KR102183558B1 - L-알라닐-l-글루타민 생합성 효소를 코딩하는 유전자 및 그 용도 - Google Patents

L-알라닐-l-글루타민 생합성 효소를 코딩하는 유전자 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 L-알라닐-L-글루타민 생합성 효소를 코딩하는 유전자 및 이의 용도를 공개하며 이 유전자의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.1과 같다. 본 발명은 이 유전자가 코딩하는 아미노산 서열을 공개하며 또한 이 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 대장균, 재조합 사카로마이세스 세레비지아에 및 자아 응집 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 제공함과 함께 이러한 재조합 미생물을 이용한 L-알라닐-L-글루타민의 생물전환 합성방법을 공개한다.

Description

L-알라닐-L-글루타민 생합성 효소를 코딩하는 유전자 및 그 용도
본 발명은 L-알라닐-L-글루타민의 생합성 방법에 관한 것이며 생물기술 분야에 속한다.
L-알라닐-L-글루타민(L-Ala-Gln)은 N(2)-L-알라닐-L-글루타민이라고도 하며 용해도가 높고 수용성과 열안정성이 강한 장점을 가지고 있으며, 이미 점차적으로 글루타민(L-Gln)을 대신하여 주요한 장관외 영양용 약물로 부상하였다.
목전, L-알라닐-L-글루타민의 합성방법으로 주요하게 화학 합성법 및 생효소에 의한 촉매법을 들 수 있다. 화학 합성법으로 L-알라닐-L-글루타민을 합성시 반응단계가 많고 부산물이 많으며 시제독성이 크고 비친환경적(문헌 [Tang guo, 디페티드 N(2)-L-알라닐-L-글루타민의 합성 및 반응에 대한 연구, 하문대학, 2004]; 문헌 [중국특허 CN1392156A, L-알라닐-L-글루타민의 합성방법])등 결점이 있다.
생효소에 의한 촉매법 또한 효소 사용량이 많고, 펩티드 생산성이 낮으며 또한 일부 소수성이 높은 아미노산의 합성에 국한되어 있는 등 결점이 있다. 중국 특허문헌 CN104480075A와 CN105274174A에서 생효소를 촉매로 한 L-알라닐-L-글루타민의 두가지 합성 방법을 공개하였는 바, 생효소 동결건조 분말 혹은 생효소 완충액을 이용하여 촉매반응을 진행하였다. 그러나 효소의 분리정제 비용이 높고, 또한 반응후의 회수와 재활용이 어려워 실제의 공업화 생산에 적합하지 않은 단점이 있다. 중국 특허문헌 CN1671840A에 의하면, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에서 아미노산 연결효소(Lal)를 얻었으며, 이 효소는 비보호 아미노산을 기질로 하여 디펩티드를 합성할 수 있다. 그러나 이 효소는 ATP 의존성 효소로서 외부에서의ATP 공급을 필요로 하기 때문에 디펩티드의 생산원가가 여전히 높아 대규모의 시장공급에 사용될 수 없다(Fermentative production of L-alanyl-L-glutamine by a metabolically engineered Escherichia coli strain expressing L-amino acid α-ligase. Applied and environmental microbiology, 2007, 73(20): 6378-6385.).
본 발명의 목적은 생물전환으로 L-알라닐-L-글루타민을 생산하는 한조의 완정한 기술수단을 제공하는 데 있다. 본 발명은 L-알라닐-L-글루타민 합성효소를 코딩하는 특출한 외래성 유전자의 탐색을 시작으로, 유전공학적 방법을 통하여 재조합 공정균을 구축하고, 또한 합리적 설계에 따른 생물 발효공정 방안에 근거하여 친환경적이고 고효율적이며 저가의 L-알라닐-L-글루타민의 공업화 생산을 실현하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 실현하기 위하여, 본 발명은 우선 L-알라닐-L-글루타민 생합성 효소를 코딩하는 유전자를 공개하며, 이 유전자의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.1에 표시된 바와 같다.
다음으로, 본 발명은 L-알라닐-L-글루타민 생합성 효소를 공개하며, 이 생합성 효소는 상기 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO.1인 유전자에 의하여 코딩되며, 아미노산 서열은 SEQ ID NO.2에 표시된 바와 같다.
상기 L-알라닐-L-글루타민 생합성 효소를 코딩하는 유전자는 기질이 L-알라닐-L-글루타민으로 전환하는 것을 촉진하는 뛰어난 능력을 구비한다. 또한, 본 발명은 상기 유전자를 외래유전자로 하여, 미생물공학 방법을 이용하여 재조합 플라미드 및 재조합 공정균을 구축하며, 진일보로 재조합된 미생물을 이용하여 발효 시스템중에서 직접 L-알라닐-L-글루타민을 촉매합성함으로써 L-알라닐-L-글루타민의 전환효율을 향상시켰다. 또한, 생물전환 공정에 있어서의 효소의 분리 정제가 어렵고, 효소활성이 불안정하며 코스트가 높은 등 문제를 해결하였다.
용도방면에 있어서, 본 발명은 우선 재조합 대장균을 제공하며, 또한 상기 재조합 대장균을 기반으로 한 L-알라닐-L-글루타민의 생합성방법을 제공한다. 본 발명이 공개한 재조합 대장균은 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO.1인 유전자를 대장균에 도입시켜 얻은 것이다.
상기 재조합 대장균을 이용한 L-알라닐-L-글루타민의 생합성 방법은 상기 재조합 대장균을 이용하여 기질에 대하여 전환반응을 진행하는 단계를 포함한다.
용도의 다른 한 방면에 있어서, 본 발명은 재조합 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)을 공개하며, 상기 재조합 사카로마이세스 세레비지아에는 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO.1인 외래성 유전자를 포함한다.
상기 방법으로 얻은 사카로마이세스 세레비지아에는 전세포 촉매제로 이용될 수 있으며, 기질을 빠른 속도로 L-알라닐-L-글루타민으로 전환시키며, 또한 효소의 분리정제 단계를 필요로 하지 않는다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 L-알라닐-L-글루타민의 생합성 방법을 제공하는 것이며, 이 방법은 상기 본 발명의 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 이용한 기질의 전환반응 단계를 포함한다.
한편, 상기 제공한 재조합 사카로마이세스 세레비지아를 기반으로 하여, 본 발명은 자아응집 능력을 갖는 재조합 사카로마이세스 세레비지아를 진일보로 제공하며, 또한 이 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 이용한 L-알라닐-L-글루타민의 생합성 방법을 제공한다.
이상에서 기술한 바와 같이, 본 발명은 새로 발견한 에스테르 교환 효소 및 이를 코딩하는 유전자를 기반으로 하여, 미생물공학과 효소유전자공학 방법을 이용하여 재조합 대장균과 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 성공적으로 구축하였으며, 또한 이를 전세포 촉매제로 하여 기질을 L-알라닐-L-글루타민으로 전환시키므로써, 효소의 분리정제 단계를 생략하였으며, 높은 몰 전환율, 빠른 생산속도, 균체의 수회 재순환이용가능 등 특징을 구비하기에, L-알라닐-L-글루타민의 고효율, 친환경 및 경제적 생산에 있어서의 양호한 선택이다. 또한, 순환이용 공정과정을 통하여, 공업화 생산원가 절감을 기대할 수 있으며, 효소의 회수가 어렵고 이용율이 낮으며 효소의 불안정성 등 문제를 해결할 수 있다.
본 발명이 공개하는 그 어떤 형식의 L-알라닐-L-글루타민의 생산방법을 이용하든지, 모두 아래의 기술적 효과를 구비한다. 1) 실험재료가 경제적이고 쉽게 얻을 수 있으며, 설비조작과 제어가 간편하며 전세포 촉매합성경로가 간단하고 친환경적이다. 또한, 효소의 분리정제 단계를 생략하므로써 에너지 소모와 생산원가를 낮추었다. 2) 반응속도가 빠르고 반응시간이 짧으며 몰 전환율이 높고, 반응액을 원심분리하여 반응을 종료시킬 수 있어 가열에 의한 효소 불활성화 과정이 필요 없으며 따라서 고온으로 인한 글루타민의 독성 반응을 피할 수 있다. 3) 박테리아 세포의 순환이용으로 박테리아의 배양차수를 줄였으며 이로써 생효소의 제조 및 가열 불활성화에 따른 경제원가를 절감하였으며, 또한 L-알라닐-L-글루타민의 반응주기를 단축하여 생산강도를 향상시키었기에 뚜렷한 시장 경쟁력을 구비하며 L-알라닐-L-글루타민의 공업화 생산에 더욱 적합하다.
본 발명의 도면은 총 12개이다.
도 1은 재조합 대장균에 이용되는 재조합 발현 벡터의 구조 설명도이다.
도 2는 재조합 대장균의 상대적 효소활성이 반응온도에 따른 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 재조합 대장균의 상대적 효소활성이 순환이용 차수에 따른 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 재조합 사카로마이세스 세레비지아에에 이용되는 재조합 발현 벡터의 구조 설명도이다.
도 5는 재조합 사카로마이세스 세레비지아에의 세포 표면에 발현되는 생효소의 형광 및 공초점 레이저 검증도이다.
도 6은 서로 다른 기질농도가 재조합 사카로마이세스 세레비지아에 전세포에 의한 L-알라닐-L-글루타민의 촉매합성에 대한 영향을 나타낸 그래프이다.
도 7은 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 이용한 L-알라닐-L-글루타민의 촉매합성에 있어서의 상대적 효소활성이 반응온도에 따른 변화를 나타낸 그래프이다.
도 8은 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 이용한 L-알라닐-L-글루타민의 촉매합성에 있어서의 상대적 효소활성이 반응pH에 따른 변화를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 우선 L-알라닐-L-글루타민 생합성 효소를 코딩하는 유전자를 확인 및 획득 하였으며, 이의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO.1에 표시한 바와 같다. 상기 유전자의 공여체는 스핑고박테리움 속 미생물이며, 더 구체적으로는 스핑고박테리움 시안지에네시스(Sphingobacterium siyangensis)이다.
서열이 SEQ ID NO.1으로 표시되는 유전자가 코딩하는 아미노산 서열은 SEQ ID NO.2에 표시한 바와 같다. 이 아미노산 서열은 619개의 아미노산으로 조성되었으며, 이미 공개된 가장 가까운 기존 기술(중국특허 ZL03817916.4)에 비하여, 3개의 아미노산에 변화가 발생하였는 바, 하기와 같다. 서열 188번 위치에 상응하는 아미노산이 Y(타이로신)로부터 F(페닐알라닌)로 변이하였으며, 양자 모두 방향족 아미노산에 속하며, 전하를 띠지 않는 극성 R기 아미노산으로부터 비극성 R기 아미노산으로 변이하였다.
서열 586/587번 위치에 상응하는 아미노산: AP(알라닌/프롤린)으로부터 PS(프롤린/세린)으로 변이하였는 바, 중성 아미노산/헤테로 고리 아미노산이 헤테로 고리 아미노산/하이드록시 함유 아미노산으로 변이하였으며, 또한 비극성 R기 아미노산으로부터 전하를 띠지 않는 극성 R기 아미노산으로 변이하였다. 진일보, 효소 효능 영역에 대한 분석 결과에 따르면, 에스테르 교환효소는 주요하게 두개의 효능 영역을 가지며, 두개 영역은 각기 Peptidase S15(44-331)와 PepX_C(382-613)이다. 그중, Peptidase S15(44-331) 영역은 X-Pro dipeptidyl-peptidase(S15 family)에 속하며, 에스테르 교환 효소의 잠재적인 키 촉매중심 영역이다. 이와는 다르게, PepX_C(382-613) 영역은 C말단 비촉매 영역에 속하지만, 디펩티딜 펩티다아제(S9B 단백질 패밀리에 속하는 세린 엑소펩티다아제)와 많은 유사한 구조가 있다. 이에 대한 생리 기능성 연구를 진일보 진행해야 함에도 불구하고, 기존기술에 의하여 아래와 같은 두가지 정보를 얻을 수 있다. 즉, 하나는, 단백질 이합체화는 효소가 촉매활성을 갖는 필요한 조건이라는 것이며, 다른 하나는, 효소의 글리코실화가 생리 기능에 영향을 줄 수 있다는 것이다. 본 발명 중의 SEQ ID NO.2로 표시되는 아미노산 서열중 188번 위치의 아미노산의 돌연변이가 효소의 촉매효능 영역을 변화시켰을 가능성이 있으며, 아미노산 서열 586/587번 위치의 아미노산의 돌연변이는 단백질 이합체화에 변화를 발생시켰을 가능성이 있으며, 또한 이러한 두가지 변화를 통하여 효소의 촉매활성에 영향을 준다.
상기 생효소 유전자의 정보를 확정한 후, 본 발명은 진일보로 이를 증폭 및 플라스미드를 보존한다. 구체적으로는, 대장균 E. coli DH5α를 사용하여 증폭 및 플라스미드 보존을 진행한다.
이를 기반으로, 본 발명은 상기 외래 유전자를 갖는 플라스미드를 서로 다른 재조합 미생물에 사용되는 재조합 벡터의 구축, 재조합 미생물의 구축에 이용하며, 또한 재조합 미생물을 이용하여 발효법으로 L-알라닐-L-글루타민을 생산하는 방법을 건립한다.
상기 외래성 유전자의 한가지 구체적 용도로는, 재조합 대장균을 구축하는 것이며 또한 이를 이용하여 L-알라닐-L-글루타민의 생합성을 진행한다.
목적 유전자와 발현 벡터를 효소 소화에 의하여 절단한 후, 재조합 과정을 거쳐 재조합 대장균의 재조합 벡터를 구축하며, 벡터는 pET29a가 바람직하다.
구축한 재조합 벡터는 기존 기술 중의 방법을 이용하여 발현 숙주 세포에 형질전환시켜, 목표 유전자를 갖는 생물학적 공정균을 제조하며, 이러한 방법으로 열충격법을 들 수 있지만 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명에서 구체적으로 발현 숙주로 대장균을 선택하였으나, 발현 숙주는 기존 기술에 의하여 형질전환 숙주로 할수 있는 모든 대장균을 포함하며, 그 예로 E. coli BL21(DE3)을 들 수 있지만 이에 국한되는 것은 아니다.
다음, 본 발명은 상기 재조합 대장균을 이용하여 L-알라닐-L-글루타민을 합성하는 생합성 방법을 제공한다. 이 방법에 있어서, 적어도 상기 방법으로 얻은 재조합 대장균을 사용하여 기존 기술에 의해 발효생산을 진행하는 과정을 포함하며, 이 과정중에는 상기 재조합 대장균에 의한 기질의 전환반응 단계가 포함된다.
L-알라닐-L-글루타민의 생합성에 있어서, 기질은 기존 기술에 의해 카르복실기 성분과 아민 성분을 포함하는 기질로 묘사할 수 있으며, 본 발명에 있어서, 상기 카르복실기 성분은 아미노산 에스테르 또는 아미노산 아미드로부터 선택할 수 있으며, L-알라닌 메틸에스테르 염화수소산염이 가장 바람직하다. 상기 아민 성분은 아미노산, C말단이 보호된 아미노산 또는 아민으로부터 선택할 수 있으며, L-글루타민이 가장 바람직하다. 반응시스템 중의 기질 농도는 반응물의 비례반응관계에 따라 설정하는 것이 생산에 있어 제일 유리하다. 반응 기질의 농도는 상하한 설정이 없지만, 제일 높은 반응물 농도는 어느 정도에서는 반응 기질의 반응 시스템에서의 용해도에 의하여 결정되며, 또한 반응 기질 농도의 증가에 따라서 전환에 어느 정도의 억제작용이 있다. 한층 더 구체적인 실시예에서 글루타민의 용해도가 최고로 약 250mM에 달하였지만 실제 생산에 있어서 이보다 높은 표준으로 투여량을 설정할 수 있다. 예를 들면 600mM를 사용하였을 때 원 반응 시스템중에는 용해되지 않은 고체상태가 존재하지만 반응이 진행됨에 따라서 점차적으로 용해될 수 있기에 전환반응의 진행에는 영향을 주지 않는다. 따라서, 이러한 원료 투여 방법은 반응의 순조로운 진행을 보증하는 한편 조작 원가를 낮출 수 있다. 실시 가능한 조작 방식으로, 본 발명에서는 최초의 반응 시스템 중의 상기 카르복실기 성분과 아민 성분의 농도를 50~600mM로 설정할 수 있다.
다른 한 방면으로, 상기의 재조합 대장균을 이용한 L-알라닐-L-글루타민의 생물전환 합성방법에 있어서, 전환반응 시스템의 pH가 8.0~10.0이며, 8.0~9.0가 바람직하다.
또 다른 한 방면으로 상기의 재조합 대장균을 이용한 L-알라닐-L-글루타민의 생물전환 합성방법에 있어서, 전환반응 시스템중 재조합 대장균의 사용량은 (시스템) OD600=0.5~5.0이다.
최적화한 결과에 의하여, 상기의 재조합 대장균을 이용한 L-알라닐-L-글루타민의 생물전환 합성방법의 구체적인 실시예의 하나로 하기와 같은 단계를 포함하는 방법으로 묘사할 수 있다:
(1) 기질로써 사용되는 L-알라닌 메틸에스테르 염산염(L-Ala-OMe)과 L-글루타민을 완충 용액에 용해시키고, pH가 8.0~10.0이 되도록 조절하는 단계;
(2) 재조합 대장균을 단계 (1)에서 얻은 시스템에서 반응을 진행하는 단계, 이때 반응 온도는 15~40℃이며, 반응 시스템의 pH값은 8.0~10.0이며;
(3) pH값이 더 떨어지지 않는 시점을 반응이 종점에 달한 지표로 하여 반응액을 모아 균체를 분리하고 반응을 중지하는 단계.
이 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명의 상기 L-알라닐-L-글루타민의 생합성 경로는 하기식으로 간단하게 묘사할 수 있다.
Figure 112019065662728-pct00001
상기 방법에 대한 묘사에 있어서, 한 방면으로, 단계 (1) 중의 상기 완충 용액은 본 분야의 기술자가 기존 기술에 의하여 확정할 수 있으며, 붕산염 완충 용액을 예로 들수 있지만 이에 국한되는 것은 아니다. 또한 단계 (1) 중에서 바람직하게는 알칼리 용액을 사용하여 시스템의 pH가 8.0~9.0이 되도록 조절할 수 있다. 다른 한 방면으로, 단계 (2)에서 언급한 반응 온도는 25℃가 바람직하지만, 윤허하는 측량 혹은 제어 오차에 의한 일정한 범위내의 온도 파동은 허락 가능하며, 단계 (2)의 반응 시스템에 있어서 pH값은 여전히 8.0~9.0가 바람직하다.
상기 재조합 대장균을 이용한 L-알라닐-L-글루타민의 생물전환 합성 방법에 의하면, 촉매반응에 의한 합성 시스템에 있어 전세포가 생산을 진행하며 반응이 적당한 정도로 진행되면 재조합 대장균을 물리적으로 분리하여 반응을 종료시키며, 또한 분리해 낸 재조합 대장균은 공정균으로써 생물전환반응 시스템에 첨가하여 사용하므로써 순환이용을 실현하며, 따라서 이 방법의 제일 중요한 하나의 실시예에 있어서 균체의 순환이용 단계가 더 포함된다. 즉, 상기 단계 (3)의 반응을 중지시킨 후, 분리해 낸 균체를 새로운 반응 시스템에 넣어 순환이용할 수 있다.
하기 실시예에서 본 발명의 내용 및 바람직한 실시방식을 더욱 완정하고 구체적으로 설명한다. 이 구체적인 실시예에 있어서, L-알라닐-L-글루타민의 생합성 방법은 아래의 단계를 포함한다.
(1) 재조합 대장균의 구축:
SEQ ID NO.1로 표시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 표적 유전자를 클로닝하고, 발현 벡터 pET29a을 사용하여 이 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 구축하고, 열충격법으로 재조합 벡터를 발현숙주 E. coli BL21(DE3)에 형질전환시키는 단계;
(2) 저항성 유전자 선별, PCR 및 효소 절단을 이용하여 단계 (1)에서 얻은 양성 형질전환체를 검증하고, 사면 배지에 보존하는 단계;
상기 사면 배지의 조성은 효모 추출물 5g/L, 트립톤 10g/L, NaCl 10g/L, 한천 분말 20g/L이며, 121℃에서 15min간 멸균하고 냉각된 후 최종농도가 10~100㎍/mL이 되도록 카나마이신을 첨가하며,
(3) 활성화한 재조합 대장균을 종자배지에 접종하고, 37℃, 200rpm하에서 밤샘(overnight)배양을 진행한 후 일정한 접종량으로 발효 배양배지에 접종하여 확대배양을 진행하며, 세포의 OD600값이 0.4~1.0에 달한 후, 이소프로필 티오갈락토시드 (IPTG)를 최종농도가 0.2~2.0mM에 달하도록 처리하여 저온하에서 밤샘유도배양을 진행하는 단계;
상기 종자배지와 발효배지의 조성은 효모 추출물 5g/L, 트립톤 10g/L, NaCl 10g/L이며 121℃에서 15min간 멸균하고 냉각된 후 최종농도가 10~100㎍/mL이 되도록 카나마이신을 첨가하며,
(4) L-알라닐-L-글루타민의 생합성: 기질인 L-알라닌 메틸에스테르 염산염 (L-Ala-OMe)과 L-글루타민(L-Gln)을 완충 용액에 용해(청구항 5에 근거한 기질농도와 완충 용액 종류)시키고, 단계 (3)에서 얻은 배양물을 첨가하고 pH값이 8.0~9.0이 되도록 조절한 다음, 25±1℃하에서 반응을 진행하며, pH값이 더 떨어지지 않는 시점을 반응 종점으로 하여 반응액을 모아 원심분리로 균체를 분리하는 단계;
(5) 단계 (4)에서 분리해 낸 균체를 새로운 반응 시스템에 첨가하고 L-알라닐-L-글루타민의 순환생산을 진행한다.
상기 외래성 유전자 용도에 관한 또 다른 구체적인 실시예는, 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 구축하고 또한 이를 이용하여 L-알라닐-L-글루타민의 생합성을 진행하는 것이다.
SEQ ID NO.1로 표시되는 외래성 유전자를 갖는 플라스미드를 기반으로 하여, 표적 유전자와 발현 벡터를 효소 절단한 후, 재조합 과정을 거쳐 재조합 사카로마이세스 세레비지아에에 사용되는 재조합 벡터를 구축하며, 그중 벡터는 pYD1이 바람직하다. 그다음, 이 재조합 벡터를 대장균 DH5α에 형질전환시킨다. 형질전환 방법으로 열충격법을 들 수 있지만 이에 국한되는 것은 아니다. 다음으로 암피실린 저항성 유전자 선별, PCR 및 효소절단에 의하여 상기 단계에서 얻은 형질전환체를 검증하고, 사면 배지에 보존한다.
필요로 하는 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 얻기 위하여, 진일보로 재조합 발현 벡터ii를 추출하여 얻고 이를 사카로마이세스 세레비지아에 컴피턴트 세포에 형질전환시키고 결함 스크리닝 방법을 이용하여 양성 형질전환체를 얻는다. 양성 형질전환체를 활성화 시킨 후 종자배지에 접종하고, 균체가 OD620=0.5~5.0까지 자랐을 때, 유도 배지에 접종하여 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 얻는다.
원칙상, 상기 사카로마이세스 세레비지아에 컴피턴트 세포는 기존 기술에 의하여 형질전환숙주로 할수 있는 모든 사카로마이세스 세레비지아를 포함한다. 본 구체적인 실시예에 있어서, 상기 발현 숙주로 사카로마이세스 세레비지아Saccharomyces cerevisiae EBY100을 사용한다. 이 숙주를 선택한 하나의 원인은 효모세포 표면 발현 기술을 이용하여 에스테르 교환효소 단백질과 효모 세포벽 단백질을 융합시켜 천연구조의 형태로 세포표면에 정착되게 할 수 있는 바, 이는 효소의 고정화에 상당하다. 기타 숙주 발현에 비하여, 발현 효소의 제조가 간단하며, 효소의 분리정제 및 고정화등 단계를 생략할 수 있기에 효소제조 원가를 낮출 수 있다. 세포질내 효소에 비하여, 발현 효소는 기질 및 산물의 막관통 저지가 없으며 또한 세포내의 가수분해 효소에 의한 촉매산물 L-알라닐-L-글루타민의 분해작용도 없다.
특수한 설명이 없을시, 본 발명 중의 상기 사면 배지의 제조방법은 하기와 같다: 트립톤 10.0g/L, NaCl 10.0g/L, 한천 분말 20.0g/L을 포함하며, 121℃에서 15min간 멸균하고, 냉각된 후 최종농도가 10~100㎍/mL이 되도록 암피실린을 첨가한다.
상기 종자 배지의 제조방법은 하기와 같다: 82mL의 초순수에 아미노기가 없는 효모 질소원 0.67g, 고체배지 제조시에는 3.0g/L의 한천 분말을 첨가, 121℃에서 15min간 멸균하며, 멸균 후, 아미노산 혼합 용액 10mL, 류신 (6.0g/L) 1mL, 히스티딘 (2.0g/L) 1mL, 트레오닌 (20.0g/L) 1mL, 및 40wt% 포도당 5mL을 더 첨가한다.
상기 유도배지의 제조방법은 하기와 같다: 82mL의 초순수에 아미노기가 없는 효모 질소원 0.67g을 첨가하고 121℃에서 15min간 멸균하며, 멸균 후, 아미노산 혼합 용액 10mL, 류신 (6.0g/L) 1mL, 히스티딘 (2.0g/L) 1mL, 트레오닌 (20.0g/L) 1mL, 및 40wt% 갈락토오스 5mL을 더 첨가한다.
상기 종자 배지 및 유도 배지의 제조과정 중 언급한 아미노산 혼합 용액은 하기의 성분을 함유한다: 아르지닌 0.2g/L, 아스파르트산 1.0g/L, 글루타민산 1.0g/L, 이소류신 0.3g/L, 라이신 0.3g/L, 발린 1.5g/L, 메티오닌 0.2g/L, 페닐알라닌 0.5g/L, 세린 3.75g/L, 타이로신 0.3g/L 및 아데닌 0.4g/L
재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 구축한 기초상에서, 본 발명은 진일보로 L-알라닐-L-글루타민의 생합성 방법을 제공하는 바, 상기 본 발명의 재조합 사카로마이세스 세레비지아에 의한 기질 전환반응 단계를 포함한다.
상기 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 이용한 L-알라닐-L-글루타민의 생합성에 있어서, 기질은 기존 기술에 의해 카르복실기 성분과 아민 성분을 포함하는 기질로 묘사할 수 있으며, 본 발명에 있어서, 상기 카르복실기 성분은 아미노산 에스테르 또는 아미노산 아미드로부터 선택할 수 있으며, L-글루타민이 가장 바람직하다. 반응 시스템의 기질 농도는 반응물의 비례반응관계에 따라 설정하는 것이 생산에 있어 제일 유리하다. 반응기질의 농도는 상하한 설정이 없지만, 제일 높은 반응물 농도는 어느 정도에서는 반응기질의 반응 시스템에서의 용해도에 의하여 결정되며, 또한 반응기질 농도의 증가에 따라서 전환에 어느 정도의 억제작용이 있다.
본 실시예에 있어서, 글루타민의 용해도가 최고로 약 250mM에 달하였지만 실제 생산에 있어서 이보다 높은 표준으로 투여량을 설정할 수 있다. 예를 들면 600mM를 사용하였을 때 최초의 반응 시스템중에는 용해되지 않은 고체상태가 존재하지만 반응이 진행됨에 따라서 점차적으로 용해될 수 있기에 전환반응의 진행에는 영향을 주지 않는다. 따라서, 이러한 원료 투여 방법은 반응의 순리로운 진행을 보증하는 한편 조작원가를 낮출 수 있다. 실시 가능한 조작방식으로, 본 발명에서는 최초의 반응 시스템 중의 상기 카르복실기 성분과 아민 성분의 농도를 100~600mM로 설정할 수 있다.
다른 한 방면으로, 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 이용한 L-알라닐-L-글루타민의 합성 방법에 있어서, 전환반응 시스템의 pH가 6.0~10.0이며, 8.0~9.0가 바람직하다. 상기 전환반응의 반응온도는 10~40℃이며, 18~25℃가 바람직하며 20~25℃가 가장 바람직하다.
또 다른 한 방면으로, 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 이용한 L-알라닐-L-글루타민의 합성방법에 있어서, 전환반응 시스템 중의 재조합 사카로마이세스 세레비지아에의 사용량은 OD600=0.5~5.0이다.
최적화한 결과에 근거하여, 상기의 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 이용한 L-알라닐-L-글루타민의 생합성 방법의 비교적 구체적인 실시예의 하나로 다음과 같은 단계를 포함하는 방법으로 묘사할 수 있다:
(1) 기질로써 사용되는 L-알라닌 메틸에스테르 염산염(L-Ala-OMe)과 L-글루타민(L-Gln)을 용매 시스템에 용해시키고 pH를 8.0~10.0로 조절하는 단계;
(2) 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 단계 (1)에서 얻은 시스템에 첨가하여 반응을 진행하는 단계, 그중 반응온도는 10~40℃이며, 반응 시스템의 pH값은 8.0~10.0이며;
(3) pH값이 더 떨어지지 않는 시점을 반응이 종점에 달한 지표로 하여 반응액을 모아 균체를 분리하고 반응을 중지하는 단계.
이 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명의 상기 L-알라닐-L-글루타민의 생합성 경로는 아래식으로 간단하게 묘사할 수 있다.
Figure 112019065662728-pct00002
상기 방법에 대한 묘사에 있어서, 한 방면으로, 단계 (1) 중의 상기 완충 용액은 본 분야의 기술자가 기존 기술에 의하여 확정할 수 있으며, 이 용매시스템은 물, 인산염 완충 용액 혹은 붕산염 완충 용액을 예로 들 수 있으며, 인산염 완충 용액을 사용하는 것이 바람직하다. 단계 (1)에서 바람직하게는 알칼리 용액을 사용하여 시스템의 pH를 8.0~9.0로 조절할 수 있다. 다른 한 방면으로, 단계 (2)에서 언급한 반응온도는 18~25℃가 바람직하며 20~25℃가 가장 바람직하다. 윤허하는 측량 혹은 제어 오차에 의한 일정 범위내의 온도파동은 접수할 수 있음은 당연한 것이며, 단계 (2)의 반응 시스템의 pH값은 여전히 8.0~9.0가 바람직하다.
상기에서 언급한 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 이용한 L-알라닐-L-글루타민의 생합성 방법에 의하면, 촉매반응에 의한 합성 시스템에 있어서 전세포가 생산을 진행하며 반응이 적당한 정도로 진행되면 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 물리적으로 분리하여 반응을 종료시키며, 또한 분리해 낸 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 공정균으로 하여 생물전환반응 시스템 중에 첨가하여 사용하므로써 순환이용을 실현하며, 따라서 이 방법의 제일 중요한 하나의 실시예에 있어서 균체의 순환이용 단계가 더 포함된다. 즉, 상기 단계 (3)의 반응이 중지된 후 분리해 낸 균체를 새로운 반응 시스템에 넣어 순환사용할 수 있다.
구체적인 실시예 중, 사카로마이세스 세레비지아가 발효 과정에 발효 시스템중에 자아 침강되는 특징이 있기 때문에, 전환반응이 끝난 후, 시스템을 조용히 놓아두어, 재조합 사카로마이세스 세레비지아에세포가 자아 침강되게 한 후, 연동식 펌프로 반응 상층액을 이출하여 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 얻으며 이를 새로운 반응 시스템에 사용한다.
하기 실시예에서 본 발명의 내용 및 바람직한 실시 방식을 더욱 완정하고 구체적으로 설명한다. 이 구체적인 실시예에 있어서, 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 이용한 L-알라닐-L-글루타민의 생합성 방법은 아래의 단계를 포함한다:
(1) 재조합 사카로마이세스 세레비지아에의 구축:
SEQ ID NO.1로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 표적 유전자를 클로닝하고, 발현 벡터 pYD1을 사용하여 이 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 구축하고, 열충격법으로 재조합 벡터를 대장균 DH5α에 형질전환시키는 단계;
(2) 암피실린 저항성 유전자 선별, PCR 및 효소 절단을 이용하여 단계 (1)에서 얻은 양성 형질전환체를 검증하고, 사면 배지에 보존하는 단계;
상기 사면 배지는 효모 추출물 5g/L, 트립톤 10g/L, NaCl 10g/L, 한천 분말20g/L을 포함하며, 121℃에서 15min간 멸균하고 냉각된 후 최종농도가 10~100㎍/mL이 되도록 암피실린을 첨가;
(3) 단계 (2)에서 얻은 형질전환체에서 재조합 발현 벡터를 추출하여 얻고 이를 사카로마이세스 세레비지아에 EBY100 컴피턴트 세포에 형질전환시키고, 결함 스크리닝으로 양성 형질전환체를 얻고, 이 양성 형질전환체를 활성화한 후, 종자배지에 접종하고 균체를 OD620=0.5~5.0이 될때까지 배양한 다음, 이를 유도배지에 접종하여 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 얻는 단계;
상기 종자 배지의 제조: 82mL의 초순수에 아미노기가 없는 효모 질소원 0.67g, 고체 배지 제조시에는 3.0g/L의 한천 분말을 넣으며, 121℃에서 15min간 멸균한 후, 아미노산 혼합용액 10mL, 류신 (6.0g/L) 1mL, 히스티딘 (2.0g/L) 1mL, 트레오닌 (20.0g/L) 1mL 및 40wt% 포도당 5mL를 더 첨가;
상기 유도배지의 제조: 82mL의 초순수에 아미노기가 없는 효모 질소원 0.67g을 첨가하고, 121℃에서 15min간 멸균한 후, 아미노산 혼합용액 10mL, 류신 (6.0g/L) 1mL, 히스티딘 (2.0g/L) 1mL, 트레오닌 (20.0g/L) 1mL, 및 40wt% 갈락토오스 5mL을 더 첨가;
상기 종자배지 및 유도배지의 제조 중에서 언급한 아미노산 혼합용액은 하기의 성분을 포함한다: 아르지닌 0.2g/L, 아스파르트산 1.0g/L, 글루타민산 1.0g/L, 이소류신 0.3g/L, 라이신 0.3g/L, 발린 1.5g/L, 메티오닌 0.2g/L, 페닐알라닌 0.5g/L, 세린 3.75g/L, 타이로신 0.3g/L 및 아데닌 0.4g/L;
(4) L-알라닐-L-글루타민의 생합성: 기질인 L-알라닌 메틸에스테르 염산염 (L-Ala-OMe)과 L-글루타민(L-Gln)을 용매 시스템에 용해시키고, 단계 (3)에서 얻은 배양물을 첨가하고 pH8.0~9.0이 되도록 조절한 다음, 시스템 온도 20±5℃하에서 반응을 진행하며, pH값이 더 떨어지지 않는 시점을 반응 종점으로 하여 반응액을 모아 원심분리로 균체를 분리하는 단계;
(5) 단계 (4)에서 분리해 낸 균체를 새로운 반응 시스템에 첨가하고 L-알라닐-L-글루타민의 순환생산을 진행한다.
상기의 외래성 유전자 용도에 관한 또 다른 구체적인 실시예는, 구축한 재조합 사카로마이세스 세레비지에를 기반으로 하여, 자아 응집 능력이 있는 재조합 사카로마이세스 세레비지아에 진일보 구축하는 것이다.
상기 자아 응집 능력을 가지는 재조합 사카로마이세스 세레비지아에는 상기 재조합 사카로마이세스 세레비지아에의 하나의 바람직한 선택이 될 수 있으며, 이는 외래성 응집 유전자 FLO1을 함유하는 것을 특징으로 한다.
상기 자아 응집능력을 구비하는 재조합 사카로마이세스 세레비지아에는 하기의 방법으로 구축할 수 있다:
(1) 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO.6/7인 프라이머를 이용하여, 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO.8인 응집유전자 FLO1을 증폭하는 단계;
(2) 증폭하여 얻은 산물을 발현 벡터 pRS425-pGK에 연결하고, 연결산물을 E. coli DH5α 컴피턴트 세포에 형질전환시키고, LB 저항성 배지를 깐 플레이트에서 형질전환체를 스크리닝 및 검증을 진행하여 자아 응집 재조합 벡터를 얻는 단계;
(3) 자아 응집 재조합 벡터를 상기 본 발명의 재조합 사카로마이세스 세레비지아에의 컴피턴트 세포에 형질전환시키고 LEU 결함성 스크리닝을 통하여 자아 응집 능력을 가지는 사카로마이세스 세레비지아에(자아 응집 재조합 사카로마이세스 세레비지아에)를 얻는다.
진일보로, 본 발명은 상기 얻은 자아 응집을 기초로 또 다른 L-알라닐-L-글루타민의 생합성 방법을 제공하는 바, 아래와 같은 단계를 포함한다:
(1) 재조합 사카로마이세스 세레비지아에의 구축: 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO.1인 표적 유전자를 클로닝하고, 발현 벡터 pYD1를 이용하여 이 표적 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 구축하고 이를 열충격법에 의하여 대장균 DH5α에 형질전환시키는 단계;
(2) 암피실린 저항성 유전자 선별, PCR 및 효소 절단을 이용하여 단계 (1)에서 얻은 형질전환체를 검증하고, 사면 배지에 보존하는 단계;
(3) 단계 (2)에서 얻은 형질전환체에서 재조합 발현 벡터를 추출하여 얻고 이를 사카로마이세스 세레비지아에 EBY100 컴피턴트 세포에 형질전환시키고, 결함 스크리닝으로 양성 형질전환체를 얻고, 이 양성 형질전환체를 활성화 한후, 종자배지에 접종하고 균체를 OD620=0.5~5.0이 될 때까지 배양한 다음, 이를 유도배지에 접종하여 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 얻는 단계;
(4) 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO.6/7인 프라이머를 이용하여 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO.8인 응집 유전자 FLO1을 증폭하는 단계;
(5) 단계 (4)에서 증폭하여 얻은 산물을 발현 벡터 pRS425-pGK에 연결하고, 연결산물을 E. coli DH5α 컴피턴트 세포에 형질전환시키고, LB 저항성 배지를 깐 플레이트에서 형질전환체를 스크리닝 및 검증을 진행하여 자아 응집 재조합 벡터를 얻는 단계;
(6) 자아 응집 재조합 벡터를 단계 (3)에서 얻은 재조합 사카로마이세스 세레비지아에 컴피턴트 세포에 형질전환시키고 LEU 결함 스크리닝을 통하여 자아 응집능력을 가지는 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 얻는 단계;
(7) L-알라닐-L-글루타민의 생합성：기질로 사용되는 L-알라닌 메틸에스테르 염산염과 L-글루타민을 용매 시스템에 용해시키고, 단계 (6)에서 얻은 자아 응집 능력을 가지는 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 첨가한 후, pH값을 8.0~9.0로 조절하고, 시스템 온도 20±5℃하에서 반응을 진행하며, pH값이 더 떨어지지 않는 시점을 반응 종료시점으로하여 반응액을 모아 균체를 분리하는 단계;
(8) 단계 (7)에서 얻은 균체를 새로운 반응 시스템에 넣어 L-알라닐-L-글루타민을 순환 생산한다.
아래의 실시예는 본 발명에 대한 진일보의 설명으로 사용될 뿐 어떤 형식으로든 본 발명을 한정 짓는 것은 아니다.
실시예 1 재조합 대장균의 구축:
기지의 관련 생효소의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO.5)에 근거하여, 프라이머(SEQ ID NO.3/4)를 설계하여 얻고, 중국 일반 미생물균종 보관 관리센터에서 구입한 스핑고박테리움 시안지에네시스(Sphingobacterium siyangensis, 균주번호: 1.6855)의 게놈을 주형으로하여 SEQ ID NO.1로 표시되는 생효소의 유전자를 증폭하여 얻는다.
그중, PCR 반응 시스템: dNTPs (2.5mM each), 4μL；10*Buffer, 5μL；F (10 μM), 2μL；R (10μM), 2μL；ExTaq효소 (5U/μL), 1μL；ddH2O, 34μL
PCR 반응조건：94℃, 5 min, 1회 순환；94℃, 30sec, 55℃, 30sec, 72℃, 2min, 30회 순환; 72℃, 7min, 1회 순환. 산물은 4℃에 보관한다.
PCR산물을 겔 전기영동을 통하여 회수하여 정제한 후, 플라스미드 pMDTM19-T에 연결한 다음, 양성 클론을 얻어 그 중의 플라스미드를 추출하여 서열을 측정한다. 효소 절단을 통하여 양성 클론 중의 생효소 유전자를 얻고 이를 같은 방법으로 처리하여 얻은 발현 벡터 pET29a와 연결시키고, 이 연결산물을 E. coli DH5α컴피턴트 세포에 형질전환시킨 후, LB 저항성 배지에서 배양한다. 단일 균락을 고른 후, 플라스미드 추출, 효소 절단에 의한 검증, DNA 서열 측정 등 과정을 거쳐 생효소 발현 벡터를 얻는다. 다음, 얻어진 벡터를 열충격법을 이용하여 발현숙주 컴피턴트 세포에 형질전환시키고, 스크리닝 과정을 거쳐 L-알라닐-L-글루타민을 촉매합성할 수 있는 재조합 대장균을 얻는다.
실시예 2 재조합 대장균의 발효배양:
재조합 대장균을 LB 액체배지에 접종하고 37℃, 200rpm하에서 배양하여 균체를 활성화 시킨다. 그중 LB 액체배지의 조성은 효모 추출물 5g/L, 트립톤 10g/L, NaCl 10g/L을 포함한다. 다음, 활성화 한 균체를 종자 배양배지에 접종하고 37℃, 200rpm하에서 밤샘 진탕배양을 진행한다. 1%의 접종량으로 1.5L의 발효 배양배지에 접종하고 37℃, 200rpm하에서 호기배양을 진행하며 세포의 OD620가 0.6~0.8에 달하면 유도제인 IPTG를 넣어 밤샘 유도배양을 진행한 후 원심분리하여 균체를 모아 본 발명의 아래 실시예에서 언급한 재조합 대장균으로 하여 사용한다.
실시예 3 기질농도 50 mM하에서 전세포에 의한 L-알라닐-L-글루타민의 촉매합성:
0.698g의 L-알라닌 메틸에스테르 염산염(50mM L-Ala-OMe)과 1.462g의 L-글루타민(100mM L-Gln)을 90mL의 0.2M, pH8.7인 붕산염 완충 용액에 용해시키고, 25℃로 온도를 제어하며 6M NaOH 수용액으로 pH값이 8.5가 되도록 조절한다. 재조합 대장균을 OD600=0.75가 되도록 반응 시스템에 첨가하고 6M NaOH 용액으로 pH값이 안정되도록 유지시켜 주며, 10min 후, 원심분리로 세포를 제거하여 반응을 종료한다. 고성능 액체 크로마토그래피(중국약전 2010년판 제2부 부록V D)를 이용하여 L-알라닐-L-글루타민의 농도를 측정한 결과, 최고농도가 9.04g/L이었으며 몰 전환율은 83.3%였다.
실시예 4 기질농도 100mM하에서 전세포에 의한 L-알라닐-L-글루타민의 촉매합성:
1.396g의 L-알라닌 메틸에스테르 염산염(100mM L-Ala-OMe)과 1.462g의 L-글루타민(100mM L-Gln)을 90mL의 0.2M, pH8.7인 붕산염 완충 용액에 용해기키고, 25℃로 온도를 제어하며 6M NaOH 수용액으로 pH값이 8.5가 되도록 조절한다. 재조합 대장균을 OD600=2가 되도록 반응 시스템에 첨가하고 6M NaOH 용액으로 pH값이 안정되도록 유지시켜 주며, 10min 후, 원심분리로 세포를 제거하여 반응을 종료한다. 고성능 액체 크로마토그래피(중국약전 2010년판 제2부 부록V D)를 이용하여 L-알라닐-L-글루타민의 농도를 측정한 결과, 최고농도가 15.92g/L였다.
실시예 5 기질농도 200mM하에서 전세포에 의한 L-알라닐-L-글루타민의 촉매합성:
2.792g의 L-알라닌 메틸에스테르 염산염(200mM L-Ala-OMe)과 2.924g의 L-글루타민(200mM L-Gln)을 90mL의 0.2M, pH8.7인 붕산염 완충 용액에 용해시키고, 온도를 25℃로 제어하며 6M NaOH 수용액으로 pH값이 8.5가 되도록 조절한다. 재조합 대장균을 OD600=2가 되도록 반응 시스템에 첨가하고 6M NaOH 용액으로 pH값이 안정되도록 유지시켜 주며, 10min 후, 원심분리로 세포를 제거하여 반응을 종료한다. 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 L-알라닐-L-글루타민의 농도를 측정한 결과, 최고농도가 31.34g/L였다.
실시예 6 기질농도 400mM하에서 전세포에 의한 L-알라닐-L-글루타민의 촉매합성:
5.584g의 L-알라닌 메틸에스테르 염산염(400mM L-Ala-OMe)과 5.848g의 L-글루타민(400mM L-Gln)을 90mL의 0.2M, pH8.7인 붕산염 완충 용액에 용해시키고, 온도를 25℃로 제어하며 6M NaOH 용액으로 pH값이 8.5가 되도록 조절한다. 재조합 대장균을 OD600=2가 되도록 반응 시스템에 첨가하고 6M NaOH 용액으로 pH값이 안정되도록 유지시켜 주며, 20min 후, 원심분리로 세포를 제거하여 반응을 종료한다. 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 L-알라닐-L-글루타민의 농도를 측정한 결과, 최고농도가 61.53g/L였다.
실시예 7 기질농도 600mM하에서 전세포에 의한 L-알라닐-L-글루타민의 촉매합성:
8.376g의 L-알라닌 메틸에스테르 염산염(600mM L-Ala-OMe)과 8.772g의 L-글루타민(600mM L-Gln)을 90mL의 0.2M, pH8.7인 붕산염 완충 용액에 용해시키고, 온도를 25℃로 제어하며 6M NaOH 수용액으로 pH값이 8.5가 되도록 조절한다. 재조합 대장균을 OD600=2가 되도록 반응 시스템에 첨가하고 6M NaOH 용액으로 pH값이 안정되도록 유지시켜 주며, 20min 후, 원심분리로 세포를 제거하여 반응을 종료한다. 고성능 액체 크로마토그래피(중국약전 2010년판 제2부 부록V D)를 이용하여 L-알라닐-L-글루타민의 농도를 측정한 결과, 최고농도가 79.91g/L였다.
실시예 8 서로 다른 반응온도가 전세포에 의한 L-알라닐-L-글루타민의 촉매합성에 대한 영향:
1%의 접종량으로 재조합 대장균을 LB 발효 배지에 접종하고 37℃, 200rpm하에서 세포의 OD620=0.73가 되도록 호기배양을 진행한다. 다음, 유도제인 IPTG를 첨가하여 생효소의 발현을 유도한다. 원심분리로 세포를 분리하고 L-알라닐-L-글루타민의 촉매반응을 진행한다. 5.584g의 L-알라닌 메틸에스테르 염산염(400mM L-Ala-OMe)과 5.848g의 L-글루타민(400mM L-Gln)을 90mL의 0.2M, pH8.7인 붕산염 완충 용액에 용해시키고 6M NaOH 용액으로 pH값이 8.5가 되도록 조절한 다음, 서로 다른 온도하에서 촉매합성 반응을 진행한다. 고성능 액체 크로마토그래피(중국약전 2010년판 제2부 부록V D)를 이용하여 L-알라닐-L-글루타민의 농도를 측정하였다. 재조합 대장균 전세포는 15~40℃온도범위 내에서 L-알라닐-L-글루타민을 촉매합성할 수 있으며, 25℃하에서의 L-알라닐-L-글루타민의 전세포 촉매합성 생산성이 가장 높으며, 이때의 효소활성을 100%로 하여, 서로 다른 반응온도에서의 상대적 효소활성을 제작하였으며 도 2에 도시된 바와 같다.
실시예 9 균체 순환이용에 의한 L-알라닐-L-글루타민의 고효율 합성:
재조합 대장균의 배양방법은 실시예 2에서 기술한 방법과 같으며, 수집한 균체세포를 실시예 3에서 기술한 방법에 따라 촉매합성 반응을 진행한다. 반응을 종료한 후, 고성능 액체 크로마토그래피(중국약전 2010년판 제2부 부록V D)를 이용하여 L-알라닐-L-글루타민의 농도를 측정하며, 대응하는 효소활성을 100%로 한다.
원심분리로 균체세포를 모아 다음 배양의 공정균으로 사용하며, 상기 반응 과정을 반복한다. 순환차수에 따른 균체 효소활성을 측정한 결과, 도 3에 도시된 바와 같이 제1차 순환이용 균체의 상대적 효소활성이 99.8%이었으며, 제2차 순환이용 균체의 상대적 효소활성이 97.8%이었으며, 제3차 순환이용 균체의 상대적 효소활성이 94.4%였다. 원심분리로 균체를 회수하는 과정중에서 소량의 세포 손실이 있는 것을 감안하면 재조합 대장균을 수차례 순환이용하여 L-알라닐-L-글루타민을 촉매합성하는 과정중 효소활성은 안정적이며, 공업화 생산의 이용에 적합하다.
실시예 10 기존 기술과의 비교:
일본 아지노모토회사(특허등록번호: ZL03817916.4)가 효소법으로 L-알라닐-L-글루타민을 합성하는 분야에서 사용하는 에스테르 교환효소는 생물 안정성, 전환효율 및 생산효율 등 방면에 있어서 세계적으로 선두수준에 있다. 문헌(Biosci Biotechnol Biochem. 2013;77(3):618-23；2011；75（11）:2087-2092)에서 보고한 가장 좋은 결과로 반응 시스템 중 세포의 OD610값이 약 4.6인 상황하에서 두가지 기질의 몰 전환율은 67%이었지만 촉매 반응시간이 40min으로 비교적 길었다. 이와 비교하여, 본 발명에서 구축한 에스테르 교환효소 발현 시스템에 있어서, 세포의 OD600값이 0.75인 반응조건하에서, 10min 내의 몰 전환율이 83.3%에 달하였으며, 따라서 더욱 빠른 생산효율과 더욱 높은 몰 전환율을 가진다.
표 1에 표시된 더욱 상세한 대비 데이터(일본 아지노모토회사 데이터 출처: Enzymatic production of L-Alany-L-glutamine by recombinant E. coli expressing α-Amino acid ester Acyltransferase from Sphingobacterium siyangensis. Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 2013, 77(3): 618-623.)로부터 볼 수 있듯이 유사한 기질 조건하에서 본 발명의 방법은 기존 기술인 중국등록특허 ZL03817916.4의 반응시간보다 훨씬 짧은 반응시간에도 불구하고 더욱 좋은 전환율을 실현할 수 있었다. 이는 유사한 반응 시스템하에서 본 발명의 세포의 효소 촉매활성이 더욱 강함을 보여준다.
[표 1]
Figure 112019065662728-pct00003
실시예 11 재조합 사카로마이세스 세레비지아에의 구축:
실시예 1과 같은 방법으로 외래성 생효소 유전자(SEQ ID NO.1)를 증폭한다.
PCR 반응을 종료한 후, 2μL의 PCR산물을 아가로오스 겔 전기영동을 진행하여 측정하고, PCR 산물 정제키트(OMEGA, USA)을 이용하여 증폭하여 얻은 PCR 산물을 정제한 후 -20℃에 냉동보관한다.
PCR 산물과 발현 벡터 pYD1를 효소 절단하여 정제한 후, 밤샘방치하여 연결하고, 연결 산물을 E. coli DH5α컴피턴트 세포에 형질전환시켜 LB 저항성 배지를 깐 플레이트 (배지의 조성은 사면배지와 같음)에서 형질전환체를 선별하여 얻는다. 얻어진 형질전환체에 대하여 PCR, 효소 절단 및 DNA 서열 측정을 통하여 정확성을 검증하며 도 4에 도시된 효모 재조합 발현 벡터를 얻으며, 이를 화학적 방법에 의하여, 사카로마이세스 세레비지아에 EBY100 컴피턴트 세포에 형질전환시키고 결함 스크리닝을 통하여 L-알라닐-L-글루타민을 촉매합성할 수 있는 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 얻으며 이를 본 발명의 다른 실시예에서 사용되는 재조합 사카로마이세스 세레비지아에로 한다.
실시예 12 재조합 사카로마이세스 세레비지아에의 발효배양:
재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 종자배지에 접종하고, 30℃, 180rpm하에서 균체를 활성화 시킨다. 그 다음, 이를 종자배지에 접종하고 30℃, 180rpm하에서 진탕배양으로 확대배양을 진행한다. 적합한 생물량까지 배양한 후 이를 다시 1.0L의 배양배지에 접종하고 20℃, 150rpm하에서 호기배양을 진행한다. 배양 16~24 h후에 원심분리로 세포를 수집하여 본 발명의 상기 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 얻는다.
실시예 13 표면 발현 생효소의 검증:
a. 실시예 12에서 배양한 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 3000~5000rpm의 조건하에서 원심분리하여 세포를 모으고 인산염 완충 용액으로 두번 세척한다.
b. 상층액을 버리고 1mg/mL 우혈청 알부민(BSA) 과 1㎍항체(anti-V5-FITC)를 포함하는 인산염 완충 용액으로 세포를 다시 현탁시킨다.
c. 얼음우에 30min간 방치한 후, 3000~5000rpm의 조건하에서 원심분리하여 세포를 모으고 인산염 완충 용액으로 두번 세척한다.
d. 마지막으로 인산염 완충 용액으로 세포를 다시 현탁시키고 형광 인버젼 현미경과 공초점 레이저 주사 현미경하에서 관찰한다.
생효소가 세포표면에 발현될 때 노출된 V5 항원 에피토프와 측정방법 b에서 유리된 형광 표지된 항체와의 특이적 결합이 발생하며, 그 다음 인산염 완충 용액으로 세포를 세척하여 여분의 비특이적으로 결합된 항체를 씻어낸 후, 493nm의 여기 파장하에서 형광신호, 즉, 특이적으로 결합된 형광신호를 측정하여 이 생효소가 세포표면에 성공적으로 발현 되었음을 증명한다.
본 실시예에서 언급한 인산염 완충 용액중에는 137mM의 염화나트륨, 2.7mM의 염화칼륨, 10mM의 인산염이 포함되며 완충 용액의 pH값은 7.4이다.
형광 인버젼 현미경과 공초점 레이저 주사 현미경하에서 측정된 형광신호는 도 5에 도시된 바와 같다. 도 5중, A-1/A-2는 형광 인버젼 현미경하에서 측정한 결과를 나타내며, A-2/B-2는 공초점 레이저 주사 현미경에서 측정한 결과를 나타낸다. 도 A-1/B-1는 백광 조사하에서의 세포의 위치를 나타내는 결과도이며, 도 A-2/B-2는 493nm의 여기 파장하에서의 세포의 형광신호 결과도인 바, 같은 위치에 녹색 형광신호를 나타내는 세포가 존재함을 볼 수 있으며, 이는 이 세포는 이미 생효소를 세포표면에 발현하고 있음을 증명한다.
생효소를 세포 표면에 발현시킴으로써 효소의 고정화를 실현하였다. 우선, 기질과 산물의 막 통과저항을 극복하였고 반응속도를 향상시켰다. 다음, 세포질내의 효소와 비교하여, 한 방면으로는, 세포질 내의 단백질 효소와 펩티다아제의 가수분해 작용을 피면할 수 있기에 효소활성의 안정성과 산물의 축적을 유지할수 있다. 다른 한 방면으로는, 효소 농축을 필요로 하는 공정에 있어서 세포 파쇄와 효소의 분리 정제 등 단계를 생략할 수 있어 생산원가를 낮추고 경제적 효익을 향상시켰다. 마지막으로, 세포의 반복 이용에 동반하여 효소의 반복 이용을 실현하므로써 효소의 회수가 곤란하고 원가가 높은 등 문제를 해결하였다.
실시예 14 100mM의 기질농도하에서의 효모 전세포에 의한 L-알라닐-L-글루타민의 촉매합성에 대한 연구:
1.396g의 L-알라닌 메틸에스테르 염산염(100mM L-Ala-OMe)과 1.462g의 L-글루타민(100mM L-Gln)을 90mL의 물에 용해시키고 온도를 25℃로 제어하며 6M NaOH 용액으로 pH값이 8.5가 되도록 조절하고 4℃에 보관한다. 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 반응 액중에서의 생물량이 OD600=0.5~5.0가 되도록 반응 시스템에 첨가하고 6M NaOH 용액으로 pH값이 안정되도록 유지시켜 주며, 반응이 종료된 후 원심분리로 상층액을 모아 4℃에 보관한다. 고성능 액체 크로마토그래피(중국약전 2010년판 제2부 부록V D)를 이용하여 반응시간내에서의 L-알라닐-L-글루타민의 농도를 측정하며, 최고농도가 7.7g/L였으며 도 6에 도시된 바와 같다.
실시예 15 200mM의 기질농도하에서의 효모 전세포에 의한 L-알라닐-L-글루타민의 촉매합성에 대한 연구:
2.792g의 L-알라닌 메틸에스테르 염산염(200mM L-Ala-OMe)과 2.924g의 L-글루타민(200mM L-Gln)을 90mL의 물에 용해시키고, 온도를 25℃로 제어하며 6M NaOH 용액으로 pH값이 8.5가 되도록 조절하고 4℃에 보관한다. 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 반응액에서의 생물량이 OD600=0.5~5.0가 되도록 반응 시스템에 첨가하고 6M NaOH 용액으로 pH값이 안정되도록 유지시켜 주며, 반응이 종료된 후 원심분리로 상층액을 모아 4℃에 보관한다. 고성능 액체 크로마토그래피(중국약전 2010년판 제2부 부록V D)를 이용하여 반응시간내에서의 L-알라닐-L-글루타민의 농도를 측정하며, 최고농도가 20.4g/L였으며 도 6에 도시된 바와 같다.
실시예 16 50mM L-Ala-OMe, 100mM L-Gln의 기질농도하에서의 효모 전세포에 의한 L-알라닐-L-글루타민의 촉매합성에 대한 연구:
0.698g의 L-알라닌 메틸에스테르 염산염(50mM L-Ala-OMe)과 1.462g의 L-글루타민(100mM L-Gln)을 90mL의 0.2M, pH8.7인 인산염 완충 용액에 용해시키고, 온도를 20℃로 제어하며 6M NaOH 용액으로 pH값이 8.5가 되도록 조절하고 4℃에 보관한다. 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 반응액에서의 생물량이 OD600=0.5~5.0가 되도록 반응 시스템에 첨가하고 6M NaOH 용액으로 pH값이 안정되도록 유지시켜 주며, 20min간 반응시킨 후 원심분리로 상층액을 모아 4℃에 보관한다. 고성능 액체 크로마토그래피(중국약전 2010년판 제2부 부록V D)를 이용하여 측정한 반응시간 내에서의L-알라닐-L-글루타민의 최고농도는 5.8g/L이였다.
실시예 17 100mM L-Ala-OMe, 200mM L-Gln의 기질농도하에서의 효모 전세포에 의한 L-알라닐-L-글루타민의 촉매합성에 대한 연구:
1.396g의 L-알라닌 메틸에스테르 염산염(100mM L-Ala-OMe)과 2.924g의 L-글루타민(200mM L-Gln)을 90mL의 0.2M, pH8.7인 인산염 완충 용액에 용해시키고, 온도를 20℃로 제어하며 6M NaOH 용액으로 pH값이 8.5가 되도록 조절하고 4℃에 보관한다. 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 반응액 중의 생물량이 OD600=0.5~5.0가 되도록 반응 시스템에 첨가하고 6M NaOH 용액으로 pH값이 안정되도록 유지시켜 주며, 40min간 반응시킨 후, 원심분리로 반응을 종료시키고 상층액을 각기 모아 4℃에 보관한다. 고성능 액체 크로마토그래피(중국약전 2010년판 제2부 부록V D)를 이용하여 측정한 반응시간 내에서의 L-알라닐-L-글루타민의 최고농도는 14.4g/L였다.
실시예 18 200mM L-Ala-OMe, 400mM L-Gln의 기질농도하에서의 효모 전세포에 의한 L-알라닐-L-글루타민의 촉매합성에 대한 연구:
2.792g의 L-알라닌 메틸에스테르 염산염(200mM L-Ala-OMe)과 5.848g의 L-글루타민(400mM L-Gln)을 90mL의 0.2M, pH8.7인 인산염 완충 용액에 용해시키고, 온도를 20℃로 제어하며 6M NaOH 용액으로 pH값이 8.5가 되도록 조절하고 4℃에 보관한다. 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 반응액에서의 생물량이 OD600=0.5~5.0가 되도록 반응 시스템에 첨가하고 6M NaOH 용액으로 pH값이 안정되도록 유지시켜 주며, 60min간 반응시킨 후, 원심분리로 반응을 종료시키고 상층액을 모아 4℃에 보관한다. 고성능 액체 크로마토그래피(중국약전 2010년판 제2부 부록V D)를 이용하여 측정한 반응시간내에서의 L-알라닐-L-글루타민의 최고농도는 24.7g/L였다.
실시예 19 서로 다른 반응 시스템이 효모 전세포에 의한 L-알라닐-L-글루타민의 촉매합성에 대한 영향:
재조합 사카로마이세스 세레비지아에의 배양 방법은 실시예 12와 같으며, 원심분리로 세포를 모아 L-알라닐-L-글루타민의 촉매반응을 진행한다. 물, 인산염 완충 용액, 붕산염 완충 용액이 효모 전세포를 이용한 L-알라닐-L-글루타민의 촉매합성에 대한 영향을 연구한다. 2.792g의 L-알라닌 메틸에스테르 염산염(200mM L-Ala-OMe)과 5.848g의 L-글루타민(400mM L-Gln)을 90mL의 상기 서로 다른 반응용액에 용해시키며 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 반응 시스템에서의 생물량이 OD600=0.5~5.0가 되도록 반응 시스템에 첨가하고 6M NaOH 용액으로 pH=8.5가 되도록 유지시켜 주며, 반응온도 25℃하에서 촉매합성반응을 진행시키며 반응 과정중 반응시간 10min, 30min, 60min에서 샘플을 채취한다. 원심분리로 반응을 종료시키고 각자 상층액을 모아 4℃에 보관한다. 고성능 액체 크로마토그래피(중국약전 2010년판 제2부 부록V D)를 이용하여 L-알라닐-L-글루타민의 농도를 측정한 결과 가장 적합한 반응용액이 인산염 완충 용액임을 발견하였다.
실시예 20 서로 다른 반응온도가 효모 전세포에 의한 L-알라닐-L-글루타민의 촉매합성에 대한 영향:
재조합 사카로마이세스 세레비지아에의 배양 방법은 실시예 12와 같으며, 원심분리로 세포를 모아 L-알라닐-L-글루타민의 촉매반응을 진행한다. 서로 다른 반응온도 10℃, 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 40℃가 효모 전세포를 이용한 L-알라닐-L-글루타민의 촉매합성에 대한 영향을 연구한다.
1.396g의 L-알라닌 메틸에스테르 염산염(100mM L-Ala-OMe)과 2.924g의 L-글루타민(200mM L-Gln)을 90mL의 0.2M, pH8.7인 인산염 완충 용액에 용해시키고 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 반응시스텡에서의 생물량이 OD600=0.5~5.0가 되도록 반응 시스템에 첨가하고 6M NaOH 용액으로 pH=8.5가 되도록 유지시켜 주며, 상기 서로 다른 반응온도하에서 촉매합성반응을 30 min간 반응시킨 후 원심분리로 효소반응을 종료시키고 고성능 액체 크로마토그래피(중국약전 2010년판 제2부 부록V D)를 이용하여 L-알라닐-L-글루타민의 농도를 측정하였다. 측정결과, 상기 효소는 비교적 넓은 반응온도범위내에서 비교적 높은 활성을 보여주었으며, 가장 적합한 반응온도는 20℃이였지만 반응온도 25℃ 및 30℃와의 차이가 크지 않았다. 따라서, 생산에 있어서의 에너지 소모등 경제적 요소를 고려할때, 직접 실온(20~30℃)하에서 효소 반응을 진행할수 있다. 결과는 도 7에 도시한 바와 같이
실시예 21 서로 다른 pH값이 효모 전세포에 의한 L-알라닐-L-글루타민의 촉매합성에 대한 영향:
재조합 사카로마이세스 세레비지아에의 배양 방법은 실시예 12와 같으며, 원심분리로 세포를 모아 L-알라닐-L-글루타민의 촉매반응을 진행한다. pH가 각기 4, 5, 6인 초산염 완충 용액, pH가 각기 6, 7, 7.5, 8, 8.5, 9인 인산염 완충 용액, pH가 각기 8, 8.5, 9, 10인 붕산염 완충 용액이 효모 전세포를 이용한 L-알라닐-L-글루타민의 촉매합성에 대한 영향을 연구한다.
1.396g의 L-알라닌 메틸에스테르 염산염(100mM L-Ala-OMe)과 2.924g의 L-글루타민(200mM L-Gln)을 90mL의 완충 용액에 갖자 용해시키고 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 반응 시스템에서의 생물량이 OD600=0.5~5.0가 되도록 반응 시스템에 첨가하고, 온도를 20℃로 제어하며 6M NaOH 용액으로 상기 서로 다른 pH가 되도록 조절하여, 촉매반응을 진행시킨다. 반응 30min후, 원심분리로 효소반응을 종료시키고 고성능 액체 크로마토그래피(중국약전 2010년판 제2부 부록V D)를 이용하여 L-알라닐-L-글루타민의 농도를 측정하였다. 측정결과, 상기 효소는 비교적 넓은 pH범위내에서 모두 비교적 높은 활성을 보여주었으며, 가장 적합한 pH는 8.0이었고, 또한 가장 적합한 반응기질 용액이 인산염 완충 용액이임이 다시 한번 검증되었다. 결과는 도 8에 도시한바와 같다.
실시예 22 재조합 사카로마이세스 세레비지아에의 순환사용에 의한 L-알라닐-L-글루타민의 고효율 합성：
재조합 사카로마이세스 세레비지아에의 배양 방법은 실시예 12와 같으며, 원심분리로 세포를 모아 L-알라닐-L-글루타민의 촉매반응을 진행한다.
0.698g의 L-알라닌 메틸에스테르 염산염(50mM L-Ala-OMe)과 1.462g의 L-글루타민(100mM L-Gln)을 90mL의 완충 용액에 용해시키고 온도를 20℃로 제어하며 또한6M NaOH 용액으로 pH가 8이 되도록 조절하여, 반응시간 20min과 30min에서 샘플을 채취하며 원심분리로 효소반응을 종료시킨다. 고성능 액체 크로마토그래피(중국약전 2010년판 제2부 부록V D)를 이용하여 L-알라닐-L-글루타민의 농도를 측정하였다. 제 1차 반응에서의 재조합 사카로마이세스 세레비지아에세포의 상대적 효소활성을 100%로 정의하였을 때, 제 2차 반응에서의 효모세포의 상대적 효소활성이 94.0%이며, 제 3차 반응에서의 효모세포의 상대적 효소활성이 86.7%이며, 제 4차 반응에서의 효모세포의 상대적 효소활성이 76.7%이었다. 균체를 회수하는 과정중, 세포의 부분적 손실을 감한할 때, 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 여러 차례 순환이용하여 L-알라닐-L-글루타민을 촉매합성하는 과정중에서의 효소활성은 비교적 안정적인 것으로 볼 수 있으며, 여러 차례 반복하여 이용할 수 있다. 따라서, 공업화 생산의 원가를 내릴 수 있으며 또한 효소의 회수가 곤란하고 이용율이 낮은 등 문제를 해결할수 있어 공업화 생산의 요구에 더욱 부합된다.
실시예 23 자아 응집 재조합 사카로마이세스 세레비지아에의 구축:
실시예 11에서 구축한 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 기초로, 이가 반응기 중에서의 담체가 필요없는 자아 고정화를 실현하기 위하여, NCBI에 공포된 자아 응집 유전자 FLO1의 뉴클레오티드 서열에 근거하여 상류 프라이머/하류 프라이머 SEQ ID NO.6/7을 설계하고 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) S288c의 게놈을 주형으로 하여 이 응집 유전자(SEQ ID NO.8)를 증폭하여 얻는다.
그중, PCR 반응시스템: dNTPs (2.5mM each), 4μL；10*Buffer, 5μL；F (10 μM), 2μL；R (10μM), 2μL；주형, 2μL；Taq효소 (5U/μL), 1μL；ddH2O, 34μL
PCR반응조건: 94℃, 5min, 1회 순환；94℃, 30sec, 55℃, 30sec, 72℃, 5 min, 30회 순환；72℃, 10min, 1회순환. 산물은 4℃에 보관한다.
PCR반응이 끝난 후, 2μL의 PCR산물을 채취하여 아가로오스겔 전기영동을 이용하여 측정을 진행하고, PCR 산물 정제키트(OMEGA, USA)를 이용하여 증폭하여 얻은 PCR 산물을 정제한 후 -20℃에 냉동 보관한다.
PCR산물과 발현 벡터 pRS425-pGK을 효소 절단하여 정제한 후, 밤샘 방치하여 연결하고, 연결산물을 E. coli DH5α컴피턴트 세포에 형질전환시켜 LB저항성배지 플레이트에서 형질전환체를 선별하여 얻고, PCR과 효소 절단을 진행하여 정확성을 검증하여 자아 응집 재조합 벡터를 얻는다. 화학적 방법에 의하여, 실시예 11에서 구축한 사카로마이세스 세레비지아에를 컴피턴트 세포에 형질전환 시키고 LEU 결함 스크리닝을 통하여 밀리미터급 응집과립양의 자아 응집 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 얻는다. 구축이 완성된 자아 응집 재조합 사카로마이세스 세레비지아에는 응집속도가 빠르며 1-5초간에 완전히 침강되며 또한 응집과립의 크기가 2-4밀리미터로 적당하다. 자아 응집 재조합 사카로마이세스 세레비지아에의 발효배양은 실시예 12와 같다.
실시예 24 자아 응집 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 이용한 L-알라닐-L-글루타민의 촉매합성 및 순환이용:
200mM L-Ala-OMe 및 100mM L-Gln의 기질농도하에서 실시예 23에서 구축한 자아 응집 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 이용한 L-알라닐-L-글루타민의 직접 촉매합성에 대하여 연구한다.
2.792g의 L-알라닌 메틸에스테르 염산염(200mM L-Ala-OMe)과 1.462g의 L-글루타민(100mM L-Gln)을 90mL의 0.2M, pH8.7인 인산염 완충 용액에 용해시키고, 온도를20℃로 제어하며 6M NaOH 용액으로 pH값이 8.5가 되도록 조절하고 4℃에 보관한다. 자아 응집 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 반응 시스템에 첨가하고 6M NaOH 용액으로 pH값이 안정되도록 유지시켜 주며, 반응시간 15min, 30min, 45min에서 샘플을 채취하고 원심분리로 반응을 종료시키고 상층액을 모아 4℃에 보관한다. 고성능 액체 크로마토그래피(중국약전 2010년판 제2부 부록V D)를 이용하여 서로 다른 반응시간 내에서의 L-알라닐-L-글루타민의 농도를 측정하였다.
실시예 23에서 구축한 자아 응집 재조합 사카로마이세스 세레비지아에는 실시예 11에서 구축한 재조합 사카로마이세스 세레비지아에와 일치하는 촉매활성을 보여주었으며, 응집과립의 크기가 적합하여 물질전달 저항력에 대한 영향이 거의 없으며, 또한 L-알라닐-L-글루타민의 높은 축적량의 유지에 있어 뚜렷한 우세를 보여주었다.
자아 응집 재조합 사카로마이세스 세레비지아에의 순환이용이 L-알라닐-L-글루타민의 촉매합성에 대한 영향을 진일보로 고찰하였다.
자아 응집 재조합 사카로마이세스 세레비지아에의 순환이용 방법은 실시예 22와 같으며 고성능 액체 크로마토그래피(중국약전 2010년판 제2부 부록V D)를 이용하여 L-알라닐-L-글루타민의 농도를 측정하였다. 제 1차 반응에서의 상대적 효소활성을 100%로 정의하였을 때, 제 2차 반응에서의 상대적 효소활성이 92.6%이며, 제 3차 반응에서의 상대적 효소활성이 84.8%이며, 제 4차 반응에서의 상대적 효소활성이 79.9%이며, 제 5차 반응에서의 상대적 효소활성이 75.1%이었다. 이로부터, 자아 응집 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 여러 차례 순환이용하여도 효소활성이 비교적 안정적이며, 중복성이 좋은 것을 알 수 있다. 따라서, 반응기에서의 담체를 필요로 하지 않는 자아 고정화 및 성장과 촉매 이 두 단계의 연합을 실현할 수 있으며 이로부터 균체를 원심분리하는 단계를 생략할 수 있어 생산원가를 내릴 수 있으며 친환경적이고 경제적인 공업화 생산방식에 더욱 부합된다.
SEQUENCE LISTING <110> 댕젯努킵?膠믈룀唐掘무鱇 <120> 긍쯤깩믄랗奫?膠북냥첩돨샘凜섟페壇痰 <130> N/A <160> 8 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1860 <212> DNA <213> Sphingobacterium siyangensis <400> 1 atgaaaaata caatttcgtg cctaacttta gcgcttttaa gcgcaagcca gttacatgct 60 caaacagctg ccgactcggc ttatgttaga gatcattatg aaaagaccga agtagcaatc 120 cccatgcgag atgggaagaa attatttact gcgatctaca gtccaaaaga caaatccaag 180 aaatatccag ttttactcaa tagaacaccc tacacggttt ctccttatgg gcagaacgaa 240 tacaaaaaaa gcttgggaaa ctttccccaa atgatgcgtg aaggttatat tttcgtttat 300 caggatgtcc gtggcaagtg gatgagcgaa ggtgattttg aagatattcg tccgaccacc 360 tacagcaaag ataaaaaagc aatcgatgaa agtacggata cctatgatgc gcttgaatgg 420 ttacagaaaa atctcaaaaa ctataatgac aaagccgggc tctatgggat ttcctatcca 480 ggcttctatt ctaccgtcgg attggtcaaa acacacccga gcttgaaggc agtctcccca 540 caggctcccg taacagactg gtttatcggc gacgacttcc accataatgg cgtattgttt 600 cttcaggatg catttacatt catgtcaacc tttggtgtcc cacgtccaaa acccattaca 660 ccggatcaat ttaagggcaa aattcaaatc aaagaagccg ataaatataa cttttttgca 720 gaagcaggaa cagcgcggga actcaaagaa aagtattttg gtgactccgt acaattttgg 780 aatggcctgt ttaaacatcc cgactatgat gatttttgga aatcgcgtgt gatcaccaat 840 tctttacagg aggtaaaacc agctgtgatg gtggttggtg gtttctttga cgcggaagat 900 gcttatggaa catttaagac ttaccaatcg attgaggata aaagcaaaaa aaacaactcg 960 attttagtcg cgggaccttg gtatcatggc ggctgggttc gtgcagaagg aaactattta 1020 ggtgatatcc aatttgagaa aaaaaccagt attacttatc aggagcaatt tgaacaaccg 1080 tttttcaaat attacctaaa agatgaagga aacttcgccc cttccgaagc taacattttt 1140 gtctcaggca gcaacgaatg gaaacatttc gaacaatggc cgccaaaaaa tgtagagaca 1200 aaaaaactat acttccaacc tcaggggaaa cttggatttg acaaagttca acgtacagat 1260 tcctgggatg aatatgtaac agaccctaat aaacttgttc cgcatcaagg tgggttaatt 1320 caaaaccgaa cacgggagta tatggtagat gatcagcgtt tcgcagctag tcgccctgat 1380 gtcatggttt atcaaacgga accgttgacg gaggatctga cgatagtagg cccaatcaaa 1440 aacttcctca aagtctcctc aacaggaaca gacgcggact atgttgtcaa actgattgat 1500 gtatacccga acgatgctgc aagttatcaa ggaaaaacaa tggctggata 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Lys Asp Lys Lys Ala Ile 115 120 125 Asp Glu Ser Thr Asp Thr Tyr Asp Ala Leu Glu Trp Leu Gln Lys Asn 130 135 140 Leu Lys Asn Tyr Asn Gly Lys Ala Gly Leu Tyr Gly Ile Ser Tyr Pro 145 150 155 160 Gly Phe Tyr Ser Thr Val Gly Leu Val Lys Thr His Pro Ser Leu Lys 165 170 175 Ala Val Ser Pro Gln Ala Pro Val Thr Asp Trp Phe Ile Gly Asp Asp 180 185 190 Phe His His Asn Gly Val Leu Phe Leu Gln Asp Ala Phe Thr Phe Met 195 200 205 Ser Thr Phe Gly Val Pro Arg Pro Lys Pro Ile Thr Pro Asp Gln Phe 210 215 220 Lys Gly Lys Ile Gln Ile Lys Glu Ala Asp Lys Tyr Asn Phe Phe Ala 225 230 235 240 Glu Ala Gly Thr Ala Arg Glu Leu Lys Glu Lys Tyr Phe Gly Asp Ser 245 250 255 Val Gln Phe Trp Asn Asp Leu Phe Lys His Pro Asp Tyr Asp Asp Phe 260 265 270 Trp Lys Ser Arg Val Ile Thr Asn Ser Leu Gln Glu Val Lys Pro Ala 275 280 285 Val Met Val Val Gly Gly Phe Phe Asp Ala Glu Asp Ala Tyr Gly Thr 290 295 300 Phe Lys Thr Tyr Gln Ser Ile Glu Asp Lys Ser Lys Lys Asn Asn Ser 305 310 315 320 Ile Leu Val Ala Gly Pro Trp Tyr His Gly Gly Trp Val Arg Ala Glu 325 330 335 Gly Asn Tyr Leu Gly Asp Ile Gln Phe Glu Lys Lys Thr Ser Ile Thr 340 345 350 Tyr Gln Glu Gln Phe Glu Gln Pro Phe Phe Lys Tyr Tyr Leu Lys Asp 355 360 365 Glu Gly Asn Phe Ala Pro Ser Glu Ala Asn Ile Phe Val Ser Gly Ser 370 375 380 Asn Glu Trp Lys His Phe Glu Gln Trp Pro Pro Lys Asn Val Glu Thr 385 390 395 400 Lys Lys Leu Tyr Phe Gln Pro Gln Gly Lys Leu Gly Phe Asp Lys Val 405 410 415 Gln Arg Thr Asp Ser Trp Asp Glu Tyr Val Thr Asp Pro Asn Lys Pro 420 425 430 Val Pro His Gln Gly Gly Leu Ile Gln Asn Arg Thr Arg Glu Tyr Met 435 440 445 Val Asp Asp Gln Arg Phe Ala Ala Ser Arg Pro Asp Val Met Val Tyr 450 455 460 Gln Thr Glu Pro Leu Thr Glu Asp Leu Thr Ile Val Gly Pro Ile Lys 465 470 475 480 Asn Phe Leu Lys Val Ser Ser Thr Gly Thr Asp Ala Asp Tyr Val Val 485 490 495 Lys Leu Ile Asp Val Tyr Pro Asn Asp Ala Ala Ser Tyr Gln Gly Lys 500 505 510 Thr Met Ala Gly Tyr Gln Met Met Val Arg Gly Glu Ile Met Ala Gly 515 520 525 Lys Tyr Arg Asn Gly Phe Asp Lys Ala Gln Ala Leu Thr Pro Gly Met 530 535 540 Val Glu Lys Val Asn Phe Glu Met Pro Asp Val Ala His Thr Phe Lys 545 550 555 560 Lys Gly His Arg Ile Met Val Gln Val Gln Asn Ser Trp Phe Pro Leu 565 570 575 Ala Glu Arg Asn Pro Gln Val Phe Leu Pro Ser Tyr Thr Ala Thr Lys 580 585 590 Ala Asp Phe Arg Lys Ala Thr Gln Arg Ile Phe His Asp Val Asn Asn 595 600 605 Ala Thr Tyr Ile Glu Phe Ser Val Leu Lys Asp 610 615 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> 훙묏埼죗 <400> 3 cgcggatcca tgaaaaatac aatttcgtgc c 31 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> 훙묏埼죗 <400> 4 ccgctcgagc taatctttga ggacagaaaa t 31 <210> 5 <211> 1860 <212> DNA <213> Sphingobacterium sp. <400> 5 atgaaaaata caatttcgtg cctaacttta gcgcttttaa gcgcaagcca gttacatgct 60 caaacagctg ccgactcggc ttatgttaga gatcattatg aaaagaccga agtagcaatt 120 cccatgcgag atgggaaaaa attatttact gcgatctaca gtccaaaaga caaatccaag 180 aaatatccag ttttgctcaa tagaacgccc tacacggttt ctccttatgg gcagaacgaa 240 tacaaaaaaa gtttgggaaa ctttccccaa atgatgcgtg aaggctatat tttcgtttac 300 caggatgtcc gtggcaagtg 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<210> 8 <211> 4614 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 8 atgacaatgc ctcatcgcta tatgtttttg gcagtcttta cacttctggc actaactagt 60 gtggcctcag gagccacaga ggcgtgctta ccagcaggcc agaggaaaag tgggatgaat 120 ataaattttt accagtattc attgaaagat tcctccacat attcgaatgc agcatatatg 180 gcttatggat atgcctcaaa aaccaaacta ggttctgtcg gaggacaaac tgatatctcg 240 attgattata atattccctg tgttagttca tcaggcacat ttccttgtcc tcaagaagat 300 tcctatggaa actggggatg caaaggaatg ggtgcttgtt ctaatagtca aggaattgca 360 tactggagta ctgatttatt tggtttctat actaccccaa caaacgtaac cctagaaatg 420 acaggttatt ttttaccacc acagacgggt tcttacacat tcaagtttgc tacagttgac 480 gactctgcaa ttctatcagt aggtggtgca accgcgttca actgttgtgc tcaacagcaa 540 ccgccgatca catcaacgaa ctttaccatt gacggtatca agccatgggg tggaagtttg 600 ccacctaata tcgaaggaac cgtctatatg tacgctggct actattatcc aatgaaggtt 660 gtttactcga acgctgtttc ttggggtaca cttccaatta gtgtgacact tccagatggt 720 accactgtaa gtgatgactt cgaagggtac gtctattcct ttgacgatga cctaagtcaa 780 tctaactgta ctgtccctga cccttcaaat tatgctgtca gtaccactac aactacaacg 840 gaaccatgga ccggtacttt cacttctaca tctactgaaa tgaccaccgt caccggtacc 900 aacggcgttc caactgacga aaccgtcatt gtcatcagaa ctccaacaac tgctagcacc 960 atcataacta caactgagcc atggaacagc acttttacct ctacttctac cgaattgacc 1020 acagtcactg gcaccaatgg tgtacgaact gacgaaacca tcattgtaat cagaacacca 1080 acaacagcca ctactgccat aactacaact gagccatgga acagcacttt tacctctact 1140 tctaccgaat tgaccacagt caccggtacc aatggtttgc caactgatga gaccatcatt 1200 gtcatcagaa caccaacaac agccactact gccatgacta caactcagcc atggaacgac 1260 acttttacct ctacttctac cgaattgacc acagtcaccg gtaccaatgg tttgccaact 1320 gatgagacca tcattgtcat cagaacacca acaacagcca ctactgccat gactacaact 1380 cagccatgga acgacacttt tacctctact tctaccgaat tgaccacagt caccggtacc 1440 aatggtttgc caactgatga gaccatcatt gtcatcagaa caccaacaac agccactact 1500 gccatgacta caactcagcc atggaacgac acttttacct ctacatccac tgaaatcacc 1560 accgtcaccg gtaccaatgg tttgccaact gatgagacca tcattgtcat cagaacacca 1620 acaacagcca ctactgccat gactacacct cagccatgga acgacacttt tacctctaca 1680 tccactgaaa tgaccaccgt caccggtacc aacggtttgc caactgatga aaccatcatt 1740 gtcatcagaa caccaacaac agccactact gccataacta caactgagcc atggaacagc 1800 acttttacct ctacatccac tgaaatgacc accgtcaccg gtaccaacgg tttgccaact 1860 gatgaaacca tcattgtcat cagaacacca acaacagcca ctactgccat aactacaact 1920 cagccatgga acgacacttt tacctctaca tccactgaaa tgaccaccgt caccggtacc 1980 aacggtttgc caactgatga aaccatcatt gtcatcagaa caccaacaac agccactact 2040 gccatgacta caactcagcc atggaacgac acttttacct ctacatccac tgaaatcacc 2100 accgtcaccg gtaccaccgg tttgccaact gatgagacca tcattgtcat cagaacacca 2160 acaacagcca ctactgccat gactacaact cagccatgga acgacacttt tacctctaca 2220 tccactgaaa tgaccaccgt caccggtacc aacggcgttc caactgacga aaccgtcatt 2280 gtcatcagaa ctccaactag tgaaggtcta atcagcacca ccactgaacc atggactggt 2340 actttcacct ctacatccac tgagatgacc accgtcaccg gtactaacgg tcaaccaact 2400 gacgaaaccg tgattgttat cagaactcca accagtgaag gtttggttac aaccaccact 2460 gaaccatgga ctggtacttt tacttctaca tctactgaaa tgaccaccat tactggaacc 2520 aacggcgttc caactgacga aaccgtcatt gtcatcagaa ctccaaccag tgaaggtcta 2580 atcagcacca ccactgaacc atggactggt acttttactt ctacatctac tgaaatgacc 2640 accattactg gaaccaatgg tcaaccaact gacgaaaccg ttattgttat cagaactcca 2700 actagtgaag gtctaatcag cactacaacg gaaccatgga ccggtacttt cacttctaca 2760 tctactgaaa tgacgcacgt caccggtacc aacggcgttc caactgacga aaccgtcatt 2820 gtcatcagaa ctccaaccag tgaaggtcta atcagcacca ccactgaacc atggactggc 2880 actttcactt cgacttccac tgaggttacc accatcactg gaaccaacgg tcaaccaact 2940 gacgaaactg tgattgttat cagaactcca accagtgaag gtctaatcag caccaccact 3000 gaaccatgga ctggtacttt cacttctaca tctactgaaa tgaccaccgt caccggtact 3060 aacggtcaac caactgacga aaccgtgatt gttatcagaa ctccaaccag tgaaggtttg 3120 gttacaacca ccactgaacc atggactggt acttttactt cgacttccac tgaaatgtct 3180 actgtcactg gaaccaatgg cttgccaact gatgaaactg tcattgttgt caaaactcca 3240 actactgcca tctcatccag tttgtcatca tcatcttcag gacaaatcac cagctctatc 3300 acgtcttcgc gtccaattat taccccattc tatcctagca atggaacttc tgtgatttct 3360 tcctcagtaa tttcttcctc agtcacttct tctctattca cttcttctcc agtcatttct 3420 tcctcagtca tttcttcttc tacaacaacc tccacttcta tattttctga atcatctaaa 3480 tcatccgtca ttccaaccag tagttccacc tctggttctt ctgagagcga aacgagttca 3540 gctggttctg tctcttcttc ctcttttatc tcttctgaat catcaaaatc tcctacatat 3600 tcttcttcat cattaccact tgttaccagt gcgacaacaa gccaggaaac tgcttcttca 3660 ttaccacctg ctaccactac aaaaacgagc gaacaaacca ctttggttac cgtgacatcc 3720 tgcgagtctc atgtgtgcac tgaatccatc tcccctgcga ttgtttccac agctactgtt 3780 actgttagcg gcgtcacaac agagtatacc acatggtgcc ctatttctac tacagagaca 3840 acaaagcaaa ccaaagggac aacagagcaa accacagaaa caacaaaaca aaccacggta 3900 gttacaattt cttcttgtga atctgacgta tgctctaaga ctgcttctcc agccattgta 3960 tctacaagca ctgctactat taacggcgtt actacagaat acacaacatg gtgtcctatt 4020 tccaccacag aatcgaggca acaaacaacg ctagttactg ttacttcctg cgaatctggt 4080 gtgtgttccg aaactgcttc acctgccatt gtttcgacgg ccacggctac tgtgaatgat 4140 gttgttacgg tctatcctac atggaggcca cagactgcga atgaagagtc tgtcagctct 4200 aaaatgaaca gtgctaccgg tgagacaaca accaatactt tagctgctga aacgactacc 4260 aatactgtag ctgctgagac gattaccaat actggagctg ctgagacgaa aacagtagtc 4320 acctcttcgc tttcaagatc taatcacgct gaaacacaga cggcttccgc gaccgatgtg 4380 attggtcaca gcagtagtgt tgtttctgta tccgaaactg gcaacaccaa gagtctaaca 4440 agttccgggt tgagtactat gtcgcaacag cctcgtagca caccagcaag cagcatggta 4500 ggatatagta cagcttcttt agaaatttca acgtatgctg gcagtgccaa cagcttactg 4560 gccggtagtg gtttaagtgt cttcattgcg tccttattgc tggcaattat ttaa 4614

Claims (16)

  1. 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO.1인, L-알라닐-L-글루타민 생합성 효소를 코딩하는 유전자.
  2. 제1항의 상기 유전자에 의하여 코딩되는, 아미노산 서열이 SEQ ID NO.2인 L-알라닐-L-글루타민 생합성 효소.
  3. 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO.1인 유전자를 대장균에 형질전환시켜 얻어지는 것을 특징으로 하는, 재조합 대장균.
  4. 제3항의 재조합 대장균을 이용하여 기질 전환 반응을 진행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, L-알라닐-L-글루타민의 생합성 방법으로서,
    상기 기질은 카르복실기 성분과 아민 성분을 포함하며, 그중 상기 카르복실기 성분은 아미노산 에스테르 또는 아미노산 아미드로부터 선택되며, 상기 아민 성분은 아미노산, C말단이 보호된 아미노산 또는 아민으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, L-알라닐-L-글루타민의 생합성 방법.
  5. 삭제
  6. 제4항에 있어서,
    (1) 기질인 L-알라닌 메틸 에스테르 염산염과 L-글루타민을 완충 용액에 용해시키고 pH값이 8.0~10.0이 되도록 조절하는 단계;
    (2) 재조합 대장균을 단계 (1)에서 얻은 시스템에 첨가하고 반응온도 15~40℃ 반응 시스템 pH값이 8.0~10.0인 조건하에서 반응을 진행하는 단계;
    (3) pH값이 더 떨어지지 않는 시점을 반응이 종점에 달한 지표로 하며, 반응액을 원심분리시켜 균체를 모으고 반응을 종료하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, L-알라닐-L-글루타민의 생합성 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    재조합 대장균 균체를 순환이용하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, L-알라닐-L-글루타민의 생합성 방법.
  8. (1) 재조합 대장균의 구축: 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO.1인 표적 유전자를 클로닝하고, 발현 벡터 pET29a을 사용하여 이 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 구축하며, 열충격법으로 재조합 벡터를 발현 숙주 E. coli BL21(DE3)에 형질전환 시키는 단계;
    (2) 저항성 유전자 선별, PCR 및 효소 절단을 통하여 단계 (1)에서 얻은 양성 형질전환체를 검증하여, 사면 배지에 보존하는 단계;
    상기 사면 배지의 조성은 효모 추출물 5g/L, 트립톤 10g/L, NaCl 10g/L, 한천 분말 20g/L이며, 121℃에서 15min간 멸균하고, 냉각된 후 카나마이신을 최종 농도가 10~100㎍/mL이 되도록 첨가;
    (3) 활성화한 재조합 대장균을 종자배지에 접종하고, 37℃ 200rpm하에서 확대 배양을 진행하며 세포의 OD600값이 0.4~1.0에 달한 후, 이소프로필 티오갈락토시드를 최종농도가 0.2~2.0mM이 되도록 첨가하고 저온하에서 밤샘 유도배양을 진행하는 단계;
    상기 종자배지는 효모 추출물 5g/L, 트립톤 10g/L, NaCl 10g/L을 포함하며, 121℃에서 15min간 멸균하고, 냉각된 후 카나마이신을 최종 농도가 10~100㎍/mL이 되도록 첨가;
    (4) L-알라닐-L-글루타민의 생합성: 기질인 L-알라닌 메틸에스테르 염산염과 L-글루타민을 완충 용액에 용해시키고, 단계 (3)에서 얻은 배양물을 첨가하고 pH값이 8.0~9.0이 되도록 조절한 다음, 25±1℃의 시스템 온도 조건하에서 반응시키며, pH값이 더 떨어지지 않는 시점을 반응 종점으로 하여 반응액을 모아 원심분리로 균체를 분리하는 단계;
    (5) 단계 (4)에서 분리하여 얻은 균체를 새로운 반응 시스템에 첨가하고 L-알라닐-L-글루타민을 순환 생산하는 단계를 포함하는 L-알라닐-L-글루타민의 생합성 방법.
  9. 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO.1인 외래성 유전자를 함유하는 재조합 사카로마이세스 세레비지아에.
  10. 제9항에 있어서,
    외래성 응집 유전자 FLO1을 더 함유하는 것을 특징으로 하는, 재조합 사카로마이세스 세레비지아에.
  11. 제9항 또는 제 10항의 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 이용하여 기질 전환반응을 진행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, L-알라닐-L-글루타민의 생합성 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 기질은 카르복실기 성분과 아민 성분을 포함하며, 그중 상기 카르복실기 성분은 아미노산 에스테르 또는 아미노산 아미드로부터 선택되며, 상기 아민 성분은 아미노산, C말단이 보호된 아미노산 또는 아민으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, L-알라닐-L-글루타민의 생합성 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    (1) 기질인 L-알라닌 메틸에스테르 염산염과 L-글루타민을 용매 시스템에 용해시키고 pH값이 8.0~9.0이 되도록 조절하는 단계;
    (2) 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 단계 (1)에서 얻은 시스템에 첨가하여 반응온도 10~40℃, 반응 시스템 pH값이 8.0~9.0인 조건하에서 반응을 진행하는 단계;
    (3) pH값이 더 떨어지지 않는 시점을 반응이 종점에 달한 지표로 하여 반응액을 원심분리하여 균체를 모아 반응을 종료하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, L-알라닐-L-글루타민의 생합성 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 순환이용하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, L-알라닐-L-글루타민의 생합성 방법.
  15. (1) 재조합 사카로마이세스 세레비지아에의 구축: 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO.1인 표적 유전자를 클로닝하고, 발현 벡터 pYD1을 사용하여 이 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 구축하며, 열충격법으로 이 재조합 벡터를 대장균 DH5α에 형질전환시키는 단계;
    (2) 암피실린 저항성 유전자 선별, PCR 및 효소 절단을 통하여 단계 (1)에서 얻은 형질전환체를 검증하고, 사면 배지에 보존하는 단계;
    (3) 단계 (2)에서 얻은 형질전환체에서 재조합 발현 벡터를 추출하여 사카로마이세스 세레비지아에 EBY100 컴피턴트 세포에 형질전환시키고 결함 스크리닝으로 양성 형질전환체를 선별하고, 양성 형질전환체를 활성화시킨 후 종자배지에 접종하고 균체가 OD620=0.5~5.0까지 성장하였을 때, 유도배지에 다시 접종하여 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 얻는 단계;
    (4) L-알라닐-L-글루타민의 생합성: 기질인 L-알라닌 메틸에스테르 염산염과 L-글루타민을 용매시스템에 용해시키고, 단계 (3)에서 얻은 배양물을 첨가하고 pH값이 8.0~9.0이 되도록 조절한 다음, 25±1℃의 시스템 온도 조건하에서 반응을 진행시키며, pH값이 더 떨어지지 않는 시점을 반응 종점으로 하여 반응액을 모아 균체를 분리하는 단계;
    (5) 단계 (4)에서 분리하여 얻은 균체를 새로운 반응시스템중에 첨가하여 L-알라닐-L-글루타민을 순환생산하는 단계를 포함하는 L-알라닐-L-글루타민의 생합성 방법.
  16. (1) 재조합 사카로마이세스 세레비지아에의 구축: 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO.1인 표적 유전자를 클로닝하고, 발현 벡터 pYD1을 사용하여 이 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 구축하며, 열충격법으로 재조합 벡터를 대장균 DH5α에 형질전환시키는 단계;
    (2) 암피실린 저항성 유전자 선별, PCR 및 효소 절단을 통하여 단계 (1)에서 얻은 형질전환체를 검증하고, 사면 배지에 보존하는 단계;
    (3) 단계 (2)에서 얻은 형질전환체에서 재조합 발현 벡터를 추출하여 사카로마이세스 세레비지아에 EBY100 컴피턴트 세포에 형질전환시키고 결함 스크리닝으로 양성 형질전환체를 선별하고, 양성 형질전환체를 활성화 시킨 후 종자배지에 접종하여 균체가 OD620=0.5~5.0까지 성장하였을때 유도배지에 다시 접종하여 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 얻는 단계;
    (4) 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO.6/7인 프라이머를 이용하여 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO.8인 응집 유전자 FLO1을 증폭하는 단계;
    (5) 단계 (4)에서 얻은 산물과 발현 벡터 pRS425-pGK을 연결하고, 연결산물을 E. coli DH5α 컴피턴트 세포에 형질전환시키고 LB 저항성 배지를 깐 플레이트에서 형질전환체를 선별 및 검증을 진행하여 자아 응집 재조합 벡터를 얻는 단계;
    (6) 자아 응집 재조합 벡터를 단계 (3)에서 얻은 재조합 사카로마이세스 세레비지아에 컴피턴트 세포에 형질전환시키고 LEU 결함 배지로 스크리닝을 진행하여 자아 응집 능력을 가지는 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 얻는 단계;
    (7) L-알라닐-L-글루타민의 생합성: 기질인 L-알라닌 메틸에스테르 염산염과 L-글루타민을 용매 시스템에 용해시키고, 단계 (6)에서 얻은 자아 응집 능력을 가지는 재조합 사카로마이세스 세레비지아에를 첨가하고 pH값이 8.0~9.0이 되도록 조절한 다음, 25±1℃의 시스템 온도 조건하에서 반응을 진행시키며, pH값이 더 떨어지지 않는 시점을 반응 종점으로 하여 반응액을 모아 균체를 분리하는 단계;
    (8) 단계 (7)에서 분리하여 얻은 균체를 새로운 반응 시스템중에 첨가하여 L-알라닐-L-글루타민을 순환생산하는 단계를 포함하는 L-알라닐-L-글루타민의 생합성 방법.
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