CN116218806B - 一种N-糖基转移酶突变体AaFQ及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种N‑糖基转移酶突变体AaFQ，是对来源于嗜沫凝聚杆菌中的N‑糖基转移酶基因经过S274A、Q468A、P496R三点突变获得，其基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了该突变体作为多肽糖基化修饰的工具酶在利用UDP‑Glc或UDP‑Gal或UDP‑Xyl将含有N‑X‑S/T序列的多肽进行糖基化形成糖肽或糖蛋白中的应用。实验证实本发明的突变体AaFQ相较野生型NGT糖基化效率显著提高，利用UDP‑Glc、UDP‑Gal和UDP‑Xyl的能力显著增强，能够实现简单快速的利用UDP‑Glc/UDP‑Gal/UDP‑Xyl将含有N‑X‑S/T序列的多肽进行糖基化修饰，并可进一步利用其他的糖基转移酶对糖肽的糖链进行修饰获得目的糖肽。这为多肽与蛋白的糖基化修饰提供了一种新途径，为糖蛋白疫苗的合成提供了一种简便方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种糖基转移酶及其应用，尤其涉及一种嗜沫凝聚杆菌(Aggregatibacter aphrophilus)来源的N-糖基转移酶的突变体AaFQ及其应用，属于分子生物学中糖工程技术领域。
背景技术
蛋白质糖基化是重要的翻译后修饰之一，糖基化的变化能够使蛋白质的功能和理化性质发生极大的改变，具有调节炎症反应、使病毒免疫逃逸、促进癌细胞转移、调节细胞凋亡等功能。N-糖基化通常与蛋白质折叠相关，常被应用于抗体及疫苗制备。
已经报道的一种嗜沫凝聚杆菌(Aggregatibacter aphrophilus)来源的N-糖基转移酶表现出高糖基转移酶活性以及宽松的糖供体特异性。然而N-糖基转移酶(NGTs)的天然糖供体为UDP-Glc，对其他糖供体的利用效率并不高，导致难以合成以半乳糖为末端的糖蛋白。已有研究的报道中，对N-糖基转移酶的改造大都集中在胸膜肺炎放线菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)来源的ApNGT上，改造后的酶的糖基化效率虽有提高，但对UDP-Gal的利用仍然有限。经检索，有关对嗜沫凝聚杆菌(Aggregatibacteraphrophilus)来源的AaNGT进行改造并获得N-糖基转移酶的突变体AaFQ的文献尚未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种嗜沫凝聚杆菌(Aggregatibacter aphrophilus)来源的N-糖基转移酶的突变体AaFQ及其在糖基化修饰中的应用。
本发明所述的N-糖基转移酶突变体，是对NCBI Reference Sequence:WP_050692945.1的来源于嗜沫凝聚杆菌(Aggregatibacter aphrophilus)中的N-糖基转移酶基因经过S274A、Q468A、P496R三点突变获得；其特征在于：所述突变体命名为N-糖基转移酶突变体AaFQ，其基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
上述N-糖基转移酶突变体AaFQ是通过将野生型嗜沫凝聚杆菌(Aggregatibacteraphrophilus)来源的N-糖基转移酶基因(NCBI Reference Sequence:WP_050692945.1)构建于载体pET45b上，得到DH5α-pET45b-AaNGT菌株，再提取其质粒pET45b-AaNGT作为模板，对来源于嗜沫凝聚杆菌(Aggregatibacter aphrophilus)的N-糖基转移酶基因的S274A、Q468A、P496R三点进行突变，设计诱变引物，根据诺唯赞一步法多点突变试剂盒(C214)说明书进行PCR反应扩增携带突变的基因片段，再转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞发酵诱导表达、纯化回收获得。
本发明所述N-糖基转移酶突变体在对多肽进行N-糖基化修饰中的应用。
实验证实：本发明所述的N-糖基转移酶突变体AaFQ相较野生型AaNGT糖基化效率明显提高，利用UDP-Gal和UDP-Xyl的能力显著增强，能够实现简单快速的利用UDP-Glc/UDP-Gal/UDP-Xyl将含有N-X-S/T序列的多肽进行糖基化修饰，实现简单快速的合成末端为半乳糖或木糖的糖蛋白。
进一步的，本发明所述N-糖基转移酶突变体AaFQ作为多肽糖基化修饰的工具酶在利用UDP-Glc或UDP-Gal或UDP-Xyl将含有N-X-S/T序列的多肽进行糖基化形成糖肽或糖蛋白中的应用。
其中：所述N-糖基转移酶突变体能将UDP-Glc或UDP-Gal或UDP-Xyl上的Glc/Gal/Xyl快速转移至含有N-X-S/T序列的多肽上，形成糖肽；并能进一步利用其他的糖基转移酶对糖肽的糖链进行修饰，用于生产带有糖基化修饰的药物蛋白或目的糖肽。
其中：所述药物蛋白是抗体、细胞因子或糖蛋白疫苗。
本发明公开的N-糖基转移酶突变体AaFQ属于N-糖基化修饰的一种重要的糖基转移酶，实验证实其与野生型AaNGT相比糖基化效率大幅提高，利用UDP-Gal和UDP-Xyl的能力显著增强，可以简单快速的生产末端为Glc/Gal/Xyl的糖链，并进一步可以利用其他的糖基转移酶对糖链进行修饰，从而获得目的糖肽。这为多肽与蛋白的糖基化修饰提供了一种新的途径，为糖蛋白疫苗的合成提供了一种简便的方法，应用前景广阔。
附图说明
图1：AaFQ蛋白的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果。
其中，M表示蛋白Maker，AaFQ分子量大约在70kDa左右。
图2：野生型蛋白及AaFQ突变体利用UDP-Glc、UDP-Gal和UDP-Xyl的酶活结果图。
其中，a.AaNGT的酶活结果；b.AaFQ的酶活结果。
图3：AaFQ突变体利用UDP-Glc、UDP-Gal和UDP-Xyl的MS结果图。
其中，a.受体对照为六肽TAMRA-DANYTK；b.供体为UDP-Glc；c.供体为UDP-Gal；d.供体为UDP-Xyl。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
其中所涉及的试剂和耗材来源见表1。
表1实施例所涉及的试剂和耗材来源明细
实施例1：N-糖基转移酶AaNGT突变体AaFQ的构建
一、实验方法
1、嗜沫凝聚杆菌(Aggregatibacter aphrophilus)来源的野生型N-糖基转移酶基因(NCBI Reference Sequence:WP_050692945.1)由南京金斯瑞公司合成并构建于载体pET45b上，其商品化菌株为DH5α-pET45b-AaNGT菌株。
2、将DH5α-pET45b-AaNGT菌株1：1000接种于含0.1mg/mL的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养菌株8～12h，利用质粒小提试剂盒提取质粒pET45b-AaNGT作为模板。
3、对来源于嗜沫凝聚杆菌(Aggregatibacter aphrophilus)的N-糖基转移酶基因的S274A、Q468A、P496R三点进行突变，设计诱变引物(见表2)，根据诺唯赞一步法多点突变试剂盒(C214)说明书进行PCR反应扩增携带突变的基因片段。
表2：构建AaFQ突变体所需要的引物
PCR反应体系：2×PhantaMaxBuffer 25μL，dNTPMix(10mMeach)1μL，DNApolymerse1μL，上下游引物各2μL，模板pET45b-AaNGT 2μL。PCR反应程序：95℃预变性30s，30个循环(95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸3min30s)，72℃后延伸5min。
4、通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段条带大小是否正确。
5、利用Dpn I酶去除甲基化质粒模板，按照试剂盒的重组环化系统将携带突变的片段进行重组环化。环化后的质粒热激转化到DH5α感受态细胞中，涂布在0.1mg/mL的氨苄青霉素固体LB平板，培养16h后挑取阳性克隆交于北京擎科生物科技有限公司测序。
二、实验结果
测序结果比对分析得到为N-糖基转移酶的突变体(命名为AaFQ，基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)。
实施例2：AaFQ蛋白的表达与纯化和鉴定
一、实验方法
1、将测序正确的突变体质粒pET45b-AaFQ热激转入BL21感受态细胞后，将表达菌株接种于于1L含有0.1mg/mL的氨苄青霉素LB液体培养基中，37℃，200rpm培养4h至OD600达到0.4～0.5，降温至16℃诱导表达20h。
2、收集菌体8000rpm，离心10min。使用50mL PBS溶液重悬菌体并在冰水环境下中200W，持续2s，间停2s超声30min以破碎细胞释放蛋白。之后10000rpm，离心20min分离沉淀，取上清。
3、过Ni-填料柱纯化，使用10倍柱体积Washing buffer洗脱杂蛋白。之后用10倍柱体积Elution buffer洗脱并收集目的蛋白。之后收集的洗脱液加入到超滤管，每次离心30min，离心后下管液体弃掉，上管加满PBS，重复离心数次以除净咪唑，获得的目的蛋白4℃保存。
4、根据生工BAC蛋白浓度测定试剂盒说明书测定蛋白浓度。样品添加SDS-PAGE上样缓冲液后，煮沸10min，上样到12.5％SDS-PAGE胶中，120V电泳90min，之后考马斯亮蓝染色2h，再进行脱色。
二、实验结果
AaFQ蛋白的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果见图1，在70kDa附近有明显条带，条带大小与预测的一致。突变体蛋白AaFQ可用于进一步的酶学分析。
实施例3：N-糖基转移酶突变体AaFQ在多肽糖基化修饰中的应用
一、实验方法
1、分别以UDP-Glc/UDP-Gal/UDP-Xyl作为糖供体，以表3所示20uL反应体系在37℃下反应30min，反应结束后100℃加热5min，12000rpm离心10min。
表3：糖基化反应体系。
2、取上清液稀释25倍，用于HPLC检测。
3、取上清液过ZipTipC18脱盐柱进行纯化回收，将所得产物稀释10倍，用于ESI-MS检测。
二、实验结果
1、HPLC结果(图2)显示，突变体AaFQ蛋白的酶活，与野生型NGT对比，利用UDP-Gal/UDP-Xyl的能力大幅提高。其中，对UDP-Gal的转化率由野生型的7.5％提高到了43.7％，效率提高了6倍；对UDP-Xyl的转化率由野生型的3.5％提高到了24.9％，效率提高了7倍。
2、MS结果(图3)显示，N-糖基转移酶突变体AaFQ能够催化底物肽TAMRA-DANYTK糖基化，生成末端为Glc/Gal/Xyl的糖肽。在进一步其他的糖基转移酶的修饰下，就可以生产带有不同糖基化修饰的糖肽。
Claims (4)
1.一种N-糖基转移酶突变体，其特征在于：所述突变体是对NCBI ReferenceSequence:WP_050692945.1的来源于嗜沫凝聚杆菌（Aggregatibacter aphrophilus）中的N-糖基转移酶基因经过S274A、Q468A、P496R三点突变获得；所述突变体命名为N-糖基转移酶突变体AaFQ，其基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
2.权利要求1所述N-糖基转移酶突变体作为多肽糖基化修饰的工具酶在利用UDP-Glc或UDP-Gal或UDP-Xyl将含有N-X-S/T序列的多肽进行糖基化形成糖肽中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述N-糖基转移酶突变体能将UDP-Glc或UDP-Gal或UDP-Xyl上的Glc/Gal/Xyl快速转移至含有N-X-S/T序列的多肽上，形成糖肽；并能进一步利用其他的糖基转移酶对糖肽的糖链进行修饰，用于生产带有糖基化修饰的药物蛋白。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述药物蛋白是抗体、细胞因子或糖蛋白疫苗。
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