CN111344399B - 一种udp-葡萄糖基转移酶突变体、其应用及其制备莱鲍迪苷d的方法 - Google Patents

一种udp-葡萄糖基转移酶突变体、其应用及其制备莱鲍迪苷d的方法 Download PDF

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Abstract

提供了一种UDP‑葡萄糖基转移酶突变体、其应用及制备莱鲍迪苷D的方法，对野生型UDP‑葡萄糖基转移酶的基因序列进行定点突变，获得了包括SEQ ID NO：3在内的一系列突变体，这些突变体的酶活力和pH稳定性较野生型亲本得到提高。

Description

一种UDP-葡萄糖基转移酶突变体、其应用及其制备莱鲍迪苷D 的方法
技术领域
本发明涉及生物酶技术领域，特别涉及一种通过基因定点突变的方法人工获得的UDP-葡萄糖基转移酶突变体及其用于催化制备莱鲍迪苷D的方法。
背景技术
葡萄糖基转移酶是在酶反应中只转移葡萄糖基的酶，该酶的作用机理是催化糖基供体的葡萄糖残基转移到糖基受体分子上，从而调节受体分子的活性。UDP-葡萄糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase，简称UGT)是葡萄糖基转移酶中的一种，以UDP-葡萄糖作为糖基供体，几乎存在于所有有机体中。
UDP-葡萄糖是二磷酸尿苷葡糖(uridine diphosphate glucose)的简称，又简称为UDP-葡糖或者UDPG，是由尿苷二磷酸和葡萄糖组成的维生素，可看作“活性葡萄糖”，广泛分布于植物、动物和微生物的细胞内，在蔗糖、淀粉、糖原及其他寡糖和多糖合成中作葡萄糖基的供体，是最常见的一种糖基供体。
如今，随着天然甜味剂甜菊糖苷的广泛应用，以及生物催化技术的日益发展，UDP-葡萄糖基转移酶被越来越多地应用在甜菊糖苷的生物催化制备的领域中来。UDP-葡萄糖基转移酶的种类很多，目前甜菊糖苷的生物酶法制备领域中使用的酶多为来源于植物细胞中的野生酶，这种野生酶往往存在酶活低、稳定性差等缺点，从而导致应用于工业化大生产制备甜菊糖苷的成本较高。因此，有必要对UDP-葡萄糖基转移酶的野生酶进行改造，从而获得酶活更高、稳定性更好的改造酶，以便更好地服务于工业化大生产。
发明内容
本发明的目的在于解决野生型UDP-葡萄糖基转移酶酶活力低、稳定性差的技术问题，开发一种酶活力及稳定性更高的UDP-葡萄糖基转移酶。
为实现上述目的，本发明提供了一种UDP-葡萄糖基转移酶突变体，该突变体为如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的蛋白质；
(b)在如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸并且具有比氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的UDP-葡萄糖基转移酶亲本更高的催化莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的酶活力的由(a)衍生的蛋白质；
(c)与(a)限定的蛋白质的氨基酸序列具有90％以上同源性并且具有比氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的UDP-葡萄糖基转移酶亲本更高的催化莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D的酶活力的蛋白质。
优选地，与如SEQ ID NO：2所示的UDP-葡萄糖基转移酶亲本的氨基酸序列相比，本发明提供的UDP-葡萄糖基转移酶突变体在至少一个如下位点处有突变：第69位、第148位、第244位、第251位、第252位、第255位、第368位、第426位和第432位。
更优选地，与如SEQ ID NO：2所示的UDP-葡萄糖基转移酶亲本的氨基酸序列相比，本发明提供的UDP-葡萄糖基转移酶突变体具有至少一个如下突变：A69D、M148L、F244P、L251S、H252P、R255G、M368L、S426R、K432N。
更优选地，与如SEQ ID NO：2所示的UDP-葡萄糖基转移酶亲本的氨基酸序列相比，本发明提供的UDP-葡萄糖基转移酶突变体的突变为A69D、M148L、F244P、R255G、M368L、S426R、K432N或L251S/H252P。
同时，本发明还提供了一种生物材料，包括重组载体、重组细胞或者重组微生物，该生物材料含有编码本发明提供的上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体的基因序列，在合适的条件下，该生物材料能够表达分泌出本发明提供的上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体。
同时，本发明还提供了上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体的用途，该用途为将本发明提供的上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体应用于制备甜菊糖苷中，特别地，将本发明提供的上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体应用于制备莱鲍迪苷D中。
优选地，本发明提供的上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体的用途为：在UDPG存在的条件下，用上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体催化莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D。
另外，本发明还提供了一种制备莱鲍迪苷D的方法，该方法包括：在蔗糖、UDP和蔗糖合成酶存在的条件下，用UDP-葡萄糖基转移酶催化莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D，其中，UDP-葡萄糖基转移酶为氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的UDP-葡萄糖基转移酶亲本或者是本发明提供的上述UDP-葡萄糖基转移酶突变体，蔗糖合成酶来源于拟南芥<Arabidopsisthaliana>的AtSUS基因，该基因已被收录在NCBI数据库中，其登录号为NP_197583。
上述方法中，UDP是尿苷二磷酸(Uridine diphosphate)的英文缩写，是合成UDPG的物质之一。
优选地，本发明提供的上述方法中，催化反应过程在水环境中进行，催化反应的pH值为4～9，催化反应的温度为4～45℃。
更优选地，催化反应的pH值为7～8，催化反应的温度为35～45℃。
优选地，本发明提供的上述方法中，莱鲍迪苷A在反应体系中的终浓度为10-50g/L。
有益效果：
1、与UDP-葡萄糖基转移酶亲本相比，本发明提供的UDP-葡萄糖基转移酶突变体在酶活力和pH稳定性方面均得到了较为明显的提高，特别是酶活力至少提高了200％。
2、应用本发明提供的UDP-葡萄糖基转移酶突变体开发的制备莱鲍迪苷D的方法，在确保底物莱鲍迪苷A的转化率高达97％以上的同时可大大减少酶的使用量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例，实施例中未注明具体条件者，按常规条件或制造商建议的条件进行。若无特别说明，本发明实施例中所使用的原料及试剂皆为市售商品。
1、亲本质粒的制备
根据来源于水稻(Oryza sativa Japonica Group)的UDP-葡萄糖基转移酶的氨基酸序列(GenBank登录号：XP_015629141.1)合成所需基因片段，连入pET28a载体，两端酶切位点分别为BamH I和Hind III，得到UDP-葡萄糖基转移酶亲本质粒，再将获得的亲本质粒转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞DE3，经Amp筛选后挑取菌落进行测序，确定该被克隆的UDP-葡萄糖基转移酶亲本的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2、突变体的制备
根据亲本基因序列设计引物，通过反向PCR技术分别对UDP-葡萄糖基转移酶亲本的第69位、第148位、第244位、第251、252位、第255位、第368位、第426位和第432位进行定点突变。利用表1中各突变位点对应的上下游引物，以第1部分制备得到的亲本质粒为模板，分别进行反向PCR扩增，PCR扩增反应体系和PCR扩增反应程序如下：
PCR扩增反应体系：
Figure BDA0002307048570000041
PCR扩增反应程序：
98℃2min；98℃10s；50-65℃30s；72℃7min；30个循环；最后72℃10min。
表1
Figure BDA0002307048570000051
将PCR扩增产物经Dpn I酶消化模板处理后转化到大肠杆菌Rosetta感受态细胞DE3，经Amp筛选后挑取菌落进行测序，确定目标突变体。与第1部分制备的UDP-葡萄糖基转移酶亲本的如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相比，本部分制备得到的UDP-葡萄糖基转移酶突变体的突变分别为A69D、M148L、F244P、R255G、M368L、S426R、K432N或L251S/H252P。
3、UDP-葡萄糖基转移酶酶液的制备
将第1、2部分制备得到的含有UDP-葡萄糖基转移酶亲本和突变体的重组大肠杆菌表达菌株以1％比例分别接种到4mL液体LB培养基中，37℃振荡培养(200rpm)过夜，取过夜培养物以1％接种量转接于大体积液体LB培养基，37℃振荡培养(200rpm)至OD600值达到0.6-0.8，加入终浓度0.1mM～1mM IPTG于20～37℃振荡培养12～16h。诱导结束后离心收集菌体，并用50mM磷酸缓冲液(pH7.4)重悬细胞，于冰浴中超声波破碎细胞，将破碎液离心，收集上清液即可获得含有UDP-葡萄糖基转移酶亲本或者突变体的粗酶液。
4、酶活力测定
以100mg莱鲍迪苷A为底物，10mL反应体系，1.2g蔗糖，10mg UDP，10mg AtSUS蔗糖合成酶(来自拟南芥<Arabidopsis thaliana>)，再分别加入4mL第3部分制备得到的UDP-葡萄糖基转移酶亲本或者突变体的粗酶液，调节pH至7.4，在37℃、200rpm下进行反应2.5h。然后取样进行HPLC检测，计算酶活力，测定结果如表2所示。
表2
类型 酶活力U/mL 温度稳定性 pH稳定性
亲本 53.0±3.3 4-45℃ 7-8
A69D 123.5±1.1 4-45℃ 6-8
M148L 128.9±2.6 4-45℃ 6-8
F244P 165.7±1.8 4-45℃ 4-9
L251S+H252P 158.1±4.3 4-45℃ 4-9
R255G 151.9±1.5 4-45℃ 4-9
M368L 140.4±3.2 4-45℃ 7-8
S426R 118.5±2.4 4-45℃ 6-9
K432N 157.6±2.9 4-45℃ 4-8
5、莱鲍迪苷D的制备
莱鲍迪苷A 100g、蔗糖(MW.342)1200g、UDP(MW.628)10g，加水至莱鲍迪苷A的终浓度为10g/L，搅拌使之完全溶解，然后分别加入第3部分制备得到的UDP-葡萄糖基转移酶亲本或者突变体的粗酶液和10g AtSUS蔗糖合成酶(来自拟南芥<Arabidopsis thaliana>)，调节pH至7-8。在37℃、200rpm下进行反应10h，测定转化率，反应结束后将反应液进行分离、纯化、干燥处理后即得莱鲍迪苷D产品。UDP-葡萄糖基转移酶的加入量以及各反应的转化率数据如表3所示。
表3
Figure BDA0002307048570000071
序列表
<110> 邦泰生物工程（深圳）有限公司
<120> 一种UDP-葡萄糖基转移酶突变体、其应用及其制备莱鲍迪苷D的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1383
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa Japonica Group)
<400> 1
gatagtggct atagcagtag ctatgccgca gcagccggca tgcacgtggt tatttgtccg 60
tggctggcat ttggccatct gctgccgtgc ctggatctgg cccaacgtct ggccagccgt 120
ggtcaccgcg tgagcttcgt gagcaccccg cgtaacatca gtcgcctgcc gcctgtgcgt 180
cctgccttag caccgttagt ggcctttgtt gccctgccgc tgccgcgtgt tgaaggtctg 240
ccggatggcg ccgaaagcac caatgatgtt ccgcatgacc gtccggacat ggttgaactg 300
catcgtcgcg cattcgatgg tctggccgca ccgtttagcg aatttctggg caccgcatgt 360
gcagattggg tgatcgtgga cgtgtttcat cattgggccg ccgccgccgc attagaacat 420
aaggttcctt gcgcaatgat gctgctgggc agtgcccaca tgatcgcaag cattgcagat 480
cgccgcctgg agcgtgccga aacagaaagc cctgcagcag ccggtcaggg ccgccctgca 540
gcagcaccga cctttgaagt ggcccgcatg aagctgattc gtaccaaggg cagtagcggc 600
atgagcctgg ccgaacgctt tagcctgacc ctgagccgca gcagtctggt ggttggtcgt 660
agctgcgtgg aatttgaacc ggagacagtt ccgctgctga gtaccctgcg cggcaaacct 720
atcacctttc tgggtctgat gccgccgtta cacgagggtc gtcgtgaaga tggcgaagat 780
gcaaccgttc gttggctgga tgcccagccg gcaaagagcg tggtttatgt tgccctgggt 840
agcgaagttc cgctgggcgt tgaaaaggtt catgaactgg ccctgggtct ggaattagca 900
ggcacccgtt ttctgtgggc actgcgcaaa ccgaccggcg ttagcgatgc agacctgctg 960
ccggcaggct tcgaagaacg cacacgtggc cgtggtgttg ttgccacccg ctgggtgcct 1020
cagatgagca tcttagccca tgccgccgtg ggcgcctttc tgacacattg cggctggaat 1080
agcaccatcg agggtctgat gttcggccat ccgctgatta tgctgccgat ttttggcgat 1140
cagggcccga atgcccgtct gattgaggcc aaaaatgccg gtctgcaagt ggcacgcaat 1200
gatggcgatg gcagctttga ccgcgaaggt gtggccgcag caattcgcgc agttgcagtg 1260
gaagaagaaa gcagcaaggt tttccaggcc aaggccaaga aactgcagga aatcgttgcc 1320
gacatggcat gtcacgagcg ttacatcgac ggcttcattc agcagctgcg cagctacaag 1380
gat 1383
<210> 2
<211> 462
<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa Japonica Group)
<400> 2
Met Asp Ser Gly Tyr Ser Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Ala Gly Met His
1 5 10 15
Val Val Ile Cys Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Leu Leu Pro Cys Leu
20 25 30
Asp Leu Ala Gln Arg Leu Ala Ser Arg Gly His Arg Val Ser Phe Val
35 40 45
Ser Thr Pro Arg Asn Ile Ser Arg Leu Pro Pro Val Arg Pro Ala Leu
50 55 60
Ala Pro Leu Val Ala Phe Val Ala Leu Pro Leu Pro Arg Val Glu Gly
65 70 75 80
Leu Pro Asp Gly Ala Glu Ser Thr Asn Asp Val Pro His Asp Arg Pro
85 90 95
Asp Met Val Glu Leu His Arg Arg Ala Phe Asp Gly Leu Ala Ala Pro
100 105 110
Phe Ser Glu Phe Leu Gly Thr Ala Cys Ala Asp Trp Val Ile Val Asp
115 120 125
Val Phe His His Trp Ala Ala Ala Ala Ala Leu Glu His Lys Val Pro
130 135 140
Cys Ala Met Met Leu Leu Gly Ser Ala His Met Ile Ala Ser Ile Ala
145 150 155 160
Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ala Glu Thr Glu Ser Pro Ala Ala Ala Gly
165 170 175
Gln Gly Arg Pro Ala Ala Ala Pro Thr Phe Glu Val Ala Arg Met Lys
180 185 190
Leu Ile Arg Thr Lys Gly Ser Ser Gly Met Ser Leu Ala Glu Arg Phe
195 200 205
Ser Leu Thr Leu Ser Arg Ser Ser Leu Val Val Gly Arg Ser Cys Val
210 215 220
Glu Phe Glu Pro Glu Thr Val Pro Leu Leu Ser Thr Leu Arg Gly Lys
225 230 235 240
Pro Ile Thr Phe Leu Gly Leu Met Pro Pro Leu His Glu Gly Arg Arg
245 250 255
Glu Asp Gly Glu Asp Ala Thr Val Arg Trp Leu Asp Ala Gln Pro Ala
260 265 270
Lys Ser Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Val Pro Leu Gly Val
275 280 285
Glu Lys Val His Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ala Gly Thr Arg
290 295 300
Phe Leu Trp Ala Leu Arg Lys Pro Thr Gly Val Ser Asp Ala Asp Leu
305 310 315 320
Leu Pro Ala Gly Phe Glu Glu Arg Thr Arg Gly Arg Gly Val Val Ala
325 330 335
Thr Arg Trp Val Pro Gln Met Ser Ile Leu Ala His Ala Ala Val Gly
340 345 350
Ala Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Ile Glu Gly Leu Met
355 360 365
Phe Gly His Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile Phe Gly Asp Gln Gly Pro
370 375 380
Asn Ala Arg Leu Ile Glu Ala Lys Asn Ala Gly Leu Gln Val Ala Arg
385 390 395 400
Asn Asp Gly Asp Gly Ser Phe Asp Arg Glu Gly Val Ala Ala Ala Ile
405 410 415
Arg Ala Val Ala Val Glu Glu Glu Ser Ser Lys Val Phe Gln Ala Lys
420 425 430
Ala Lys Lys Leu Gln Glu Ile Val Ala Asp Met Ala Cys His Glu Arg
435 440 445
Tyr Ile Asp Gly Phe Ile Gln Gln Leu Arg Ser Tyr Lys Asp
450 455 460
<210> 3
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第69位点由亲本的丙氨酸突变为天冬氨酸
<400> 3
Met Asp Ser Gly Tyr Ser Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Ala Gly Met His
1 5 10 15
Val Val Ile Cys Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Leu Leu Pro Cys Leu
20 25 30
Asp Leu Ala Gln Arg Leu Ala Ser Arg Gly His Arg Val Ser Phe Val
35 40 45
Ser Thr Pro Arg Asn Ile Ser Arg Leu Pro Pro Val Arg Pro Ala Leu
50 55 60
Ala Pro Leu Val Asp Phe Val Ala Leu Pro Leu Pro Arg Val Glu Gly
65 70 75 80
Leu Pro Asp Gly Ala Glu Ser Thr Asn Asp Val Pro His Asp Arg Pro
85 90 95
Asp Met Val Glu Leu His Arg Arg Ala Phe Asp Gly Leu Ala Ala Pro
100 105 110
Phe Ser Glu Phe Leu Gly Thr Ala Cys Ala Asp Trp Val Ile Val Asp
115 120 125
Val Phe His His Trp Ala Ala Ala Ala Ala Leu Glu His Lys Val Pro
130 135 140
Cys Ala Met Met Leu Leu Gly Ser Ala His Met Ile Ala Ser Ile Ala
145 150 155 160
Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ala Glu Thr Glu Ser Pro Ala Ala Ala Gly
165 170 175
Gln Gly Arg Pro Ala Ala Ala Pro Thr Phe Glu Val Ala Arg Met Lys
180 185 190
Leu Ile Arg Thr Lys Gly Ser Ser Gly Met Ser Leu Ala Glu Arg Phe
195 200 205
Ser Leu Thr Leu Ser Arg Ser Ser Leu Val Val Gly Arg Ser Cys Val
210 215 220
Glu Phe Glu Pro Glu Thr Val Pro Leu Leu Ser Thr Leu Arg Gly Lys
225 230 235 240
Pro Ile Thr Phe Leu Gly Leu Met Pro Pro Leu His Glu Gly Arg Arg
245 250 255
Glu Asp Gly Glu Asp Ala Thr Val Arg Trp Leu Asp Ala Gln Pro Ala
260 265 270
Lys Ser Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Val Pro Leu Gly Val
275 280 285
Glu Lys Val His Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ala Gly Thr Arg
290 295 300
Phe Leu Trp Ala Leu Arg Lys Pro Thr Gly Val Ser Asp Ala Asp Leu
305 310 315 320
Leu Pro Ala Gly Phe Glu Glu Arg Thr Arg Gly Arg Gly Val Val Ala
325 330 335
Thr Arg Trp Val Pro Gln Met Ser Ile Leu Ala His Ala Ala Val Gly
340 345 350
Ala Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Ile Glu Gly Leu Met
355 360 365
Phe Gly His Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile Phe Gly Asp Gln Gly Pro
370 375 380
Asn Ala Arg Leu Ile Glu Ala Lys Asn Ala Gly Leu Gln Val Ala Arg
385 390 395 400
Asn Asp Gly Asp Gly Ser Phe Asp Arg Glu Gly Val Ala Ala Ala Ile
405 410 415
Arg Ala Val Ala Val Glu Glu Glu Ser Ser Lys Val Phe Gln Ala Lys
420 425 430
Ala Lys Lys Leu Gln Glu Ile Val Ala Asp Met Ala Cys His Glu Arg
435 440 445
Tyr Ile Asp Gly Phe Ile Gln Gln Leu Arg Ser Tyr Lys Asp
450 455 460

Claims (7)

1.一种UDP-葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于：与如SEQ ID NO：2所示的UDP-葡萄糖基转移酶亲本的氨基酸序列相比，所述突变体的突变为A69D。
2.一种生物材料，为重组载体、重组细胞或者重组微生物，其特征在于：所述生物材料含有编码权利要求1所述的UDP-葡萄糖基转移酶突变体的基因序列。
3.权利要求1所述的UDP-葡萄糖基转移酶突变体在制备甜菊糖苷中的应用。
4.根据权利要求3所述的UDP-葡萄糖基转移酶突变体在制备甜菊糖苷中的应用，其特征在于所述应用为：在UDPG存在的条件下，用所述UDP-葡萄糖基转移酶突变体催化莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D。
5.一种制备莱鲍迪苷D的方法，其特征在于所述方法包括：在蔗糖、UDP和蔗糖合成酶存在的条件下，用UDP-葡萄糖基转移酶催化莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D，所述UDP-葡萄糖基转移酶为权利要求1所述的UDP-葡萄糖基转移酶突变体，所述蔗糖合成酶是由拟南芥的AtSUS基因编码。
6.根据权利要求5所述的制备莱鲍迪苷D的方法，其特征在于：所述方法中，催化反应的pH值为4～9，催化反应的温度为4～45℃。
7.根据权利要求5所述的制备莱鲍迪苷D的方法，其特征在于：所述方法中，莱鲍迪苷A在反应体系中的终浓度为10-50g/L。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4349989A1 (en) * 2021-06-01 2024-04-10 Abiochem Biotechnology Co., Ltd. Glycosyltransferase and application thereof
CN115449514B (zh) * 2021-06-08 2023-09-29 弈柯莱生物科技(上海)股份有限公司 一种β-1,2-糖基转移酶及其应用
CN115478060B (zh) * 2021-06-16 2023-11-28 弈柯莱生物科技(集团)股份有限公司 一种糖基转移酶及其应用
CN115678867B (zh) * 2021-07-27 2023-12-01 弈柯莱生物科技(集团)股份有限公司 一种蔗糖合成酶及其应用
CN116218806B (zh) * 2022-10-21 2024-05-10 山东大学 一种N-糖基转移酶突变体AaFQ及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101942424A (zh) * 2010-08-24 2011-01-12 北京农学院 Udp-葡萄糖基转移酶突变体的编码基因及其应用
CN105164270A (zh) * 2013-02-28 2015-12-16 Cj第一制糖株式会社 由甜菊苷制备莱苞迪甙a的方法
CN107109453A (zh) * 2014-11-05 2017-08-29 马努斯生物合成股份有限公司 甜菊醇糖苷的微生物产生

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9522929B2 (en) * 2014-05-05 2016-12-20 Conagen Inc. Non-caloric sweetener

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101942424A (zh) * 2010-08-24 2011-01-12 北京农学院 Udp-葡萄糖基转移酶突变体的编码基因及其应用
CN105164270A (zh) * 2013-02-28 2015-12-16 Cj第一制糖株式会社 由甜菊苷制备莱苞迪甙a的方法
CN107109453A (zh) * 2014-11-05 2017-08-29 马努斯生物合成股份有限公司 甜菊醇糖苷的微生物产生

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