CN1164611C - 丙-谷二肽合成方法 - Google Patents
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Abstract
涉及一种丙-谷二肽合成方法,N端保护的氨基酸与三苯基磷、六氯乙烷在有机溶剂中反应形成活泼酯;活泼酯与谷氨酰胺在有机溶剂和无机碱水溶液的混合溶液中进行,用无机酸酸化,然后脱去N端保护基团。其原料极为便宜,合成工艺简单,中间产物不需要分离和提纯处理,产物容易分离提纯;省去了有机碱、谷氨酰胺氨基酸接保护基团保护和脱除保护基团,简化了合成路线,节约了成本,缩短了时间,提高了产率,节省了溶剂和试剂,对环境友好;而且产物可直接分液得到,简化了生产设备,降低成本,有利环保;反应结束生成两个产物,丙-谷二肽和副产物三苯基氧磷,后者为不挥发的固体,容易回收,整个合成过程中所采用的试剂毒性均较小。
Description
本发明涉及一种含氨基酸的二肽合成方法,尤其是一种丙-谷二肽合成方法。
谷氨酰胺是人体中含量最多的氨基酸,谷氨酰胺在肌肉蛋白质和血浆蛋白质中含量约分别为75%和26%。
谷氨酰胺具有重要的生理作用。谷氨酰胺是生物合成核酸的必需前体物质,是蛋白质合成与分解的调节物,是氨基氮从外周组织转动至内脏的携带者,是肾脏排泄氨的重要基质。谷氨酰胺是肠粘膜上皮细胞、肾小管细胞、巨噬细胞和成纤维细胞的重要能量物质,在维持肠道机能,促进免疫功能,维持体内碱平衡及提高机体对应激的适应等方面都发挥着极其重要的作用。
在临床上的严重感染、复合性骨折、创伤、大手术、大面积烧伤与恶性肿瘤后期等应急和高分解代谢状态下,谷氨酰胺的需要大大超过了机体合成谷氨酰胺的能力,使体内谷氨酰胺的含量降低,从而使核酸、蛋白质合成减少。若采用传统的全静脉营养液(TPN),则可能导致肠粘膜萎缩,肠粘膜通透性升高和细菌易位,甚至导致败血症及多器官功能衰竭。大量的实验表明,补充GLN的TPN对许多疾病的预防和恢复有显著作用,若在TPN中加入一定量的谷氨酰胺,以提高血液和肌肉等组织中谷氨酰胺浓度,则对维持或恢复肠粘膜功能具有重要作用。给严重感染的病人输入补充GLN的TPN,明显保持正氮平衡和促进细胞GLN合成酶的表达,减轻肌细胞内GLN浓度和核糖体浓度的降低。
近年来,因为谷氨酰胺重要的生理功能和药理作用,使其在肠外营养中的应用受到人们普遍的重视。如上所述,在各种创伤(包括意外伤、手术伤、及辐射伤)、感染等应激条件下,血中和细胞中的谷氨酰胺浓度降低,而补给现有的氨基酸制剂(不含GLN),不能使其逆转;一些重要的细胞功能如蛋白质的合成、细胞的吞噬作用和淋巴细胞的增殖,都必须依赖充足的GLN。但是由于它的溶解度低,而且溶液中不稳定,在加热灭菌的条件下,生成有毒的焦谷氨酸和氨,所以商品氨基酸制剂中都不含有GLN。目前GLN的应用主要有以下途径:(1)现配现用,把GLN晶体加到氨基酸溶液中,然后过滤除菌,在8h内输完。这一过程必须严格无菌操作且工作繁琐,费力,适用范围受到限制;(2)合成GLN衍生物,如乙酰谷酰胺。它容易合成,加热稳定,在体内可形成GLN,便是它的利用率较低,摄入量的40%被从尿中排泄掉;(3)应用GLN的二肽。
目前,用于试验研究的二肽主要有两种:甘氨酰谷氨酰胺(L-glynyl-L-glutamine,Gly-Gln)和丙-谷二肽(Ala-Gln)。动物和人体实验证明,在体内,这两种二肽很快被分为其组成氨基酸,半衰期很短,血液中只能检测到少量的二肽,仅有微量的二肽从尿中排出。说明GLN二肽可有效地利用而且不会在血积聚,避免了二肽可能产生的药理及生理性损害。有实验证明,健康人体长期静脉注射滴注Ala-Gln二肽没有任何副作用及不良反应,不影响正常的肾功能。用化学方法合成的Ala-Gln经纯化其溶解度是GLN单体的20倍,在储存和加热灭菌中也很稳定,而进入体内后即迅速分解成GLN而发挥作用,使GLN在TPN中的应用更加方便可行。
丙-谷二肽合成方法有如下4种:
1、首先将GLN(谷氨酰胺)的氨基进行保护,形成Cbz-Gln;第二步,将Cbz-Gln的酰氨基保护形成Cbz-Gln(OC13H9);第三步,将Cbz-Gln(OC13H9)的羧基保护形成Cbz-Gln(OC13H9)OMe;第四步,通氢气形成Gln(OC13H9)OMe;第五步,加入CBZ-ALA;第六步,对CBZ-ALA活化;第七步,CBZ-ALA和Gln(OC13H9)OMe结合成肽;第八步,皂化脱甲酯;第九步,酸化脱去全部保护,形成丙-谷二肽。(文献Yasutsugu Shimomishi,Studies onthe Synthesis of Peptides Containing Glutamine as the C-Terminal.Y.Bull.Chem.Soc.Jpn.1962,35,1966)该方法反应步骤太多,而且试剂昂贵,无实际应用价值。
2、利用Z-Ala与HOSu在DCC作用下,于20~25℃反应5h,过滤去二环己基脲,然后与未保护的Gln于碳酸氢钠的水溶液中进行合成。产物在甲醇中还原氢化,脱去保护基,即可得到丙-谷二肽。(文献Katoh,T.Kurauchi,M.Eur.Pat311,057,12Apr.1989)该方法的试剂昂贵,而且DCC反应后的产物难以除去,而且生产过程复杂。
3、利用COCl2与Ala反应生成混酐,然后与Gln在水中反应,pH保持在10.2。最后在酸溶液中脱去保护,即可得到丙-谷二肽。(文献Frerst,P.Pfaendetr,P.Ger.Offen.DE3206,784.01Sep1983)此方法的反应步骤简单,但光气为剧毒气体,而且该反应难以反应完全,对人体危害较大。
4、利用手性试剂氯代丙酸通过SOCl2活化,形成酰氯,然后与Gln在NaOH的水溶液中反应,pH保持在10。产物为氯代丙酰谷酰胺,再与液氨在一定的压力下反应,即可得到丙-谷二肽。(文献Takahiro Sano,Toru Sugaya,Process Research ang Development ofl-Alanyl-l-glutamine,a Component of Parenteral Nutrition.Oganic Process Researchand Development.2000,4,147-152)该反应的原料为手性试剂,极为昂贵,在合成酰氯步骤中,温度较高,副反应较多。该合成用于生产,成本太高。
本发明的目的在于提供一种原料便宜、合成工艺简单、设备简单、成本低、产率高、有利于环保的丙-谷二肽合成方法。
丙-谷二肽合成方法的步骤:
1)N端保护的丙氨酸(I)10mmol,与三苯基磷(Ph3P)10~30mmol,最佳15~20mmol,六氯乙烷(C2Cl6)10~30mmol,最佳15~20mmol,在有机溶剂(II)中反应20min~3h,最佳1.5~2h,反应温度-5~30℃,最佳0~10℃,形成活泼酯;
2)活泼酯与谷氨酰胺10~30mmol,最佳为15~20mmol,在有机溶剂(III)和无机碱水溶液(IV)的混合溶液中进行(III和IV的体积比值为0~4,最佳为0.5~2,)反应温度为-5~30℃,最佳为5~10℃,pH控制在8.5~13,最佳为9.5~10.5;
3)用无机酸(V)酸化至pH≤3.0,最佳为2.0~3.0,然后脱去N端保护基团(VI),可得到丙-谷二肽,产率为30%~65%。
其中,N端保护的丙氨酸(I)主要有:N-(O,O-二异丙基)磷酰氨酸(DIPP-l-Ala),N-(O,O-二乙基)磷酰丙氨酸(DEP-l-Ala),N-(O,O-二甲基)磷酰丙氨酸(DMP-l-Ala),苄氧羰基丙氨酸(Z-l-Ala),(对甲氧羰基)苄氧羰基丙氨酸(MZ-l-Ala),叔丁氧羰基丙氨酸(Boc-l-Ala),2-(二连苯基)异丙氧羰基丙氨酸(Bpoc-l-Ala),等;
有机溶剂(II)主要选自:二氯甲烷,甲苯,四氢呋喃,乙腈,1,2-二氯乙烷,等;
有机溶剂(III)主要选自:乙醇,乙酸乙酯,石油醚,环己烷,甲苯,二氯甲烷,等;
无机碱(IV)主要选自:氢氧化钠,氢氧化钾,碳酸氢钠,碳酸氢钾,碳酸钠,碳酸钾,等;
无机酸(V)主要选自:盐酸,硫酸,硝酸,磷酸,等;
脱保护基(VI)的方法主要有:三氟乙酸,氯化氢/冰乙酸,溴化氢/冰乙酸,甲基磺酸,氢化还原,氯化氢/1、4二氧六环,溴化氢/1,4二氧六环,等。
与已有的丙-谷二肽合成方法相比,本发明的主要优点是:
1)原料极为便宜,三苯基磷100g只需50元,六氯乙烷100g只需10元,而传统方法中的HOBt每100g需1500元,DCC100g需400元,HOSU每100g需700元;R-2-氯代丙酸每1g需500元;
2)合成工艺简单,中间产物(活泼酯)不需要分离和提纯处理,直接进行下一步反应,反应结束后,副产物(三苯基氧磷)在有机相,产物在水相,产物容易分离提纯;
3)第一步合成中省去了有机碱,通常有机碱易挥发,毒性大,很多有机碱容易引起二肽的消旋,而且一些有机碱难以除去,本方法在第一步合成中在酸性介质中反应,形成活泼酯,而一般这类化合物的合成都需加入三乙胺等有机碱;
4)在第二步反应中,采用了水相法,省去了谷氨酰胺氨基酸接保护基团保护和脱除保护基团,简化了合成路线,节约了成本,缩短了时间,提高了产率,节省了溶剂和试剂,对环境友好;
5)由于第二步中采用了水相法,用无机碱代替了有机碱,减少了毒性,产物二肽不容易消旋,而且产物可直接分液得到,简化了生产设备,降低了生产成本,有利于环保;
6)反应结束后,生成两个产物,其一为所需的丙-谷二肽,另一个为副产物(三苯基氧磷),三苯基氧磷为不挥发的固体,容易回收,可以作为一种试剂销售,既不污染环境,又可以创造利润;
7)整个合成过程中所采用的试剂毒性均较小。
总之,本方法合成路线简单,原料便宜易得,有利于环保,生产工艺简单,成本低,有着很好的应用价值。
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1:N-(O,O-二异丙基)磷酰丙氨酸,三苯基磷和六氯乙烷各10mmol分别加入圆底烧瓶,再加入20mL四氢呋喃,于30℃反应2h后,滴加到含有15mmol谷氨酰胺,水20mL,乙醇10mL的混合液中,反应中用氢氧化钠调pH为10.5,反应温度为-5℃,滴加后反应2h。然后用浓盐酸酸化至pH为3.0,水相浓缩后用饱和氯化氢/冰乙酸室温反应5h,反应结束后加入乙醚50mL,析出固体,将固体用乙醇-水重结晶得产物L-Ala-L-Gln。产率60%。
实施例2:三苯基磷15mmol用20mL二氯甲烷溶解,滴加到N-(O,O-二异丙基)磷酰丙氨酸10mmol,和六氯乙烷20mmol,10mL二氯甲烷的混合体系内,于10℃反应3h后,滴加到含有10mmol谷氨酰胺,水20mL,乙酸乙酯20mL的混合液中,反应中用氢氧化钠10mmol,然后用碳酸氢钠调pH为9.0,反应温度为10℃,滴加后反应1h。然后用稀硫酸酸化至pH为2.0,水相浓缩后用20%溴化氢/冰乙酸室温反应5h,反应结束后加入乙醚50mL,析出固体,将固体用甲醇-水重结晶得产物L-Ala-L-Gln。产率30%。
实施例3:六氯乙烷15mmol用10mL1,2二氯乙烷,滴加到N-(O,O-二异丙基)磷酰丙氨酸10mmol,和三苯基磷15mmol,10mL1,2二氯乙烷的混合体系内,于20℃反应。1.5h后,滴加到含有20mmol谷氨酰胺,水20mL中,反应中用氢氧化钾调pH为13,反应温度为10℃,滴加后反应2h。然后用稀硝酸酸化至pH为1.5,水相浓缩后用三氟乙酸室温反应10h,反应结束后加入乙醚50mL,析出固体,将固体用异丙醇-水重结晶得产物L-Ala-L-Gln。产率52%。
实施例4:N-(O,O-二乙基)磷酰丙氨酸10mmol,三苯基磷10mmol和六氯乙烷15mmol分别加入圆底烧瓶,再加入20mL乙腈,于15℃反应2.5h后,滴加到含有30mmol谷氨酰胺,水20mL,甲苯30mL的混合液中,反应中用碳酸钠调pH为8.5,反应温度为30℃,滴加后反应1h。然后用稀硫酸酸化至pH为2,水相浓缩后用饱和溴化氢/1,4二氧六环室温反应5h,反应结束后加入乙醚50mL,析出固体,将固体用四氢呋喃-水重结晶得产物L-Ala-L-Gln。产率50%。
实施例5:三苯基磷20mmol用10mL甲氢呋喃溶解,滴加到N-(O,O-二乙基)磷酰丙氨酸10mmol,和六氯乙烷30mmol,10mL的四氢呋喃混合体系内,于-5℃反应2h后,滴加到含有10mmol谷胺酰胺,水20mL,乙醇20mL的混合液中,反应中用氢氧化钠10mmol,然后用碳酸氢钠设pH为9.5,反应温度为-5℃,滴加后反应2h。然后用浓盐酸酸化至pH为3,水相浓缩后用饱和氯化氢/冰乙酸室温反应5h,反应结束后加入乙醚50mL,析出固体,将固体用乙醇-水重结晶得产物L-Ala-L-Gln。产率35%。
实施例6:六氯乙烷30mmol用20mL二氯甲烷溶解,滴加到N-(O,O-二乙基)磷酰丙氨酸10mmol,和三苯基磷30mmol,10mL二氯甲烷的混合体系内,于0℃反应40min后,滴加到含有30mmol谷氨酰胺,水20mL,环己烷10mL的混合液中,反应中用氢氧化钾调pH为13,反应温度为20℃,滴加后反应30min。然后用稀硝酸酸化至pH为1.5,水相浓缩后用三氟乙酸室温反应10h,反应结束后加入乙醚50mL,析出固体,将固体用1,4二氧六环-水重结晶得产物L-Ala-L-Gln。产率60%。
实施例7:N-(O,O-二甲基)磷酰丙氨酸10mmol,三苯基磷20mmol和六氯乙烷30mmol分别加入圆底烧瓶,再加入20mL甲苯,于5℃反应1h后,滴加到含有10mmol谷氨酰胺,水20mL,乙醇5mL的混合液中,反应中用碳酸钠调pH为9.5,反应温度为5℃,滴加后反应10min。然后用磷酸化至pH为1.0,水相浓缩后用三氟乙酸室温反应15h,反应结束后加入乙醚50mL,析出固体,将固体用乙醇-水重结晶得产物L-Ala-L-Gln。产率40%。
实施例8:三苯基磷30mmol用30mL四氢呋喃溶解,滴加到N-(O,O-二甲基)磷酰丙氨酸10mmol,和六氯乙烷30mmol,10mL四氢呋喃的混合体系内,于10℃反应20min后,滴加到含有30mmol谷氨酰胺,水20mL,环己烷20mL的混合液中,反应中用氢氧化钠调pH为12,反应温度为25℃,滴加后反应30min。然后用稀硝酸酸化至pH为1.5,水相浓缩后用20%溴化氢/冰乙酸室温反应5h,反应结束后加入乙醚50mL,析出固体,将固体用甲醇-水得结晶得产物L-Ala-L-Gln。产率50%。
实施例9:六氯乙烷20mmol用10mL二氯甲烷溶解,滴加到N-(O,O-二甲基)磷酰丙氨酸10mmol,和三苯基磷20mmol,20mL甲苯的混合体系内,于0℃反应3h后,滴加到含有25mmol谷胺酰胺,水20mL中,石油醚60mL,反应中用氢氧化钾20mmol,然后用碳酸钾调pH为10,反应温度为0℃,滴加后反应1.5h。然后用浓盐酸酸化至pH为2.5,水相浓缩后用甲磺酸室温反应20h,反应结束后加入乙醚50mL,析出固体,将固体用异丙醇-水重结晶得产物L-Ala-L-Gln。产率45%。
实施例10:叔丁氧羰基丙氨酸(Boc-Ala)10mmol,三苯基磷15mmol和六氯乙烷20mmol分别加入圆底烧瓶,再加入20mL1,2二氯乙烷于10℃反应20min后,滴加到含有30mmol谷氨酰胺,水20mL,环己烷20mL的混合液中,反应中用氢氧化钾调pH为11,反应温度为20℃,滴加后反应30min。然后用稀硝酸酸化至pH为1.5,水相浓缩后用三氟乙酸室温反应15h,反应结束后加入乙醚50mL,析出固体,将固体用四氢呋喃-水重结晶得产物L-Ala-L-Gln。产率40%。
实施例11:三苯基磷10mmol用10mL甲苯溶解,滴加到10mmol叔丁氧羰基丙氨酸(Boc-Ala),和六氯乙烷10mmol,20mL甲苯的混合体系内,于5℃反应2h后,滴加到含有15mmol谷氨酰胺,水20mL,石油醚60mL的混合液中,反应中用氢氧化钠调pH为12,反应温度为10℃,滴加后反应1.5h。然后用稀硫酸酸化至pH为1.5,水相浓缩后用氯化氢/1,4-氧六环室温反应5h。反应结束后加入乙醚50mL,析出固体,将固体用1,4二氧六环-水重结晶得产物L-Ala-L-Gln。产率52%。
实施例12:六氯乙烷20mmol用10mL四氢呋喃溶解,滴加到叔丁氧基丙氨酸(Boc-Ala)10mmol,和三苯基磷20mmol,10mL四氢呋喃的混合体系内,于0℃反应1.5h后,滴加到含有20mmol谷氨酰胺,水20mL中,二氯甲烷15mL,反应中用氢氧化钾20mmol,然后用碳酸钠调pH为10,反应温度为8℃,滴加后反应2h,然后用浓盐酸酸化至pH为2.0,水相浓缩后甲磺酸室温反应20h,反应结束后加入乙醚50mL,析出固体,将固体用甲醇-水重结晶得产物L-Ala-L-Gln。产率45%。
实施例13:苄氧羰基丙氨酸(Z-Ala)10mmol,三苯基磷10mmol和六氯乙烷10mmol分别加入圆底烧瓶,再加入30mL甲苯,于0℃反应3h后,滴加到含有25mmol谷氨酰胺,水20mL的混合液中,反应中用氢氧化钠调pH为12,反应温度为15℃,滴加后反应1.5h。然后用稀盐酸酸化至pH为2.5,水相浓缩后用氢气在甲醇中室温反应15h,得产物L-Ala-L-Gln。产率48%。
实施例14:三苯基磷15mmol用10mL四氢呋喃溶解,滴加到10mmol苄氧羰基丙氨酸(Z-Ala),和六氯乙烷20mmol,10mL四氢呋喃的混合体系内,于0℃反应1.5h后,滴加到含有18mmol谷氨酰胺,水20mL,二氯甲烷40mL的混合液中,反应中用氢氧化钾调pH为13,反应温度为0℃,滴加后反应2h。然后用稀硫酸酸化至pH为2.0,水相浓缩后氢气在甲醇室温反应15h,得产物L-Ala-L-Gln。产率65%。
实施例15:六氯乙烷30mmol用10mL乙腈溶解,滴加到苄氧羰基丙氨酸(Z-Ala)10mmol,和三苯基磷20mmol,10mL乙腈的混合体系内,于5℃反应1.0h后,滴加到含有10mmol谷按酰胺,水20mL中,反应中用氢氧化钠20mmol,然后用碳酸氢钾调pH为10,反应温度为5℃,滴加后反应2h。然后用浓盐酸酸化至pH为3.0,水相浓缩后用三氟乙酸室温反应40h,反应结束后加入乙醚50mL,析出固体,将固体用1,4二氧六环-水重结晶得产物L-Ala-L-Gln。产率45%。
实施例16:六氯乙烷30mmol用10mL乙腈溶解,滴加到苄氧羰基丙氨酸(Z-Ala)10mmol,和三苯基磷20mmol,10mL乙腈的混合体系内,于10℃反应2h后,滴加到含有15mmol缬氨酸,水20mL中,用碳酸氢钠调pH为9.5,反应温度为10℃,滴加后反应20min。然后用盐酸调至pH为2.5,浓缩后用氢气脱保护基,得丙-缬二肽,产率60%。
实施例17:三苯基磷10mmol,N-(O,O-二乙基)磷酰苯丙氨酸10mmol,六氯乙烷13mmol,加入20mL四氢呋喃,于10℃反应1h后,滴加到15mmol亮氨酸中,反应用氢氧化钠调pH为11,反应温度为5℃,滴加后,反应1h,然后用稀硫酸酸化至pH为2.0,浓缩后,用氯化氢/1,4-二氧六环脱保护,析出固体,将固体用乙醇-水重结晶,得产物苯-亮二肽,产率50%。
Claims (8)
1、丙-谷二肽合成方法,其特征在于1)N端保护的丙氨酸10mmol,与三苯基磷10~30mmol,六氯乙烷10~30mmol,在有机溶剂中反应20min~3h,反应温度-5~30℃,形成活泼酯;
2)活泼酯与谷氨酰胺10~30mmol,在有机溶剂和无机碱水溶液的混合溶液中进行,有机溶剂和无机碱水溶液的体积比值为0~4,反应温度为-5~30℃,pH控制在8.5~13;
3)用无机酸酸化至pH≤3.0,然后脱去N端保护基团,可得到丙-谷二肽。
2、如权利要求1所述的丙-谷二肽合成方法,其特征在于1)N端保护的丙氨酸10mmol,与三苯基磷15~20mmol,六氯乙烷15~20mmol,在有机溶剂中反应1.5~2h,反应温度0~10℃,形成活泼酯;
2)活泼酯与谷氨酰胺15~20mmol,在有机溶剂和无机碱水溶液的混合溶液中进行,有机溶剂和无机碱水溶液的体积比值为0.5~2,反应温度为5~10℃,pH控制在9.5~10.5;
3)用无机酸酸化至pH为2.0~3.0,然后脱去N端保护基团,可得到丙-谷二肽。
3、如权利要求1所述的丙-谷二肽合成方法,其特征在于N端保护的丙氨酸有:N-(O,O-二异丙基)磷酰氨酸(DIPP-1-Ala),N-(O,O-二乙基)磷酰丙氨酸(DEP-1-Ala),N-(O,O-二甲基)磷酰丙氨酸(DMP-1-Ala),苄氧羰基丙氨酸(Z-1-Ala),(对甲氧羰基)苄氧羰基丙氨酸(MZ-1-Ala),叔丁氧羰基丙氨酸(Boc-1-Ala),2-(二连苯基)异丙氧羰基丙氨酸(Bpoc-1-Ala)。
4、如权利要求1所述的丙-谷二肽合成方法,其特征在于在步骤1)中的有机溶剂选自:二氯甲烷,甲苯,四氢呋喃,乙腈或1,2-二氯乙烷。
5、如权利要求1所述的丙-谷二肽合成方法,其特征在于在步骤2)中的有机溶剂选自:乙醇,乙酸乙酯,石油醚,环己烷,甲苯或二氯甲烷。
6、如权利要求1所述的丙-谷二肽合成方法,其特征在于在步骤2)中的无机碱选自:氢氧化钠,氢氧化钾,碳酸氢钠,碳酸氢钾,碳酸钠或碳酸钾。
7、如权利要求1所述的丙-谷二肽合成方法,其特征在于在步骤2)中的无机酸选自:盐酸,硫酸,硝酸或磷酸。
8、如权利要求1所述的丙-谷二肽合成方法,其特征在于脱保护基的有:三氟乙酸,氯化氢/冰乙酸,溴化氢/冰乙酸,甲基磺酸,氢化还原,氯化氢/1、4二氧六环,溴化氢/1,4二氧六环。
Priority Applications (6)
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