ES2908806T3 - Gen que codifica la enzima biosintética del dipéptido de alanil-glutamina y aplicación del mismo - Google Patents

Gen que codifica la enzima biosintética del dipéptido de alanil-glutamina y aplicación del mismo Download PDF

Info

Publication number
ES2908806T3
ES2908806T3 ES17888980T ES17888980T ES2908806T3 ES 2908806 T3 ES2908806 T3 ES 2908806T3 ES 17888980 T ES17888980 T ES 17888980T ES 17888980 T ES17888980 T ES 17888980T ES 2908806 T3 ES2908806 T3 ES 2908806T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
recombinant
reaction
alanyl
saccharomyces cerevisiae
glutamine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES17888980T
Other languages
English (en)
Inventor
Wenjie Yuan
Chao Fan
Yimin Li
Hao Hong
Wenzhong Wu
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Innobio Corp Ltd
Original Assignee
Innobio Corp Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from CN201611254240.XA external-priority patent/CN106754447B/zh
Priority claimed from CN201611254213.2A external-priority patent/CN106754985B/zh
Application filed by Innobio Corp Ltd filed Critical Innobio Corp Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2908806T3 publication Critical patent/ES2908806T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Gen que codifica la enzima biosintética del dipéptido alanil-glutamina, en el que la secuencia de nucleótidos codificante es tal como se muestra en la SEQ ID NO.1.

Description

DESCRIPCIÓN
Gen que codifica la enzima biosintética del dipéptido de alanil-glutamina y aplicación del mismo
Campo Técnico
[0001] La presente invención se refiere a un procedimiento de biosíntesis del dipéptido alanil-glutamina que pertenece al campo biotecnológico.
Antecedentes de la Técnica
[0002] El dipéptido alanil-glutamina (L-Ala-Gln), también conocido como N (2)- L-alanil-L-glutamina, tiene las ventajas de alta solubilidad, solubilidad en agua y alta solubilidad térmica, de manera que ha sustituido de manera gradual la glutamina (L-Gln) para convertirse en un fármaco principal para nutrición parenteral.
[0003] Actualmente, la síntesis del dipéptido alanil-glutamina adopta principalmente procedimientos de síntesis química y catálisis con enzimas biológicas. La síntesis química del dipéptido alanil-glutamina incluye un conjunto de etapas de reacción, con muchos subproductos, alta toxicidad de reactivos e incompatibilidad medioambiental (Tang Guo. Study on synthesis and reaction of N(2)-L-alanyl -L- glutamine dipeptide, Universidad de Xiamen, 2004; Patente china, procedimiento de síntesis del dipéptido alanil-glutamina, CN1392156A).
[0004] Sin embargo, el procedimiento de catálisis con enzimas biológicas también tiene deficiencias, tales como alta cantidad de enzimas, baja productividad de péptido y solamente una parte de aminoácidos hidrofóbicos superiores sintetizados, etc. Los documentos CN104480075A y CN105274174A dan a conocer dos procedimientos para sintetizar el dipéptido alanil-glutamina a través de la catalización de enzimas biológicas, y se utiliza un polvo liofilizado de enzimas biológicas o un tampón de enzimas biológicas para la reacción catalítica en las invenciones, sin embargo, debido al alto coste para la separación de enzimas y purificación y la dificultad en el reciclaje y la reutilización después de las reacciones, no es adecuado para la producción industrial actual. Algunos investigadores han desarrollado una aminoácido ligasa (Lal) a partir de Bacillus subtilis que podría sintetizar un dipéptido utilizando un aminoácido desprotegido como sustrato (documento CN1671840A). Pero la enzima pertenece a una enzima dependiente de ATP y necesita proporcionar ATP de forma exógena, de manera que el procedimiento tiene un coste de producción alto y es incapaz de utilizarlo extensamente en los mercados (Fermentative production of L-alanyl-L- glutamine by a metabolically engineered Escherichia coli strain expressing L-amino acid a-ligase. Applied and environmental microbiology, 2007, 73(20): 6378-6385.
Características de la invención
[0005] Un objetivo de la presente invención es proporcionar una solución técnica completa para producir el dipéptido alanil-glutamina a través de biotransformación. Al buscar genes exógenos excelentes que codifican la sintasa del dipéptido alanil-glutamina, se espera construir bacterias modificadas recombinantes mediante modificación genética y diseñar un programa de modificación por biofermentación razonable para conseguir una producción industrial verde, eficiente y de bajo coste del dipéptido alanil-glutamina.
[0006] Para alcanzar el objetivo anterior, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un gen que codifica la enzima biosintética del dipéptido alanil-glutamina de acuerdo con la reivindicación 1.
[0007] En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una enzima biosintética del dipéptido alanilglutamina de acuerdo con la reivindicación 2.
[0008] El gen que codifica la enzima biosintética del dipéptido alanil-glutamina tiene una capacidad excelente para estimular la conversión de sustrato en el dipéptido alanil-glutamina. Además, en la presente invención, el gen se utiliza como un gen exógeno para construir un plásmido recombinante y una cepa modificada recombinante a través de modificación microbiana y, además, el microorganismo recombinante se utiliza para catalizar directamente la síntesis del dipéptido alanil-glutamina en el sistema de fermentación para potenciar la eficiencia de conversión del dipéptido alanil-glutamina y resolver las deficiencias en la modificación de biotransformación, tal como la separación y purificación difícil de enzimas, actividad enzimática inestable y alto coste.
[0009] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una Escherichia coli recombinante de acuerdo con la reivindicación 3, y en un aspecto correspondiente, la presente invención proporciona un procedimiento biosintético del dipéptido alanil-glutamina de acuerdo con la reivindicación 4. La Escherichia coli recombinante dada a conocer en la presente invención se obtiene transfiriendo una secuencia de nucleótidos, tal como se muestra en la SEQ ID NO.
1, en Escherichia coli. El procedimiento de biosíntesis del dipéptido alanil-glutamina basado en la Escherichia coli recombinante comprende una etapa de transformación de un sustrato utilizando Escherichia coli recombinante.
[0010] En otro aspecto, la presente invención proporciona una Saccharomyces cerevisiae recombinante de acuerdo con la reivindicación 9.
[0011] La Saccharomyces cerevisiae recombinante preparada utilizando el procedimiento anterior puede utilizarse como un biocatalizador de célula completa para transformar de manera eficiente y rápida un sustrato en un dipéptido alanil-glutamina sin requerimiento de una etapa de separación y purificación de enzimas. Basándose en esto, es otro objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento de biosíntesis del dipéptido alanil-glutamina, que comprende la etapa de transformación de un sustrato utilizando la Saccharomyces cerevisiae recombinante anterior de la presente invención.
[0012] Además, basándose en la Saccharomyces cerevisiae recombinante proporcionada, la presente invención da a conocer una Saccharomyces cerevisiae recombinante que tiene la capacidad de autofloculación, y, en un aspecto adicional de la presente invención, proporciona un procedimiento de biosíntesis del dipéptido alanil-glutamina de acuerdo con la reivindicación 11.
[0013] Diferentes realizaciones y mejorías de los aspectos mencionados anteriores de la invención se proporcionan en las reivindicaciones dependientes.
[0014] En resumen, en la presente invención, se construyen satisfactoriamente Escherichia coli recombinante y Saccharomyces cerevisiae recombinante por la transesterasa descubierta recientemente y el gen que codifica la enzima a través de modificación microbiana y modificación genética de enzimas para transformar sustrato en dipéptido alanil-glutamina mediante un biocatalizador de célula completa, que omite las etapas de separación y purificación de enzimas. Tiene características de índice de conversión molar alto, velocidad de producción rápida y reciclaje repetido de las bacterias, así que es una buena elección para una producción eficiente, respetuosa con el medio ambiente y económica del dipéptido alanil-glutamina. Adicionalmente, a través del proceso de reciclaje, se espera reducir el coste de producción industrial, resolver los problemas de recuperación difícil de enzimas, tasa de utilización baja y actividad enzimática inestable, etc.
[0015] Sin importar qué procedimiento se utiliza para la producción del dipéptido alanil-glutamina en la presente invención, se pueden lograr los siguientes efectos técnicos: primero, los materiales brutos experimentales son económicos y están disponibles fácilmente, el material es fácil de manipular y controlar, la ruta de síntesis catalítica de célula completa es fácil y respetuosa con el medio ambiente, y la etapa de separación y purificación enzimática se omite, reduciendo el consumo de energía y el coste de producción; segundo, la velocidad de reacción es rápida, el tiempo de reacción es corto, el índice de conversión molar es alto, la solución de reacción centrífuga puede terminar la reacción, la enzima puede desactivarse sin calentamiento evitando las reacciones tóxicas de glutamina causadas por temperatura alta; tercero, las células bacterianas se reciclan, reduciendo el número de cultivos bacterianos, ahorrando el coste de preparación de enzimas biológicas y la desactivación por calentamiento, acortando el ciclo de reacción del dipéptido alanil-glutamina y aumentando la intensidad de producción, con competitividad de mercado obvia, de este modo, es más adecuado para la producción industrial del dipéptido alanil-glutamina.
Breve descripción de los dibujos
[0016] Las 12 figuras adjuntas de la presente invención:
La Figura 1 es un diagrama esquemático que muestra la estructura de un vector de expresión recombinante para Escherichia coli recombinante.
La Figura 2 es un gráfico que muestra la actividad enzimática relativa de una Escherichia coli recombinante con la temperatura de reacción.
La Figura 3 es un gráfico que muestra el cambio de la actividad enzimática relativa de una Escherichia coli recombinante con el número de veces de reciclaje.
La Figura 4 es un diagrama esquemático que muestra la estructura de un vector de expresión recombinante para Saccharomyces cerevisiae recombinante.
La Figura 5 es un mapa de verificación fluorescente y con láser confocal de una bioenzima sobre la superficie de células de Saccharomyces cerevisiae recombinante.
La Figura 6 es un gráfico que muestra el efecto de concentraciones de sustrato diferentes sobre la síntesis catalítica de célula completa de dipéptido alanil-glutamina por Saccharomyces cerevisiae recombinante.
La Figura 7 es un gráfico que muestra la actividad enzimática relativa del dipéptido alanil-glutamina catalizado por la Saccharomyces cerevisiae con la temperatura de reacción.
La Figura 8 es un gráfico que muestra la actividad enzimática relativa del dipéptido alanil-glutamina catalizada por la Saccharomyces cerevisiae con el valor pH de reacción.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
[0017] La presente invención confirma primero que se obtiene un gen que codifica la enzima biosintética del dipéptido alanil-glutamina que tiene una secuencia de nucleótidos, tal como se muestra en SEQ ID NO.1. El donante de este gen es un microorganismo que pertenece al género Sphingobacterium, y más específicamente, Sphingobacterium siyangensis.
[0018] Una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia genética de SEQ ID NO.1 se muestra en la SEQ ID NO. 2. La secuencia de aminoácidos consiste en 619 aminoácidos. En comparación con la técnica anterior más próxima (ZL03817916.4), existen cambios de tres aminoácidos: el aminoácido en la posición 188 se cambia de Y (tirosina) a F (fenilalanina), ambos son aminoácidos aromáticos, convertidos de un aminoácido basado en R polar no cargado a un aminoácido basado en R no polar; aminoácido 546/547: cambiado de AP (alanina/ prolina) a PS (prolina /serina), que se convierte de un aminoácido neutro/aminoácido heterocíclico a un aminoácido heterocíclico/aminoácido que contiene hidroxilo, y también se convierte de un aminoácido basado en R no polar a un aminoácido basado en R polar no cargado. El análisis adicional del dominio funcional de enzimas muestra que la transesterasa tiene principalmente dos dominios funcionales: Peptidasa S15 (44-331) y PepX_C (382-613). Entre estos, el dominio de Peptidasa S15 (44-331) pertenece a X-Prodipeptidil-peptidasa (familia S15), que es un centro catalítico clave de potencial transesterasa; mientras que el dominio de PepX C (382-613) pertenece a un dominio no catalítico C-terminal, pero tiene muchas estructuras similares a la dipeptidil peptidasa (la exonucleasa del péptido de serina de la familia de proteínas S9B). Aunque sus funciones fisiológicas necesitan investigación adicional, se pueden obtener dos mensajes a partir de la técnica anterior: la dimerización de la proteína es esencial para la actividad catalítica de la enzima; la glicosilación de la enzima puede afectar a su función fisiológica. En la presente invención, la mutación de aminoácido en la posición 188 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0.2 puede cambiar el dominio catalítico de la enzima; y la mutación de aminoácido en la posición 546/547 puede cambiar la dimerización de proteína y afectar a la actividad catalítica de la enzima a través de las mismas.
[0019] En la presente información, después de que se determine la información del gen de enzima biológica, posteriormente se amplifican y se conservan los plásmidos. Específicamente, los plásmidos se amplifican y se conservan utilizando Escherichia coli Dh5a.
[0020] Basándose en esto, en la presente invención, se construyen un vector recombinante para diferentes microorganismos recombinantes y un microorganismo recombinante utilizando plásmidos que utilizan el plásmido anterior que contiene el gen exógeno y un procedimiento para producir el dipéptido alanil-glutamina mediante un procedimiento de fermentación que utiliza un microorganismo recombinante.
[0021] Una de las vías específicas para la aplicación de genes exógenos sirve para construir Escherichia coli recombinante utilizada para la biosíntesis del dipéptido alanil-glutamina.
[0022] Después de la digestión del gen diana y el vector de expresión, se construye de manera recombinante un vector recombinante para Escherichia coli recombinante y un vector preferido es pET29a.
[0023] El vector recombinante construido se puede transformar en una célula huésped de expresión mediante un procedimiento en la técnica anterior para construir una bacteria biomodificada que contiene el gen diana y dicho procedimiento puede ejemplificarse, pero no está limitado a, un procedimiento de choque térmico. El huésped de expresión seleccionado en la presente invención es Escherichia coli, que incluye todas las Escherichia coli que se pueden utilizar como un huésped de transformación de acuerdo con la técnica anterior y, preferiblemente, pero no limitado a, Escherichia coli Bl21 (DE3).
[0024] La presente invención proporciona un procedimiento de biosíntesis para la síntesis del dipéptido alanilglutamina basado en Escherichia coli recombinante. En el procedimiento, como mínimo se incluye un proceso de producción de fermentación por Escherichia coli recombinante obtenida a partir del procedimiento anterior de acuerdo con la técnica anterior, que implica una etapa de transformación de un sustrato por la Escherichia coli recombinante.
[0025] En la biosíntesis del dipéptido alanil-glutamina, el sustrato puede describirse como sustrato que comprende un componente de carboxilo y un componente de amina de acuerdo con la técnica anterior. En la presente invención, el componente de carboxilo se selecciona del grupo que consiste en ésteres de aminoácidos y amidas de aminoácidos, lo más preferiblemente, clorhidrato de éster metílico de L-alanina; el componente de amina se selecciona del grupo que consiste en aminoácidos, aminoácidos protegidos con C y aminas, lo más preferiblemente L-glutamina. La concentración del sustrato en el sistema de reacción se establece de acuerdo con la relación de reactivos de la reacción proporcionales para facilitar especialmente la producción. La concentración en la reacción del sustrato no tiene límites superiores e inferiores. Sin embargo, la concentración más alta de reactivo se determina hasta un cierto grado mediante la solubilidad del sustrato de reacción en el sistema, y a medida que la concentración del sustrato de reacción aumenta, existe un cierto grado de inhibición de conversión. En realizaciones más detalladas, la solubilidad máxima de glutamina es de aproximadamente 250 mM, pero podemos establecer la cantidad de reactivos en la producción de acuerdo con un estándar por encima de la misma, por ejemplo, se utiliza 600 mM. En ese momento, una parte del sistema de reacción original se encuentra en un estado sólido insoluble, pero a medida que la reacción continúa, puede disolverse gradualmente sin afectar el progreso de la reacción de transformación. Por consiguiente, el procedimiento de alimentación, por un lado, asegura el progreso fluido de la reacción, y, por otro lado, reduce el coste de la operación. En un modo de operación que se puede llevar a cabo, en la presente invención, las concentraciones del componente de carboxilo y el componente de amina en el sistema de reacción inicial pueden establecerse de 50 a 600 mM.
[0026] En otro aspecto de la presente invención, en el procedimiento para sintetizar el dipéptido alanil-glutamina a través de la conversión biológica de Escherichia coli recombinante, el pH del sistema de reacción de conversión es de 8,0 a 10,0, preferiblemente de 8,0 a 9,0.
[0027] En otro aspecto adicional de la presente invención, en el procedimiento para sintetizar el dipéptido alanilglutamina a través de la conversión biológica de Escherichia coli recombinante, la cantidad de Escherichia coli recombinante en el sistema de reacción de conversión es de DO 600 (sistema) = 0,5 - 5,0.
[0028] De acuerdo con los resultados de optimización, una de las realizaciones más específicas del procedimiento de biosíntesis anterior del dipéptido alanil-glutamina utilizando Escherichia coli recombinante puede describirse como un procedimiento que comprende las siguientes etapas:
(1) disolver el sustrato de clorhidrato de éster metílico de L-alanina (L-Ala-OMe) y L-glutamina (L-Gln) en una solución tampón, y ajustar el pH hasta 8,0 -10,0;
(2) añadir la Escherichia coli recombinante a un sistema obtenido en la etapa (1) para reaccionar, con la temperatura de reacción de 15 a 40 °C, y el pH del sistema de reacción de 8,0 a 10,0;
(3) recoger la solución de reacción y centrifugar para separar células bacterianas y terminar la reacción en el punto final de reacción, cuando el pH no disminuye más.
[0029] En la realización detallada, la ruta biosintética del dipéptido alanil-glutamina de la presente invención puede describirse simplemente como:
Figure imgf000005_0001
[0030] En la descripción del procedimiento anterior, por un lado, la solución tampón que se describe en la etapa (1) puede determinarse por los expertos en la técnica de acurdo con la técnica anterior, preferiblemente, pero no se limita a, tampón borato; y en la etapa (1), preferiblemente, el pH del sistema de regulación de álcali es de 8,0 a 9,0. Por otro lado, la temperatura de reacción descrita en la etapa (2) es preferiblemente de 25 °C. Naturalmente, las fluctuaciones de temperatura dentro de un intervalo determinado causadas por la medición o error de control admisible también son aceptables; el pH del sistema de reacción en la etapa es todavía preferiblemente de 8,0 - 9,0.
[0031] Basándose en el procedimiento de biosíntesis descrito anteriormente del dipéptido alanil-glutamina utilizando Escherichia coli recombinante, se utilizan células completas para la producción en el sistema sintetizado por la reacción catalítica, la Escherichia coli recombinante puede separarse físicamente para terminar la reacción cuando la reacción continúa hasta un grado adecuado, y la Escherichia coli recombinante separada puede utilizarse como una bacteria modificada para añadirse al sistema de reacción de biotransformación para el reciclaje, por lo tanto, en la realización más importante del procedimiento, se incluye adicionalmente una etapa de reciclaje de las células bacterianas. Es decir, las células bacterianas separadas después de la terminación de las reacciones en la etapa (3) se añaden a un nuevo sistema de reacción para reciclaje.
[0032] En las siguientes realizaciones, el contenido y el modo preferido de la presente invención se explicarán más a fondo y de manera específica. En la realización específica, el procedimiento de biosíntesis del dipéptido alanilglutamina comprende las siguientes etapas:
(1) construir una Escherichia coli recombinante;
clonar un gen diana con secuencia de nucleótidos tal como SEQ ID NO.1, construir un vector recombinante que comprende el gen utilizando el vector de expresión ET29a, y transformar el vector recombinante en un huésped de expresión Escherichia coli BL21 (DE3) mediante un procedimiento de choque térmico;
(2) conservar los transformantes positivos obtenidos mediante cribado de gen de resistencia, PCR y etapa (1) de verificación por enzimas de restricción en un medio de suspensión (slant);
El medio de suspensión: polvo de extracto de levadura 5 g/l, triptona 10 g/l, NaCl 10 g/l, polvo de agar 20 g/l, esterilizar a 121° C durante 15 minutos, después del enfriamiento, añadir kanamicina con una concentración final de 10~100 ug/ml;
(3) transferir Escherichia coli recombinante activada a un medio de cultivo de semillas a 37° C, 200 rpm durante la noche, e inocularla en el medio de fermentación a una dosis inoculada determinada para el cultivo de amplificación; añadir isopropil tiogalactósido (IPTG) a una concentración final de 0,2 hasta 2,0 mM durante la noche para inducir un cultivo a una temperatura baja, donde la DO600 de la célula = 0,4 a 1,0;
El medio de cultivo para siembra y el medio de fermentación: polvo de extracto de levadura 5 g/l, triptona 10 g/l, NaCl 10 g/l, esterilizar a 121 °C durante 15 minutos, después del enfriamiento, añadir kanamicina a una concentración final de 10~100 ug/ml;
(4) La biosíntesis del dipéptido alanil-glutamina: disolver el sustrato de clorhidrato de éster metílico de L-alanina (L- Ala-OMe) y L- glutamina (L- Gln) en una solución tampón (la concentración de sustrato y el tipo de tampón tal como se reivindican en la reivindicación 5), añadir el cultivo de la etapa (3), y ajustar el pH a 8,0-9,0, hacer reaccionar el sistema a 25 ± 1 °C, hasta que el valor de pH no disminuye más como el punto final de la reacción y recoger la solución de reacción para centrifugar y separar las células bacterianas;
(5) añadir las células bacterianas obtenidas en la etapa (4) a un nuevo sistema de reacción para reciclar la producción del dipéptido alanil-glutamina.
[0033] El segundo procedimiento específico para la aplicación de genes exógenos es para construir Saccharomyces cerevisiae recombinante y utilizarla para la biosíntesis del dipéptido alanil-glutamina.
[0034] Basándose en el plásmido conservado que contiene el gen exógeno de SEQ ID NO.1, el gen diana y el vector de expresión se digieren y se construyen de manera recombinante como un vector recombinante para Saccharomyces cerevisiae recombinante, y el vector preferido es pYD1. El vector recombinante se transforma a continuación en Escherichia coli Dh5a mediante procedimientos particulares, pero no limitados a, un procedimiento de choque térmico. A continuación, los transformantes obtenidos en las etapas anteriores se verifican mediante el cribado del gen de resistencia a ampicilina, PCR y digestión con enzimas de restricción y se conservan en un medio de suspensión (“slant”). Para obtener la Saccharomyces cerevisiae recombinante deseada, el vector de expresión recombinante ii se extrae adicionalmente y se transforma en células competentes de Saccharomyces cerevisiae para obtener un transformante positivo mediante cribado de tipo deficiente. El transformante positivo se activa y se inocula en el medio de cultivo de semillas. Cuando las células bacterianas crecen hasta DO620 = 0,5 ~5,0, las células bacterianas se transfieren al medio de inducción para obtener una Saccharomyces cerevisiae recombinante. En principio, las células competentes de Saccharomyces cerevisiae anteriores incluyen todas las células competentes de Saccharomyces cerevisiae que pueden utilizarse como huéspedes de transformación de acuerdo con la técnica anterior. En la realización particular, el huésped de expresión es Saccharomyces cerevisiae EBY100. Una de las razones importantes para la selección de este huésped es que se puede utilizar una tecnología de expresión en la superficie celular de levadura para fusionar la proteína transesterasa con la proteína de pared celular de levadura y anclarla a la superficie celular en forma de una conformación nativa, que es equivalente a la inmovilización de la enzima. En comparación con el resto de la expresión en huéspedes, la enzima de expresión es fácil de preparar y se omiten las etapas de separación y purificación enzimática e inmovilización, lo que ayuda a reducir el coste de producción de la preparación de la enzima. En comparación con las enzimas intracelulares, la enzima de expresión no tiene resistencia transmembrana de sustrato y producto, y no existe degradación del producto catalítico del dipéptido alanil-glutamina por hidrolasa intracelular.
[0035] A menos que se especifique lo contrario, el medio de cultivo inclinado descrito en la presente invención se prepara de la siguiente manera: polvo de extracto de levadura 5,0 g/l, triptona 10,0 g/l, NaCl 10,0 g/l, polvo de agar 20,0 g/l, esterilizar a 121 °C durante 15 minutos, y después del enfriamiento, se añade ampicilina a una concentración final de 10 a 100 ug/ml.
[0036] El medio de cultivo de semillas se prepara de la siguiente manera: en 82 ml de agua ultrapura, añadir 0,67 g de fuente de nitrógeno de levadura libre de amino; si se prepara un medio de cultivo sólido, añadir 3,0 g/l de polvo de agar, esterilizar durante 15 minutos a 121 °C; después de la esterilización, añadir 10 ml de mezcla de aminoácidos, 1 ml de leucina (6,0 g/l), 1 ml de histidina (2,0 g/l), 1 ml de treonina (20,0 g/l), y 5 ml de glucosa al 40 % en peso;
[0037] El medio de inducción se prepara de la siguiente manera: en 82ml de agua ultrapura, añadir 0,67 g de fuente de nitrógeno de levadura libre de amino; después de la esterilización, añadir 10ml de mezcla de aminoácidos, 1ml de leucina (6,0 g/l), 1 ml de histidina (2,0 g/l), 1 ml de treonina (20,0 g/l) y 5 ml de glucosa al 40 % en peso;
[0038] La mezcla de aminoácidos descrita en la preparación del medio de cultivo para siembra e inducción anterior contiene los siguientes componentes: arginina 0,2 g/l, ácido aspártico 1,0 g/l, ácido glutámico 1,0 g/l, isoleucina 0,3 g/l, lisina 0,3 g/l, valina 1,5 g/l, metionina 0,2 g/l, fenilalanina 0,5 g/l, serina 3,75 g/l, tirosina 0,3 g/l y adenina 0,4 g/l.
[0039] Basándose en la Saccharomyces cerevisiae recombinante construida, la presente invención proporciona adicionalmente un procedimiento de biosíntesis del dipéptido alanil-glutamina, que comprende la etapa de transformación de un sustrato utilizando la Saccharomyces cerevisiae recombinante descrita anteriormente de la presente invención.
[0040] En la biosíntesis del dipéptido alanil-glutamina utilizando la Saccharomyces cerevisiae recombinante, el sustrato de la misma puede describirse como un sustrato que comprende un componente de carboxilo y un componente de amina de acuerdo con la técnica anterior. En la presente invención, el componente de carboxilo se selecciona del grupo que consiste en ésteres de aminoácidos y amidas de aminoácidos, lo más preferiblemente, clorhidrato de éster metílico de L-alanina; el componente de amina se selecciona del grupo que consiste en aminoácidos, aminoácidos protegidos en C y aminas, preferiblemente L-glutamina. La concentración del sustrato en el sistema de reacción se establece de acuerdo con la relación de reactivos de la reacción proporcionales para facilitar especialmente la producción. La concentración en la reacción del sustrato no tiene límites superiores e inferiores. Sin embargo, la concentración más alta de reactivo se determina hasta un cierto grado mediante la solubilidad del sustrato de reacción en el sistema, y a medida que la concentración del sustrato de reacción aumenta, existe un cierto grado de inhibición de conversión. En esta realización detallada, la solubilidad máxima de glutamina es de aproximadamente 250 mM, pero podemos establecer la cantidad de reactivos en la producción de acuerdo con un estándar por encima de la misma, por ejemplo, se utiliza 600 mM. En ese momento, una parte del sistema de reacción original se encuentra en un estado sólido insoluble, pero a medida que la reacción continúa, puede disolverse gradualmente sin afectar el progreso de la reacción de transformación. Por consiguiente, el procedimiento de alimentación, por un lado, asegura el progreso fluido de la reacción, y, por otro lado, reduce el coste de la operación. En un modo de operación que se puede llevar a cabo, las concentraciones del componente de carboxilo y el componente de amina en el sistema de reacción inicial pueden establecerse de 100 a 600 mM.
[0041] En otro aspecto de la presente invención, el procedimiento para sintetizar el dipéptido alanil-glutamina utilizando Saccharomyces cerevisiae recombinante, el pH del sistema de reacción de conversión es de 6,0 a 10,0, preferiblemente de 8,0 a 9,0. La temperatura de la reacción de conversión es de 10 a 40 ° C, preferiblemente de 18 a 25 °C, y lo más preferiblemente de 20 a 25 °C.
[0042] En otro aspecto de la presente invención, en el procedimiento para sintetizar el dipéptido alanil-glutamina utilizando Saccharomyces cerevisiae recombinante, la cantidad de Saccharomyces cerevisiae recombinante que se utiliza en el sistema de reacción de conversión es DO 600 = 0,5 - 5,0.
[0043] De acuerdo con los resultados de optimización, una de las realizaciones más específicas del procedimiento de biosíntesis anterior del dipéptido alanil-glutamina utilizando Saccharomyces cerevisiae recombinante puede describirse como un procedimiento que comprende las siguientes etapas:
(1) disolver el sustrato de clorhidrato de éster metílico de L-alanina (L-Ala-OMe) y L-glutamina (L-Gln) en una solución de disolvente, y ajustar el pH a 8,0 ~ 9,0;
(2) añadir la Saccharomyces cerevisiae recombinante a un sistema obtenido en la etapa (1) para reaccionar, con la temperatura de reacción de 10 a 40 °C, y el pH del sistema de reacción de 8,0 a 9,0;
(3) recoger la solución de reacción para separar bacterias y terminar la reacción en el punto final de reacción, cuando el pH ya no disminuye más.
[0044] En una realización particular, la ruta biosintética del dipéptido alanil-glutamina de la presente invención puede simplemente describirse como:
Figure imgf000007_0001
[0045] En la descripción del procedimiento anterior, por un lado, la solución tampón que se describe en la etapa (1) puede determinarse por los expertos en la técnica de acuerdo con la técnica anterior, el sistema de disolventes puede ser agua, un tampón fosfato o un tampón borato, preferiblemente, un tampón fosfato; y en la etapa (1), preferiblemente el pH de sistema de regulación de álcali es de 8,0 a 9,0. Por otro lado, la temperatura de reacción descrita en la etapa (2) es preferiblemente de 18 a 25 °C, lo más preferiblemente de 20 a 25 °C. Naturalmente, las fluctuaciones de temperatura dentro de un intervalo determinado causadas por la medición o error de control admisible también son aceptables; el pH del sistema de reacción en la etapa es todavía preferiblemente de 8,0-9,0.
[0046] Basándose en el procedimiento de biosíntesis descrito anteriormente del dipéptido alanil-glutamina utilizando Saccharomyces cerevisiae recombinante, se utilizan células completas para la producción en el sistema sintetizado mediante la reacción catalítica, la Saccharomyces cerevisiae recombinante puede separarse físicamente para terminar la reacción cuando la reacción continúa hasta un grado adecuado, y la Saccharomyces cerevisiae recombinante separada puede utilizarse como bacterias modificadas para añadirse al sistema de reacción de biotransformación para el reciclaje, por lo tanto, en una realización más importante del procedimiento, se incluye adicionalmente una etapa de reciclaje de las células bacterianas. Es decir, las células bacterianas separadas después de la terminación de reacciones en la etapa (3) se añaden a un nuevo sistema de reacción para reciclaje.
[0047] En realizaciones particulares, debido a las características de autosedimentación de Saccharomyces cerevisiae en el sistema de fermentación, al final de la reacción de transformación, el sistema se deja en reposo, y las células de Saccharomyces cerevisiae recombinante pueden extraerse utilizando una bomba peristáltica después de sedimentación; la Saccharomyces cerevisiae recombinante resultante separada se utiliza en el nuevo sistema de reacción.
[0048] En las siguientes realizaciones, el contenido y el modo preferido de la presente invención se explicarán más a fondo y de manera específica. El procedimiento de biosíntesis del dipéptido alanil-glutamina utilizando la Saccharomyces cerevisiae recombinante comprende las siguientes etapas:
(1) construir Saccharomyces cerevisiae recombinante;
clonar un gen diana con la secuencia de nucleótidos, tal como SEQ ID NO.1, construir un vector recombinante que comprende el gen utilizando el vector de expresión pYD1y transformar el vector recombinante en Escherichia coli DH5a mediante un procedimiento de choque térmico;
(2) conservar los transformantes obtenidos mediante cribado de gen de resistencia a ampicilina, PCR y etapa (1) de verificación por enzimas de restricción en un medio de suspensión (slant);
El medio de suspensión: polvo de extracto de levadura 5,0 g/l, triptona 10,0 g/l, NaCl 10,0 g/l, polvo de agar 20,0 g/l, esterilizar a 121° C durante 15 minutos, después del enfriamiento, añadir ampicilina a una concentración final de 10~100 ug/ml.
(3) extraer un vector de expresión recombinante a partir del transformante obtenido en la etapa (2), y transformar células competentes de Saccharomyces cerevisiae EBY100, para obtener un transformante positivo mediante cribado de tipo deficiente.
El transformante positivo se activa y se inocula en un medio de cultivo de semillas, y cuando las células bacterianas crecen hasta DO620= 0,5 ~ 5,0, se transfieren a un medio de inducción para obtener Saccharomyces cerevisiae recombinante;
El medio de cultivo de semillas: en 82 ml de agua ultrapura, añadir 0,67 g de fuente de nitrógeno de levadura libre de amino; si se prepara un medio de cultivo sólido, añadir 3,0 g/l de polvo de agar, esterilizar durante 15 minutos a 121 °C; después de la esterilización, añadir 10 ml de mezcla de aminoácidos, 1 ml de leucina (6,0 g/l), 1 ml de histidina (2,0 g/l), 1 ml de treonina (20,0 g/l), y 5 ml de glucosa al 40 % en peso;
El medio de inducción: en 82 ml de agua ultrapura, añadir 0,67 g de fuente de nitrógeno de levadura libre de amino; esterilizar durante 15 minutos a 121 °C; después de la esterilización, añadir 10 ml de mezcla de aminoácidos, 1 ml de leucina (6,0 g/l), 1 ml de histidina (2,0 g/l), 1 ml de treonina (20,0 g/l) y 5 ml de glucosa al 40 % en peso;
La mezcla de aminoácidos descrita anteriormente en la preparación del medio de cultivo para siembra e inducción contiene los siguientes componentes: arginina 0,2 g/l, ácido aspártico 1,0 g/l, ácido glutámico 1,0 g/l, isoleucina 0,3 g/l, lisina 0,3 g/l, valina 1,5 g/l, metionina 0,2 g/l, fenilalanina 0,5 g/l, serina 3,75 g/l, tirosina 0,3 g/l y adenina 0,4 g/l.
(4) La biosíntesis del dipéptido alanil-glutamina: disolver el sustrato de clorhidrato de éster metílico de L-alanina (L-Ala-OMe) y L-glutamina (L-Gln) en un sistema de disolventes, añadir un cultivo en la etapa (3) para ajustar el pH de 8,0 a 9,0 y hacer reaccionar el sistema con una condición de 20 ± 5 °C hasta el punto final de reacciones cuando el valor de pH no disminuye más, y recoger el líquido de reacción para separar células bacterianas;
(5) añadir las células bacterianas obtenidas en la etapa (4) a un nuevo sistema de reacción para reciclar la producción del dipéptido alanil-glutamina.
[0049] En una tercera realización de aplicación de genes exógenos, se construye adicionalmente Saccharomyces cerevisiae recombinante que tiene capacidad de autofloculación basándose en la Saccharomyces cerevisiae recombinante construida.
[0050] La Saccharomyces cerevisiae recombinante que tiene la capacidad de autofloculación es una de las realizaciones preferidas de la Saccharomyces cerevisiae recombinante, que comprende además un gen floculante exógeno FLO1.
[0051] La Saccharomyces cerevisiae recombinante descrita con la capacidad de autofloculación puede construirse utilizando el siguiente procedimiento:
(1) amplificar un gen floculante FLO1 que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID N0. 8 utilizando una pareja de cebadores en la que una secuencia de nucleótidos es SEQ ID NO. 6/7.
(2) ligar el producto amplificado con el vector de expresión pRS425-pGK, y transformar el producto ligado en células competentes de Escherichia coli DH5a, y cribar transformantes sobre la placa de medio resistente a LB y realizar verificación, para obtener un vector recombinante de autofloculación;
(3) transformar el vector recombinante de autofloculación en las células competentes de la Saccharomyces cerevisiae recombinante anterior de la presente invención para obtener una Saccharomyces cerevisiae recombinante con capacidad de autofloculación mediante cribado deficiente en LEU (Saccharomyces cerevisiae recombinante autofloculante).
[0052] Además, la presente invención proporciona además otro procedimiento de biosíntesis del dipéptido alanilglutamina basado en la autofloculación obtenida, que comprende las siguientes etapas:
(1) construir una Saccharomyces cerevisiae recombinante;
clonar un gen diana con una secuencia de nucleótidos, tal como SEQ ID NO.1, construir un vector recombinante que comprende el gen utilizando el vector de expresión pYD1 y transformar el vector recombinante en Escherichia coli DH5a mediante un procedimiento de choque térmico;
(2) conservar los transformantes obtenidos mediante cribado de gen de resistencia a ampicilina, PCR y etapa (1) de verificación por enzimas de restricción en un medio de suspensión (slant);;
(3) extraer un vector de expresión recombinante a partir del transformante obtenido en la etapa (2), y transformar células competentes de Saccharomyces cerevisiae EBY100, para obtener un transformante positivo mediante cribado de tipo deficiente. El transformante positivo se activa y se inocula en un medio de cultivo de semillas, y cuando las células bacterianas crecen hasta DO620 = 0,5 ~ 5,0, se transfieren a un medio de inducción para obtener Saccharomyces cerevisiae recombinante;
(4) amplificar un gen floculante FLO1 que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO.8 utilizando una pareja de cebadores con una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 6/7.
(5) ligar el producto amplificado obtenido en la etapa (4) con el vector de expresión pRS425-pGK, y transformar el producto ligado en células competentes de Escherichia coli DH5a, y cribar transformantes sobre la placa de medio resistente a LB y realizar verificación, para obtener un vector recombinante de autofloculación;
(6) transformar el vector recombinante de autofloculación en las células competentes de la Saccharomyces cerevisiae recombinante preparado en la etapa (3) para obtener una Saccharomyces cerevisiae recombinante con la capacidad de autofloculación mediante cribado deficiente en LEU.
(7) Biosíntesis del dipéptido alanil-glutamina:
disolver el sustrato de clorhidrato de éster metílico de L-alanina y L- glutamina en un sistema de disolventes, añadir la Saccharomyces cerevisiae recombinante con la capacidad de autofloculación en la etapa (6), y ajustar el pH a 8,0­ 9,0, hacer reaccionar el sistema a 20 ± 5 °C, hasta que el valor de pH no disminuye más como el punto final de la reacción y recoger la solución de reacción para separar células bacterianas;
(8) añadir las células bacterianas obtenidas en la etapa (7) a un nuevo sistema de reacción para reciclar la producción del dipéptido alanil-glutamina.
[0053] Los siguientes ejemplos no limitativos pretenden ilustrar la invención y no deben entenderse como limitantes de ningún modo de la presente invención.
Ejemplo 1
[0054] Construcción de Escherichia coli recombinante:
El cebador (SEQ ID N0.3/4) se diseñó de acuerdo con la secuencia enzimática de enzimas relacionadas conocidas (SEQ ID NO. 5), y el gen de enzima biológica de SEQ ID NO.1 se amplificó utilizando el genoma de Sphingobacterium siyangensis (cepa Número: 1.6855) de Colección General de Microorganismos Chinos como molde.
[0055] Entre ellos, el sistema de reacción de PCR: dNTP (2,5 mM cada uno), 4 pl; 10* Tampón, 5 ul; F (10 pM), 2 pl; R (10 pM), 2 pl; enzima ExTaq (5 U/pl), 1 pl; ddH2O, 34 pl.
[0056] Condiciones de reacción de PCR: 94 °C, 5 minutos, 1 ciclo; 94 °C, 30 segundos, 55 °C, 30 segundos, 72 °C, 2 minutos, 30 ciclos; 72°C, 7 minutos, 1 ciclo. El producto se almacenó a 4 °C.
[0057] El producto de PCR se purificó mediante recuperación con gel y se ligó con el plásmido pMD™19 -T. Después de la extracción del plásmido, se secuenció el clon positivo. El gen de bioenzima obtenido mediante digestión con enzima de restricción se ligó con el vector de expresión pET29a después del mismo tratamiento, y el producto ligado se transformó en células competentes de Escherichia coli DH5a, se cultivó en medio resistente l B. Se recogieron las colonias únicas y se digirieron los plásmidos y se identificaron y sometieron a la secuencia de ADN para obtener un vector de expresión de enzima biológica. A continuación, se transformó en las células competentes del huésped de expresión mediante un procedimiento de choque térmico para obtener una Escherichia coli recombinante capaz de catalizar la síntesis del dipéptido alanil-glutamina.
[0058] Cultivo de fermentación de Escherichia coli recombinante:
La Escherichia coli recombinante se inoculó en un medio líquido LB (polvo de extracto de levadura 5 g/l, triptona 10 g/l, NaCl 110 g/l), y se activaron las células bacterianas a 37 °C, 200 rpm. A partir de entonces, las células se transfirieron a un medio de cultivo de semillas y se cultivaron mientras se agitaban a 37 °C, 200 rpm, durante la noche. Las células se inocularon hasta 1,5 litros del medio de fermentación a una dosis inoculada del 1 %. Después de la incubación de células a 37 °C, 200 rpm hasta DO 620= 0,6 a 0,8 mediante la introducción de aire, se añadió durante la noche el agente inductivo IPTG, se centrifugaron para recoger las células bacterianas como la Escherichia coli recimbinante tal como se describe en las realizaciones restantes de la presente invención.
Ejemplo 3
[0059] La síntesis del dipéptido alanil-glutamina mediante catálisis de células completas a una concentración de sustrato de 50 mM.
0,698 g de clorhidrato de éster metílico de L-alanina (L-Ala-OMe 50 mM) y 1,462 g de L-glutamina (L-Gln 100 mM) se pesaron y se disolvieron en 90 ml de solución tampón de borato 0,2 M a pH 8,7 y se controló la temperatura a 25 °C y se ajustó el pH hasta 8,5 con una solución acuosa de NaOH 6 M. Se añadió Escherichia coli recombinante al sistema de reacción, DO600 = 0,75, el pH se estabilizó con una solución de NaOH 6 M, y después de 10 minutos, las células se extrajeron mediante centrifugación para terminar la reacción. La concentración más alta del dipéptido alanilglutamina fue de 9,04 g/l y la tasa de conversión molar fue del 83,3 % medida mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (Apéndice V D, parte II, Farmacopea China, edición de 2010).
Ejemplo 4
[0060] La síntesis del dipéptido alanil-glutamina mediante catálisis de células completas a una concentración de sustrato de 100 mM.
1,396 g de clorhidrato de éster metílico de L-alanina (L-Ala-OMe 100 mM) y 1,462 g de L-glutamina (L-Gln 100 mM) se pesaron y se disolvieron en 90 ml de solución tampón de borato 0,2 M a pH 8,7 y se controló la temperatura a 25 °C y se ajustó el pH hasta 8,5 con una solución acuosa de NaOH 6 M. Se añadió Escherichia coli recombinante al sistema de reacción, DO600 = 2,0, el pH se estabilizó con una solución de NaOH 6 M, y después de 10 minutos, las células se extrajeron mediante centrifugación para terminar la reacción. La concentración más alta del dipéptido alanilglutamina fue de 15,92 g/l medida mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (Apéndice V D, parte II, Farmacopea China, edición de 2010).
Ejemplo 5
[0061] La síntesis del dipéptido alanil-glutamina mediante catálisis de células completas a una concentración de sustrato de 200 mM.
2,792 g de clorhidrato de éster metílico de L-alanina (L-Ala-OMe 200 mM) y 2,924 g de L-glutamina (L-Gln 200 mM) se pesaron y se disolvieron en 90 ml de solución tampón de borato 0,2 M a pH 8,7 y se controló la temperatura a 25 °C y se ajustó el pH hasta 8,5 con una solución acuosa de NaOH 6 M. Se añadió Escherichia coli recombinante al sistema de reacción, DO600 = 2,0, el pH se estabilizó con una solución de NaOH 6 M, y después de 10 minutos, las células se extrajeron mediante centrifugación para terminar la reacción. La concentración más alta del dipéptido alanilglutamina fue de 31,34 g/l medida mediante cromatografía líquida de alto rendimiento.
Ejemplo 6
[0062] La síntesis del dipéptido alanil-glutamina mediante catálisis de células completas a una concentración de sustrato de 400 mM.
5,584 g de clorhidrato de éster metílico de L-alanina (L-Ala-OMe 200 mM) y 5,848 g de L-glutamina (L-Gln 400 mM) se pesaron y se disolvieron en 90 ml de solución tampón de borato 0,2 M a pH 8,7 y se controló la temperatura a 25 °C y se ajustó el pH hasta 8,5 con una solución acuosa de NaOH 6 M. Se añadió Escherichia coli recombinante al sistema de reacción, DO600 = 2,0, el pH se estabilizó con una solución de NaOH 6 M, y después de 20 minutos, las células se extrajeron mediante centrifugación para terminar la reacción. La concentración más alta del dipéptido alanilglutamina fue de 61,53 g/l medida mediante cromatografía líquida de alto rendimiento.
Ejemplo 7
[0063] La síntesis del dipéptido alanil-glutamina mediante catálisis de células completas a una concentración de sustrato de 600 mM.
8,376 g de clorhidrato de éster metílico de L-alanina (L-Ala-OMe 600 mM) y 8,772 g de L-glutamina (L-Gln 600 mM) se pesaron y se disolvieron en 90 ml de solución tampón de borato 0,2 M a pH 8,7 y se controló la temperatura a 25 °C y se ajustó el pH hasta 8,5 con una solución acuosa de NaOH 6 M. Se añadió Escherichia coli recombinante al sistema de reacción, DO600 = 2,0, el pH se estabilizó con una solución de NaOH 6 M, y después de 20 minutos, las células se extrajeron mediante centrifugación para terminar la reacción. La concentración más alta del dipéptido alanilglutamina fue de 79,91 g/l medida mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (Apéndice V D, parte II, Farmacopea China, edición de 2010).
Ejemplo 8
[0064] Los efectos de diferentes temperaturas de reacción sobre la síntesis catalítica por células completas del dipéptido alanil-glutamina:
La Escherichia coli recombinante se inoculó en el medio de fermentación LB con una dosis inoculada del 1 %, y las células se cultivaron hasta DO620 = 0,73 a 200 rpm a 37 °C introduciendo aire, a continuación, se añadió el agente inductor IPTG para inducir la expresión de enzimas biológicas. Las células se recogieron mediante centrifugación para la catálisis del dipéptido alanil-glutamina. Se pesaron 5,584 g de clorhidrato de éster metílico de L-alanina (L-Ala-OMe 400 mM) y 5,848 g de L-glutamina (L-Gln 400 mM) y se disolvieron en 90 ml de solución de tampón borato 0,2 M a pH 8,7, se ajustó a pH 8,5 con una solución de NaOH 6 M y, a continuación, se llevaron a cabo las reacciones de síntesis catalítica con diferentes temperaturas de reacción. La concentración del dipéptido alanil-glutamina se determinó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (Apéndice V D, parte II, Farmacopea China, edición de 2010). Las células completas de Escherichia coli recombinante podían catalizar la síntesis del dipéptido alanil-glutamina dentro del intervalo de 15~ 40 °C. El rendimiento del dipéptido alanil-glutamina catalizado y sintetizado por células completas a 25 °C fue el más alto, utilizando la actividad enzimática como 100 %, se representó la actividad enzimática relativa a diferentes temperaturas, tal como se muestra en la Figura 2.
Ejemplo 9
[0065] Síntesis de alta eficiencia del dipéptido alanil-glutamina mediante el reciclaje de células bacterianas:
El cultivo de Escherichia coli recombinante se llevó a cabo de acuerdo con el mismo procedimiento tal como se describe en el Ejemplo 2. Las células bacterianas recogidas se sometieron a la reacción de síntesis catalítica de acuerdo con el Ejemplo 3. Cuando se terminó la reacción, se midió la concentración del dipéptido alanil-glutamina mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (Apéndice V D, parte II, Farmacopea China, edición de 2010), con una actividad enzimática correspondiente del 100 %.
[0066] Se recogieron las células bacterianas mediante centrifugación como el siguiente ciclo de bacterias modificadas, y se repitió el proceso de reacción anterior. La actividad enzimática relativa de células bacterianas en el primer ciclo se calculó como el 99,8 %, y la del segundo ciclo y el tercer ciclo fue del 97,8 % y 94,4 % respectivamente, tal como se muestra en la Figura 3. Debido a que existía una pequeña pérdida de células durante la centrifugación y recuperación de células bacterianas, la actividad enzimática del dipéptido alanil-glutamina catalizada por las células de Escherichia coli recombinantes durante ciclos repetidos fue estable, adecuada para producción industrial.
Ejemplo 10
[0067] Comparación con la técnica anterior:
Japan Ajinomoto Corporation (patente ZL03817916.4) es un líder en bioseguridad, eficiencia de conversión y productividad de transesterasas utilizadas en el campo de la síntesis enzimática del dipéptido alanil-glutamina a nivel mundial. (Biosci Biotechnol Biochem. 2013; 77(3): 618-23; 2011; 75 (11): 2087-2092) El resultado óptimo descrito en literatura fue el siguiente: cuando la DO610 celular fue de aproximadamente 4,6 en el sistema de reacción, la conversión molar de dos tipos de sustrato fue del 67 %, pero el tiempo de reacción catalítica fue más largo, 40 minutos. En cambio, el sistema de expresión de transesterasas construido en la presente invención tenía una tasa de conversión molar del 83,3 % en 10 minutos bajo la condición de reacción de una DO600 del volumen celular 0,75, que tenía una eficiencia de producción más rápida y una tasa de conversión molar más alta.
[0068] Los datos de comparación más detallados se describen en la Tabla 1 (fuentes de información de Japan Ajinomoto: Enzymatic production of L-Alany-L-glutamine by recombinant Escherichia coli expressing a-Amino acid ester Acyltransferase from Sphingobacterium siyangensis. Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 2013, 77(3): 618-623.). Tal como se muestra a partir de los resultados, en condiciones de sustrato similares, la presente invención puede conseguir una tasa de conversión más excelente dentro de un periodo de tiempo mucho menor que el tiempo de reacción de la técnica anterior ZL03817916.4. Por consiguiente, las enzimas celulares de la presente invención poseen actividades catalíticas más fuertes.
Tabla 1
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000012_0001
Ejemplo 11
[0069] Construcción de Saccharomyces cerevisiae recombinante:
El gen de enzima exógeno (SEQ ID NO. 1) se amplifico del mismo modo que el del Ejemplo 1.
[0070] Después de terminar la reacción de PCR, se detectaron 2 j l de producto de PCR mediante electroforesis con gel de agarosa y el producto de PCR amplificado se purificó mediante un kit de purificación de producto de PCR (OMEGA, EE. UU.) y se almacenó en una nevera a -20 °C para su uso en espera.
[0071] El producto de PCR y el vector de expresión pYDl se digirieron y se ligaron durante la noche, y el producto ligado se transformó en células competentes de Escherichia coli DH5a, y los transformantes se cribaron sobre una placa de medio resistente de LB (la composición de medio fue la misma que la del medio de suspensión), y, a continuación, se realizaron por separado una PCR y digestión con enzima de restricción y secuenciación de ADN. El vector de expresión recombinante de levadura se obtuvo después de verificación, tal como se muestra en la Figura 4, y, a continuación, se llevó a cabo el cribado de tipo deficiente para obtener una Saccharomyces cerevisiae recombinante capaz de catalizar la síntesis del dipéptido alanil-glutamina, como la Saccharomyces cerevisiae recombinante usada en los ejemplos restantes de la presente invención.
Ejemplo 12
[0072] Cultivo de fermentación de Saccharomyces cerevisiae recombinante:
La Saccharomyces cerevisiae recombinante se inoculó en un medio de cultivo para siembra y se activaron las células bacterianas a 3o °C y 180 rpm. A partir de entonces, las células se transfirieron a un medio de cultivo de semillas para cultivo de amplificación y se cultivaron mientras se agitaban a 30 °C, 180 rpm. Cuando crecieron hasta una cantidad apropiada, las células se inocularon en 1,0 litros de medio de inducción para el cultivo mientras se introducía aire a 20 °C, 150 rpm. 16 ~24 h después, las células se centrifugaron y se recogieron, como la Saccharomyces cerevisiae recombinante tal como se describe en la presente invención.
Ejemplo 13
[0073] Verificación de la bioenzima de expresión en superficie:
a. La Saccharomyces cerevisiae recombinante cultivada en el Ejemplo 12 se centrifugó para recoger células a de 3000 a 5000 rpm, y se lavó dos veces con tampón fosfato;
b. El sobrenadante se descartó y las células se volvieron a suspender en tampón fosfato que contenía 1 mg/ml de albumina de suero bovino (BSA) y 1 jg de anticuerpo (anti-V5-FITC);
c. Después de colocarse sobre hielo durante 30 minutos, las células se recogieron mediante centrifugación a 3000~5000 rpm y se lavaron dos veces con tampón fosfato;
d. Finalmente, las células se volvieron a suspender en tampón fosfato y se observaron bajo un microscopio invertido fluorescente y microscopio confocal láser.
[0074] Cuando la enzima biológica se expresó sobre la superficie celular, el epítopo V5 expuesto puede unirse de manera específica al anticuerpo marcado con fluoresceína libre en el ensayo b, y, a continuación, las células se lavaron con tampón fosfato para eliminar los anticuerpos en exceso y unidos de manera no específica. Finalmente, se detectaron las señales fluorescentes a la longitud de onda de excitación de 493 nm, que era la señal fluorescente generada por la unión específica, que demostraba que la enzima biológica se expresaba con éxito sobre la superficie celular.
[0075] La solución tampón fosfato descrita en este ejemplo contenía 137 mM de cloruro de sodio; 2,7 mM de cloruro de potasio; 10 mM de fosfato y solución tampón con pH 7,4.
[0076] Las señales de fluorescencia detectadas bajo el microscopio invertido de fluorescencia y microscopio confocal láser respectivamente se mostraron en la Figura 5 (A-1/A-2 fue el resultado de verificación de microscopio invertido de fluorescencia; B-1/B-2 fue el resultado de verificación de microscopio confocal láser). Entre ellos, la Figura A-1/B-1 fue el cuadro de la posición celular bajo luz blanca; la Figura A-2/B-2 fue el diagrama de señal de fluorescencia de las células a la longitud de onda de excitación de 493 nm. Se pudo demostrar que las células que podían producir señales fluorescentes verdes existían en la misma posición, demostrando que las enzimas biológicas se habían expresado sobre la superficie celular.
[0077] Las enzimas biológicas se expresaron sobre la superficie celular para lograr la inmovilización de las enzimas. En primer lugar, se solucionó el efecto de resistencia transmembrana del sustrato y producto y aumentó la velocidad de reacción; en segundo lugar, en comparación con enzimas intracelulares, por un lado, se evitó la hidrólisis de proteasa y peptidasa intracelular para facilitar mantener la estabilidad de la actividad enzimática y acumular el producto. Por otro lado, en el proceso de enriquecimiento de la enzima, se omitieron las etapas de ruptura celular y separación y purificación enzimática, y el coste de producción se redujo para aumentar el beneficio económico; finalmente, con el uso repetido de las células, se logró la reutilización de enzimas, para resolver los problemas de dificultad de recuperación enzimática y alto coste.
Ejemplo 14
[0078] Estudio sobre la síntesis catalítica del dipéptido alanil-glutamina por células completas de levadura con una concentración de sustrato de 100 mM.
[0079] Se pesaron 1,396 g de clorhidrato de éster metílico de L-alanina (L-Ala-OMe 100 mM) y 1,462 g de L-glutamina (L-Gln 100 mM) y se disolvieron en 90 ml de agua a una temperatura controlada de 25 °C, y la solución se ajustó a pH 8,5 con una solución de NaOH 6 M, y, a continuación, se llevó a cabo la aplicación de la muestra y se almacenó a 4 °C. Se añadió la Saccharomyces cerevisiae recombinante al sistema de reacción para producir una DO620 = 0,5~5,0 en la solución de reacción, y el pH se mantuvo estable con la solución de NaOH 6 M. Al final de la reacción, la solución se centrifugó y el sobrenadante se almacenó a 4 °C. La concentración más alta del dipéptido alanil-glutamina dentro del tiempo de reacción fue de 7,7 g/l medida mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (Apéndice V D, parte II, Farmacopea China, edición de 2010), tal como se muestra en la Figura 6.
Ejemplo 15
[0080] Estudio sobre la síntesis catalítica del dipéptido alanil-glutamina por células completas de levadura con una concentración de sustrato de 200 mM.
Se pesaron 2,792 g de clorhidrato de éster metílico de L-alanina (L-Ala-OMe 200 mM) y 2,924 g de L-glutamina (L-Gln 200 mM) y se disolvieron en 90 ml de agua a una temperatura controlada de 25 °C, y la solución se ajustó a pH 8,5 con una solución de NaOH 6 M, y, a continuación, se llevó a cabo la aplicación de la muestra y se almacenó a 4 °C. Se añadió la Saccharomyces cerevisiae recombinante al sistema de reacción para producir una DO620 = 0,5~5,0 en la solución de reacción, y el pH se mantuvo estable con la solución de NaOH 6 M. Al final de la reacción, la solución se centrifugó y el sobrenadante se almacenó a 4 °C. La concentración más alta del dipéptido alanil-glutamina dentro del tiempo de reacción fue de 20,4 g/l medida mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (Apéndice V D, parte II, Farmacopea China, edición de 2010), tal como se muestra en la Figura 6.
Ejemplo 16
[0081] Estudio sobre la síntesis catalítica del dipéptido alanil-glutamina por células completas de levadura en la condición de (L-Ala-OMe 50 mM, L-Gln 100 mM)
Se pesaron 0,698 g de clorhidrato de éster metílico de L-alanina (L-Ala-OMe 50 mM) y 1,462 g de L-glutamina (L-Gln 100 mM) y se disolvieron en 90 ml de solución de tampón fosfato 0,2 M a pH 8,7 a una temperatura controlada de 20 °C, y la solución se ajustó a pH 8,5 con una solución de NaOH 6 M, y, a continuación, se llevó a cabo la aplicación de la muestra y se almacenó a 4 °C. Se añadió la Saccharomyces cerevisiae recombinante al sistema de reacción para producir una DO620 = 0,5~5,0 en la solución de reacción, y el pH se mantuvo estable con la solución de NaOH 6 M para reaccionar 20 minutos. Después de centrifugación el sobrenadante se almacenó a 4 °C. La concentración del dipéptido alanil-glutamina dentro del tiempo de reacción fue de 5,8 g/l medida mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (Apéndice V D, parte II, Farmacopea China, edición de 2010).
Ejemplo 17
[0082] Estudio sobre la síntesis catalítica del dipéptido alanil-glutamina por células completas de levadura en la condición de (L-Ala-OMe 100 mM, L-Gln 200 mM)
Se pesaron 1,396 g de clorhidrato de éster metílico de L-alanina (L-Ala-OMe 100 mM) y 2,924 g de L-glutamina (L-Gln 200 mM) y se disolvieron en 90 ml de solución de tampón fosfato 0,2 M a pH 8,7 a una temperatura controlada de 20 °C, y la solución se ajustó a pH 8,5 con una solución de NaOH 6 M, y, a continuación, se llevó a cabo la aplicación de la muestra y se almacenó a 4 °C. Se añadió la Saccharomyces cerevisiae recombinante al sistema de reacción para producir una DO620 = 0,5~5,0 en la solución de reacción, y el pH se mantuvo estable con la solución de NaOH 6 M para reaccionar 40 minutos. Después de centrifugación el sobrenadante se almacenó a 4 °C. La concentración del dipéptido alanil-glutamina dentro del tiempo de reacción fue de 14,4 g/l medida mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (Apéndice V D, parte II, Farmacopea China, edición de 2010).
Ejemplo 18
[0083] Estudio sobre la síntesis catalítica del dipéptido alanil-glutamina por células completas de levadura en la condición de (L-Ala-OMe 200 mM, L-Gln 400 mM)
Se pesaron 2,792 g de clorhidrato de éster metílico de L-alanina (L-Ala-OMe 200 mM) y 5,848 g de L-glutamina (L-Gln 400 mM) y se disolvieron en 90 ml de solución de tampón fosfato 0,2 M a pH 8,7 a una temperatura controlada de 20 °C, y la solución se ajustó a pH 8,5 con una solución de NaOH 6 M, y, a continuación, se llevó a cabo la aplicación de la muestra y se almacenó a 4 °C. Se añadió la Saccharomyces cerevisiae recombinante al sistema de reacción para producir una DO620 = 0,5~5,0 en la solución de reacción, y el pH se mantuvo estable con la solución de NaOH 6 M para reaccionar 60 minutos. Después de centrifugación el sobrenadante se almacenó a 4 °C. La concentración del dipéptido alanil-glutamina dentro del tiempo de reacción fue de 24,7 g/l medida mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (Apéndice V D, parte II, Farmacopea China, edición de 2010).
Ejemplo 19
[0084] Efecto de diferentes sistemas de reacción sobre la síntesis catalítica del dipéptido alanil-glutamina por células completas de levadura. Se cultivó la Saccharomyces cerevisiae recombinante del mismo modo que la del Ejemplo 12, y se recogieron las células mediante centrifugación para reacción catalítica del dipéptido alanil-glutamina. Se estudiaron los efectos de agua, tampón fosfato y solución de tampón borato sobre la síntesis catalítica del dipéptido alanil-glutamina por células completas de levadura. Se pesaron 2,792 g de clorhidrato de éster metílico de L-alanina (L-Ala-OMe 200 mM) y 5,848 g de L-glutamina (L-Gln 400 mM) y se disolvieron en 90 ml de las tres soluciones de reacción diferentes anteriores respectivamente, y se añadió la Saccharomyces cerevisiae recombinante al sistema de reacción para producir DO620 = 0,5~5,0 en la solución de reacción, y el pH se mantuvo a 8,5 con una solución de NaOH 6 M a una temperatura controlada de 25 °C para la reacción de síntesis catalítica. Se recogieron las muestras en un punto fijo a 10/ 30/ 60 minutos, se centrifugaron para terminar la reacción enzimática, a continuación, se recogió el sobrenadante y se almacenó a 4 °C respectivamente. La concentración del dipéptido alanil-glutamina se determinó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (Apéndice V D, parte II, Farmacopea China, edición de 2010), y se descubrió que la solución de reacción más adecuada fue la solución de tampón fosfato.
Ejemplo 20
[0085] Los efectos de diferentes temperaturas de reacción sobre la síntesis catalítica del dipéptido alanil-glutamina por células completas de levadura: Se cultivó la Saccharomyces cerevisiae recombinante del mismo modo que la del Ejemplo 12, y se recogieron las células mediante centrifugación para la reacción catalítica del dipéptido alanilglutamina. Se estudiaron los efectos de diferentes temperaturas dereacción (10/ 15/ 20/ 25/ 30/40°C) sobre la síntesis catalítica del dipéptido alanil-glutamina por células completas de levadura. Se pesaron 1,396 g de clorhidrato de éster metílico de L-alanina (L-Ala-OMe 100 mM) y 2,924 g de L-glutamina (L-Gln 200 mM) y se disolvieron en 90 ml de solución de tampón fosfato 0,2 M con pH 8,7. Se añadió la Saccharomyces cerevisiae recombinante al sistema de reacción para producir una DO620 = 0,5~5,0 en la solución de reacción, y el pH se mantuvo a 8,5 con una solución de NaOH 6 M para la reacción de síntesis catalítica a las temperaturas de reacción diferentes anteriores. 30 minutos después, la solución se centrifugó para terminar la reacción enzimática, y se determinó la concentración del dipéptido alanil-glutamina mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (Apéndice V D, parte II, Farmacopea China, edición de 2010). Los resultados mostraron que la enzima tenía una actividad más alta en un amplio intervalo de temperaturas y la temperatura óptima para la reacción fue de 20 °C, pero con una pequeña diferencia de la de 25 °C y 30 °C. Considerando los factores económicos, tales como consumo de energía de producción, se puede llevar a cabo la reacción enzimática directamente a temperatura ambiente (20 - 30 °C), tal como se muestra en la Figura 7.
Ejemplo 21
[0086] Los efectos de diferentes pH de reacción sobre la síntesis catalítica del dipéptido alanil-glutamina por células completas de levadura:
Se cultivó la Saccharomyces cerevisiae recombinante del mismo modo que la del Ejemplo 12, y se recogieron las células mediante centrifugación para la reacción catalítica del dipéptido alanil-glutamina. Se estudiaron los efectos de diferentes pH de reacción (pH 4/5/6 (tampón acetato), 6/7/7,5/8/8,5/9 (tampón fosfato), 8 /8,5 /9 /10 (tampón borato)) sobre la síntesis catalítica del dipéptido alanil-glutamina por células completas de levadura. Se pesaron 1,396 g de clorhidrato de éster metílico de L-alanina (L-Ala-OMe 100 mM) y 2,924 g de L-glutamina (L-Gln 200 mM) y se disolvieron en 90 ml de solución de tampón y se añadió la Saccharomyces cerevisiae recombinante al sistema de reacción para producir una DO620 = 0,5~5,0 en la solución de reacción, y la temperatura se controló a 20 °C y la reacción de síntesis catalítica se llevó a cabo a diferentes pH de reacción que se mantuvo mediante una solución de NaOH 6M. Después de 30 minutos de reacción, la solución se centrifugó para terminar la reacción enzimática. Se determinó la concentración del dipéptido alanil-glutamina mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (Apéndice V D, parte II, Farmacopea China, edición de 2010). Los resultados mostraron que la enzima tenía una actividad más alta en un amplio intervalo de pH y el pH óptimo para la reacción fue de 8,0, que verificó que la solución de reacción óptima de sustrato fue una solución de tampón fosfato, tal como se muestra en la Figura 8.
Ejemplo 22
[0087] Síntesis eficaz del dipéptido alanil-glutamina mediante el reciclaje de Saccharomyces cerevisiae recombinante:
Se cultivó la Saccharomyces cerevisiae recombinante del mismo modo que en el Ejemplo 12, y se recogieron las células mediante centrifugación para la reacción catalítica del dipéptido alanil-glutamina. Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 0,698 g de clorhidrato de éster metílico de L-alanina (L-Ala-OMe 50 mM) y 1,462 g de L-glutamina (L-Gln 100 mM) se disolvieron en 90 ml de tampón a una temperatura controlada de 20 °C. El pH de solución se ajustó a 8 con una solución de NaOH 6 M, se recogieron las muestras en un punto fijo a 20/ 30 minutos, se centrifugaron para terminar la reacción enzimática. A continuación, después de bombear el sobrenadante de reacción utilizando una bomba peristáltica o de centrifugación, la reacción se repitió varias veces de acuerdo con las condiciones de reacción anteriores. Finalmente, la concentración del dipéptido alanil-glutamina se determinó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (Apéndice V D, parte II, Farmacopea China, edición de 2010). La actividad enzimática relativa de las células de Saccharomyces cerevisiae recombinantes de primera reacción se definió como 100 %, a continuación, la actividad enzimática relativa de las células de levadura de la segunda reacción se determinó que fue del 94,0 %; y la actividad relativa de las células de levadura de la tercera reacción fue del 86,7 %; la actividad enzimática relativa de las células de levadura de la cuarta reacción fue del 81,0 %; la actividad relativa de las células de levadura de la quinta reacción fue del 76,7 %. Durante el proceso de recuperación de células bacterianas, las células parciales se perdieron, por consiguiente, la actividad enzimática en el proceso de síntesis catalítica del dipéptido alanil-glutamina por Saccharomyces cerevisiae recombinante durante ciclos repetidos fue estable, y puede reutilizarse, para reducir el coste de producción industrial y resolver los problemas de dificultad de recuperación enzimática y baja tasa de utilización, etc., y cumple los requisitos de producción industrial.
Ejemplo 23
[0088] Construcciones de Saccharomyces cerevisiae recombinante autofloculante:
Basándose en la Saccharomyces cerevisiae recombinante cosntruida como en el Ejemplo 11, para lograr su autoinmovilización libre de vector en el reactivo, se diseñaron los cebadores en dirección 5' y dirección 3' SEQ ID No.6/7 de acuerdo con la secuencia de nucleótidos del gen FLO1 e floculación publicada por NCBI. Se utilizó el genoma de Saccharomyces cerevisiae S288c como un molde para amplificar el gen de floculación (SEQ ID NO. 8).
[0089] Entre ellos, sistema de reacción de PCR: dNTPs (2,5 mM cada uno), 4 pl; 10* Tampón, 5 pl; F(10 pM), 2 pl; R (10 pM), 2 pl; molde, 2 pl; enzima Taq (5 U/pl), 1 pl; ddH2O, 34 pl.
[0090] Condiciones de reacción de PCR : 94 °C, 5 minutos, 1 ciclo; 94 °C, 30 segundos, 55 °C, 30 segundos, 72 °C, 5 minutos, 30 ciclos; 72°C, 10 minutos, 1 ciclo. El producto se almacenó a 4 °C.
[0091] Al final de la reacción de PCR, se detectaron 2 pl de producto de PCR mediante electroforesis con gel de agarosa, y el producto de PCR amplificado se purificó mediante un kit de purificación de producto de PCR (OMEGA, EE. UU.) y se almacenó en una nevera a -20 °C para su uso en espera.
[0092] El producto de PCR y el vector de expresión pRS425 -pGK se digirieron y se ligaron durante la noche, y el producto ligado se transformó en células competentes de Escherichia coli DH5a, y los transformantes se cribaron sobre una placa de medio resistente de LB y se llevó a cabo una digestión con enzimas de restricción respectivamente, después de la verificación, se obtuvo un vector recombinante autofloculante, tal como se muestra en la Figura 10. En las células competentes de Saccharomyces cerevisiae recombinante construidas en el Ejemplo 11 mediante un procedimiento químico, se obtuvo Saccharomyces cerevisiae recombinante autofloculante de partículas floculantes de tamaño milimétrico mediante cribado de tipo deficiente de LEU. La Saccharomyces cerevisiae recombinante autofloculante construida tenía una velocidad de floculación rápida y podría establecerse completamente en un periodo de 1-5 segundos, y las partículas floculantes son de tamaño moderado, con un tamaño de 2-4 mm. El cultivo de fermentación de Saccharomyces cerevisiae recombinante autofloculante se llevó a cabo del mismo modo que en el Ejemplo 12.
Ejemplo 24
[0093] La síntesis catalítica del dipéptido alanil-glutamina mediante Saccharomyces cerevisiae recombinante autofloculante y sus reciclaje:
La Saccharomyces cerevisiae recombinante autofloculante construida en el Ejemplo 23 se utilizó para catalizar directamente la síntesis del dipéptido alanil-glutamina con la concentración de sustrato de (L-Ala-OMe 200 mM, L-Gln 100 mM).
[0094] Se pesaron 2,792 g de clorhidrato de éster metílico de L- alanina (L-Ala-OMe 200 mM) y 1,462 g de L- glutamina (L-Gln 100 mM) y se disolvieron en 90 ml de tampón fosfato 0,2 M a pH 8,7. La temperatura se controló a 20 °C, y el pH se ajustó hasta 8,5 con una solución de NaOH 6 M, y se llevó a cabo la aplicación de muestra y se almacenó a 4 °C. Se añadió la Saccharomyces cerevisiae recombinante autofloculante al sistema de reacción y el pH se estabilizó con una solución de NaOH 6 M, se recogieron las muestras a 15/ 30/ 45 minutos respectivamente, se centrifugaron para terminar la reacción y se almacenaron a 4 °C. La concentración del dipéptido alanil-glutamina en diferentes tiempos de reacción se determinó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (Apéndice V D, parte II, Farmacopea China, edición de 2010). La Saccharomyces cerevisiae recombinante autofloculante construida en el

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Gen que codifica la enzima biosintética del dipéptido alanil-glutamina, en el que la secuencia de nucleótidos codificante es tal como se muestra en la SEQ ID NO.1.
2. Enzima biosintética del dipéptido alanil-glutamina, codificada por el gen de la reivindicación 1, en la que la secuencia de aminoácidos de la enzima es tal como se muestra en la SEQ ID NO.2.
3. Escherichia coli recombinante obtenida mediante la transferencia de la secuencia de nucleótidos del gen de la reivindicación 1 a Escherichia coli.
4. Procedimiento de biosíntesis del dipéptido de alanil-glutamina, que comprende una etapa de transformar un sustrato utilizando la Escherichia coli recombinante de la reivindicación 3.
5. Procedimiento, según la reivindicación 4, en el que el sustrato comprende un componente de carboxilo y un componente de amina, el componente de carboxilo se selecciona del grupo que consiste en ésteres de aminoácidos y amidas de aminoácidos, el componente de amina se selecciona del grupo que consiste en aminoácidos, aminoácidos protegidos en C y aminas.
6. Procedimiento, según la reivindicación 4, que comprende las siguientes etapas:
(1) disolver el sustrato de clorhidrato de éster metílico de L-alanina y L-glutamina en una solución tampón, y ajustar el pH hasta 8,0 -10,0;
(2) añadir la Escherichia coli recombinante a un sistema obtenido en la etapa (1) para reaccionar, con la temperatura de reacción de 15 a 40 °C, y el pH del sistema de reacción de 8,0 a 10,0; y
(3) recoger la solución de reacción y centrifugar para separar células bacterianas y terminar la reacción en el punto final de reacción, cuando el pH no disminuye más.
7. Procedimiento, según la reivindicación 6, que comprende además una etapa de reciclar las células bacterianas de Escherichia coli recombinante.
8. Procedimiento, según la reivindicación 4, que comprende, además, las siguientes etapas:
(1) construir una Escherichia coli recombinante mediante las siguientes etapas: clonar un gen de la reivindicación 1, construir un vector recombinante que comprende el gen utilizando el vector de expresión ET29a, y transformar el vector recombinante en un huésped de expresión Escherichia coli BL21 (DE3) mediante un procedimiento de choque térmico;
(2) conservar los transformantes positivos obtenidos mediante cribado de gen de resistencia, PCR y etapa (1) de verificación por enzimas de restricción en un medio de suspensión (slant); en la que el medio de suspensión comprende: polvo de extracto de levadura 5 g/l, triptona 10 g/l, NaCl 10 g/l y polvo de agar 20 g/l, y el medio de suspensión se obtiene mediante las siguientes etapas: esterilizarse a 121 °C durante 15 minutos, y después de enfriamiento, añadir kanamicina a una concentración final de 10~100 ug/ml;
(3) transferir Escherichia coli recombinante activada a un medio de cultivo para siembra y realizar un cultivo de amplificación a 37 °C, 200 rpm, añadir isopropil tiogalactósido (IPTG) a una concentración final de 0,2 a 2,0 mM durante la noche para inducir un cultivo a una temperatura baja, cuando la DO600 de las células = 0,4 a 1,0; en la que el medio de cultivo para siembra comprende polvo de extracto de levadura 5 g/l, triptona 10 g/l y NaCl 10 g/l, y el medio de cultivo para siembra se obtiene mediante las siguienes etapas: esterilizarse a 121 °C durante 15 minutos, y después de enfriamiento, añadir kanamicina a una concentración final de 10~100 ug/ml;
(4) realizar una biosíntesis del dipéptido alanil-glutamina mediante las siguientes etapas: disolver el sustrato de clorhidrato de éster metílico de L-alanina y L- glutamina en una solución tampón, añadir el cultivo de la etapa (3), y ajustar el pH a 8,0-9,0, hacer reaccionar el sistema a 25 ± 1 °C, hasta que el valor de pH no disminuye más como el punto final de la reacción y recoger la solución de reacción para centrifugar y separar las células bacterianas; y
(5) añadir las células bacterianas obtenidas en la etapa (4) a un nuevo sistema de reacción para reciclar la producción del dipéptido alanil-glutamina.
9. Saccharomyces cerevisiae recombinante, que comprende el gen de la reivindicación 1.
10. Saccharomyces cerevisiae recombinante, según la reivindicación 9, que comprende, además, un gen de floculación exógeno FLO1.
11. Procedimiento de biosíntesis del dipéptido alanil-glutamina, que comprende la etapa de transformar un sustrato utilizando la Saccharomyces cerevisiae recombinante de la reivindicación 9 o 10.
12. Procedimiento, según la reivindicación 11, en el que el sustrato comprende un componente de carboxilo y un componente de amina, el componente de carboxilo se selecciona del grupo que consiste en ésteres de aminoácidos y amidas de aminoácidos, el componente de amina se selecciona del grupo que consiste en aminoácidos, aminoácidos protegidos en C y aminas.
13. Procedimiento, según la reivindicación 11, que comprende las siguientes etapas:
(1) disolver el sustrato de clorhidrato de éster metílico de L-alanina y L-glutamina en un sistema de disolventes, y ajustar el pH a 8,0 ~ 9,0;
(2) añadir la Saccharomyces cerevisiae recombinante a un sistema obtenido en la etapa (1) para reaccionar, con la temperatura de reacción de 10 a 40 °C y un pH del sistema de reacción de 8,0 a 9,0;
(3) recoger la solución de reacción y centrifugar para separar las células bacterianas y terminar la reacción en el punto final de la reacción cuando el pH no disminuye más;
en el que dicho procedimiento comprende opcionalmente la etapa adicional de reciclar la Saccharomyces cerevisiae recombinante.
14. Procedimiento, según la reivindicación 11, que comprende, además, las siguientes etapas:
(1) construir una Saccharomyces cerevisiae recombinante mediante las siguientes etapas: clonar el gen de la reivindicación 1, construir un vector recombinante que comprende el gen utilizando el vector de expresión Pyd1, y transformar el vector recombinante en Escherichia coli DH5a mediante un procedimiento de choque térmico;
(2) conservar los transformantes obtenidos mediante el cribado de genes de resistencia a ampicilina, PCR y etapa de verificación por enzimas de restricción (1) en un medio de suspensión;
(3) extraer un vector de expresión recombinante del transformante obtenido en la etapa (2), y transformar en células competentes de Saccharomyces cerevisiae EBY100 para obtener un transformante positivo mediante cribado de tipo deficiente, activar e inocular el transformante positivo en un medio de cultivo para siembra y, tras crecer hasta DO620 = 0,5 ~5,0, las células bacterianas se transfieren a un medio de inducción para obtener Saccharomyces cerevisiae recombinante;
(4) realizar la biosíntesis del dipéptido de alanil-glutamina mediante las siguientes etapas: disolver el sustrato de clorhidrato de éster metílico de L-alanina y L-glutamina en un sistema de disolventes, añadir un cultivo en la etapa (3) para ajustar el pH de 8,0 a 9,0, hacer reaccionar el sistema en una condición de 20 ± 5 °C hasta el punto final de las reacciones cuando el valor de pH no disminuye más, y recoger el líquido de reacción para separar las células bacterianas; y
(5) añadir las células bacterianas obtenidas en la etapa (4) a un nuevo sistema de reacción para reciclar la producción del dipéptido de alanil-glutamina.
15. Procedimiento, según la reivindicación 11, que comprende, además, las siguientes etapas:
(1) construir una Saccharomyces cerevisiae recombinante mediante las siguientes etapas: clonar el gen de la reivindicación 1, construir un vector recombinante que comprende el gen utilizando el vector de expresión pYD1, y transformar el vector recombinante en Escherichia coli DH5a mediante un procedimiento de choque térmico;
(2) conservar los transformantes obtenidos mediante el cribado de genes de resistencia a ampicilina, la PCR y la etapa de verificación de enzimas de restricción (1) en un medio de suspensión; en el que el medio de suspensión comprende polvo de extracto de levadura 5 g/l, triptona 10 g/l, NaCl 10 g/l y polvo de agar 20 g/l, y el medio de suspensión se obtiene mediante las siguientes etapas: esterilizarse a 121 °C durante 15 minutos, y después de enfriamiento, añadir kanamicina a una concentración final de 10~100 ug/ml;
(3) extraer un vector de expresión recombinante del transformante obtenido en la etapa (2) y transformar en células competentes de Saccharomyces cerevisiae EBY100 para obtener el transformante positivo mediante cribado de tipo deficiente, activar e inocular el transformante positivo en un medio de cultivo para siembra y, tras crecer hasta DO620 = 0,5 ~ 5,0, las células bacterianas se transfieren a un medio de inducción para obtener Saccharomyces cerevisiae recombinante; en el que el medio de cultivo para siembra comprende polvo de extracto de levadura 5 g/l, triptona 10 g/l y NaCl 10 g/l, y el medio de cultivo para siembra se obtiene mediante las siguientes etapas: esterilizarse a 121 °C durante 15 minutos, después de enfriamiento, añadir kanamicina a una concentración final de 10 ~ 100 ug/ml;
(4) amplificar un gen de floculación FLO1 que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO.8 utilizando un par de cebadores con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 6/7;
y
(5) ligar el producto amplificado obtenido en la etapa (4) al vector de expresión pRS425-pGK, y transformar el producto ligado en células competentes de Escherichia coli DH5a, y cribar los transformantes sobre la placa de medio resistente a LB y realizar la verificación, para obtener una vector recombinante autofloculante;
(6) transformar el vector recombinante autofloculante en las células competentes de la Saccharomyces cerevisiae recombinante preparadas en la etapa (3), para obtener una Saccharomyces cerevisiae recombinante con capacidad de autofloculación mediante cribado deficiente en LEU;
(7) realizar la biosíntesis del dipéptido alanil-glutamina mediante las siguientes etapas: disolver el sustrato de clorhidrato de éster metílico de L-alanina y L-glutamina en un sistema de disolventes, añadir la Saccharomyces cerevisiae recombinante con capacidad de autofloculación en la etapa (6), ajustar el pH a 8,0 ~ 9,0, hacer reaccionar el sistema a 20 ± 5 °C hasta que el valor de pH ya no disminuye más como el punto final de la reacción, y recoger la solución de reacción para separar las células bacterianas;
y
(8) añadir las células bacterianas obtenidas en la etapa (7) a un nuevo sistema de reacción para reciclar la producción del dipéptido de alanil-glutamina.
ES17888980T 2016-12-30 2017-12-25 Gen que codifica la enzima biosintética del dipéptido de alanil-glutamina y aplicación del mismo Active ES2908806T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611254240.XA CN106754447B (zh) 2016-12-30 2016-12-30 重组酿酒酵母及其在合成丙谷二肽中的应用
CN201611254213.2A CN106754985B (zh) 2016-12-30 2016-12-30 编码丙谷二肽生物合成酶的基因及其应用
PCT/CN2017/118167 WO2018121458A1 (zh) 2016-12-30 2017-12-25 编码丙谷二肽生物合成酶的基因及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2908806T3 true ES2908806T3 (es) 2022-05-04

Family

ID=62706916

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES17888980T Active ES2908806T3 (es) 2016-12-30 2017-12-25 Gen que codifica la enzima biosintética del dipéptido de alanil-glutamina y aplicación del mismo

Country Status (9)

Country Link
US (1) US10865225B2 (es)
EP (1) EP3564376B1 (es)
JP (1) JP6731119B2 (es)
KR (1) KR102183558B1 (es)
AU (1) AU2017385151B2 (es)
CA (1) CA3049488C (es)
ES (1) ES2908806T3 (es)
HU (1) HUE057583T2 (es)
WO (1) WO2018121458A1 (es)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110382705B (zh) * 2018-09-26 2022-07-15 邦泰生物工程(深圳)有限公司 丙谷二肽的制备方法、丙谷二肽制备用酶及应用
CN113481252A (zh) * 2021-08-11 2021-10-08 苏州富士莱医药股份有限公司 一步法催化合成l-肌肽的方法
CN114107150B (zh) * 2021-11-12 2022-12-27 江南大学 一种α-氨基酸酯酰基转移酶在细胞表面表达的重组大肠杆菌与应用
CN114807200A (zh) * 2022-03-18 2022-07-29 大连理工大学 一种表面展示生物酶的无载体双固定化生物催化剂及其制备方法和应用
CN116286567B (zh) * 2022-09-27 2023-09-29 合肥工业大学 一株产α-氨基酸酯酰基转移酶的重组大肠埃希氏菌及其构建方法和应用
KR102650468B1 (ko) 2024-01-19 2024-03-25 큐티스바이오 주식회사 생물전환공정을 이용한 디펩타이드의 제조방법

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3643404B2 (ja) * 1995-02-01 2005-04-27 麒麟麦酒株式会社 酵母に凝集性を付与する遺伝子及びその遺伝子産物
EP1411060A4 (en) * 2001-07-26 2006-09-13 Ajinomoto Kk METHOD FOR THE PREPARATION OF DIPEPTIDE, L AMINO ACID AMIDHYDROLASE FOR THE USE THEREOF AND METHOD FOR THE PRODUCTION OF L AMINO ACID AMIDHYDROLASE
CN1164611C (zh) 2002-06-17 2004-09-01 厦门大学 丙-谷二肽合成方法
CN1316016C (zh) 2002-07-26 2007-05-16 味之素株式会社 新的生成肽的酶、生成该酶的微生物和利用它们合成二肽的方法
KR100855520B1 (ko) * 2002-07-26 2008-09-02 아지노모토 가부시키가이샤 신규 펩타이드 신타제 유전자
EP1829968A4 (en) * 2004-12-20 2008-09-10 Ajinomoto Kk PROTEIN MUTANT WITH PEPTIDE PRODUCTION ACTIVITY
JP2011223896A (ja) * 2010-04-15 2011-11-10 Ajinomoto Co Inc ペプチドの製造方法
GB201108343D0 (en) * 2011-05-18 2011-06-29 Hibernation Honey Ltd Honey composition
CN104480075B (zh) 2014-11-20 2017-04-19 江苏诚信药业有限公司 一种催化合成丙谷二肽的生物酶及其制备方法和应用
CN105274174A (zh) 2015-11-30 2016-01-27 精晶药业股份有限公司 一种生物酶转化制备丙谷二肽的方法
CN106754447B (zh) * 2016-12-30 2020-08-25 大连医诺生物股份有限公司 重组酿酒酵母及其在合成丙谷二肽中的应用
CN106754985B (zh) * 2016-12-30 2019-08-13 大连医诺生物股份有限公司 编码丙谷二肽生物合成酶的基因及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20190315801A1 (en) 2019-10-17
HUE057583T2 (hu) 2022-05-28
KR102183558B1 (ko) 2020-11-26
CA3049488C (en) 2020-07-28
AU2017385151B2 (en) 2021-03-25
CA3049488A1 (en) 2018-07-05
AU2017385151A1 (en) 2019-07-18
EP3564376A1 (en) 2019-11-06
JP6731119B2 (ja) 2020-07-29
WO2018121458A1 (zh) 2018-07-05
EP3564376A4 (en) 2020-07-29
EP3564376B1 (en) 2021-12-15
JP2020505915A (ja) 2020-02-27
KR20190086016A (ko) 2019-07-19
US10865225B2 (en) 2020-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2908806T3 (es) Gen que codifica la enzima biosintética del dipéptido de alanil-glutamina y aplicación del mismo
JP5101492B2 (ja) 融合タンパク質の自己タンパク質分解切断による組換えタンパク質の産生
CN106754447B (zh) 重组酿酒酵母及其在合成丙谷二肽中的应用
Zhu et al. A simple and effective strategy for solving the problem of inclusion bodies in recombinant protein technology: His-tag deletions enhance soluble expression
CN106148296A (zh) 一种重组谷氨酰胺转氨酶的生产方法
CN110387379B (zh) 一种用于生产谷胱甘肽的重组大肠杆菌的混合培养工艺及其应用
CN106754985A (zh) 编码丙谷二肽生物合成酶的基因及其应用
CN108535489A (zh) 一种用于体外蛋白质合成的蛋白合成体系、试剂盒及其制备方法
CN113481226B (zh) 信号肽相关序列及其在蛋白质合成中的应用
CN109593702B (zh) 一种基因工程菌株实现全细胞转化合成l-苯乳酸的方法
Chen et al. A novel molecular chaperone GroEL2 from Rhodococcus ruber and its fusion chimera with nitrile hydratase for co-enhanced activity and stability
Belková et al. Active inclusion bodies: The unexpected journey
CN109762834B (zh) 一种获取芳香族异戊烯基转移酶的发酵和一步纯化方法
JP2020018304A (ja) 微生物宿主生物における目的タンパク質の生産方法
US20220340628A1 (en) Tag protein for increasing water solubility and heat stability of target protein, and fusion protein comprising same
RU2697375C2 (ru) ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pRh15A ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗМЕТИОНИНОВОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21 DE3 - ПРОДУЦЕНТ БЕЗМЕТИОНИНОВОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗМЕТИОНИНОВОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b
JP7306719B2 (ja) 改変デカルボキシラーゼポリペプチドおよびβ－アラニンの調製におけるそれらの用途
CN111363709A (zh) 一种提高异戊二烯产量的基因工程菌及其构建方法与应用
CN114774398B (zh) 一种重组ek酶工程菌的高密度发酵方法
CN113801856B (zh) 利用表达聚谷氨酸合成酶的重组菌静息细胞和/或聚谷氨酸合成酶制备γ-聚谷氨酸的方法
RU2620942C2 (ru) Бесплазмидный рекомбинантный штамм Escherichia coli, обладающий конститутивной аспартазной активностью и способ синтеза L-аспарагиновой кислоты с использованием этого штамма в качестве биокатализатора
CN118028326A (zh) 厌氧酶的无细胞反应体系及表达方法
RU2577138C1 (ru) Способ получения рекомбинантного белка sav-rgd
JP2023135741A (ja) アミノ酸の製造方法
JP2021520213A (ja) 改変デカルボキシラーゼポリペプチドならびにチラミンおよびドーパミンの調製におけるその使用