JP5101492B2

JP5101492B2 - 融合タンパク質の自己タンパク質分解切断による組換えタンパク質の産生

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Publication number: JP5101492B2
Application number: JP2008508021A
Authority: JP
Inventors: アロイス・ユングバウアー; ライナー・ハーン; アンネ・チェリースニッヒ; ヴァルトラウト・カール
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Sandoz AG
Priority date: 2005-04-26
Filing date: 2006-04-25
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2026-04-25
Also published as: PL1874825T3; JP2008539170A; KR20080030551A; WO2006113958A3; KR20080036545A; PT1874825E; US8058410B2; SI1874825T1; ES2342100T3; WO2006113958A8; WO2006113959A3; AU2006239723B2; CN103333252A; AU2006239722A1; CA2605140C; JP2015226547A; US8163890B2; WO2006113958A2; KR101289728B1; PT1874932E

Description

発明の分野

本発明は、特定の相同Ｎ−末端を有する対象異種組換えポリペプチドの製造方法に関するものである。本発明は、対象ポリペプチドおよび付加部分、すなわち、自己タンパク質分解切断機能を呈し、対象ポリペプチドのＮ−末端に結合される第２ポリペプチドを含む融合ポリペプチドを、クロマトグラフィーシステムと組合せたものである。本発明の一部を形成するクロマトグラフィーシステムは、融合ポリペプチドがクロマトグラフィーシステムに結合している間、該融合ポリペプチドのＮ−末端部分の自己タンパク質分解切断機能を活性化させ得る。融合ポリペプチドの結合、リフォールディングおよび切断は、同一クロマトグラフィーシステムで誘導され、次いで、そこから対象ポリペプチドがその精製形態で単離され得る。

発明の背景

ほとんどの対象ポリペプチド、例えば医薬上有用なタンパク質は、真核生物に由来し、それらは、高い発現割合および高い収率故に、通常は細菌細胞で産生される。しかしながら、細菌におけるポリペプチドの合成機構は、真核生物のそれとは異なる。付加アミノ酸の切断は行われ得るがその間ほとんどで不完全なままであるため、細菌細胞で発現されるポリペプチドは、通常Ｎ−末端に付加的外来アミノ酸を有するか、またはそれらのＮ−末端に関して非相同である。

しかしながら、非相同であるポリペプチドは、例えば抗体形成の誘導、半減期、薬物動態などといった天然に存するポリペプチドの特性とは異なる特性を示すため、上記非相同性は特に医薬分野では許容できない。天然型タンパク質に由来するか、および／または非相同性であるＮ−末端は許容され得ない特徴である。医薬ポリペプチドの製造について、ほとんどの場合、付加アミノ酸を全くもたない、正確なＮ−末端と相同である同一性質の生成物を製造することが必要である。既知方法では、ポリペプチド製造過程に付加段階を組込むことによりこの目標の達成を試みているが、コストおよび材料の消費を伴い、さらなる後処理、いわゆる生成物の下流プロセッシングがさらに複雑なものになっている。

特定された相同Ｎ−末端をもつ細菌細胞におけるポリペプチドの既知製造方法は、対象ポリペプチドおよびそこにＮ−末端結合した、自己タンパク質分解切断活性をもつポリペプチド、好ましくはペスチウイルスのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏを含む融合ポリペプチドを使用する。融合パートナーの自己タンパク質分解切断活性により、相同Ｎ−末端をもつ対象ポリペプチドの切断が誘導される。

ある種の条件下、ポリペプチドを細菌細胞の細胞質で製造する場合、ポリペプチドの製造速度は折りたたみ速度論よりも速い。従って、高密度ポリペプチド凝集体が形成され、それらは封入体として細胞の細胞質で沈積される。発現したポリペプチドは高量および高純度で封入体に存在するため、封入体形態でのポリペプチドの製造は工業規模での製造にとって特に興味深いものである。また、細胞の封入体はプロテアーゼを欠くため、ポリペプチドは、封入体に貯蔵されているときには保護される。さらに、封入体は単離し易い。しかしながら、細胞質封入体形態でのポリペプチド製造の主たる欠点は、封入体の溶解度が低く、ポリペプチドのリフォールディングを必要とする点である。

従って、特に対象ポリペプチドの生物学的活性形態を獲得するためには正確なリフォールディングが要求されることから、封入体の製造は複雑なものとなる。従って、上記融合ポリペプチドの自己タンパク質分解切断活性を利用することにより、相同Ｎ−末端をもつポリペプチドは一貫して製造されるが、それが細胞質封入体形態で発現される場合、目的生成物の精製方法は依然として単調で時間のかかる作業である。この製造過程は、洗浄、リフォールディング、切断、精製および単離を含む多くの工程を必要とする。

すなわち、複雑な下流プロセッシングにより、ポリペプチドの迅速で費用効率的な産生に関して難題が課されることになる。これは、工業規模での製造にまさしく当てはまることである。従って、ポリペプチドの製造および精製について単純で実行可能な方法が依然として要望されている。

発明の要旨

本発明の範囲内で、驚くべきことに、例えば封入体から対象異種ポリペプチドを得る方法が、特異的アフィニティークロマトグラフィー法と自己タンパク質分解切断活性を呈する融合ポリペプチド系の組合せにより大きく簡易化され得ることが見出された。従って、一つのクロマトグラフィーシステムでの協調作用で製造が実施され得る。

最初に融合ポリペプチドを提供する。この融合ポリペプチドは、自己タンパク質分解切断機能、好ましくはオートプロテアーゼの自己タンパク質分解切断機能、さらに好ましくはペスチウイルスのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏ、およびその誘導体の自己タンパク質分解切断機能を有するポリペプチドを含む。自己タンパク質分解切断機能をもつポリペプチドのＣ−末端に、融合ポリペプチドは、対象異種ポリペプチドを含む。

融合ポリペプチドは、Ｎ−末端部の自己タンパク質分解切断活性を阻害する条件下、宿主細胞で産生される。特に、融合ポリペプチドは、細胞質封入体に変性形態で製造される。これらの封入体を、細胞から単離し、不活性状態を保存する条件下で可溶化する。次いで、融合ポリペプチドを、不活性変性状態の融合ポリペプチドのＮ−末端部を保つ条件下でクロマトグラフィーシステム、特にカラムに選択的に結合させる。

一旦融合ポリペプチドが結合されると、必要に応じて、非結合汚染成分を洗い流す。

融合ポリペプチドのみがクロマトグラフィーシステムに結合された状態であるとき、自己タンパク質分解切断機能を阻害するものから活性化するものへと上記精製システムにおける条件を変化させる。この条件変化で、融合ポリペプチドがその天然立体配置を回復し得ることにより、そのＮ−末端部の自己タンパク質分解切断機能は活性化され、対象ポリペプチドは切断され、相同Ｎ−末端をもつ既に精製されたリフォールディング対象ポリペプチドは溶出されるが、Ｎ−末端部はクロマトグラフィーシステムに結合されたままである。

一旦融合ポリペプチドが結合されると、１）非結合汚染成分を洗い流し、２）リフォールディングさせ、および３）対象ポリペプチドを切断し、そして４）対象ポリペプチドを精製する段階が同一クロマトグラフィーシステムで行なわれる。このため後処理が非常に簡単になる。非結合の汚染成分はこのシステム内で容易に洗い流され、融合ポリペプチドはクロマトグラフィーシステムに選択的に結合された状態で残る。

発明の詳細な記載

相同Ｎ−末端をもつ対象異種ポリペプチドの新規製造方法が提供され、活性ポリペプチドを得るために通常必要とされる複雑な製造工程が大きく低減化される。

従って、本発明は、対象ポリペプチドおよびそのＮ−末端のところに自己タンパク質分解切断機能を呈するポリペプチドを含む融合ポリペプチドを用いる、相同Ｎ−末端を有する対象異種ポリペプチドの製造方法であって、a）アフィニティークロマトグラフィーシステムにより、可溶性で自己タンパク質分解切断が不活性な形態で融合ポリペプチドを結合し、ｂ）融合ポリペプチドのリフォールディングにより、融合ポリペプチドの自己タンパク質分解切断機能の活性化および対象異種ポリペプチドの切断を誘発し、そしてｃ）それに続いて対象異種ポリペプチドを溶出する工程を含み、上記工程を一アフィニティークロマトグラフィーシステムで実施する方法に関するものである。

本明細書で使用されている下記の語は、下記に記載した意味を有する：
「対象異種ポリペプチド」の語は、天然に存する（融合）ポリペプチドから天然に存するオートプロテアーゼにより天然の状態では切断されることのないポリペプチドをいう。対象異種ポリペプチドの例には、工業用酵素（製造用酵素）または特にヒトの治療についての治療活性をもつポリペプチドがある。

「融合ポリペプチド」の語は、２個またはそれ以上のポリペプチドから成るポリペプチドをいう。特に、融合ポリペプチドは、アフィニティー標識、自己タンパク質分解切断部分、好ましくはオートプロテアーゼ、および対象ポリペプチドを含み得る。本発明の意味において、融合ポリペプチドは、対象ポリペプチドおよびそのＮ−末端結合した自己タンパク質分解切断機能をもつポリペプチドを含む。

本発明の意味における「変性形態」の語は、組換え的製法の産物として得られる、通常封入体の可溶化後に得られる、発現した融合ポリペプチドの生物学的に不活性な形態を指す。

「リフォールディング」の語は、可溶化ポリペプチドがその天然立体配座および生物活性を回復する、すなわちその変性した不活性状態からその活性形態へとタンパク質を再構成する間の機構をいう。

「自己タンパク質分解切断機能」の語は、融合パートナーの一方の自己タンパク質分解切断活性をいい、融合ポリペプチドがその変性状態である間は阻害され、融合ポリペプチドのリフォールディング時には活性化される。

融合ポリペプチドは、その自己タンパク質分解切断機能部分が不活性であるとき、ある一定の状態でクロマトグラフィーシステムに結合されている。条件の変化、対象ポリペプチドの切断中、およびその後も、結合は維持されている状態でなくてはならない。本発明の範囲内において、融合ポリペプチドがリフォールディングされている間に切断の開始は達成され、不活性状態から活性状態へと移行する。本発明は、変性条件下においてＮ−末端での融合ポリペプチドの結合を確立し、続いて起こる条件のあらゆる変化を通して自己タンパク質分解切断機能を呈する融合パートナーの結合を維持するアフィニティークロマトグラフィーシステムを提供する。ポリペプチドがクロマトグラフィーシステムに結合されている間にリフォールディングが行なわれるため、付加的必要条件は、アフィニティーシステムがリフォールディング過程を妨げないことである。この問題もまた、本発明により解決される。

本明細書で使用されている「変性（させる）」の語は、ポリペプチドの天然三次元構造を破壊させる条件をいう。

融合ポリペプチドの自己タンパク質分解切断活性部分では、リフォールディングにより活性化、すなわち切断の開始が誘発される。同時に、対象ポリペプチド部分は、その天然立体配座を回復し、その結果、切断された対象ポリペプチドは、その天然活性形態となる。融合ポリペプチドの自己タンパク質分解切断活性部分は切断後もカラムに結合したままであるため、そして非結合汚染成分は切断開始前にカラムから洗い流されているため、既に精製された、リフォールディング対象ポリペプチドがカラムから溶出される。すなわち、融合ポリペプチドの２つの部分の単離、切断剤からの単離またはリフォールディングのためのさらなる後処理は、無くてもすむ。

本発明の範囲内における融合ポリペプチドは、細菌宿主細胞内での製造により初期不活性形態で提供される。

本発明の好ましい実施態様において、融合ポリペプチドは、融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を利用する、封入体形態での細菌宿主細胞における組換え発現により提供される。

本明細書で使用されている「封入体」の語は、形質転換宿主細胞の細胞質に存在する異種ポリペプチドを含む凝集体をいう。これらは、顕微鏡下では輝点として現われ、細胞質の単離により採取され得る。

本明細書で使用されている「形質転換宿主細胞」の語は、異種ポリペプチドをコードするベクターを含む細胞をいう。

カラムでの切断を開始させるため、宿主細胞内でポリペプチドが既に発現している間、融合ポリペプチドの自己タンパク質分解切断活性は開始から阻止されなければならない。宿主細胞の細胞質で発現したポリペプチドの沈積を誘発する条件下での発現については、不活性状態の必要条件が満たされる。

本発明により使用される細菌宿主細胞は、例えば、グラム陰性菌、例えばエシェリキア（Echerichia）種、例えば大腸菌（E.coli）、または他のグラム陰性菌、例えばシュードモナス（Pseudomonas）種、例えばシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）、またはカウロバクター（Caulobacter）種、例えばカウロバクター・クレセンツス（Caulobacter crescentus）、またはグラム陽性菌、例えばバシラス（Bacillus）種、特にバシラス・サチラス（Bacillus subtilis）であり得る。大腸菌（E.coli）が宿主細胞としては特に好ましい。

本発明方法で使用される発現ベクターは、自己タンパク質分解切断機能を呈するポリペプチドおよびそのＣ−末端のところで結合した対象ポリペプチドを含む、融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む。自己タンパク質分解切断活性ポリペプチドのＣ−末端端部で切断が行なわれることにより、所望のポリペプチドの相同Ｎ−末端が形成される。

本発明の好ましい実施態様において、自己タンパク質分解切断機能を呈するポリペプチドは、オートプロテアーゼである。

本明細書で使用されている「オートプロテアーゼ」の語は、自己タンパク質分解切断活性を有し、大きなポリペプチド部分、好ましくは天然オートプロテアーゼからそれ自体を切断させ得るポリペプチドをいう。オートプロテアーゼそれ自体の概念は、当業者には十分利用可能なものである。多くの天然に存するオートプロテアーゼ系が知られている。十分に研究し尽くされたオートプロテアーゼ系は、例えばウイルス性プロテアーゼ、発生系タンパク質（例、ＨｅｔＲ、ヘッジホッグタンパク質（そのカルボキシ末端オートプロテアーゼ）、ＲｕｍＡオートプロテアーゼドメイン、ＵｍｕＤなど）である。

ペスチウイルスを含む、フラビウイルス（Flaviviridae）科内のウイルスは全て、共通してＮＳ３プロテアーゼを有する。プロテアーゼドメインがＮＳ３のＮ−末端から１８０残基に位置し、見かけ上分子内における形でＮＳ２Ａ／２ＢおよびＮＳ２Ｂ／ＮＳ３連結点での切断に関与することは、黄熱病、デング熱２型および西ナイル熱ウイルスで示されている。Ｃ型肝炎およびＧＢウイルスＮＳ３配列の解析結果は、フラビウイルスおよびペスチウイルスＮＳ３配列との密接な関係を示していた。

Ｎ−末端オートプロテアーゼはまた、ピコルナウイルス科に属するプラス鎖ＲＮＡウイルスである、アフトウイルス［口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）］からも見出される。リーダープロテアーゼ（Ｌｐｒｏ）とも称されるこのプロテイナーゼは、システイン−プロテアーゼのパパイン科に属する。これは、ポリタンパク質からの自身の切断に加えて、真核生物開始因子４Ｇの２２０−ｋＤａサブユニットのタンパク質加水分解的分解を誘発するため、キャップ依存的宿主細胞タンパク質合成の遮断の一因となる。ピコルナウイルスＲＮＡはキャッピングされていないため、それは翻訳され続け、キャップ結合タンパク質複合体は不活化されている。しかしながら、アフトウイルスリーダープロテイナーゼ遺伝子は、細胞培養におけるウイルス複製に必要とはされない。

ピコルナウイルス科に属する他の２種のオートプロテアーゼは２Ａおよび３Ｃであり、キモトリプシン様セリンプロテアーゼとの顕著な同一性を有する。両プロテアーゼとも、ポリタンパク質前駆体内に含まれる。植物ウイルスにおける自己タンパク質分解切断についての短い一例は、ビート萎黄ウイルスのリーダープロテイナーゼであり、これは非保存Ｎ−末端ドメイン（ＲＮＡ増幅で機能する）および自己タンパク質分解切断に要求される保存されたパパイン様Ｃ−末端ドメインを有する。

オートプロテアーゼはまた、レトロウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）のＧａｇ−Ｐｏｌポリタンパク質からも見出され得る。ポリタンパク質は、別のポリタンパク質からの第２プロテアーゼとの二量体形成後に自身を放出する９９アミノ酸ロテアーゼを含む。

さらに好ましくは、「オートプロテアーゼ」の語は、自己タンパク質分解切断活性をもつその誘導体を全て含む、ペスチウイルスのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏをいう。

本発明は、オートプロテアーゼがペスチウイルスのＮ^ｐｒｏ、または自己タンパク質分解切断機能をもつその誘導体であるさらなる実施態様に関するものである。

ペスチウイルスは、ｍＲＮＡとして直接作用するゲノムをもつ小さな包膜ウイルスである。ペスチウイルスで同定された２つのウイルスコード化プロテアーゼは、オートプロテアーゼＮ^ｐｒｏおよびセリンプロテアーゼＮＳ３である。プロテアーゼＮ^ｐｒｏは、ポリタンパク質のＮ−末端に位置する。Ｎ^ｐｒｏは、ペスチウイルスのポリタンパク質における第一タンパク質を構成するもので、続くヌクレオキャプシドタンパク質からの自己タンパク質分解切断が行なわれる。この切断は、Ｎ^ｐｒｏの配列における最後のアミノ酸、Ｃｙｓ１６８の後に行なわれる。

ペスチウイルスは、特に古典的ブタコレラ（fewer）ウイルス（ＣＳＦＶ）、ボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）およびウシウイルス性下痢性ウイルス（ＢＶＤＶ）を含む病原体の一群を形成する。

従って、本発明のさらに好ましい実施態様では、ペスチウイルスは、ＣＳＦＶ、ＢＤＶおよびＢＶＤＶから成る群から選択され、ＣＳＦＶが特に好ましい。

本発明のさらに好ましい実施態様では、ＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏは、下記のアミノ酸配列：
配列番号１：

または自己タンパク質分解切断機能をもつその誘導体のアミノ酸配列を有する。

また、ＥＭＢＬデータベース寄託番号Ｘ８７９３９、Ｎ−末端からＣ−末端方向に読む、アミノ酸１〜１６８を参照のこと。

本発明による自己タンパク質分解切断機能をもつ誘導体は、特に相同Ｎ−末端をもつ対象所望の異種ポリペプチドを生成するのに必要とされる自己タンパク質分解切断活性が保持されている限りは、突然変異導入、特にアミノ酸置換、欠失、付加および／またはアミノ酸挿入によりペスチウイルスのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏから誘導される。突然変異導入による上記誘導体の生成方法は当業者には周知である。上記突然変異導入によって、種々の異種ポリペプチドに関してオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの特性を適合させることにより、融合ポリペプチドから切断させることが可能である。特に、本発明の範囲内におけるポリペプチドは、ペスチウイルスのＮ^ｐｒｏの自己タンパク質分解切断活性を依然として呈しながらも、もともと存在するオートプロテアーゼと比べて改善された特性をもつように設計され得る。この点で特に好ましいのは、溶解度に関して改善された特性およびアフィニティークロマトグラフィーシステムへの優れた結合性を示す誘導体であり、上記特性は本発明に関して特に有用なものである。

突然変異導入により得られる誘導体の自己タンパク質分解切断特性は、例えば国際公開第０１／１１０５６号に記載された要領で試験され得る。

上記配列番号１で示されたペスチウイルスの天然Ｎ^ｐｒｏの誘導体は、特に好ましいものであり、システイン残基が置換されている。この点でさらに好ましいのは、システイン残基Ｃ１１２、Ｃ１３４およびＣ１３８が、他のアミノ酸残基、例えばグルタミン酸により置換されている、天然Ｎ^ｐｒｏの誘導体である。特に好ましい誘導体は、下記のアミノ酸配列を含む：
配列番号２：

ペスチウイルスの天然Ｎ^ｐｒｏの別の好ましい誘導体は、上記システイン突然変異に加えて、５３および５７位でアルギニンがグルタミン残基に置換され、グリシン５４がアスパラギン酸に置換され、ロイシン１４３がグルタミンに置換されたものである。この誘導体は、下記のアミノ酸配列を含む：
配列番号３：

すなわち本発明はまた、別の特徴として、融合ポリペプチドがＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体を含み、少なくとも１個の上記システイン残基の置換に加えて、少なくとも１個の疎水性アミノ酸残基が親水性残基により置換されている、上記方法に関するものである。

本発明の範囲内で好ましいのは、少なくとも１個の上記システイン残基の置換に加えて、さらに下記のアミノ酸：Ｖ２４、Ａ２７、Ｌ３２、Ｇ５４、Ｌ７５、Ａ１０９、Ｖ１１４、Ｖ１２１、Ｌ１４３、Ｉ１５５およびＦ１５８の少なくとも１個が置換されているＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体である。好ましい例は、次のアミノ酸：アラニン（Ａ）１０９、バリン（Ｖ）１１４、イソロイシン（Ｉ）１５５およびフェニルアラニン（Ｆ）１５８がトレオニン（Ｔ）により置換された誘導体である。

すなわち、本発明は、別の特徴として、好ましくは、融合ポリペプチドがＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体を含み、少なくとも１個の上記システイン残基の置換に加えて、下記のアミノ酸：アラニン（Ａ）１０９、バリン（Ｖ）１１４、イソロイシン（Ｉ）１５５およびフェニルアラニン（Ｆ）１５８がトレオニン（Ｔ）により置換されている、上記方法に関するものである。また、本発明の範囲内で、ＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏのさらに好ましい誘導体は、下記のアミノ酸配列を含む：
配列番号４：

すなわち、本発明は、別の特徴として、さらに好ましくは、融合ポリペプチドが、配列番号４による配列を有するＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体を含む、上記方法に関するものである。

本発明の範囲内でさらに好ましいのは、少なくとも１個の上記システイン残基の置換に加えて、下記のアミノ酸：アラニン（Ａ）１０９、バリン（Ｖ）１１４，イソロイシン（Ｉ）１５５およびフェニルアラニン（Ｆ）１５８がトレオニン（Ｔ）により、アルギニン（Ｒ）５３がグルタミン酸（Ｅ）により、グリシン（Ｇ）５４がアスパラギン酸（Ｄ）により、アルギニン（Ｒ）５７がグルタミン酸（Ｅ）により、そしてロイシン（Ｌ）１４３がグルタミン（Ｑ）により置換されている、ＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体である。

すなわち、本発明は、別の特徴において、さらに好ましくは、融合ポリペプチドがＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体を含み、少なくとも１個の上記システイン残基の置換に加えて、下記のアミノ酸：アラニン（Ａ）１０９、バリン（Ｖ）１１４、イソロイシン（Ｉ）１５５およびフェニルアラニン（Ｆ）１５８がトレオニン（Ｔ）により、アルギニン（Ｒ）５３がグルタミン酸（Ｅ）により、グリシン（Ｇ）５４がアスパラギン酸（Ｄ）により、アルギニン（Ｒ）５７がグルタミン酸（Ｅ）により、そしてロイシン（Ｌ）１４３がグルタミン（Ｑ）により置換されている、上記方法に関するものである。

最も好ましくは、本発明によるＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体は、下記のアミノ酸配列を含む：
配列番号５：

すなわち、本発明はまた、別の最も好ましい特徴として、融合ポリペプチドが、配列番号５による配列を有するＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体を含む、上記方法に関するものである。

本発明は、別の同じく好ましい特徴において、上記異種タンパク質の製造方法であって、融合ポリペプチドが、配列番号５による配列を有するＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体を含み、さらにアスパラギン（Ｎ）３５がトレオニン（Ｔ）により置換され、トレオニン（Ｔ）１５８がセリン（Ｓ）により置換されている方法に関するものである。

本発明の上記特徴による方法で使用されるＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体もまた、本発明の一部分を形成しており、下記のアミノ酸配列を含む：
配列番号５０：

本発明は、別の好ましい特徴において、上記異種タンパク質の製造方法であって、融合ポリペプチドが、配列番号５０による配列を有するＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体を含み、さらにアラニン（ａ）２８がグルタミン酸（Ｅ）により置換され、セリン（Ｓ）７１がフェニルアラニン（Ｆ）により置換され、アルギニン（Ｒ）１５０がヒスチジン（Ｈ）により置換されている方法に関するものである。

本発明の上記特徴による方法で使用されるＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体もまた、本発明の一部を形成するもので、下記のアミノ酸配列を含む：
配列番号５１：

好ましくは、本発明方法において、配列番号５０による配列を有するＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体は、プロインスリンの製造を目的とする、プロインスリンの少なくとも最初の３アミノ酸を含むタンパク質、好ましくはプロインスリン、さらに好ましくはヒトプロインスリン、最も好ましくは組換えヒトプロインスリンとの融合で使用される。

本発明によると、ＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体では、少なくとも１個の上記システイン残基の置換に加えて、次のアミノ酸：アルギニン（Ｒ）５３、グリシン（Ｇ）５４、アルギニン（Ｒ）５７、トレオニン（Ｔ）１０９、１１４、１５５、１５８およびロイシン（Ｌ）１４３のうち少なくとも１個が置換されている場合が好ましい。本発明によるＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの好ましい誘導体では、少なくとも１個の上記システイン残基の置換に加えて、下記のアミノ酸：アルギニン（Ｒ）５３がグルタミン酸（Ｅ）により、グリシン（Ｇ）５４がアスパラギン酸（Ｄ）により、アルギニン（Ｒ）５７がグルタミン酸（Ｅ）により、トレオニン（Ｔ）１０９、１１４、１５５、１５８がセリン（Ｓ）により、そしてロイシン（Ｌ）１４３がグルタミン（Ｑ）またはアスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）またはセリン（Ｓ）またはヒスチジンにより置換されている。

本発明の上記特徴による方法で使用されるＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの好ましい上記誘導体もまた、本発明の一部を形成するもので、下記のアミノ酸配列を含む：
配列番号５２：

配列番号５３：

配列番号５４：

配列番号５５：

配列番号５６：

発現ベクターは、自己タンパク質分解切断的に切断される融合ポリペプチドの一部として対象ポリペプチドをコードしている。本発明によると、様々な対象ポリペプチドが、上記発現ベクターの使用により製造され得る。例えば、対象ポリペプチドは、薬理学的活性を呈するものであり、例えば、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン、成長因子、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、抗体および抗体フラグメントなど、例えばインターフェロン・アルファ２Ａ、インターフェロン・アルファ２Ｂ、インターロイキン−３、インターロイキン−６、ヒト成長ホルモン、（プロ）インスリン、インスリン様増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子、マクロファージ−コロニー刺激因子、インターフェロン・ベータ１、ウシソマトロピン、ブタソマトロピン、インターロイキン１１、インターロイキン−２、Ｆａｂ−フラグメント、および小ペプチド、例えばカルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、またはグルカゴン、ＣＤ４０リガンド可溶形態、プラスミノーゲン活性化因子、性ステロイド結合タンパク質、上皮増殖因子、組織因子細胞外ドメインから成る群から選択され得る。

さらに、対象ポリペプチドは、他の種類のポリペプチド、特に分析方法に特に適したポリペプチド、例えば緑色蛍光タンパク質などであり得る。

本発明による方法で使用される発現ベクターにおいて、融合ポリペプチドは、少なくとも１つの発現制御配列に機能し得るように結合されている。発現制御配列は、特に、プロモーター（例えばｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７、ｔｒｐ、ｇａｃ、ｖｈｂ、ラムダｐＬまたはｐｈｏＡプロモーター）、リボソーム結合部位（例えば上記プロモーター、ｃｒｏに属する天然リボソーム結合部位または合成リボソーム結合部位）、または転写ターミネーター（例えば rrnＴ１Ｔ２またはｂｌａ）である。

ベクターはまた、下記によると、融合ポリペプチドのＮ−末端に存在し、そのアフィニティークロマトグラフィーシステムへの結合に必要とされる融合ドメイン、例えばポリリシンのようなポリアミノ酸または、免疫アフィニティークロマトグラフィーの場合に、通常は特異的抗体が利用可能である短いペプチド配列である、いわゆる「エピトープ標識」をコード化する配列を含み得る。特異的モノクローナル抗体が容易に利用可能なよく知られているエピトープ標識には、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス、血球凝集素（ＨＡ）、およびｃ−ｍｙｃ標識がある。

本発明の好ましい実施態様において、発現ベクターはプラスミドである。
形質転換された細菌宿主細胞、すなわち発現株は、自体公知の微生物学的実践法にしたがって培養される。

宿主株は、一般的に栄養培地での単コロニーから出発して培養されるが、低温保存細胞懸濁液（細胞バンク）を使用することも可能である。株は、一般にさらなる使用に向けて十分なバイオマスを得るために多段階プロセスで培養される。

小規模の場合、これは振とうフラスコで行われ得るため、ほとんどの場合、複合培地（例えばＬＢブロス）を使用することが可能である。しかしながら、規定培地（例えばクエン酸培地）を使用することも可能である。本発明の好ましい実施態様では、発現した融合ポリペプチドは不溶性封入体形態であるものとするため、これらの場合、比較的高温（例えば３０℃または３７℃）で培養を実施する。誘導系は、封入体の製造に特に適切である（例えばｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｃまたはｐｈｏＡプロモーターによる）。

大規模の場合、多段階システムは、複数のバイオリアクター（発酵槽）により構成されるが、規定栄養培地を使用するのが好ましい。さらに、特に栄養素を定量化すること（フィードバッチ）により、バイオマスおよび生成物の形成を増加させることもおおいに可能である。別法として、このプロセスは、同様に振とうフラスコで行なわれる。
本発明方法において、封入体は自体公知の方法で宿主細胞から単離される。

例えば、発酵が行なわれた後、宿主細胞を遠心分離、精密濾過、フロキュレーションまたはそれらの組合せにより、好ましくは遠心分離により採取する。含水細胞塊を、機械的、化学的または物理的手段、例えば高圧ホモジナイザー、ビーズミル、フレンチプレス、ヒューズプレス、浸透圧ショック、デタージェント、酵素溶解またはそれらの組合せにより崩壊する。好ましくは、細胞の破砕は、高圧ホモジナイゼーションにより行なわれる。組換え融合ポリペプチドが封入体として沈積する好ましい実施態様において、封入体は、例えば高圧分散法または、好ましくは低回転速度での単純遠心分離により得られる。封入体は、遠心分離または精密濾過またはその組合せにより単離される。次いで、対象目的ポリペプチドに関する純度は、例えばＮａＣｌ（例えば０.５〜１.０Ｍ）および／またはデタージェント（例えばトリトンＸ−１００）の存在下で様々な緩衝液に封入体を何回も再懸濁することにより改善され得る。好ましくは、封入体調製物の純度は、様々な緩衝液（例、０.５％デオキシコレート、次いで１ＭのＮａＣｌ溶液で２回−および最後に蒸留水）による数回の洗浄工程により改善される。これによって、通常、外来ポリペプチドの大部分が封入体から除去される。

アフィニティークロマトグラフィーについての製造工程では、単離された封入体は可溶化される必要がある。

本発明は、クロマトグラフィーシステムへの適用前に、提供された融合ポリペプチドを、その自己タンパク質分解切断活性を阻害するカオトロピック条件下で可溶化することを特徴とする、上記製法に関するものである。

本明細書で使用されている「カオトロピック」の語は、分子内相互作用がほとんどまたは全く観察され得ない条件をいう。これらの条件は、例えばデタージェント、アルコール、尿素またはグアニジンＨＣｌの添加により達成され得る。ポリペプチドが異なれば、条件も異なり得る。しかしながら、それぞれのポリペプチドに応じて条件を調節することは、当業者の技能の範囲内である。

カオトロピック剤を用いて封入体を可溶化する。可溶化後、封入体を溶解し、分子内−および分子間相互作用が実質的に低減化された単分子懸濁液を得る。好ましい溶媒は、尿素、グアニジンＨＣｌおよびＮ−ラウロイルサルコシンのような強イオン性デタージェントである。本発明の別の実施態様でも、アルカリ性ｐＨのアルコール水溶液または単にアルカリ性ｐＨの水溶液を用いることにより、封入体を可溶化する。

本明細書で使用されている「可溶化」の語は、封入体を溶かすのに必要とされる過程をいう。可溶化により、分子内および分子間相互作用が最低限に抑えられたポリペプチドの単分子分散液が得られる。

本発明の範囲内における封入体の好ましい可溶化方法は、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ７.３に懸濁し、酸化されたシステイン残基が存在する場合には、還元剤、例えば５０ｍＭのＤＴＴを加えることにより実施される。

必要な場合、例えば、遠心分離により潜在的不溶性物質を除去することが可能である。

不活性融合ポリペプチドを細胞内で溶解し得るように製造する場合、澄明化された細胞ホモジネートを、可溶化封入体について下記で記載したさらなる後処理にかける。

可溶化されたポリペプチドをさらに希釈し、それをアフィニティークロマトグラフィーカラムにローディングすることにより、クロマトグラフィーシステムに適用する。本発明の範囲内では、自己タンパク質分解切断機能を呈する融合ポリペプチドの部分が選択的に認識され、変性カオトロピック条件下で結合されるようにクロマトグラフィーシステムを調節する。これらの条件下で、融合ポリペプチドを変性させ、不活性にする。カラムにおけるポリペプチドのプロセッシングの過程において、条件がリフォールディング的、コスモトロピックに変えられることにより、融合ポリペプチドはその天然立体配置に折り返され、自己タンパク質分解切断機能が活性化される。自己タンパク質分解切断機能を発揮する部分の結合は、条件が変化する間も維持される。

本明細書で使用されている「コスモトロピック」の語は、分子相互作用を促し、従って生物学的構造の形成を促進する条件をいう。分子が異なれば条件も異なり得る。アニオンとしてのクエン酸および硫酸イオン並びにカチオンとしての第４級アミンまたはアンモニウムイオンが最高のコスモトロピック効果を呈する。また、他の試薬、例えばデタージェントまたはレドックス系を導入することにより、リフォールディングが促進され得る。それぞれのポリペプチドに応じて条件を調節することは、当業者の技能の範囲内である。

原則として、カオトロピック条件下で融合ポリペプチドと選択的に結合し、コスモトロピック条件下で結合を維持し得るクロマトグラフィーシステムであれば全て、本発明の枠内で使用され得る。クロマトグラフィーシステムのマトリックスは、好ましい具体例では、カラム形態であり得るが、それはまた、ビーズまたは有機材料、例えばアフィニティーペプチドで修飾されたポリエチレングリコールといった他の形態でもあり得る。

本発明の範囲内での使用に適したクロマトグラフィーシステムは、セルロース結合ドメインに基づき得るもので、それらは、ポリカチオン系標識、例えばポリアルギニンまたはポリリシンを用いるカチオン交換クロマトグラフィーシステム並びにポリアニオン系標識、例えばポリアスパラギンによるアニオン交換クロマトグラフィーであり得る。

従って、本発明の範囲内において、アフィニティークロマトグラフィーシステムは、好ましくは固定化金属イオンクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、セルロース結合ドメインクロマトグラフィーおよびペプチドアフィニティークロマトグラフィーから成る群から選択される。

さらに好ましくは、使用されるアフィニティークロマトグラフィーシステムは、融合ポリペプチドがポリカチオン標識を含む、カチオン交換クロマトグラフィーである。さらに好ましいのは、ポリアルギニンまたはポリリシンアフィニティー標識の使用である。

カチオン交換クロマトグラフィーの場合、発現した融合ポリペプチドは、Ｎ−末端ポリカチオン系標識、例えばポリアルギニンまたはポリリシン標識を含む。宿主細胞から抽出される発現した融合ポリペプチドを含む溶液を（濾過し）、カチオン交換クロマトグラフィーに適した媒質、例えばＳＰセファロースＦＦ、ＣＭセファロースＦＦ、フラクトゲルＥＭＤＳＯ^３−で充填したカラムにローディングする。好ましくは、伝導率が低い緩衝液を適用する。ローディング後、非結合物質を洗い流し、尿素濃度が低い緩衝液を導入することにより、リフォールディングを開始させ得る。０.５Ｍ未満の尿素濃度で、標的タンパク質は切断され、カラムから溶出され得る。

本発明の別の好ましい実施態様は、アフィニティークロマトグラフィーシステムがアニオン交換クロマトグラフィーであり、融合ポリペプチドがポリアニオン系標識を含んでいるものである。さらに好ましくは、ポリアスパラギンをアフィニティー標識として使用する。

所望の結合特性を獲得するためのさらに好ましい実施態様は、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）である。

従って、本発明の好ましい実施態様では、アフィニティークロマトグラフィーシステムは、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）であり、融合ポリペプチドは、金属キレートアフィニティー標識を含む。

この場合、融合ポリペプチドは、それに含まれる金属キレートアフィニティー標識により検出および結合される。

本発明のさらに好ましい実施態様では、金属キレートアフィニティー標識は、ポリヒスチジンアフィニティー標識である。

ＩＭＡＣは、ヒスチジンまたは他の適切な特有のアミノ酸（タンパク質表面に天然に存在するかまたは組換えＤＮＡ技術で移植）および様々な固定化金属イオン、例えば銅、ニッケル、亜鉛または鉄イオン間の特異的な配位共有結合に基づいている。ＩＭＡＣでの使用について当業界で公知のクロマトグラフィー材料もまた本発明の範囲内において有用であり得る。本発明の好ましい実施態様では、Ｎｉ^２＋−キレーティング・セファロース・ファースト・フロー（GE Healthcare、ウプサラ、スウェーデン）がマトリックスとして使用される。

別法として、アフィニティークロマトグラフィーは、融合ポリペプチドのＮ−末端に存在し、上記標識を認識する抗体を介してクロマトグラフィーマトリックスに結合する上記エピトープ標識を用いる、免疫アフィニティークロマトグラフィーであり得る。

また、本発明の範囲内において、必要とされる結合特性を有する、好ましいアフィニティークロマトグラフィー方法は、オリゴペプチドリガンドを用いるアフィニティークロマトグラフィーである。

本明細書で使用されている「オリゴペプチド」の語は、少なくとも３個のアミノ酸を含む、タンパク質性化合物をいう。通常、上記オリゴペプチドは、３５アミノ酸までの長さを有する。

従って、本発明の好ましい実施態様において、アフィニティークロマトグラフィーシステムは、トリプトファン残基を含む、５〜１２アミノ酸長、さらに好ましくは６〜８アミノ酸長のオリゴペプチドリガンドであって、カオトロピック条件下で自己タンパク質分解切断機能を呈する融合ポリペプチドの一部に選択的に結合し、コスモトロピック条件下に向かって変化している間も結合を維持するリガンドを利用する。

アフィニティークロマトグラフィーのこの形態は、例えば抗体から知られている、ある種のポリペプチドの他のポリペプチドへの特異的結合を利用する。オリゴペプチドは、アフィニティーリガンドとしての役割も果たし得る。これらの分子は、高い化学的安定性、有効性、選択性、低価格を呈し、通常それらは毒性を示さない。特に生物薬剤的プロセスで適用されたとき、これらの特徴は有利なものとみなされる。標的分子に対して指向したペプチドリガンドは、当業者に公知の方法で、コンビナトリアルペプチドライブラリーまたは生物学的ライブラリーから同定され得る。本発明の場合、ペプチドリガンドについてのスクリーニングをカオトロピック条件下で実施した。

当業界で公知のペプチド合成方法は、本発明で用いられるオリゴペプチドリガンドの製造に適している。しかしながら、好ましくは、ペプチドリガンドは、ＳＰＯＴ合成法、ＰＩＮ合成法、ティーバッグ合成法、Ruiwu Liu et al. Experimental Hematology ３１（２００３）１１−３０頁に記載された、混合および単離方法、または Joseph A. Buettner et al.、Int.J.Peptide Protein Res. ４７（１９９６）、７０−８３頁に記載された、ＰＥＬＩＣＡＮ法により生成される。第一アミノ酸の固定については、幾つかのリンカー化学作用が適用され得る。本発明の好ましい一例では、リガンドを、別々に生成し、その後クロマトグラフィーマトリックスに固定化する。本発明の別の好ましい実施態様では、ペプチドリガンドを、クロマトグラフィーマトリックスにおいて直接合成する。

オリゴペプチドリガンドは、高度の特異性を発揮する。本発明の範囲内で合成されるオリゴペプチドは、変性条件下でＮ^ｐｒｏ、Ｎ^ｐｒｏ誘導体およびその融合ポリペプチドと選択的に結合できることを特徴とする。本発明の範囲内において、上記オリゴペプチドリガンドを、自己タンパク質分解切断機能を呈する本発明融合ポリペプチドの部分に対して指向させる。

本発明のさらなる好ましい実施態様では、オリゴペプチドリガンドは、
配列番号６：ＶＳＩＦＥＷ
配列番号７：ＡＶＳＩＥＷＹ
配列番号８：ＡＶＳＦＩＷＹ
配列番号９：ＶＳＦＩＷＹＫ
配列番号１０：ＡＳＲＦＷＹＡ
配列番号１１：ＡＦＹＴＷＹＡ
配列番号１２：ＡＦＹＲＷＹＫ
配列番号１３：ＡＦＹＲＷＹ
配列番号１４：ＡＦＹＲＷＹＡ
配列番号１５：ＡＶＳＩＦＥＷＹ
配列番号１６：ＡＶＳＲＮＷＹ
配列番号１７：ＡＳＲＦＷＹ
配列番号１８：ＡＦＹＲＷＹＡＡ
配列番号１９：ＡＦＹＲＷＹ
配列番号２０：ＡＳＲＦＷＹＡＡ
配列番号２１：ＡＦＹＲＷＹＡＡ
配列番号２２：ＡＦＹＳＷＹＡＡ
から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する：

本発明の範囲内において、オリゴペプチドリガンドは、遊離Ｎ−末端または遮断されたＮ−末端を有する形で使用され得、遮断は例えばアセチル化により達成される。

本発明実施態様で最も好ましいのは、配列番号５によるＣＳＦＶの天然Ｎ^ｐｒｏの誘導体を、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４から成る群から選択されるオリゴペプチドリガンドと組合せて使用する場合である。

従って、本発明はまた、固相およびこの固相にカップリングされたペプチド結合を含むアフィニティーリガンドを含むアフィニティーマトリックスを提供するもので、このペプチド結合を含むアフィニティーリガンドは、下記のリガンド：
ａ）式Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４（式中、Ｘ_１〜Ｘ_４はアミノ酸残基であり、Ｘ_１〜Ｘ_４のうち少なくとも２個はＷ、ＹまたはＦである）を含むペプチド；
ｂ）式Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８（式中、Ｘ_５〜Ｘ_８はアミノ酸残基であり、Ｘ_５〜Ｘ_８のうち少なくとも１個はＷであり、Ｘ_５〜Ｘ_８のうち少なくとも１個はＥまたはＤである）を含むペプチド；および
ｃ）Ｒ、Ｋ、ＥおよびＤから成る群のアミノ酸単量体およびＹ、ＦおよびＷから成る群のアミノ酸単量体から成るポリ−アミノ酸、好ましくはポリ−ＫＹ、ポリ−ＫＦ、ポリ−ＫＷ、ポリ−ＲＹ、ポリ−ＲＦ、ポリ−ＲＷ、ポリ−ＥＹ、ポリ−ＤＹ、ポリ−ＥＦ、ポリ−ＥＷ、ポリ−ＤＦおよびポリ−ＤＷ
から成る群から選択されるが、ただし、ａ）およびｂ）によるペプチドは、３５アミノ酸残基の最大長を有し、ｃ）によるポリ−アミノ酸は２０アミノ酸残基の最小長を有するものとする。

これらのアフィニティーリガンドは、本明細書記載のオートプロテアーゼ分子への高い親和力を有し、特にＮ^ｐｒｏ、その誘導体およびその融合タンパク質に結合する。具体的には、これらのリガンドまたはアフィニティーマトリックスは、カオトロピック条件下、およびコスモトロピック条件下でもＮ^ｐｒｏ、その誘導体およびその融合タンパク質、例えば融合タンパク質の少なくともＮ^ｐｒｏ−部分と結合する。

好ましくは、ａ）およびｂ）によるペプチド（本明細書では「オリゴペプチド」とも称す）は、５〜１２個、特に６〜８個のアミノ酸残基長を有する。好ましくは、少なくとも１個の正に荷電したアミノ酸がこれらのオリゴペプチドには存在する。ｃ）によるポリ−アミノ酸は、少なくとも３５アミノ酸残基の好ましい長さ、さらに好ましくは少なくとも５０アミノ酸残基、特に少なくとも１００アミノ酸残基の長さを有する。特に好ましいポリ−アミノ酸は、例えば市販されている培養培地用ポリ−アミノ酸、例えばポリ−ＫＷ、４：１（ＭＷ２００００〜５００００Ｄａ；ＳＩＧＭＡ製品番号Ｐ９２８５）、ポリ−ＫＹ、４：１（ＭＷ２００００〜５００００Ｄａ；ＳＩＧＭＡ製品番号Ｐ４６９５）またはポリ−ＫＦ、１：１（ＭＷ２００００〜５００００Ｄａ；ＳＩＧＭＡ製品番号Ｐ３１５０）である。

本発明によるアフィニティーリガンドは、化学的に修飾され、特にアセチル化、エステル化、アミド化、酸化、還元またはリンカー分子により提供され得る。

アフィニティーリガンドは、好ましくは共有結合により固体マトリックスに結合される。

固相材料としては、当分野で既に適用されている材料であれば全て適している。好ましくは、固相は、クロマトグラフィー材料、特にセルロース、アガロース、アクリルアミド、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）またはエチレングリコール−メタクリレートコポリマーに基づく支持体、マイクロタイタープレート、ニトロセルロース膜、マイクロチップ、ガラスプレートまたは金属被覆支持体から成る群から選択される。

本発明によると、様々なタイプの固相支持体、例えばセルロース、アガロース（Sepharose またはMacro‐Prepゲル）、デキストラン（Sephadex ゲル）、アクリルアミド（Sephacryl、Trisacryl ゲル）、シリカ（ＴＳＫ、ＳＷゲル）、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）（SourceまたはPorosゲル）、エチレングリコール−メタクリレートコポリマー（Toyopearl ＨＷ、ＴＳＫ、ＰＷ、フラクトゲルＥＭＤゲル）または特にアガロースおよびデキストラン（Superdex ゲル）の混合物に基づく支持体が使用され得る。アメリカの所管官庁（ＦＤＡ、すなわち食品医薬品局）または欧州連合機関により人体または獣医学的使用について承認されている支持体が特に選択される。さらに、選択された支持体は、好ましくは共有結合により本発明アフィニティーリガンドに結合されなければならない（支持体は官能化されたと言われる）。固相マトリックスは、マトリックスバックボーンとして、タンパク質および他の生体分子の固相単離において適用可能である自体公知の天然または合成および有機または無機材料、例えば天然または合成多糖類、例えば寒天およびアガロース；セルロース、セルロースエーテル、例えばヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース；澱粉；ゴム類、例えばグアールガム、およびアラビアゴム、ガティガム、トラガカントゴム、イナゴマメガム、キサンタンガム；ペクチン；ムチン；デキストラン；キチン；キトサン；アルギネート；カラゲーニン；ヘパリン；ゼラチン；合成ポリマー、例えばポリアミド、例えばポリアクリルアミドおよびポリメタクリルアミド；ポリイミド；ポリエステル；ポリエーテル；ポリマービニル化合物、例えばポリビニルアルコールおよびポリスチレン；ポリアルケン；無機材料、例えば珪質材料、例えば非晶質シリカおよび石英を含む二酸化珪素；シリカ；金属珪酸塩、多孔質グラス（ＣＰＧ）およびセラミック；金属酸化物および硫化物、またはこれらの天然または合成および有機または無機材料の組合せを含み得る。

マトリックスバックボーンは、好ましくは寒天、アガロース、セルロース、セルロースエーテル、例えばヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリアミド、例えばポリアクリル（ポリメタクリル）−アミド、ポリビニルアルコール、シリカおよび多孔質グラス（ＣＰＧ）から選択される。

マトリックスバックボーンとして特に興味深い固相材料は、例えば寒天またはアガロースビーズ、例えばスウェーデン国、Pharmacia BiotechのSepharose および Superose ビーズおよび米国、BioradのBiogel A；デキストランベースのビーズ、例えば Pharmacia BiotechのSephadex；セルロースベースのビーズおよびメンブラン、例えばチェコスロバキア国、SechezaのPerloza セルロース；合成ビーズ、例えば Sephacryl および Superdex、Pharmacia Biotech;合成有機ポリマーのビーズ、例えば米国、Toso-HaasのFractogel；米国、Perceptive BiosystemsのPOROS 媒質、米国、Bioradの Bio-Rex、Bio-Gel P および Macro Prep、TESSEKのHEMAおよび Separon および BioSepraのHyper D および Trisacryl 媒質、米国3MのEnzacryl および Azlactone；珪質材料、例えば多孔質グラス（CGP）のビーズ、英国BioprocesingのPROSEPおよび BioSepraのSpherocil、およびビーズまたは膜形態でのコーティングしたシリカ合成物、例えば米国、Arbor TechnologiesのACTI-DISK、ACTI-MOD および CycloSepである。

典型的には、固相マトリックスバックボーン、および得られた官能化固相マトリックスは、例えば、不規則な粒子または球状ビーズ、膜またはシート、成形表面、またはスティック形態であり得る。さらに固相材料は、タンパク質に対して全体的または部分的透過性または完全に非透過性であり得る。本発明の特に興味深い実施態様では、マトリックスは、サイズが１〜１００００μｍ、好ましくは１０〜１０００μｍ、高性能適用については例えば１０〜６０μｍおよび調製目的の場合は例えば５０〜５００μｍ、好ましくは５０〜３００μｍの範囲である不規則または球状ビーズ形態である。

マトリックスの特に興味深い形態は、密度調整粒子を含む集塊形態の密度制御型マトリックスである。これらの集塊は、流動または拡張床クロマトグラフィーおよび非充填カラム、例えば攪拌タンクにおける単純なバッチ吸着での種々のバッチ式クロマトグラフィー技術に関する大規模操作において特に適用可能である。

本発明によるアフィニティーリガンドは、本発明によるアフィニティーリガンドおよび固相物質間の直接的化学反応により、または本質的にマトリックスバックボーンおよびリガンドの結合を可能にすることが知られている適切な試薬での固相物質またはリガンドの上記活性化により、本質的にこの目的に関して適用可能であることが知られているあらゆるタイプの共有結合によって固相物質に結合され得る。上記の適切な活性化試薬の例は、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、アリル−グリシジルエーテル；ビス−エポキシド、例えばブタンジオールジグリシジルエーテル；ハロゲン−置換脂肪族化合物、例えばジクロロプロパノール、ジビニルスルホン；カルボニルジイミダゾール；アルデヒド、例えばグルタルジアルデヒド；キノン；臭化シアン；過ヨウ素酸塩、例えばメタ過ヨウ素酸ナトリウム；カルボジイミド；クロロ−トリアジン、例えば、シアヌル酸クロリド；スルホニルクロリド、例えばトシルクロリドおよびトレシルクロリド；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；２−フルオロ−１−メチルピリジニウムトルエン−４−スルホネート；オキサゾロン；マレイミド；ピリジルジスルフィド、およびヒドラジドである。これらの中で、単結合とは異なるスペーサー基ＳＰ１を残す活性化試薬、例えばエピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、アリル−グリシジルエーテル、ビス−エポキシド、ハロゲン置換脂肪族化合物；ジビニルスルホン、アルデヒド、キノン、臭化シアン、クロロ−トリアジン、オキサゾロン、マレイミド、ピリジルジスルフィド、およびヒドラジドが好ましい。

特に興味深い活性化試薬は、エポキシ化合物、例えばエピクロロヒドリン、アリル−グリシジルエーテルおよびブタンジオールグリシジルエーテルであると考えられる。

本発明の範囲内におけるペプチドアフィニティークロマトグラフィーについては、ペプチドリガンドの固定化に有用なものであればいかなるマトリックスでも使用され得る。好ましくは、ドイツ国、ダルムスタットのMerckによる、フラクトゲルエポキシ（Ｍ）または同じく好ましい「モノリシッククロマトグラフィー媒質」ＣＩＭ−エポキシが使用される。リガンドは、クロマトグラフィーマトリックスの化学的に活性化されたバックボーンに直接、またはスペーサーまたはリンカーを介して固定化され得る。後者の場合、スペーサーをクロマトグラフィーマトリックスにカップリングさせ、次いでそのスペーサーを化学的に活性化することにより、リガンドを結合させ得る。好ましくは、フラクトゲルエポキシマトリックスを、スペーサーと組合せて使用する。

本発明の特に好ましい実施態様では、クロマトグラフィーマトリックスとジアミノジプロピルアミン（ＤＡＤＰＡ）との反応、およびそれに続く無水コハク酸（ＳＡ）との反応によりスペーサーを生成させる。生成したスペーサー上の末端カルボキシ基を化学的に活性化し、好ましくは末端アミノ−基に結合させる。リガンドを、それが含む反応基を介してマトリックスまたはスペーサーに固定化する。ペプチドリガンドの場合、上記反応基は、アミノ、カルボキシまたはスルフヒドリル基であり得る。本発明の範囲内では、アミノ結合を介してマトリックスまたはスペーサーにペプチドを固定するのが特に好ましい。

好ましくは、特にアフィニティークロマトグラフィー材料として提供されている、本発明によるアフィニティーマトリックスは、上記ａ）およびｂ）記載のオリゴペプチドリガンドを呈する。

本明細書で使用されている「オリゴペプチド」の語は、少なくとも３個のアミノ酸を含む、タンパク質性化合物をいう。通常、上記オリゴペプチドは、３５個のアミノ酸長、好ましくは４〜２０個のアミノ酸残基長を有する。

従って、本発明の好ましい実施態様において、アフィニティークロマトグラフィーシステムは、特にトリプトファン残基を含む、５〜１２アミノ酸長、さらに好ましくは６〜８アミノ酸長のオリゴペプチドリガンドであって、カオトロピック条件下で自己タンパク質分解切断機能を発揮する融合ポリペプチドの部分に選択的に結合し、コスモトロピック条件下でもそれに向かう変化の間結合を維持するリガンドを利用する。

アフィニティークロマトグラフィーのこの形態は、例えば抗体から知られている、ある種のポリペプチドの他のポリペプチドへの特異的結合を利用する。オリゴペプチドは、アフィニティーリガンドとしての役割も果たし得る。これらの分子は、高い化学的安定性、有効性、選択性、低価格であり、通常それらは毒性を示さない。特に生物薬剤的プロセスで適用されたとき、これらの特徴は有利なものとみなされる。標的分子に対して指向したペプチドリガンドは、当業者に公知の方法で、コンビナトリアルペプチドライブラリーまたは生物学的ライブラリーから同定され得る。本発明の場合、ペプチドリガンドについてのスクリーニングをカオトロピック条件下で実施した。

本発明によるこれらのアフィニティーリガンドは、具体的には、例えば４Ｍ尿素といった、変性条件下でＮ^ｐｒｏおよびＮ^ｐｒｏ−融合タンパク質（およびその突然変異体であるかまたはそれを含むタンパク質）に結合し得る能力を特徴とすることが判明した。

オリゴペプチドリガンドは、高度の特異性を発揮する。本発明の範囲内で合成されるオリゴペプチドは、変性条件下でＮ^ｐｒｏ、Ｎ^ｐｒｏ誘導体およびその融合ポリペプチドと選択的に結合できることを特徴とする。本発明の範囲内では、上記オリゴペプチドリガンドを、自己タンパク質分解切断機能を呈する本発明融合ポリペプチドの部分に対して指向させる。

本発明のさらなる好ましい実施態様において、オリゴペプチドリガンドは、ＶＳＩＦＥＷ、ＡＶＳＩＥＷＹ、ＡＶＳＦＩＷＹ、ＶＳＦＩＷＹＫ、ＡＳＲＦＷＹＡ、ＡＦＹＴＷＹＡ、ＡＦＹＲＷＹＫ、ＡＦＹＲＷＹ、ＡＦＹＲＷＹＡ、ＡＶＳＩＦＥＷＹ、ＡＶＳＲＮＷＹ、ＡＳＲＦＷＹ、ＡＦＹＲＷＹＡＡ、ＡＦＹＲＷＹ、ＡＳＲＦＷＹＡＡ、ＡＦＹＲＷＹＡＡおよびＡＦＹＳＷＹＡＡから成る群から選択されるアミノ酸配列を有する。

本発明の範囲内において、オリゴペプチドリガンドは、遊離Ｎ−末端または遮断されたＮ−末端を有する形で使用され得、遮断は例えばアシル（アセチル）化により達成される。

本発明実施態様で最も好ましいのは、配列番号５によるＣＳＦＶの天然に存するＮ^ｐｒｏの誘導体（この突然変異体のアミノ酸配列は、（野生型における「ＲＧＤＩＲ」の代わりに）残基５３〜５７の配列モチーフ「ＥＤＤＩＥ」を有するため、この突然変異体（およびこのモチーフを含む他の突然変異体）を本明細書では「ＥＤＤＩＥ」−突然変異体と称す）を、ＡＳＲＦＷＹＡ、ＡＦＹＴＷＹＡ、ＡＦＹＲＷＹＫ、ＡＦＹＲＷＹおよびＡＦＹＲＷＹＡから成る群から選択されるオリゴペプチドリガンドと組合せて使用する場合である。

従って、好ましいアフィニティーリガンドは、ＶＳＤＤＷＹ、ＶＳＥＤＷＹ、ＶＳＩＤＷＹ、ＶＳＹＤＷＹ、ＶＳＶＤＷＹ、ＶＳＷＤＷＹ、ＶＳＹＤＷＹ、ＶＳＦＤＷＹ、ＶＳＤＥＷＹ、ＶＳＥＥＷＹ、ＶＳＩＥＷＹ、ＶＳＹＥＷＹ、ＶＳＶＥＷＹ、ＶＳＷＥＷＹ、ＶＳＹＥＷＹ、ＶＳＦＥＷＹ、ＤＤＤＤＷＹ、ＤＤＥＤＷＹ、ＤＤＩＤＷＹ、ＤＤＹＤＷＹ、ＤＤＶＤＷＹ、ＤＤＷＤＷＹ、ＤＤＹＤＷＹ、ＤＤＦＤＷＹ、ＶＳＩＦＷＥ、ＦＳＩＦＥＷ、ＷＳＩＦＥＷ、ＶＳＬＩＷＹ、ＶＳＬＩＤＷ、ＶＳＬＩＥＷ、ＶＳＬＩＷＥ、ＦＳＬＥＥＷ、ＶＳＤＬＤＷ、ＶＳＤＬＥＷ、ＶＳＹＩＤＷ、ＶＳＹＩＷＥ（これらのペプチドは全て、ｐＨ５.５でＮ^ｐｒｏと結合している）、ＶＳＩＤＷＹ、ＶＳＩＥＷＹ、ＶＳＩＷＷＹ、ＶＳＩＩＷＹ、ＶＳＹＩＷＹ、ＶＳＶＩＷＹ、ＶＳＦＩＷＹ、ＶＳＦＩＷＥ、ＶＳＩＦＥＷ、ＶＳＩＦＷＥ、ＦＳＩＦＥＷ、ＷＳＩＦＥＷ、ＶＳＬＩＷＹ、ＶＳＬＩＤＷ、ＶＳＬＩＥＷ、ＶＳＬＩＷＥ、ＦＳＬＩＥＷ、ＷＳＬＩＥＷ、ＦＳＹＦＥＷ、ＦＳＦＹＥＷ、ＷＳＦＹＥＷ、ＦＳＹＩＥＷ、ＷＳＹＩＥＷ（これらのペプチドは全て、ｐＨ７.３でＮ^ｐｒｏと結合している）、ＡＦＹＴＷＹＡ、ＡＦＹＲＷＹＫ、ＡＦＹＲＷＹ、ＡＦＹＲＷＹＡ、ＡＦＦＲＷＹＡ、ＡＦＧＲＷＹＡ、ＡＦＨＲＷＹＡ、ＡＦＩＲＷＹＡ、ＡＦＬＲＷＹＡ、ＡＦＭＲＷＹＡ、ＡＦＮＲＷＹＡ、ＡＦＰＲＷＹＡ、ＡＦＱＲＷＹＡ、ＡＦＲＲＷＹＡ、ＡＦＳＲＷＹＡ、ＡＦＴＲＷＹＡ、ＡＦＶＲＷＹＡ、ＡＦＹＲＷＹＡ、ＡＦＹＦＷＹＡ、ＡＦＹＧＷＹＡ、ＡＦＹＬＷＹＡ、ＡＦＹＭＷＹＡ、ＡＦＹＮＷＹＡ、ＡＦＹＰＷＹＡ、ＡＦＹＴＷＹＡ、ＡＦＹＶＷＹＡ、ＡＦＹＷＷＹＡ、ＡＦＹＹＷＹＡ、ＡＫＷＦＲＹＡ、ＶＳＲＮＷＹ、ＡＳＲＮＷＹＡ、ＡＳＲＦＷＹＡ、ＦＳＲＮＷＹＡ、ＶＦＲＮＷＹＡ、ＶＷＲＮＷＹＡ、ＶＹＲＮＷＹＡ、ＶＳＲＡＷＹＡ、ＶＳＲＦＷＹＡ、ＶＳＲＷＷＹＡ、ＶＳＲＹＷＹＡ、ＶＳＲＮＦＹＡ、ＶＳＲＮＹＹＡ、ＶＳＲＮＷＦＡ、ＶＳＲＮＷＷＡ（これらのペプチドは全て、アミノ酸残基５３〜５７にＥＤＤＩＥモチーフをもつＮ^ｐｒｏ突然変異体に対し特に高い親和力を有する）、Ａｃ−ＡＦＹＴＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＦＹＲＷＹＫＫ、Ａｃ−ＡＦＹＲＷＹＫ、Ａｃ−ＡＦＹＲＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＦＦＲＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＦＧＲＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＦＨＲＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＦＩＲＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＦＬＲＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＦＭＲＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＦＮＲＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＦＰＲＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＦＱＲＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＦＲＲＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＦＳＲＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＦＴＲＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＦＶＲＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＦＹＲＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＦＹＦＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＦＹＧＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＦＹＬＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＦＹＭＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＦＹＮＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＦＹＰＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＦＹＴＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＦＹＶＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＦＹＷＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＦＹＹＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＫＷＦＲＹＡＫ、Ａｃ−ＶＳＲＮＷＹＫ、Ａｃ−ＡＳＲＮＷＹＡＫ、Ａｃ−ＡＳＲＦＷＹＡＫ、Ａｃ−ＦＳＲＮＷＹＡＫ、Ａｃ−ＶＦＲＮＷＹＡＫ、Ａｃ−ＶＷＲＮＷＹＡＫ、Ａｃ−ＶＹＲＮＷＹＡＫ、Ａｃ−ＶＳＲＡＷＹＡＫ、Ａｃ−ＶＳＲＦＷＹＡＫ、Ａｃ−ＶＳＲＷＷＹＡＫ、Ａｃ−ＶＳＲＹＷＹＡＫ、Ａｃ−ＶＳＲＮＦＹＡＫ、Ａｃ−ＶＳＲＮＹＹＡＫ、Ａｃ−ＶＳＲＮＷＦＡＫ、Ａｃ−ＶＳＲＮＷＷＡＫ、ＹＷＫＡ、Ａｃ−ＹＷＫＡＫ、ＹＫＹＡ、Ａｃ−ＹＫＹＡＫ、ＹＷＲＡ、Ａｃ−ＹＷＲＡＫ、ＡＲＷＹ、Ａｃ−ＡＲＷＹＫ、ＹＷＲＡ、Ａｃ−ＹＷＲＡＫ（これらの全ペプチドについては、Ｎ−末端アセチル化およびＣ−末端リシン化故に、基質への固定化能力が改善されている）から成る群から選択される。

本発明の特に好ましい実施態様では、クロマトグラフィーマトリックスとジアミノジプロピルアミン（ＤＡＤＰＡ）との反応、およびそれに続く無水コハク酸（ＳＡ）との反応によりスペーサーを生成させる。生成したスペーサー上の末端カルボキシ基を化学的に活性化し、好ましくは末端アミノ基に結合させる。リガンドを、それが含む反応基を介してマトリックスまたはスペーサーに固定化する。ペプチドリガンドの場合、上記反応基は、アミノ、カルボキシまたはスルフヒドリル基であり得る。本発明の範囲内では、アミノ結合を介してマトリックスまたはスペーサーにペプチドを固定するのが特に好ましい。

クロマトグラフィーシステムへの融合ポリペプチドの結合が達成されると、非結合汚染成分はカラムから容易に洗い流され得る。上記汚染化合物は、例えば封入体に吸蔵または吸着されていたもので、可溶化後のポリペプチド溶液中に残存している宿主細胞ポリペプチドおよび核酸、並びに酵素的細胞破壊からの残留成分であり得る。洗浄後、融合ポリペプチドのみがカラムに結合された状態で残存するため、下記の工程は精製系で実施される。

融合ポリペプチドの結合は、カオトロピック性の不活化条件下で確立される。リフォールディングを誘導するため、条件をコスモトロピック性に変える。

好ましい実施態様において、融合ポリペプチドのリフォールディング段階は、緩衝液の交換により条件をカオトロピック性からコスモトロピック性に変えることにより遂行される。

別法として、緩衝液を徐々にまたは即座にコスモトロピック条件に変えることもできる。本発明の好ましい一例では、カオトロピック性緩衝液とコスモトロピック性緩衝液の交換は、プラグとして緩衝液を適用することにより、即座に実施される。本発明の同じく好ましい別の実施態様では、緩衝液の交換を徐々に実施する。

緩衝液交換が温度調節を有するものであれば、カラムへの融合ポリペプチドの結合および／または上記融合ポリペプチドのリフォールディングおよび切断は簡便化され得る。これは、例えば、冷却／加熱ジャケットにより導入され得る。従って、好ましい実施態様では、冷却／加熱ジャケットを温度調節用に適用する。さらに好ましくは、緩衝液をその適用前に所望の温度に到達させておく。こうして、上記温度調節が達成される。

充填床で条件が変化すると、融合ポリペプチドがリフォールディングし始め、自己タンパク質分解切断機能を発揮する部分が活性状態になる。その結果、対象Ｃ−末端融合ポリペプチドが、自己タンパク質分解部分の特異性により特定される独特な部位で切断されることにより、対象ポリペプチドの相同Ｎ−末端が生成される。融合ポリペプチドのリフォールディングに要求される時間によって、カオトロピック緩衝液が全て充填床から除去されたとき、コスモトロピック緩衝液による移動相の速度は低下するかまたは停止する。リフォールディングが完了後、コスモトロピック緩衝液をさらに供給することにより、遊離した対象ポリペプチドを充填床から洗い流す。融合ポリペプチドおよび非切断融合ポリペプチドのＮ−末端自己タンパク質分解切断部分を、慣用的手段、例えば高い塩濃度、ｐＨ−変化またはＮａＯＨにより溶出し、クロマトグラフィー物質をリフォールディングさせる。リフォールディングさせるため、吸着剤からオートプロテアーゼを単離する緩衝液で充填床を洗浄する。これらの緩衝液は、酸性またはアルカリ性溶液または有機溶媒を含む。出発緩衝液／カオトロピック性緩衝液による再平衡後、次のサイクル用に充填床を準備する。

切断速度が希望するほど高くない場合もあり得るため、必要時には、リフォールディング段階中にカラムから洗い流される非切断融合ポリペプチドは、本発明によるクロマトグラフィープロセスの別のサークルへ再注入され得る。

対象遊離ポリペプチドは、所望により部分的または完全リフォールディング状態でそれぞれの緩衝液の選択により得られる。本発明の範囲内において、流出液中の対象ポリペプチドは、部分的または好ましくは完全にリフォールディングされている。本発明の一例では、融合ポリペプチドの自己タンパク質分解切断活性部分のリフォールディングは完全なものであり得、対象ポリペプチドは部分的に未リフォールディングのままである。この状況は、例えば対象ポリペプチドが、非常に複雑な立体配座、例えば二または三量体化を含むか、補欠分子族または補因子を含むときに起こり得る。対象である上記ポリペプチドは、リフォールディングを完全なものにするために特定の条件を必要とし得る。従って、上記の場合、折りたたみは、例えばプロトン強度またはｐＨまたは通常はリフォールディング中に加えられるデタージェントの完全除去といった特殊な条件を生じさせ得る独立した段階で完成され得る。

本発明の範囲内において、条件は、融合ポリペプチドがカラムに吸着されたままである状態であるように変えられ得る。

本発明はまた、本発明による使用について上記で述べたオリゴペプチドリガンドおよびＣＳＦＶのＮ^ｐｒｏの誘導体について開示している。本発明はまた、本発明による上記のオリゴペプチドおよびＣＳＦＶのＮ^ｐｒｏの誘導体の使用に関するものである。

特に断らなければ、本明細書で使用されている技術および科学用語は全て、通常レベルの当業者が一般的に理解しているのと同じ意味を有する。

以下、実施例により本発明についてさらに説明するが、それらは単なる実例に過ぎず、限定を意図したものではない。特に、実施例は、本発明の好ましい実施態様に関するものである。

実施例１：
ペプチドアフィニティークロマトグラフィーおよび種々の融合ポリペプチドを利用する、本発明による異種ポリペプチドの製造
１.１．ペスチウイルスのＮ^ｐｒｏオートプロテアーゼを利用する異種ポリペプチドの製造
この実施例は、ペスチウイルスオートプロテアーゼ６×Ｈｉｓ−Ｎ^ｐｒｏの融合ポリペプチドとしてのＧＦＰｍｕｔ３.１の製造について記載しており、リフォールディングおよび切断については、ペプチドアフィニティーマトリックスで実施する。

以後の実施例においてＮ^ｐｒｏとの融合構築物で使用されているＧＦＰｍｕｔ３.１は、大腸菌（E.coli）での製造用に最適化されたＧＦＰの突然変異体である。ＧＦＰｍｕｔ３.１は、下記のアミノ酸置換をもつ：Ｓ２はＲにより置換され、Ｓ６５はＧにより、そしてＳ７２はＡにより置換されている。６Ｈ−ｓＮｐ−Ｇｍｕｔ３.１−ｐＥＴ３０ａと命名された融合構築物全体の配列の１７８〜４１５位を、ＧＦＰｍｕｔ３.１の配列と称す。

ベクター６Ｈ−ｓＮｐ−Ｇｍｕｔ３.１−ｐＥＴ３０ａの構築について、下記１.２.１.１および１.２.１.２項に記載する。
下記１.２.２記載の要領で宿主細胞の形質転換を実施する。

１.１.１クロマトグラフィー設備
実施例１におけるクロマトグラフィー操作を、AKTA 100 Explorer クロマトグラフィーシステム（Amersham Biosciences）で実施する。調製したペプチドアフィニティー吸着剤を、ＨＲ５カラム（内径５ｍｍ、Amersham Biosciences）に充填する。ゲル体積は約１ｍｌである。

１.１.２オリゴペプチドリガンドの調製
実施例１で使用するオリゴペプチドリガンドを下記の方法で調製する：
４３３Ａペプチド合成装置（Applied Biosystems、ウィーン、オーストリア国）においてＦｍｏｃ−保護アミノ酸（Bachem、ブーデンドルフ、スイス国）の１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール／Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＨＯＢｔ／ＤＣＣ）−活性化により固相ペプチド合成を実施する。４−ヒドロキシメチル−フェノキシメチル−コポリスチレン−１％ジビニルベンゼン樹脂（ＨＭＰ樹脂、Wang 樹脂）でペプチドを合成する。側鎖用の保護基は、チロシン、セリンおよびトレオニンについてはｔｅｒｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）であり、グルタミン酸およびアスパラギン酸の場合はＯｔＢｕであり、リシンおよびトリプトファンの場合はｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）であり、システイン、ヒスチジン、アスパラギンおよびグルタミンについてはトリチル（Ｔｒｔ）である。第１アミノ酸のカップリングについては、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を触媒として使用する。第１アミノ酸のカップリング後、無水安息香酸を用いることによりキャッピング工程を実施する。Ｆｍｏｃ基の脱保護を、２０％ピペリジンにより実施する。側鎖脱保護および樹脂からの切断を、９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２.５％水および２.５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）を含有する切断混合物との反応により実施する。ジクロロメタン（ＤＣＭ）による洗浄後、粗ペプチドを、エーテル沈澱の反復、次いで凍結乾燥により精製する。３０ｍｌ／分で５〜５０％アセトニトリル対水（０.１％ＴＦＡ）の直線勾配を用い、Ｐ３５００ポンプ（Amershama Biosciences、ウプサラ、スウェーデン国）を備えた Luna １５μ Ｃ１８（２）２５０×２１.２ｍｍカラム（Phenomenex、トレンス、カリフォルニア、米国）でのＲＰ−ＨＰＬＣによりペプチドをさらに精製する。１分当たり１％アセトニトリルの直線勾配でLuna ３μ Ｃ１８（２）１００×４.６ｍｍカラム（Phenomenex）を用いるＨＰ１０９０液体クロマトグラフ（Hewlett Packard、米国）での分析的ＲＰ−ＨＰＬＣにより純度を確認する。マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法（ThermoBioanalysis、ヘンプステッド、英国）により、等質性および同一性を確認する。

１.１.３アフィニティーマトリックスの調製
実施例１で使用されるアフィニティーマトリックスを、下記の方法で製造する：
１０ｇのFractogel エポキシ（Ｍ）（Merck、ダルムシュタット、ドイツ国）を、室温で４８時間、５０ｍｌの１Ｍジアミノジプロピルアミン（ＤＡＤＰＡ）と反応させる。反応後、ゲルを５０ｍｌの１０ｍＭのＨＣｌおよび３×５０ｍｌの水で洗浄する。ゲルを水に再懸濁し、０.１ＭのＮａＯＨの添加によりｐＨを７.０に調節し、２ｇの無水コハク酸を加える。３０分緩やかに攪拌した後、１０ＭのＮａＯＨを加えることにより、ｐＨを７.０に調節し、さらに２ｇの無水コハク酸を加える。さらに３０分攪拌後、ゲルを５０ｍｌの０.１ＭのＮａＯＨ、５０ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、３×５０ｍｌの水および２０％エタノールで洗浄する。吸引乾燥後、ゲルを４℃で貯蔵する。

１.１.４カルボキシ基の活性化およびペプチドの固定化：
実施例１によるアフィニティーマトリックスを下記の方法で活性化する：
１ｇの含水Fractogelを、１.１.３章記載の要領でＤＡＤＰＡ−ＳＡスペーサーにより修飾し、５ｍｌのアセトニトリルで２回洗浄する。３時間、アセトニトリルに溶かした３ｍｌの０.１Ｍのスクシンイミジル−トリクロロエチルカーボネートおよび０.１Ｍのトリエチルアミンで活性化を行う。それに続いてゲルをアセトニトリルおよび１ｍＭのＨＣｌで洗浄する。ペプチドＡＦＹＲＷＹＡを、３ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに溶かす。５ｍｌのペプチド溶液を、迅速にゲルに加え、２４時間反応させる。ペプチドＶＳＦＩＷＹＫを、０.１Ｍトリエチルアミン含有ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶かす。５ｍｌのペプチド溶液を、迅速にゲルに加え、２４時間反応させる。カップリングの前後における試料のＲＰ−ＨＰＬＣにより、カップリング収率を測定する。

ＣＩＭ−エポキシにおけるペプチドの固定化：
０.１５ＭのＮａＣｌを含む１００ｍＭのＮａ_２ＣＯ_３緩衝液（ｐＨ１０.０）にペプチドを溶かす。ＣＩＭディスクを、製造業者が供給したカートリッジに据え付け、室温で４８時間、循環モードでＰ１ポンプ（Amersham Biosciences）を用いることにより、ペプチド溶液をゆっくりとディスクを通してポンプ輸送する。カップリングの前後における試料のＲＰ−ＨＰＬＣにより、カップリング収率を測定する。カップリング後、残存するエポキシ基を、４８時間０.５Ｍのエタノールアミン（ｐＨ１０.０）で遮断する。

１.１.５融合ポリペプチドの発現
６×Ｈｉｓ標識を有するＮ−末端オートプロテアーゼＮ^ｐｒｏおよびＣ−末端融合ＧＦＰｍｕｔ３.１を含む融合ポリペプチドを発現する組換え大腸菌（E.coli）ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を、１０ｌ−発酵槽中で培養する。融合ポリペプチドは、下記のアミノ酸配列を含む：
配列番号２３：

細菌性宿主細胞、すなわち発現株を、自体公知の微生物学的実践法にしたがって培養する。栄養培地における単コロニーから出発して株を全般的に成長させるが、低温保存の細胞懸濁液（細胞バンク）を使用することも可能である。この株を、多段階プロセスで全般的に培養することにより、さらなる使用に十分なバイオマスが入手される。

小規模であれば、これを振とうフラスコ中で行うことができ、ほとんどの場合複合培地（例えばＬＢブロス）を使用することが可能である。しかしながら、規定培地（例えばクエン酸培地）を使用することも可能である。培養法については、小量の宿主株前培養物（単コロニーまたは低温培養からの細胞懸濁液を接種）を生育するが、この培養法における温度は後の発現結果にとっての重大な因子ではないため、比較的高温（例えば３０℃または３７℃）で常用的に操作することが可能である。主培養は大量（例えば５００ｍｌ）で設定され、その場合、良好な通気状態を確保することが特に必要である（内容物の体積と比べて大容量のフラスコ、高速回転速度）。発現は不溶性封入体形態で行われる予定であるため、主培養はほとんどの場合比較的高温（例えば３０または３７℃）で実施される。誘導系は封入体の製造に特に適している（例えばｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｃまたはｐｈｏＡプロモーターによる）。後期対数相に（通常振とうフラスコ中、０.５〜１.０の光学密度で）達した後、これらの場合には誘導物質（例えばインドールアクリル酸、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド＝ＩＰＴＧ）を加え、インキュベーションを１〜５時間続行する。この間、Ｎ^ｐｒｏ融合ポリペプチドの大部分は封入体として細菌の細胞質に沈積される。それらの細胞は採取され、さらなるプロセッシングにかけられ得る。

さらに大規模の場合、多段階システムは、複数のバイオリアクター（発酵槽）により構成され、この場合、この工程のプロセス工学技術的制御を改良し得るためには規定栄養培地を使用するのが好ましい。さらに、特に栄養素の量を調節することにより（フィードバッチ）、バイオマスおよび生成物の形成を増加させることも大いに可能である。さもなければ、この工程は振とうフラスコの場合と同様に行なわれる。例えば、予備段階発酵槽および主段階発酵槽を使用し、振とうフラスコの場合と類似した培養温度を選択する。予備段階発酵槽に、振とうフラスコにおいて単コロニーまたは低温培養物から全般的に生育されたいわゆるイノキュラムを接種する。また、良好な通気状態および十分な誘導物質濃度が発酵槽において−および特にその主段階において確保されなければならない。しかしながら、場合によっては、誘導期は、振とうフラスコの場合と比べて明らかに長いものとしなくてはならないこともある。それらの細胞をもう一度さらなるプロセッシング用に送達させる。

１.１.６封入体の単離
採取後、細胞（５８０ｇ含水重量）を、２５００ｍｌの５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１００、ｐＨ８.０に懸濁する。冷蔵懸濁液を８００ｂａｒで３回ＡＰＶ−２０００高圧ホモジナイザー（Invensys）に通すことにより、細胞を破壊する。通過させる間、懸濁液を氷上で冷却し、Ultraturraxを用いてホモジネートする。ホモジネートを低速での遠心分離（ＪＬＡ１０.５００、７５００ｒｐｍ、３０分）にかけることにより、組換え融合ポリペプチドを含む封入体を得る。

１.１.７封入体の可溶化
沈澱物を５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１００、ｐＨ８.０に懸濁し、遠心分離にかける。この処理を反復する。Ｈ_２Ｏ−洗浄処理後、沈澱物をＨ_２Ｏに懸濁する。得られた封入体−懸濁液を−２０℃でさらなる使用時まで貯蔵する。封入体−懸濁液を、室温で５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、１０Ｍの尿素、５０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７.３により１：５に希釈する。不溶性成分を遠心分離により除去する。約１５ｍｇ／ｍｌのポリペプチド濃度を得る。ポリペプチド溶液を５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、４Ｍの尿素、ｐＨ７.３で希釈することにより、約２ｍｇ／ｍｌのポリペプチド濃度に到達させる。

１.１.８クロマトグラフィーカラムへの融合ポリペプチドの結合
０.５ｍｌのポリペプチド溶液を、Fractogel−ＤＡＤＰＡ−ＳＡ−ＶＳＦＩＷＹＫ（０.５×５ｃｍ）マトリックスに適用し、それぞれのペプチドの調製およびカップリングを上記１.１.２および１.１.３の要領で実施する。５０ｃｍ／時の直線的流速で５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、４Ｍの尿素、ｐＨ７.３によりカラムを平衡状態にする。試料注入後、流速を１５０ｃｍ／時まで高める。

１.１.９非結合汚染物質の洗浄
非結合成分を、５倍カラム容量の平衡緩衝液で洗浄する。リフォールディング緩衝液、特に０.５Ｍのトリス／ＨＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、３％グリセリン、５ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７.３への緩衝液交換を４.５倍カラム容量で実施する。

１.１.１０リフォールディング、切断および溶出
カオトロピックからコスモトロピックへ条件を変えた後、流れを止めることにより、融合ポリペプチドを２５時間クロマトグラフィー樹脂においてリフォールディングさせる。活性オートプロテアーゼは、Ｃ−末端融合ＧＦＰｍｕｔ３.１を切断させる。それに続いて流速５０ｃｍ／時でリフォールディング緩衝液により溶出すると、蛍光測定法およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認される、精製天然ＧＦＰｍｕｔ３.１が得られる。

１.１.１１リフォールディング
クロマトグラフィー樹脂のリフォールディングを、５０ｃｍ／時の流速で０.１ＭのＮａＯＨにより実施する。

１.２ペスチウイルスのＮ^ｐｒｏオートプロテアーゼ誘導体を利用する異種ポリペプチドの製造
この実施例では、ペスチウイルスオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの突然変異体：６×Ｈｉｓ−Ｎ^ｐｒｏＥＤＤＩＥの融合ポリペプチドとしてのＧＦＰｍｕｔ３.１の製造について記載しており、リフォールディングおよび切断をペプチドアフィニティーマトリックスで実施する。

オリゴペプチドリガンドおよびアフィニティーマトリックスの製造を実施例１.１記載の要領で実施し、実施例１.１で記載したのと同じクロマトグラフィー設備を使用する。

１.２.１プラスミドの構築：
１.２.１.１７Ｈ−Ｎｐ−Ｇｍｕｔ３.１−ｐＥＴ３０ａプラスミドの構築：
Ｎ−末端に７−Ｈｉｓ標識を含むＮ−末端先端切除型Ｎ^ｐｒｏについての遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを、ＮＰ６−ｐＥＴ（Sandoz）プラスミドからのＰＣＲプライマー対：
Ｔ７−ｐＥＴ（配列番号２４）：

Ｎ^ｐｒｏＲ−Ｋｐｎ（配列番号２５）：

により増幅し、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩ（Ａｓｐ７１８）制限部位を介してｐＥＴ−３０ａ（＃６９９０９−３、２００２−２００３カタログ、Novagen、CN Biosciences Inc.、Merck KgaA、ダルムシュタット、ドイツ国）へ挿入する。大腸菌（E.coli）ＤＨ５アルファ（＃１０６４３−０１３、Invitrogen カタログ２００３、Invitrogen Life Technologies Corporation、１６００ファラデー・アベニュー、ＰＯボックス６４８２カールスバッド、カリフォルニア９２００８）へのリガンド反応物の形質転換、形質転換クローンからのプラスミドＤＮＡの単離および配列決定による確認の結果、プラスミド７Ｈ−Ｎ^ｐｒｏ−ｐＥＴ３０ａプラスミドを得た。プラスミドｐＧＦＰｍｕｔ３.１（＃６０３９−１、カタログ１９９９、BD Biosciences Clonetech、１０２０イースト・メドウ・サークル、パロアルト、カリフォルニア９４３０３−４２３０、米国）からは、同様にＧＦＰｍｕｔ３.１配列を、ＰＣＲプライマー対：
ＧＦＰＦ−Ｋｐｎ（配列番号２６）：

ＧＦＰＲ−Ｓａｌ（配列番号２７）：

により増幅し、ゲル抽出により単離し、ＫｐｎＩ−ＳａｌＩ制限部位を介して７Ｈ−Ｎ^ｐｒｏ−ｐＥＴ３０ａ構築物へクローン化することにより、切断部位のすぐ後にアミノ酸配列ＳＧＴ（セリン−グリシン−トレオニン）を作製する。構築物７Ｈ−Ｎｐ−Ｇｍｕｔ３.１−ｐＥＴ３０ａの配列を上記要領で確認する。

１.２.１.２６Ｈ−ｓＮｐ−Ｇｍｕｔ３.１−ｐＥＴ３０ａプラスミドの構築：
Ｎ^ｐｒｏ−プロ−インスリンについてのＤＮＡ配列（配列番号２８）：

を、Operon Biotechnologies Inc.（１０００アトランティック・アベニュー、スウィート１０８アラメダ、カリフォルニア９４５０１、米国）により、特注合成させ、ｐＵＣ１１９（ＮＣＢＩ＃Ｕ０７６５０：National Center for Biotechnology Information Plasmid Database、National Library of Medicine、ビルディング３８Ａ、ベセズダ、メリーランド２０８９４米国）へ挿入する。このプラスミドから、太線で示したＮ^ｐｒｏ−プロ−インスリン配列を、下記のプライマー対：
６Ｈ−Ｎ^ｐｒｏ−Ｆ−ＮｄｅＩ（配列番号２９）：

およびＩｎｓ−Ｒ−Ｓａｌｌ（配列番号３０）：

を用いるＰＣＲにより増幅し、生じたフラグメントをアガロースゲル電気泳動およびゲル抽出により単離し、ＮｄｅｌおよびＳａｌｌについて新たに作製された制限部位（太文字）を介して同制限部位で切断されたベクターｐＥＴ３０ａ（＃６９９０９−３、２００２−２００３カタログ、Novagen、CN Biosciences Inc.、Merck KgaA、ダルムシュタット、ドイツ国）へライゲーションすることにより、６Ｈ−ｓＮ^ｐｒｏ−Ｉｎｓ−ｐＥＴ３０ａを作製する。６Ｈ−ｓＮ^ｐｒｏ−Ｉｎｓ−ｐＥＴ３０ａを、ＳｐｅＩおよびＳａｌＩ制限部位で切断し、大きい方のフラグメントをゲル電気泳動および抽出で単離することにより、プロ−インスリンについての配列を除去する。挿入体を調製するため、ベクター７ＨＮｐ−Ｇｍｕｔ３.１−ｐＥＴ３０ａ（構築については１.２.１.１を参照）を、同酵素により消化し、ＧＦＰｍｕｔ３.１をコードする切除されたＤＮＡフラグメントをゲル抽出により単離する。調製したベクターへこのＤＮＡフラグメントをライゲーションすることにより、合成Ｎ^ｐｒｏとＧＦＰｍｕｔ３.１の融合をコードする、構築物６Ｈ−ｓＮｐ−Ｇｍｕｔ３.１−ｐＥＴ３０ａが得られる。ＤＮＡ配列を１.２.１.１記載の要領で制御する。

１.２.１.３Ｓ−Ｎｐ−Ｉｎｓ−ｐＥＴ３０ａの構築
Operon Biotechnologies Inc.により、特注合成され、ｐＵＣ１１９に挿入されたＮ^ｐｒｏ−プロ−インスリンについてのＤＮＡ配列を含む構築物から、必要とされるＮ^ｐｒｏ−プロ−インスリン配列を、下記のプライマー対：
Ｎ^ｐｒｏ−Ｆ−ＮｄｅＩ（配列番号３１）：

およびＩｎｓ−Ｒ−ＳａII（配列番号３０）
を用いるＰＣＲにより増幅する。

生成したフラグメントをアガロースゲル電気泳動およびゲル抽出により単離し、ＮｄｅＩおよびＳａｌｌについての新たに作製された制限部位（太文字）を介して同制限部位で切断されたベクターｐＥＴ３０ａへライゲーションする。プラスミドｓＮ^ｐｒｏ−Ｉｎｓ−ｐＥＴ３０ａのＤＮＡ配列を、上記要領で制御する（１.２.１.１参照）。

１.２.１.４６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−ｓＧｍｕｔ３.１−ｐＥＴ３０ａプラスミドの構築：
Operon Biotechnologies Inc.により、特注合成され、ｐＵＣ１１９に挿入されたＮ^ｐｒｏ−プロ−インスリンについてのＤＮＡ配列を含む構築物から、必要とされるＮ^ｐｒｏ−配列を、下記のプライマー対：
Ｎ^ｐｒｏ−Ｆ−ＮｄｅＩ（配列番号３１）
およびＮ^ｐｒｏ−Ｒ−ＳａII（配列番号３２）：

を用いるＰＣＲにより増幅し、ＮｄｅＩおよびＳａIIについての新たに作製された制限部位（太文字）を介してベクターｐＥＴ３０ａへ挿入することにより、Ｓ−Ｎｐ−６Ｈ−ｐＥＴ３０ａを作製する。Ｓ−Ｎｐ−６Ｈ−ｐＥＴ３０ａから、２つの標準５０μｌＰＣＲ反応：一つは５０ｐｍｏｌのＮ^ｐｒｏ−Ｆ−ＮｄｅＩプライマー（下記表１）および５０ｐｍｏｌの復帰突然変異プライマー（３'−）、５単位のＴａｑＤＮＡ−ポリメラーゼ（＃ＧＣ００２００４、２００４年カタログ、Genecraft、トレスコフ・ストラッセ１０、Ｄ−４８１６３ミューンステル、ドイツ国）、１×ＰＣＲ緩衝液（＃ＧＣ００２００６、２００４年カタログ、Genecraft）および２０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ混合物（＃ＧＣ０１３００４、２００４年カタログ、Genecraft）との反応；および５０ｐｍｏｌのＮ^ｐｒｏ−Ｒ−Ｓａｌｌプライマー（下記表１参照）および５０ｐｍｏｌの前進突然変異プライマー（５'−）、５単位のＴａｑＤＮＡ−ポリメラーゼ、１×ＰＣＲ緩衝液および２０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ混合物との第２反応によりＮ^ｐｒｏ配列を増幅する。ＰＣＲ反応は、蓋加熱型サーモサイクラーで下記のプログラムを用いて行なわれる：９４℃３分；２５サイクル：９４℃３０秒、５４℃３０秒、６８℃１分；最終インキュベーション、６８℃で７分。製造業者の推奨（QIAquick（登録商標） Spin Handbook ２００２年７月）にしたがって、QIAquick（登録商標）ＰＣＲ精製キット（QIAGEN GmbH、キアゲンストラッセ１、Ｄ４０７２４ヒルデン、ドイツ国、カタログ番号２８１０６、Qiagen Product Guide ２００４）により遊離プライマーを除去する。両ＰＣＲの１００分の１を合わせ、９４℃３分；２５サイクル：９４℃３０秒、５４℃３０秒、６８℃１分；６８℃で７分最終インキュベーションというプログラムを用いて蓋加熱型サーモサイクラーにおける５０ｐｍｏｌのＮ^ｐｒｏ−Ｆ−ＮｄｅＩプライマー（配列番号３１）および５０ｐｍｏｌのＮ^ｐｒｏ−Ｒ−Ｓａｌｌプライマー（配列番号３２）、５単位のＴａｑＤＮＡ−ポリメラーゼ（Genecraft）、１×ＰＣＲ緩衝液（Genecraft）および２０ｎｍｏｌの各ｄＮＴＰ混合物（Genecraft）との標準５０μｌＰＣＲ反応で増幅する。製造業者の推奨にしたがってQIAquick（登録商標）ＰＣＲ精製キット（QUIAGEN）により、遊離プライマーを除去する。ＰＣＲフラグメントを、ＮｄｅＩおよびＳａｌｌ制限部位を介してベクターｐＥＴ３０ａへ挿入する。次いで、構築物を次の突然変異段階に使用する。６連続処置でこれを行うことにより、下記表１に示されたそれぞれのプライマーを選択しながら、アミノ酸変化を一つずつ導入する。各段階で得られたプラスミドを、上記要領（１.２.１.１参照）でのＤＮＡ配列解析により制御する。プライマー対Ｎ^ｐｒｏ−Ｆ−Ｎｄｅｌ（配列番号３１）および３'_Ｉ１５５Ｔ,Ｆ１５８Ｔ（配列番号３３）：

との単ＰＣＲ反応により、最後の突然変異段階（Ｉ１５５ＴおよびＦ１５８Ｔ）を行い、生成したＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩおよびＳｐｅＩ（太文字、下表１）制限部位を介してＳ−Ｎｐ−６Ｈ−ｐＥＴ３０ａへ挿入する。上記要領（１.２.１.１参照）のＤＮＡ配列解析により、構築物ＥＤＤＩＥ−６Ｈ−ｐＥＴ３０ａの配列を確認する。

表１：

ＥＤＤＩＥ−６Ｈ−ｐＥＴ３０ａから、下記のプライマー対を用いるＰＣＲによりＥＤＤＩＥを増幅する：
６Ｈ−Ｎ^ｐｒｏ−Ｆ−ＮｄｅＩ、（配列番号２９）およびＮ^ｐｒｏ−Ｒ−Ｓａｌ、（配列番号３２）および得られたフラグメントを用いることにより、構築物Ｓ−Ｎｐ−Ｉｎｓ−ｐＥＴ３０ａ（１.２.１.３参照）において、ＮｄｅＩおよびＳｐｅＩについての制限部位（太文字）を介してＮ^ｐｒｏを置換することにより、６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−Ｉｎｓ−ｐＥＴ３０ａを作製する。ベクター６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−Ｉｎｓを、ＳｐｅＩ／ＳａｌＩにより消化し、大きい方のフラグメントをゲル電気泳動および抽出により単離し、プロ−インスリンについての配列を除去する。Operon Biotechnologies Incにより特注製造されたｐＵＣ１１９における合成ｓＧＦＰｍｕｔ３.１遺伝子
配列番号４６：

を含む構築物から、プライマー対
ｓＧＦＰ−Ｆ−Ｓｐｅ、（配列番号４７）：

および
ｓＧＦＰ−Ｒ−Ｓａｌ（配列番号４８）：

を用いるＰＣＲにより挿入体を生成する。

次いで、精製ＰＣＲ産物をＳｐｅＩ／ＳａｌＩで消化し、６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−ＩｎｓのＳｐｅＩ／ＳａｌＩフラグメントへライゲーションすることにより、プロインスリン遺伝子をｓＧｍｕｔ３.１により置換して、構築物６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−ｓＧｍｕｔ３.１−ｐＥＴ３０ａを形成する。各段階のＤＮＡ配列を上記要領（１.２.１.１参照）で制御する。

１.２.２形質転換：
エレクトロコンピテント細胞を、１リットルの細菌培養物（３７℃および２２５ｒｐｍで生育、ＯＤ_６００＝０.５）から調製する。細胞懸濁液を氷上で１５分間冷却（連続攪拌）し、沈降させ（４℃、２５００ｇ、および１０分）、上清を完全除去する。残存する沈澱物を４℃の脱イオン水１リットルに再懸濁し、再びスピンダウンし（４℃、２５００ｇ、１０分）、断続的に遠心分離処理（４℃、２５００ｇ、１０分）をしながら５０ｍｌの脱イオン水（４℃）で２回洗浄する。沈澱を５０ｍｌの１０％滅菌グリセリン溶液（４℃）で最終洗浄し、沈降させ（４℃、２５００ｇ、１０分）、２.５ｍｌの１０％滅菌グリセリン溶液（４℃）に再懸濁し、冷凍し、−８０℃で４０μｌアリコートにおいて貯蔵する。１アリコートのエレクトロコンピテント細胞を氷上で解凍し、５ｎｇのＤＮＡを含むライゲーション反応物１μｌを加え、空気を吹き込まずに１ｍｍ電極ギャップを有する電気穿孔キュベットに移す。４.５分より一定して短時間で１.５ｋＶ、２５μＦ、２００オームに設定された BIO-RAD パルスコントローラー（Bio-Rad Laboratories Inc.、２０００アルフレッド・ノーベル・ドライブ、ハーキュリーズ、カリフォルニア９４５４７、米国；カタログ番号１６５２０９８、Life Science Research Products １９９８）を含む BIO‐RAD Gene Pulser（登録商標）（Bio-Rad Laboratories Inc.、２０００アルフレッド・ノーベル・ドライブ、ハーキュリーズ、カリフォルニア９４５４７、米国；カタログ番号１６５２０７７、Life Science Research Products １９９８）により電気穿孔を行う。その直後、１８０μｌのＴＹ−ブロス（１.０％ｗ／ｖペプトン、０.７％ｗ／ｖ酵母抽出物、０.２５％ｗ／ｖＮａＣｌ）を加え、懸濁液を滅菌１４ｍｌプラスチック管に移し、３０分間（３７℃、２２５ｒｐｍ）インキュベーションする。次いで、懸濁液を選択培地で平板培養する。３７℃で一晩インキュベーション後、コロニーを採取し、２ｍｌのＴＹ−ブロスに移し、３７℃および２２５ｒｐｍで一晩インキュベーションする。一晩培養物１ｍｌを標準方法によるプラスミド調製に使用し、プラスミド調製物を制限分析およびＤＮＡ配列決定にかける。配列解析により確認後、本明細書記載の方法により、プラスミドを発現株でのさらなる形質転換に使用する。

１.２.３融合ポリペプチドの発現
下記のアミノ酸配列をもつＮ−末端オートプロテアーゼ６Ｈ−Ｎ^ｐｒｏＥＤＤＩＥおよびＣ−末端ＧＦＰｍｕｔ３.１との融合ポリペプチドを発現するｐＥＴ３０プラスミドを含む組換え大腸菌（E.coli）ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を、バッフル付フラスコ中、総容量１.８リットルでＬＢ−ブロス中において培養する。
配列番号４９：

１.１.５記載の要領で細胞を培養する。

１.２.４封入体の単離
細胞破壊を酵素的に実施する。簡単に述べると、細胞を、４０ｍｌの２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＭｇＣｌ_２（ｐＨ８.２）に懸濁する。７２ｍｇのリゾチームおよび３００ＵのBenzonase（登録商標）を加える。ＲＴで４５分間インキュベーション後、１.３ｇのＮａＣｌおよび０.５ｍｌのトリトンＸ−１００を加える。さらに１５分後、懸濁液を遠心単離（Beckman JA ２５.５０、１００００ｒｐｍ、１５分、４℃）にかけて、封入体を得る。

１.２.５封入体の可溶化
沈澱を２０ｍｌの０.５％デオキシコレート中で１回、２０ｍｌの１ＭＮａＣｌ中で２回洗浄し、次いでＨ_２Ｏで洗浄する。生じた沈澱（約２ｇ含水重量）を１０ｍｌのＨ_２Ｏに懸濁し、さらなる使用時まで−２０℃で貯蔵する。

懸濁液のアリコートを、５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、１０Ｍの尿素（ｐＨ７.３）で１：５に希釈し、封入体を溶解する。遠心分離で不溶性成分を除去した後、溶液を５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、４Ｍの尿素（ｐＨ７.３）で１：５に希釈する。

１.２.６融合ポリペプチドの結合
おおよそのポリペプチド濃度が２ｍｇ／ｍｌである溶液２ｍｌを、上記要領でペプチドアフィニティーマトリックスに適用する。簡単に述べると、Fractogel‐ＤＡＤＰＡ-ＳＡ-ＡＦＹＲＷＹＡ（０.５内径×５ｃｍ）を、５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、４Ｍの尿素（ｐＨ７.３）により平衡状態にする。２ｍｌの試料を流速２５ｃｍ／時で注入する。

１.２.７非結合汚染物質の洗浄
非結合成分を、流速１５０ｃｍ／時で５倍カラム容量の平衡緩衝液により洗い流す。４.５倍カラム容量の２００ｍＭトリス／ＨＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１０％グリセリン（ｐＨ７.３）との緩衝液交換によりリフォールディングを誘導する。

１.２.８リフォールディング、切断および溶出
流れを止めることにより、結合融合ポリペプチドを２５時間リフォールディングさせておく。リフォールディング時、結合したオートプロテアーゼはその特異部位で切断し、融合パートナーＧＦＰｍｕｔ３.１を放出する。次いで、融合ポリペプチドを、流速１５０ｃｍ／時で２００ｍＭトリス／ＨＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１０％グリセリン（ｐＨ７.３）緩衝液により洗浄する。１ｍｌフラクションを集め、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度および４８８ｎｍの励起および５２０ｎｍの放射での蛍光について分析する。融合パートナーＧＦＰｍｕｔ３.１を含むフラクションを、精製ＧＦＰｍｕｔ３.１についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥによりさらに分析する。

１.２.９リフォールディング
切断された対象ポリペプチドの溶出後、流速１５０ｃｍ／時で５倍カラム容量の０.１ＭＮａＯＨでカラムのリフォールディングを実施する。

実施例２：
固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーを用いた、本発明による異種ポリペプチドの製造
この実施例では、ペスチウイルスオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの突然変異体：６×Ｈｉｓ−Ｎ^ｐｒｏＥＤＤＩＥの融合ポリペプチドとしてのＧＦＰｍｕｔ３.１の製造について記載しており、リフォールディングおよび切断を固定化金属イオンアフィニティーマトリックスで実施する。

ＩＭＡＣおよびペプチドアフィニティークロマトグラフィーの両方法を直接比較できるよう、それら両方で同一構築物を使用できるようにするためＨｉｓ−標識を融合ポリペプチドに導入する。標識は、アフィニティークロマトグラフィー中における融合ポリペプチドとオリゴペプチドリガンドの相互作用には必要とされない。

封入体の製造および可溶化を、実施例１.２.４および１.２.５記載の要領で実施する。

２.１クロマトグラフィーカラムに融合ポリペプチドを結合させるクロマトグラフィーカラムの製造
キレーティング・セファロース・ファースト・フロー（Amersham Biosciences）を、内径０.５×５ｃｍの床寸法までカラムに充填し、貯蔵溶液を水で洗浄する。次の段階で、金属イオンＮｉ^２＋を、カラムにローディングする。総カラム容量の約３分の２の１００ｍＭＮｉＣｌ_２またはＮｉＳＯ_４を適用する。非結合Ｎｉ^２＋イオンを洗い流す。５０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、４Ｍの尿素（ｐＨ７.３）によりカラムを平衡状態にした後、約２ｍｇ／ｍｌの濃度でポリペプチド溶液０.５ｍｌをカラムに適用する。ローディングの流速は５０ｃｍ／時である。

２.２非結合汚染物質の洗浄
非結合試料成分を、５倍カラム容量の平衡緩衝液により洗い流した後、５００ｍＭのトリス／アセテート、０.２５Ｍのしょ糖、１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７.３）への緩衝液交換を実施する。

２.３リフォールディング、切断および溶出
４.５倍カラム容量で処理後、流れを止めることにより、融合ポリペプチドをリフォールディングさせると、リフォールディング時、オートプロテアーゼは融合パートナーを切断する。１ｍｌの５００ｍＭトリス／アセテート、０.２５Ｍしょ糖、１ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ７.３）緩衝液を用いて再び流れを１５０ｃｍ／時の速度で活性化することにより、対象ポリペプチドの溶出を実施する。フラクションを集め、蛍光測定およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。

２.４リフォールディング
クロマトグラフィー樹脂のリフォールディングを、５０ｍＭのアセテート、６Ｍの塩化グアニジニウム（ｐＨ３.５）により流速５０ｃｍ／時で実施する。

実施例３：
カラムでのＮ^ｐｒｏＥＤＤＩＥ−ｓＳＰＡ−Ｄの切断
この実施例では、ペスチウイルスオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの突然変異体：Ｎ^ｐｒｏＥＤＤＩＥの融合ポリペプチドとしての発現によるブドウ球菌（staphylococcus）プロテインＡドメインＤの製造について記載しており、リフォールディングおよび切断をペプチドアフィニティーマトリックスで実施する。オートプロテアーゼＮ^ｐｒｏＥＤＤＩＥおよびＣ−末端融合プロテインＡドメインＤ（ｓＳＰＡ−Ｄ）を含む融合タンパク質を、Ｎ^ｐｒｏＥＤＤＩＥ−ｓＳＰＡ−Ｄと称し、下記の要領で製造する：

下記のアミノ酸配列をもつ融合ポリペプチドを発現するｐＥＴ３０プラスミドを含む組換え大腸菌（E.coli）ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を、１.１.５記載の要領で１０リットル発酵槽において培養する。完全融合構築物のアミノ酸１〜１６８を、ＮｐｒｏＥＤＤＩＥの配列といい、アミノ酸１６９〜２２９をｓＳＰＡ−Ｄの配列という。

封入体の単離および可溶化を実施例１.１記載の要領で実施する。

クロマトグラフィーカラムへの融合ポリペプチドの結合
Fractogel−ＤＡＤＰＡ−ＩＴ−ペプチド（０.５×５ｃｍ）マトリックスについて、それぞれのペプチドの選択およびカップリングを上記要領で実施したものを、５０ｃｍ／時の直線的流速で５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、４Ｍの尿素、ｐＨ７.３により平衡状態にする。１ｍｌのポリペプチド溶液を、５０ｃｍ／時の直線的流速で適用する。試料注入後、流速を１５０ｃｍ／時まで高める。

非結合汚染物質の洗浄
非結合成分を、５倍カラム容量の平衡緩衝液で洗い流す。リフォールディング緩衝液、具体的には１Ｍのトリス／ＨＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０.２５Ｍのしょ糖、１０ｍＭの −モノチオグリセリン、ｐＨ７.３への緩衝液交換を、６倍カラム容量で実施する。

リフォールディング、切断および溶出
カオトロピックからコスモトロピックへ条件を変えた後、流れを止めることにより、融合ポリペプチドをクロマトグラフィー樹脂において２５時間リフォールディングさせる。活性オートプロテアーゼは、Ｃ−末端融合ｓＳＰＡ−Ｄを切断する。リフォールディング緩衝液による後続の溶出により、天然ｓＳＰＡ−Ｄを得る。１５０ｃｍ／時で１０ＣＶの０.２ＭＮａＯＨによりマトリックスのリフォールディングを実施する。

実施例４
カラムでの６Ｈｉｓ−Ｎ^ｐｒｏＥＤＤＩＥ−ＧＦＰｍｕｔ３.１のリフォールディングおよび切断
この実施例では、６Ｈｉｓ−Ｎ^ｐｒｏＥＤＤＩＥ−ＧＦＰｍｕｔ３.１融合ポリペプチドの発現による天然ＧＦＰｍｕｔ３.１の製造、アクチゲル−ポリＫＷと称されるアフィニティーマトリックスでのリフォールディングおよび切断について記載する。クロマトグラフィー条件は、上記と同じである。

実施例５：
カラムでのＮ^ｐｒｏＥＤＤＩＥ―ｓＳＰＡ−Ｄの切断
この実施例では、Ｎ^ｐｒｏＥＤＤＩＥ−ｓＳＰＡ−Ｄ融合ポリペプチドの発現による天然ｓＳＰＡ−Ｄの製造、アクチゲル−ポリＫＹと称されるアフィニティーマトリックスでのリフォールディングおよび切断について記載する。クロマトグラフィー条件は、上記と同じである。

実施例６：
カチオン交換クロマトグラフィーを用いたカラムでのリフォールディング
粗Ｎ^ｐｒｏ３７−６Ｈｉｓ（(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKLAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSC-(168)）封入体抽出物を、８Ｍ尿素、５０ｍＭのＮａ−リン酸ｐＨ７.０に再懸濁した。最終タンパク質濃度は０.５ｍｇ／ｍｌであった。２ｍｌを、上記と同じ緩衝液で予め平衡状態にしておいた５０ｃｍ／時の直線的速度でのHiTrap ＳＰセファロースＦＦカラム（２.５×０.７ｃｍ内径；カラム容量１ｍｌ；GE Healthcare）にローディングした。次いで、カラムを、５０ｍＭのＮａ−リン酸ｐＨ７、２ｍＭのＥＤＴＡ、５％グリセリン、１０ｍＭのα−モノチオグリセリン（ＭＴＧ）を含む緩衝液へと緩衝液交換した。タンパク質を室温で１時間リフォールディングさせた。リフォールディング緩衝液をさらに適用することにより、リフォールディングおよび切断されたタンパク質の溶出を実施した。２ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａ−リン酸ｐＨ７を含む緩衝液によりリフォールディングを実施した。融合タンパク質（６Ｈｉｓ）のリフォールディングをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりモニターした。

Claims

対象ポリペプチドおよび前記ポリペプチドのＮ−末端のところに自己タンパク質分解切断機能を呈するポリペプチドであるオートプロテアーゼを含む融合ポリペプチドを用いる、相同Ｎ−末端を有する対象異種ポリペプチドの製造方法であって、ａ）アフィニティークロマトグラフィーシステムにより、可溶性で自己タンパク質分解切断が不活性な形態で融合ポリペプチドを結合し、ｂ）融合ポリペプチドのリフォールディングにより、融合ポリペプチドの自己タンパク質分解切断機能の活性化および対象異種ポリペプチドの切断を誘発し、そしてｃ）次に対象異種ポリペプチドを溶出する工程を含み、上記工程を一アフィニティークロマトグラフィーシステムで実施する方法。
融合ポリペプチドが、融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を利用する、封入体形態での細菌宿主細胞における組換え発現により提供される、請求項１記載の方法。
オートプロテアーゼが、ペスチウイルス由来である、請求項１または２記載の方法。
オートプロテアーゼが、ＣＳＦＶ、ＢＤＶおよびＢＶＤＶから成る群から選択されるウイルス由来である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
オートプロテアーゼが、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
オートプロテアーゼが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
アフィニティークロマトグラフィーシステムが、固定化金属イオンクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）およびペプチドアフィニティークロマトグラフィーから成る群から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
アフィニティークロマトグラフィーシステムが固定化金属イオンクロマトグラフィーであり、融合ポリペプチドが金属キレートアフィニティー標識を含む、請求項７記載の方法。
金属キレートアフィニティー標識がポリヒスチジンである、請求項８記載の方法。
ペプチドアフィニティークロマトグラフィーシステムが、トリプトファン残基を含む、配列番号９：ＶＳＦＩＷＹＫまたは配列番号１４：ＡＦＹＲＷＹＡのオリゴペプチドリガンドを利用するものであり、リガンドが、カオトロピック条件下で自己タンパク質分解切断機能を発揮する融合ポリペプチドの一部分に選択的に結合し、コスモトロピック条件への変化中およびコスモトロピック条件下で結合を維持する、請求項７記載の方法。
配列番号９：ＶＳＦＩＷＹＫおよび配列番号１４：ＡＦＹＲＷＹＡから成る群から選択される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法で使用されるオリゴペプチドリガンド。
配列番号９：ＶＳＦＩＷＹＫおよび配列番号１４：ＡＦＹＲＷＹＡから成る群から選択される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法におけるオリゴペプチドリガンドの使用。
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するオートプロテアーゼの、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法における使用。