杆菌:E.coli BL21(DE3)/pET-28a-Y334P、E.coli BL21(DE3)/pET-28a-Y334F、E.coli BL21(DE3)/pET-28a-P443T、E.coli BL21(DE3)/pET-28a-S444D、E.coli BL21(DE3)/pET-28a-Y334W、E.coli BL21(DE3)/pET-28a-P443K、E.coli BL21(DE3)/pET-28a-P443S。
将实施例1和实施例2获得的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-SPase,E.coli BL21(DE3)/pET-28a-Y334P、E.coli BL21(DE3)/pET-28a-Y334F、E.coli BL21(DE3)/pET-28a-P443T、E.coli BL21(DE3)/pET-28a-S444D、E.coli BL21(DE3)/pET-28a-Y334W、PE.coli BL21(DE3)/pET-28a-P443K、E.coli BL21(DE3)/pET-28a-P443S分别涂布于LB固体培养基,于37℃培养8~10h,获得单菌落;挑取单菌落接入LB液体培养基,于37℃培养12~14h,分别获得种子液;
分别将上述种子液按照1%(v/v)的接种量接入LB液体培养基,于37℃、180rpm培养至OD600为0.8~0.9后,在培养液中加入终浓度为0.02mmol/L的IPTG,于25℃、180rpm继续诱导培养12h,得到发酵液;
将发酵液于4℃、8000rpm离心10min后,收集菌体;将菌体进行破碎,获得细胞破碎液;将细胞破碎液进行离心,获得细胞破碎液上清液和沉淀,将细胞破碎液上清液和沉淀通过SDS-PAGE进行分析,结果如图1所示。
由图1可知,上述突变体在56kDa附近均有很明显的条带,表明这些突变体蛋白均正常表达。
分别制备得到含有突变体Y334F的粗酶液、含有突变体P443T的粗酶液、含有突变体S444D的粗酶液、含有突变体Y334W的粗酶液、含有突变体Y334P的粗酶液、含有突变体P443K的粗酶液、含有突变体P443S的粗酶液及含有野生型SPase的粗酶液。
2、蔗糖磷酸化酶突变体比酶活的检测
具体步骤如下:
在50℃的反应条件下测定野生型粗酶液及各个SPase突变体粗酶液的比酶活,然后将其在45℃下保温30min后,测定其相对残余活力,结果见图2和表2所示。
其中,相对活力:以野生型的比酶活为100%对照,其他突变体比酶活为野生型的百分比,相对残余活力:以未处理酶液的酶活为100%对照,保温30min后的比酶活为未处理时的百分比。
表2野生型WT与突变体的残余活力及相对活力比较
样品 | 相对活力(%) | 残余活力(%) |
WT | 100.0±2.0 | 45.7±3.7 |
Y334F | 90.0±4.8 | 54.8±2.3 |
Y334W | 62.9±2.1 | 34.9±4.3 |
Y334P | 19.6±3.4 | 50.2±5.8 |
P443K | 77.8±3.6 | 40.3±1.5 |
P443S | 86.4±2.5 | 42.2±1.7 |
P443T | 115.2±4.1 | 64.1±2.1 |
S444D | 85.1±3.0 | 60.7±2.2 |
由图2及表2可知,突变体Y334F、突变体P443T及突变体S444D的相对残余活力均高于野生型,且突变体P443T的相对残余活力最高。其余突变体相对活力略有所下降,表明相对残余活力提高的同时,酶活也可能受到影响,所以对蔗糖磷酸化酶几个突变体进一步分析。
实施例3:蔗糖磷酸化酶野生型和突变体的分离和纯化
分别将实施例2中获得含有突变体Y334F的粗酶液、含有突变体P443T的粗酶液、含有突变体S444D的粗酶液、含有突变体Y334W的粗酶液、含有突变体Y334P的粗酶液含有突变体P443K的粗酶液、含有突变体P443S的粗酶液及含有野生型SPase的粗酶液进行镍柱亲和层析纯化。
具体步骤如下:
(1)配制溶液:
结合液:0.5mol/L NaCl、20mmol/L咪唑、20mmol/L PBS、1%甘油(m/m),pH=7.4。
洗脱液:0.5mmol/L NaCl、500mmol/L咪唑、20mmol/L PBS、1%甘油(m/m),pH=7.0。
裂解液:0.5mmol/L NaCl、20mmol/L PBS、50mmol/L EDTA,pH=7.0。
NiSO4:100mmol/L NiSO4。
(2)操作:
再生:选用1mL Ni-NTA预装重力柱用来进行蛋白纯化,首先用10mL结合液清洗柱子,接着用10mL裂解液冲洗,再用10mL裂解液清洗,然后用10mL水洗,之后用10mL NiSO4清洗,后用10mL水洗,再次用10mL结合液清洗,最后用20%乙醇清洗。
结合:先用20%乙醇清洗,再20mL结合液清洗,然后将细胞破碎液上清液上柱,之后用10mL结合液清洗。
洗脱:首先10mL结合液清洗,用EP管收集流穿液,接着用不同浓度的咪唑(分别为50mmol/L,100mmol/L,250mmol/L,300mmol/L)清洗并用EP管收集液体,即得到不同浓度咪唑的洗脱液,然后10mL洗脱液清洗,之后20%乙醇清洗。
保存:保存在20%乙醇中。
上样:分别取40μL流穿液和洗脱液,并向其中加入10μL SDS-PAGE蛋白上样缓冲液,加热100℃5min后并离心,然后取5μL进行SDS-PAGE蛋白电泳分析。
分析:根据SDS-PAGE电泳图,将蛋白浓度较高的样品(本实施例中所选择的是咪唑浓度为250mmol/L)进行浓缩脱盐操作,得到纯酶液。
分别制备得到含有突变体Y334F的纯酶液、含有突变体P443T的纯酶液、含有突变体S444D的纯酶液、含有突变体Y334W的纯酶液、含有突变体Y334P的纯酶液含有突变体P443K的纯酶液、含有突变体P443S的纯酶液及含有野生型SPase的纯酶液。
实施例4:蔗糖磷酸化酶野生型和突变体的热稳定性
具体步骤如下:
首先将实施例3制备得到含有突变体Y334F的纯酶液、含有突变体P443T的纯酶液、含有突变体S444D的纯酶液、含有突变体Y334W的纯酶液、含有突变体Y334P的纯酶液含有突变体P443K的纯酶液、含有突变体P443S的纯酶液及含有野生型SPase的纯酶液的蛋白浓度调为0.1mg·mL-1,在pH 7.0的条件下,分别将上述蔗糖磷酸化酶野生型与突变体纯酶液置于45℃水浴锅保温,每隔一段时间测定相对残余活力,以未处理酶液的酶活为100%对照(结果见图3)。用指数函数拟合计算半衰期,结果如表3所示:
表3:蔗糖磷酸化酶野生型与突变体在45℃条件下的半衰期
样品 | 半衰期(h) |
WT | 1.6 |
Y334F | 2 |
Y334W | 1.1 |
Y334P | 0.8 |
P443K | 1.3 |
P443S | 1.2 |
P443T | 2.8 |
S444D | 2.3 |
由图3及表3可知,突变体Y334F、突变体P443T及突变体S444D的半衰期相比较于野生型来说有很大的提高,突变体P443T的半衰期大约为170min,比野生型(半衰期为96min)提高了77%。
实施例5:蔗糖磷酸化酶突变体的应用
具体步骤如下:
(1)将实施例3制备得到含有突变体Y334F的纯酶液、含有突变体P443T的纯酶液、含有突变体S444D的纯酶液、含有突变体Y334W的纯酶液、含有突变体Y334P的纯酶液含有突变体P443K的纯酶液、含有突变体P443S的纯酶液及含有野生型SPase的纯酶液的蛋白浓度调为1mg·mL-1;
(2)分别将10μL步骤(1)制备得到的野生型与突变体的纯酶液添加至含有蔗糖的反应体系中,其中,反应体系中,蔗糖的终浓度为:50mM,将反应体系置于50℃,pH7.0的条件下,反应2h后,结束反应。
结果如表4所示。
表4:蔗糖磷酸化酶野生型与突变体制备果糖的产量及蔗糖转化率
将野生型与突变体的纯酶液与底物蔗糖进行反应,2h后突变体P443T的转化率达到99%,比野生型高出15%。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种热稳定性提高的蔗糖磷酸化酶突变体及其应用
<130> BAA211313A
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Glu Ile Gln Asn Lys Ala Met Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Leu
1 5 10 15
Gly Lys Asn Leu Lys Asp Val Arg Lys Val Leu Lys Glu Asp Ile Gly
20 25 30
Asp Ala Ile Gly Gly Val His Leu Leu Pro Phe Phe Pro Ser Thr Gly
35 40 45
Asp Arg Gly Phe Ala Pro Ser Asp Tyr Thr Arg Val Asp Ser Ala Phe
50 55 60
Gly Asp Trp Ser Asp Val Glu Ala Leu Gly Glu Glu Tyr Tyr Leu Met
65 70 75 80
Phe Asp Phe Met Ile Asn His Ile Ser Arg Glu Ser Val Met Tyr Gln
85 90 95
Asp Phe Lys Lys Asn His Asp Glu Ser Lys Tyr Lys Asp Phe Phe Ile
100 105 110
Arg Trp Glu Lys Phe Trp Ala Lys Ala Gly Glu Asn Arg Pro Thr Gln
115 120 125
Ala Asp Val Asp Leu Ile Tyr Lys Arg Lys Asp Lys Ala Pro Thr Gln
130 135 140
Glu Ile Thr Phe Asp Asp Gly Thr Thr Glu Asn Leu Trp Asn Thr Phe
145 150 155 160
Gly Asp Glu Gln Ile Asp Ile Asp Val Asn Ser Ala Ile Ala Lys Glu
165 170 175
Phe Ile Lys Thr Thr Leu Glu Asp Met Val Lys His Gly Ala Asn Leu
180 185 190
Ile Arg Leu Asp Ala Phe Ala Tyr Ala Val Lys Lys Val Asp Thr Asn
195 200 205
Asp Phe Phe Val Glu Pro Glu Ile Trp Asp Thr Leu Asn Glu Val Arg
210 215 220
Glu Ile Leu Thr Pro Leu Lys Ala Glu Ile Leu Pro Glu Ile His Glu
225 230 235 240
His Tyr Ser Ile Pro Lys Lys Ile Asn Asp His Gly Tyr Phe Thr Tyr
245 250 255
Asp Phe Ala Leu Pro Met Thr Thr Leu Tyr Thr Leu Tyr Ser Gly Lys
260 265 270
Thr Asn Gln Leu Ala Lys Trp Leu Lys Met Ser Pro Met Lys Gln Phe
275 280 285
Thr Thr Leu Asp Thr His Asp Gly Ile Gly Val Val Asp Ala Arg Asp
290 295 300
Val Leu Thr Asp Glu Glu Ile Asp Tyr Ala Ser Glu Glu Leu Tyr Lys
305 310 315 320
Val Gly Ala Asn Val Lys Lys Thr Tyr Ser Ser Ala Ser Tyr Asn Asn
325 330 335
Leu Asp Ile Tyr Gln Ile Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser Ala Leu Gly Asn
340 345 350
Asp Asp Ala Ala Tyr Leu Leu Ser Arg Ile Phe Gln Val Phe Ala Pro
355 360 365
Gly Ile Pro Gln Ile Tyr Tyr Val Gly Leu Leu Ala Gly Glu Asn Asp
370 375 380
Ile Glu Leu Leu Glu Ser Ser Lys Glu Gly Arg Asn Ile Asn Arg His
385 390 395 400
Tyr Tyr Ser Val Asp Glu Val Lys Glu Glu Val Lys Arg Pro Val Val
405 410 415
Ala Lys Leu Leu Lys Leu Leu Ser Trp Arg Asn Asn Phe Ala Ala Phe
420 425 430
Asp Leu Asp Gly Ser Ile Asp Val Glu Thr Pro Ser Asp Thr Thr Ile
435 440 445
Lys Ile Thr Arg Lys Asp Lys Ser Gly Glu Asn Val Ala Val Leu Val
450 455 460
Ala Asn Ala Ala Asp Lys Thr Phe Thr Ile Thr Ala Asn Gly Glu Glu
465 470 475 480
Ile Leu Ala Asn Thr Glu Ala Asp Lys Gln Gln Leu
485 490
<210> 2
<211> 1479
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggagattc agaataaagc aatgctgatc acttatgcag actcgttggg caagaacttg 60
aaggacgttc gcaaagtact gaaggaggac atcggcgacg ctatcggggg tgttcatctt 120
ctgccattct ttcctagcac tggggaccgt gggtttgcgc cgtccgacta cactcgcgta 180
gattctgctt ttggcgactg gtctgacgtc gaagcacttg gcgaagaata ttatcttatg 240
tttgatttca tgatcaacca tatcagccgc gaatctgtga tgtaccagga ctttaagaag 300
aatcacgatg aaagtaaata taaggacttc tttattcgtt gggaaaaatt ctgggccaag 360
gccggagaga atcgcccaac gcaagccgac gttgacttaa tttataagcg caaagataag 420
gcaccgacac aagagatcac cttcgacgac ggaacaacag agaacttatg gaacaccttc 480
ggggacgagc aaattgacat cgacgtgaat agcgcaatcg ctaaagaatt cattaagact 540
actttggagg acatggttaa acacggagct aacttgattc gccttgacgc attcgcctat 600
gctgtcaaga aggttgacac gaacgacttt ttcgtggagc ctgaaatttg ggacactctt 660
aacgaagtac gcgagatcct gacgccctta aaggcagaga tccttcccga gattcacgaa 720
cattattcta tcccgaaaaa gattaatgac cacggctatt tcacttatga ctttgcgctt 780
cccatgacca cgttatacac gctttattca ggaaagacca accaattagc aaaatggtta 840
aagatgtcac cgatgaagca gtttacaact ttagatacac acgacgggat cggtgtggtg 900
gacgctcgtg atgtgcttac agatgaggaa atcgattatg ctagcgagga gctttacaag 960
gtcggcgcta atgtgaaaaa aacgtactcc agtgccagct ataacaattt agacatttac 1020
caaattaact ctacatatta ctccgcactt ggcaatgatg acgcagctta ccttttatcc 1080
cgtatctttc aagtctttgc gccgggaatt ccgcaaatct attacgtggg gttacttgcg 1140
ggtgaaaatg acatcgagct tttagaatca tctaaggagg gccgtaacat caaccgtcat 1200
tactactcag tggacgaagt aaaggaggaa gtgaagcgtc ctgttgtcgc taagctgctg 1260
aaattgctta gctggcgcaa caatttcgcc gcgtttgatt tagatggatc tatcgacgtt 1320
gagacccctt ccgataccac aattaagatt acgcgcaaag acaaatcggg ggaaaatgtt 1380
gcggtgttag tcgcgaatgc cgccgataag acatttacta tcacggccaa cggggaggag 1440
atccttgcga acaccgaggc cgataaacaa caattataa 1479
Claims (10)
1.一种蔗糖磷酸化酶突变体,其特征在于,所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的第334位、第443位、第444位的氨基酸中的任意一个进行突变得到的。
2.如权利要求1所述的突变体,其特征在于,所述突变体是将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的蔗糖磷酸化酶的第334位的酪氨酸突变为苯丙氨酸得到的;
或,所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的第443位的脯氨酸突变为苏氨酸得到的;
或,所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的第444位的丝氨酸突变为天冬氨酸得到的。
3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的重组载体。
5.表达权利要求1或2所述突变体,或携带权利要求3所述基因,或携带权利要求4所述重组载体的重组细胞。
6.如权利要求5所述的重组细胞,其特征在于,所述重组细胞以细菌或真菌为宿主细胞。
7.一种提高蔗糖磷酸化酶热稳定性的方法,其特征在于,所述方法为,将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的第334位的酪氨酸突变为苯丙氨酸;
或,将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的第443位的脯氨酸突变为苏氨酸;
或,将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶的第444位的丝氨酸突变为天冬氨酸。
8.一种生产果糖的方法,其特征在于,将权利要求1或2所述的突变体,或将权利要求5或6所述的重组细胞添加至含有蔗糖的反应体系中,进行反应制备得到。
9.权利要求1或2所述的突变体,或权利要求3所述的基因,或权利要求4所述的重组质粒,或权利要求5或6所述的重组细胞,在制备含有果糖的产品中的应用。
10.如权利要求9所述的应用,其特征在于,所述产品为食品或化学品。
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