JP2015226547A

JP2015226547A - 融合タンパク質の自己タンパク質分解切断による組換えタンパク質の産生

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Publication number: JP2015226547A
Application number: JP2015163036A
Authority: JP
Inventors: フロリアン・ヴェルター; Florian Werther; クレメンス・アッハミューラー; Clemens Achmueller; フィリップ・ヴェヒナー; Philipp Wechner; ベルンハルト・アウアー; Bernhard Auer; ジルヴィオ・ポトミルゼク; Silvio Podmirseg
Original assignee: Boehringer Ingelheim RCV GmbH and Co KG; Sandoz AG
Current assignee: Boehringer Ingelheim RCV GmbH and Co KG; Sandoz AG
Priority date: 2005-04-26
Filing date: 2015-08-20
Publication date: 2015-12-17
Also published as: PT1874932E; KR20080030551A; AU2006239721A1; US20120107869A1; EP2348053A2; US7829319B2; US20090203069A1; JP2008539170A; EP2366719B1; WO2006113959A3; WO2006113959A2; US20100062490A1; US20090306343A1; PT1874825E; DK1874825T3; AU2006239722B2; EP2366719A2; KR20080036547A; KR101374149B1; EP2366719A3

Abstract

【課題】対象異種ポリペプチドの組換え産生のための方法であって、（i）融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養すること、ここで、該融合ポリペプチドは、ペスチウイルスの天然型オートプロテアーゼＮｐｒｏの少なくとも１つのシステイン残基が別のアミノ酸残基で置換されているペスチウイルスのオートプロテアーゼＮｐｒｏの誘導体と、異種ポリペプチドであり、第一のポリペプチドと、その第一のポリペプチドのＣ末端において、第一のポリペプチドの自己タンパク質分解活性によりその融合タンパク質から第二のポリペプチドが切断され得るように連結されている、第二のポリペプチドとを含み、該培養は融合ポリペプチドを発現させ、対応する細胞質封入体を形成させる条件下で行う、（ii）該宿主細胞から該封入体を単離すること、（iii）単離した封入体を可溶化すること、（iv）該融合ポリペプチドから対象異種ポリペプチドの自己タンパク質分解切断を誘導すること、および（v）切断された対象異種ポリペプチドを単離することを含む方法を提供すること。【解決手段】低いｐＩを有し、溶解度が高められた、ペスチウイルスの天然型オートプロテアーゼＮｐｒｏのある種の誘導体が広範な条件で使用に好適であることを見いだした。【選択図】なし

Description

本発明は、細菌宿主細胞において明確に定義された相同Ｎ末端を有する目的とする対象異種ポリペプチドを組換え産生するための方法に関し、この方法では、まず、ペスチウイルスのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体と、対象異種ポリペプチドとを含む融合ポリペプチドが、宿主細胞での発現により提供される。該対象異種ポリペプチドは、宿主細胞において細胞質封入体の形態で産生され、その後、これらを単離し、目的の異種ポリペプチドがＮ^ｐｒｏの自己タンパク質加水分解活性により該融合ポリペプチドから切断されるように処理する。

細菌細胞におけるヒトまたは他の真核生物のタンパク質の発現のような、異種生物における組換えタンパク質の産生では、極力１００％に近い相同性を持つ、明確に定義されたＮ末端を得るのが困難な場合が多い。特に、多くの場合でそのアミノ酸配列がヒト／動物に天然に存在するアミノ酸配列と同じであったほうがよい組換え医薬タンパク質ではそうである。

例えばヒトで本来の発現をした場合、治療用にも使用される多くの医薬タンパク質は細胞外間隙へ輸送される。そのためシグナル配列が前駆タンパク質に存在し、このシグナル配列が切断される結果、明確に定義されたＮ末端が生じる。いくつかの理由から、このような相同Ｎ末端は、例えば細菌細胞で容易に産生される場合ばかりではない。

工業規模での産生では、多くの医薬タンパク質は細菌細胞、例えば、大腸菌(Escherichia coli)の細胞質で産生される。これらの宿主細胞では、医薬タンパク質が十分な量蓄積し、多くの場合、細胞内に不溶性の封入体（ＩＢ）として沈着している。これらのＩＢは、目的タンパク質の後処理や精製に非常に有利である。さらに、ＩＢの形態で発現するタンパク質は、細胞内プロテアーゼによる分解から保護される。

本明細書において「封入体」とは、形質転換した宿主細胞の細胞質に存在する、異種ポリペプチドを含む凝集物を指す。これらは顕微鏡下で輝点として観察され、細胞質を分離により回収することができる。

しかしながら、ＩＢ物質の産生には、発現されたタンパク質のin vitroでのリフォールディングが必要である。これは多くの場合、それ自体公知の方法により行うことができる。

目的タンパク質が好適な原核生物または真核生物のシグナル配列の助けで細菌周縁質に輸送される場合がわずかながら存在する。この細菌輸送機構の輸送能は低いので、この場合、通常、極めて少量の生成物しか蓄積できない。

しかしながら、細菌の細胞質は、真核生物の細胞外間隙とは著しく異なる。１つの違いは、細菌の細胞質内では還元条件が優勢であることであり、また、Ｎ末端リーダー配列を切断して成熟タンパク質を生じる機構がないということにある。細胞質タンパク質の合成は全てメチオニンで始まり、適当な開始コドンで示される（ＡＴＧ＝翻訳の開始）。このＮ末端メチオニンは多くのタンパク質で保持されているが、一方で、細胞質中に存在し、その宿主に固有のメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）により切断されている場合もある。この切断の効率は本質的に、１．それに続くアミノ酸の性質と、２．そのタンパク質の三次元構造におけるＮ末端の位置の、２つのパラメーターに依存する。このＮ末端メチオニンは、それに続くアミノ酸がセリン、アラニン、グリシン、メチオニンまたはバリンである場合、また、Ｎ末端が露出している、すなわち、タンパク質内に「隠れていない」場合には優先的に欠失している。それに続くタンパク質が違うもの、特に、荷電しているもの（グルタミン酸、アスパラギン酸、リシン、アルギニン）である場合、またはＮ末端がタンパク質内に位置する場合には、Ｎ末端メチオニンの切断は起こらないことが多い。

切断を促すアミノ酸が２番の位置に存在していても、滅多に切断は完了しない。目的タンパク質のかなりの割合（１〜５０％）がＭＡＰにより影響を受けずに残るのは普通である。

しかしながら、これらの産物はしばしば種々の免疫特性（例えば、抗体形成の誘導）および薬理特性（半減期、薬物動態）を示すので、天然配列からのこの異種性または逸脱は許容されない場合が多い。このような理由から、ほとんどの場合で、本質的に同一な産物（相同であり、かつ、Ｎ末端に外来アミノ酸を含まない）を産生する必要がある。細胞質発現の場合、ほとんどの場合で救済策は、特定のエンドペプチダーゼ（例えば、因子Ｘａ、エンテロキナーゼ、ＫＥＸエンドペプチダーゼ、ＩｇＡプロテアーゼ）またはアミノペプチダーゼ（例えば、ジペプチジルアミノペプチダーゼ）の切断配列（リーダー）と目的タンパク質のＮ末端とを融合させることである。しかしながら、これによりその後の後処理、いわゆるタンパク質の下流プロセシングに追加工程が必要になり、費用と材料を費やさなければならない。さらに、ＩＢが存在すれば、多くの場合でリーダー配列によるリフォールディングの妨害、または完全な阻害すら起こる。

ペスチウイルスのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏを含む融合ポリペプチドは、この点で特に有用である。ペスチウイルスのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏは、常に、明確に定義された部位で融合相手を切断し、相同Ｎ末端を有する対象ポリペプチドを放出する。さらに、このＮ^ｐｒｏの自己タンパク質分解活性は、in vitroにおいて特殊なバッファーを適用することで誘導でき、その結果、ＩＢで発現した融合ポリペプチドの切断により対象ポリペプチドを取得できる。

ペスチウイルスは、ｍＲＮＡとしてそのまま働き、１２．３ｋｂの大きさで、細胞質中でウイルス遺伝子産物が転写されるゲノムを持つ小型のエンベロープウイルスである。これは、約４０００アミノ酸を含み、ウイルスのプロテアーゼによっても細胞のプロテアーゼによっても約１２の成熟タンパク質へと分解される１つのポリプロテインの形態で生じる。

ペスチウイルスは、ＣＳＦＶ（豚コレラウイルス(classical swine fever virus）)、ＢＤＶ（ボーダー病ウイルス）およびＢＶＤＶ（ウシ下痢ウイルス）のサブクラスを含む。

Ｎ^ｐｒｏは１６８アミノ酸長で、見掛けのＭ_ｒが約２０，０００(in vivo)のオートプロテアーゼである。Ｎ^ｐｒｏはペスチウイルスのポリプロテインの最初のタンパク質であり、それに続くヌクレオキャプシドタンパク質Ｃから自己タンパク質分解切断を受ける。この切断はＮ^ｐｒｏの配列の最後のアミノ酸であるＣｙｓ１６８の後で起こる。

in vitroにおけるＮ^ｐｒｏの自己タンパク質分解の活性化は特定の復元条件だけを感受することから、対象異種ポリペプチドの産生のための、ペスチウイルスの天然型オートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの使用は限定されたものであるといえる。in vitroにおいてＮ^ｐｒｏの切断活性を見込めるこれらの条件は、対象異種ポリペプチドの産生のためのいくつかの状況で必要または望ましいものとなる他の特定の相互作用に対しては阻害的である。このような相互作用の一例として、例えば選択的ペプチド−タンパク質親和性などのある種の生体特異的親和性が挙げられる。また、パラメーターの他の要件のため、ある特定のプロセスがＮ^ｐｒｏに対して好適な復元条件を作り出せないようにしており、その結果、Ｎ^ｐｒｏはこれらのプロセスでは使用できない。よって、ペスチウイルスの天然型Ｎ^ｐｒｏは、ある種の対象ポリペプチドの産生やある種の条件下での使用には適さないことがある。従って、切断効率を高めるため、高収率の対象タンパク質を得るため、また、幅広い条件下でＮ^ｐｒｏを使用可能とするために、特性の向上したペスチウイルスのＮ^ｐｒｏが必要とされ、これにより新たな産生方法の適用が可能となる。

発明の概要
本発明において、驚くことに、低いｐＩを有し、溶解度が高められた、ペスチウイルスの天然型オートプロテアーゼＮ^ｐｒｏのある種の誘導体が広範な条件で使用に好適であることが見出された。さらに、これらの誘導体は驚くことに、in vitroにおいて改良された自己タンパク質分解活性を有することが見出された。

よって、本発明の範囲内で、相同なＮ末端を有する、対象異種ポリペプチドの産生のための改良法が提供され、また、ペスチウイルスのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体の使用も本発明の一部となる。

発明の詳細な説明
本発明は、対象異種ポリペプチドの組換え産生のための方法に関し、その方法は、
（i）融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養すること、ここで、該融合ポリペプチドは、ペスチウイルスの天然型オートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの少なくとも１つのシステイン残基が別のアミノ酸残基で置換されているペスチウイルスのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体と、異種ポリペプチドであり、該誘導体とその誘導体のＣ末端において、該誘導体の自己タンパク質分解活性により該融合ポリペプチドから第二のポリペプチドが切断され得るように連結されている、第二のポリペプチドとを含み、該培養は融合ポリペプチドを発現させ、対応する細胞質封入体を形成させる条件下で行う、
（ii）該宿主細胞から該封入体を単離すること、
（iii）単離した封入体を可溶化すること、
（iv）該融合ポリペプチドから異種ポリペプチドの自己タンパク質分解切断を誘導すること、および
（v）切断された異種ポリペプチドを単離すること
を含む。

本発明の誘導体が由来する好ましいペスチウイルスのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏは、下記のアミノ酸配列：
配列番号１：

を有するＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏである。

本発明の範囲内で、上記の配列は、改良された特性を持つ融合ポリペプチドを生成するために突然変異させるが、この融合ポリペプチドは、ペスチウイルスの天然型オートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの少なくとも１つのシステイン残基が別のアミノ酸残基で置換されているペスチウイルスのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体と、異種ポリペプチドであり、該誘導体とそのＣ末端において、該オートプロテアーゼの自己タンパク質分解活性により該融合ポリペプチドから第二のポリペプチドが切断され得るように連結されている、第二のポリペプチドとを含む。

よって、本発明は、本発明の方法において融合タンパク質のＮ末端部分として使用されるペスチウイルスの天然型Ｎ^ｐｒｏのこのような誘導体に関する。これらの誘導体は、異種タンパク質の産生方法の範囲内で用いられる融合タンパク質の一部であるという意味で本発明の一部であり、本発明はこれにも関する。

別の態様において、本発明は、凝集傾向の小さい、天然型Ｎ^ｐｒｏペスチウイルスの誘導体に関する。

本発明の範囲内で、このようなペスチウイルスの天然型Ｎ^ｐｒｏの誘導体は、システイン残基の数が減っているものが好ましい。

本発明の範囲内で、ＣＳＦＶの天然型Ｎ^ｐｒｏの誘導体が特に好ましい。

よって、本発明は、ＣＳＦＶの天然型オートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの少なくとも１つのシステイン残基が別のアミノ酸残基で置換されているＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体に関する。

従って、本発明はまた、別の態様において、融合ポリペプチドが、ＣＳＦＶの天然型オートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの少なくとも１つのシステイン残基が別のアミノ酸残基で置換されているＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体を含む、上記のような方法にも関する。

好ましくは、本発明は、Ｃ１１２、Ｃ１３４およびＣ１３８からなる群から選択されるＣＳＦＶの天然型オートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの少なくとも１つのシステイン残基が別のアミノ酸残基で置換されているＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体に関する。

よって、別の態様において、本発明は好ましくは、融合ポリペプチドが、Ｃ１１２、Ｃ１３４およびＣ１３８からなる群から選択されるＣＳＦＶの天然型オートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの少なくとも１つのシステイン残基が別のアミノ酸残基で置換されているＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体を含む、上記のような方法に関する。

Ｃ１１２、Ｃ１３４およびＣ１３８からなる群から選択されるＣＳＦＶの天然型オートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの少なくとも１つのシステイン残基がグルタミン酸残基で置換されているＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体がいっそうさらに好ましい。

よって、別の態様において、本発明はより好ましくは、融合ポリペプチドが、Ｃ１１２、Ｃ１３４およびＣ１３８からなる群から選択されるＣＳＦＶの天然型オートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの少なくとも１つのシステイン残基がグルタミン酸残基で置換されているＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体を含む、上記のような方法に関する。

下記のアミノ酸配列：
配列番号２：

を含むＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体がさらに好ましい。

よって、本発明の別の態様において、本発明はさらに好ましくは、融合ポリペプチドが、配列番号２の配列を含むＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体を含む、上記のような方法に関する。

誘導体の溶解度は次のようにして求める。
７２時間後、個々のＮ^ｐｒｏ誘導体の濃縮溶液を遠心分離し、そのペレットを溶解し、ＳＤＳゲル電気泳動にかける。この上清の一部をプローブバッファーと合わせ、ＳＤＳゲル電気泳動にかける。電気泳動後、バンドをクーマシーブルーで染色し、ＡｌｐｈａＤｉｇｉＤｏｃ（商標）系を用いて濃度計により定量し、沈殿した物質の量を算出する。試験の詳細は、実施例２を参照。

バッファーのイオン強度は、特定の産生方法をしばしば制限する。よって、本発明は、さらなる態様において、ペスチウイルスの天然型Ｎ^ｐｒｏよりも中性に近いペスチウイルスの天然型Ｎ^ｐｒｏの誘導体に関する。発現させる融合ポリペプチドのペスチウイルス部分のＮ^ｐｒｏのｐＩは、第二のポリペプチド（対象ポリペプチド）のｐＩにできるだけ近くなるようにするのが好ましい。例えば、融合ポリペプチドのペスチウイルス部分のＮ^ｐｒｏは、５．５〜９．５、特に６．０〜９．０のｐＩを有し得る。

よって、本発明の範囲内で、上記のような少なくとも１つのシステイン残基の置換に加え、少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基が酸性アミノ酸残基で置換されている、ＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体がさらに好ましい。

よって、別の態様において、本発明は、融合ポリペプチドが、上記のような少なくとも１つのシステイン残基の置換に加え、少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基が酸性アミノ酸残基で置換されている、ＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体を含む、上記のような方法がさらに好ましい。

上記のような少なくとも１つのシステイン残基の置換に加え、下記のアミノ酸：Ｈ５、Ｋ１６、Ｎ３５、Ｒ５３、Ｇ５４、Ｒ５７、Ｌ１４３、Ｋ１４５およびＲ１５０のうち少なくとも１つがさらに交換されている、ＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体がさらに好ましい。好ましい例としては、下記のアミノ酸：アルギニン（Ｒ）５３がグルタミン酸（Ｅ）に、グリシン（Ｇ）５４がアスパラギン酸（Ｄ）に、アルギニン（Ｒ）５７がグルタミン酸（Ｅ）に、そしてロイシン（Ｌ）１４３がグルタミン（Ｑ）に交換されている誘導体がある。

よって、別の態様において、本発明は、融合ポリペプチドが、上記のような少なくとも１つのシステイン残基の置換に加え、下記のアミノ酸：アルギニン（Ｒ）５３がグルタミン酸（Ｅ）に、グリシン（Ｇ）５４がアスパラギン酸（Ｄ）に、アルギニン（Ｒ）５７がグルタミン酸（Ｅ）に、そしてロイシン（Ｌ）１４３がグルタミン（Ｑ）に交換されているＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体を含む、上記のような方法がさらに好ましい。

本発明のもう１つの好ましい実施態様では、ＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体は下記のアミノ酸配列：
配列番号３：

を含む。

よって、別の態様において、本発明はまた、融合ポリペプチドが、配列番号３の配列を有するＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体を含む、上記のような方法にも関する。

さらに別の態様において、本発明は、ペスチウイルスの天然型Ｎ^ｐｒｏと比べて、低い凝集性とより中性に近いｐＩに加え、さらに高い溶解度を示すペスチウイルスの天然型Ｎ^ｐｒｏの誘導体に関する。

溶解度は上記のように測定する。

よって、本発明は、上記のような少なくとも１つのシステイン残基の置換に加え、少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基が親水性残基で置換されているＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体に関する。

よって、別の態様において、本発明はまた、融合ポリペプチドが、上記のような少なくとも１つのシステイン残基の置換に加え、少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基が親水性残基で置換されているＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体を含む、上記のような方法に関する。

本発明の範囲内で、上記のような少なくとも１つのシステイン残基の置換に加え、さらに下記のアミノ酸：Ｖ２４、Ａ２７、Ｌ３２、Ｇ５４、Ｌ７５、Ａ１０９、Ｖ１１４、Ｖ１２１、Ｌ１４３、Ｉ１５５およびＦ１５８のうち少なくとも１つが置換されているＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体が好ましい。好ましい例としては、下記のアミノ酸：アラニン（Ａ）１０９、バリン（Ｖ）１１４、イソロイシン（Ｉ）１５５およびフェニルアラニン（Ｆ）１５８がトレオニン（Ｔ）に交換されている誘導体がある。

よって、別の態様において、本発明は好ましくは、融合ポリペプチドが、上記のような少なくとも１つのシステイン残基の置換に加え、下記のアミノ酸：アラニン（Ａ）１０９、バリン（Ｖ）１１４、イソロイシン（Ｉ）１５５およびフェニルアラニン（Ｆ）１５８で置換されているＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体を含む、上記のような方法に関する。別に、本発明の範囲内で、より好ましいＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体は下記のアミノ酸配列：
配列番号４：

を含む。

よって、別の態様において、本発明はより好ましくは、融合ポリペプチドが、配列番号４の配列を有するＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体を含む、上記のような方法に関する。

本発明の範囲内で、上記のような少なくとも１つのシステイン残基の置換に加え、下記のアミノ酸：アラニン（Ａ）１０９、バリン（Ｖ）１１４、イソロイシン（Ｉ）１５５およびフェニルアラニン（Ｆ）１５８がトレオニン（Ｔ）に、アルギニン（Ｒ）５３がグルタミン酸（Ｅ）に、グリシン（Ｇ）５４がアスパラギン酸（Ｄ）に、アルギニン（Ｒ）５７がグルタミン酸（Ｅ）に、そしてロイシン（Ｌ）１４３がグルタミン（Ｑ）に交換されているＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体がいっそうより好ましい。

よって、別の態様において、本発明は、いっそうより好ましくは、融合ポリペプチドが、上記のような少なくとも１つのシステイン残基の置換に加え、下記のアミノ酸：アラニン（Ａ）１０９、バリン（Ｖ）１１４、イソロイシン（Ｉ）１５５およびフェニルアラニン（Ｆ）１５８がトレオニン（Ｔ）に、アルギニン（Ｒ）５３がグルタミン酸（Ｅ）に、グリシン（Ｇ）５４がアスパラギン酸（Ｄ）に、アルギニン（Ｒ）５７がグルタミン酸（Ｅ）に、そしてロイシン（Ｌ）１４３がグルタミン（Ｑ）に交換されているＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体を含む、上記のような方法に関する。

最も好ましくは、本発明のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体は下記のアミノ酸配列：
配列番号５：

を含む。

よって、別の最も好ましい態様において、本発明はまた、融合ポリペプチドが配列番号５の配列を有するＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体を含む、上記のような方法に関する。

別の同様に好ましい態様において、本発明は、融合ポリペプチドが、さらにアスパラギン（Ｎ）３５はトレオニン（Ｔ）で置換され、かつ、トレオニン（Ｔ）１５８がセリン（Ｓ）で置換されている、配列番号５の配列を有するＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体を含む、上記のような異種タンパク質の産生方法に関する。

本発明の上記態様に従う方法で用いられるＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体もまた本発明の一部をなし、下記のアミノ酸配列：
配列番号３２：

を含む。

別の好ましい態様において、本発明は、融合ポリペプチドが、さらにアラニン（Ａ）２８がグルタミン酸（Ｅ）で置換され、セリン（Ｓ）７１がフェニルアラニン（Ｆ）で置換され、アルギニン（Ｒ）１５０がヒスチジン（Ｈ）で置換されている、配列番号３２の配列を有するＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体を含む、上記のような異種タンパク質の産生方法に関する。

本発明の上記態様に従う方法で用いられるＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体もまた本発明の一部をなし、下記のアミノ酸配列：
配列番号３３：

を含む。

本発明の方法において好ましくは、配列番号３２の配列を有するＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体は、プロインスリンの産生のために、少なくともプロインスリンの最初の３つのアミノ酸を含むタンパク質との、より好ましくはプロインスリンとの、さらにより好ましくはヒトプロインスリンとの、最も好ましくは組換えヒトプロインスリンとの融合に用いられる。

本発明によれば、ＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体が、上記のような少なくとも１つのシステイン残基の置換に加え、下記のアミノ酸：アルギニン（Ｒ）５３、グリシン（Ｇ）５４、アルギニン（Ｒ）５７、トレオニン（Ｔ）１０９、１１４、１５５、１５８およびロイシン（Ｌ）１４３のうち少なくとも１つが交換されていれば好ましい。本発明の好ましいＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体は、上記のような少なくとも１つのシステイン残基の置換に加え、下記のアミノ酸：アルギニン（Ｒ）５３がグルタミン酸（Ｅ）に、グリシン（Ｇ）５４がアスパラギン酸（Ｄ）に、アルギニン（Ｒ）５７がグルタミン酸（Ｅ）に、トレオニン（Ｔ）１０９、１１４、１５５、１５８がセリン（Ｓ）に、そしてロイシン（Ｌ）１４３がグルタミン（Ｑ）またはアスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）またはセリン（Ｓ）またはヒスチジンに交換されている。

本発明の上記態様の方法で用いられる、このような好ましいＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体もまた本発明の一部をなし、下記のアミノ酸配列：
配列番号３４：

配列番号３５：

配列番号３６：

配列番号３７：

配列番号３８：

を含む。

本発明の一部である上記のＣＳＦＶの天然型Ｎ^ｐｒｏの誘導体は、ＣＳＦＶの天然型Ｎ^ｐｒｏよりも向上した特性を有し、従って、タンパク質産生効率の増進に好適である。本発明に記載の誘導体のリフォールディングは、in vitroにおいて、例えば天然型Ｎ^ｐｒｏが機能しなくなる低イオン強度下などの広範な条件で誘導することができる。よって、上記の誘導体は天然型Ｎ^ｐｒｏが上手く使用できない反応条件下で用いるのに好適である。本発明の直前に記載した誘導体は、特に広範な反応条件での使用に適していることから、本発明の範囲内で特に好ましい。

さらなる態様において、本発明は、本発明の対象異種ポリペプチドの産生方法における、上記のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体のいずれかの使用に関する。

よって、本発明の対象異種ポリペプチドの組換え産生方法において、融合ポリペプチドは上記のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体のいずれか１つを含む。

本発明の好ましい実施態様では、異種ポリペプチドの自己タンパク質分解切断の誘導は、リフォールディングを促進する条件下で融合ポリペプチドを希釈することにより行う。これにより、不活性な融合ポリペプチドはリフォールディングされて活性化する。

特に好ましい実施態様では、この可溶化物は、アルギニンの終濃度が１．０Ｍまで、好ましくは０．４〜０．６Ｍとなるようにアルギニン含有バッファーで希釈する。あるいは、可溶化された封入体を適当なアルギニン含有切断バッファーに対して透析することでも希釈が可能である。

この切断用の反応溶液の温度は、例えば、０℃〜３０℃の間である。温度は好ましくは１０℃〜２０℃である。

この反応溶液のｐＨは、例えば、５．０〜９．０である。ｐＨは好ましくは７．０〜８．０、特には７．０〜７．５である。最も好ましくは、ｐＨは７．４である。

適当であれば、この反応溶液は０．５〜１００ｍＭ濃度のＤＴＴを含む。ＤＤＴ濃度は好ましくは約５．５ｍＭである。

切断の際の反応溶液中のタンパク質濃度は、例えば、２０〜１５０μｇ／ｍｌの範囲である。タンパク質濃度は好ましくは４０μｇ／ｍｌ未満である。

この反応溶液は、切断の際、例えば１．５Ｍまでの濃度のトリス／ＨＣｌを含み得る。トリス／ＨＣｌ濃度は好ましくは０．４Ｍ〜１．２Ｍの間である。

反応溶液は例えば０．２〜１％の範囲の濃度でグリセロールを含み得る。より好ましくは、グリセロール濃度は５％である。

また、反応溶液は約１〜３ｍＭＥＤＴＡの範囲のＥＤＴＡを含み得る。好ましくは、ＥＤＴＡ濃度は２ｍＭである。

アルギニン含有バッファーおよび／またはトリス／ＨＣｌ含有バッファーの代わりに他のバッファー系も可能である。

特に好ましい実施態様では、切断バッファーのｐＨは７．４であり、切断の際の温度は１０℃〜２０℃であり、切断バッファーは、還元剤として約１０ｍＭのＤＴＴ、０．５ＭＮａＣｌ、５％グリセロール、および２ｍＭＥＤＴＡを含む。

最後に、融合ポリペプチドから切断された異種ポリペプチドは、それ自体公知の方法で単離される。

本発明のもう１つの好ましい実施態様では、異種ポリペプチドの自己タンパク質分解切断の誘導は、その不活性型での自己タンパク質分解部分に対するアフィニティークロマトグラフィー系に融合ポリペプチドを結合させ、その後、リフォールディングバッファーを適用することにより行う。特に、第一段階で、融合ポリペプチドをクロマトグラフィー系に結合させる。結合を維持しつつ、融合ポリペプチドの自己タンパク質分解がその活性を回復するように条件を変化させる。対象ポリペプチドは切断されて溶出するが、融合ポリペプチドの自己タンパク質分解部分はクロマトグラフィー系に結合したままである。

本発明の特に好ましい実施態様では、アフィニティークロマトグラフィー系はカラムであり、融合ポリペプチドは変性により不活性化される。よって、自己タンパク質分解活性の再活性化は、リフォールディングバッファーの適用、そして、融合ポリペプチドのリフォールディングによって誘導される。

本発明の特に好ましい実施態様では、リフォールディングは、次の組成のバッファー中で行う：０．５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５％グリセロール、２ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＤＴＴ、０．０１％Ｂｒｉｊ、ｐＨ７．４。

本明細書において次の用語は下記の意味を有するものとする。
「対象異種ポリペプチド」とは、天然型融合ポリペプチドまたはポリプロテインから、ペスチウイルスのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏによって本来は切断されないポリペプチドを意味する。異種ポリペプチドの例としては、工業用酵素（製造用酵素）または、医薬活性、特にヒトに対する医薬活性を有するポリペプチドがある。

「融合ポリペプチド」とは、２つ以上のポリペプチドからなるポリペプチドを指す。特に本明細書では、融合ポリペプチドはアフィニティータグ、自己タンパク質分解部分、好ましくはオートプロテアーゼ、および対象ポリペプチドを含み得る。

「対象ポリペプチド」とは、相同Ｎ末端を持って産生されるポリペプチドを指す。

本発明によれば、対象ポリペプチドを、自己タンパク質分解により切断される融合ポリペプチドの一部としてコードする発現ベクターを使用することができる。本発明によれば、このような発現ベクターを用いて様々な対象ポリペプチドが産生できる。例えば、対象ポリペプチドは薬理活性を示すものがあり、例えば、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン、増殖因子、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、抗体および抗体フラグメントなど、例えば、インターフェロンα２Ａ、インターフェロンα２Ｂ、インターロイキン−３、インターロイキン−６、ヒト成長ホルモン、（プロ）インスリン、インスリン様増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、インターフェロンβ１、ウシソマトロピン、ブタソマトロピン、インターロイキン１１、インターロイキン−２、Ｆａｂフラグメント；およびカルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、またはグルカゴン、ＣＤ４０リガンド可溶型、プラスミノーゲンアクチベーター、性ステロイド結合タンパク質、上皮細胞増殖因子、組織因子細胞外ドメインなどの小ペプチドからなる群から選択することができる。

また、対象ポリペプチドは他のいずれの種のポリペプチドでもよく、特に、例えば緑色蛍光タンパク質など、分析法に特に適しているポリペプチドがある。

本発明の方法で用いられる発現ベクターにおいて、融合ポリペプチドは少なくとも１つの発現制御配列に作動可能なように連結されている。発現制御配列としては、特に、プロモーター（ｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７、ｔｒｐ、ｇａｃ、ｖｈｂ、ラムダｐＬまたはｐｈｏＡプロモーターなど）、リボソーム結合部位（例えば、上記のプロモーターに属する天然リボソーム結合部位、ｃｒｏまたは合成リボソーム結合部位）、または転写ターミネーター（例えば、ｒｒｎＢＴ１Ｔ２またはｂｌａ）がある。

ベクターはまた、下記のように、融合ポリペプチドのＮ末端に存在し、例えばポリリジンのようなポリアミノ酸などのアフィニティークロマトグラフィー系との結合のために、またはイムノアフィニティークロマトグラフィー、いわゆる「エピトープタグ」（通常、それに対する特異的抗体が入手可能な短いペプチド配列）に必要な、融合タンパク質をコードする配列も含み得る。それに対する特異的モノクローナル抗体が容易に入手できる周知のエピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス凝集素（ＨＡ）、およびｃ−ｍｙｃタグが挙げられる。

本発明の好ましい実施態様では、発現ベクターはプラスミドである。

本発明の方法で用いられる細菌宿主細胞は、例えば、次の微生物群：エシェリキア属、例えば、大腸菌(Escherichia coli)などのグラム陰性菌、または他のグラム陰性菌、例えば緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)などのシュードモナス種もしくはカウロバクター・クレセンドス(Caulobacter crescendos)などのカウロバクター種、またはバチルス種、特に枯草菌(Bacillus subtilis)などのグラム陽性菌から選択することができる。宿主細胞としては大腸菌が特に好ましい。

本明細書において「形質転換宿主細胞」とは、異種ポリペプチドをコードするベクターを含む細胞を指す。

細菌宿主細胞、すなわち、発現株は、それ自体公知の微生物学の実践に従って培養する。この株は通常、栄養培地上の単一のコロニーから得られたものであるが、低温保存細胞懸濁液（細胞バンク）を使用することもできる。この株は通常、さらなる使用のために十分なバイオマスを得るために多段階法で培養する。

小規模の場合は、培養は振盪フラスコで行い、ほとんどの場合で複合培地（例えば、ＬＢ培養液）を使用できる。しかしながら、定義された培地（例えば、クエン酸培地）を使用することもできる。培養には、少量の宿主株予備培養物（単一コロニーまたは低温培養物からの細胞懸濁液を接種したもの）を増殖させるが、この培養の温度は通常その後の発現には重要ではないので、慣例的には比較的高温（例えば、３０℃または３７℃）で操作することができる。主培養物は大容量（例えば、５００ｍｌ）に設定し、この場合には、特に良好なエアレーションを確保する必要がある（内容量に対してフラスコを大きくする、回転速度を上げる）。不溶性封入体の形態で発現させることを意図するので、この主培養もほとんどの場合、比較的高温（例えば、３０℃または３７℃）で行う、誘導系は封入体を産生するのに特に適している（例えば、ｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｃまたはｐｈｏＡプロモーターを使用）。これらの場合、対数増殖後期に達した後（通常、振盪フラスコ中、光学濃度０．５〜１．０）、インデューサー物質（例えば、インドールアクリル酸、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド＝ＩＰＴＧ）を加え、１〜５時間インキュベーションを続ける。この時間中、大部分のＮ^ｐｒｏ融合ポリペプチドは細菌細胞質に封入体として沈着する。得られた細胞を採取し、さらに処理する。

大規模の場合、この多段階系は複数のバイオリアクター（ファーメンター）からなり、この場合、この方法のプロセスエンジニアリング制御を改良することができるよう、定義された栄養培地を用いるのが好ましい。さらに、特に栄養素の計量によりバイオマスおよび生成物に形成を高め得る可能性が大きい（フェッドバッチ）。それ以外の点では、この方法は振盪フラスコの場合と同様である。例えば、予備段階ファーメンターと主要段階ファーメンターを用い、培養温度は振盪フラスコの場合と同様に選択する。予備段階ファーメンターに、通常、単一コロニーまたは振盪フラスコ中の低温培養物から増殖させた、いわゆるイノキュラムを接種する。ファーメンターではまた、特に、その主要段階では、良好なエアレーションと十分なインデューサー濃度を確保しなければならない。しかしながら、この誘導期は振盪フラスコの場合に比べて明らかに長くしなければならない場合もある。ここでも、得られた細胞を回収し、さらに処理する。

本発明の方法では、封入体を、それ自体公知の方法で宿主細胞から単離する。

例えば、発酵を行った後、宿主細胞を遠心分離、精密濾過、凝集またはそれらの組合せ、好ましくは遠心分離により採取する。この湿潤細胞塊を、高圧ホモジナイザー、ビーズミル、フレンチプレス、ヒューズプレス、浸透圧ショック、洗剤、酵素的溶解、またはそれらの組合せなどの機械的、化学的または物理的手段によって崩壊させる。好ましくは、細胞の破砕は高圧ホモジナイゼーションにより行う。組換え融合ポリペプチドが封入体として沈着する好適な場合では、封入体は例えば、高圧分配により、または好ましくは単に低速での遠心分離により得ることができる。封入体は遠心分離または精密濾過またはその組合せによって分離する。次に、目的の対象ポリペプチドに関する純度は、封入体を、例えばＮａＣｌ（例えば、０．５〜１．０Ｍ）および／または洗剤（例えば、トリトンＸ−１００）の存在下、種々のバッファーに複数回再懸濁させることにより高めることができる。好ましくは、封入体調製物の純度は、種々のバッファーで数回洗浄することで高められる（例えば、０．５％デオキシコール酸塩、次いで１ＭＮａＣｌ溶液で２回、最後に蒸留水）。通常、これにより封入体中の外来ポリペプチドが大部分除去される。

本明細書において「可溶化」とは、封入体の溶解に必要なプロセスを指す。可溶化の結果、最小限の分子内および分子間の相互作用でポリペプチドの一分子分散が行える。

本発明の範囲内で封入体の可溶化の好ましい方法は、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ７．３に懸濁させ、結果的に存在するシステイン残基の酸化を防ぐために還元剤、例えば、５０ｍＭＤＴＴ、４〜８Ｍ塩酸グアニジニウムまたはグアニジニウムＳＣＮを加えることで行われる。必要であれば、例えば遠心分離により存在し得る不溶性物質を除去することができる。

細胞内で可溶の不活性融合ポリペプチドが産生される場合、明澄化した細胞ホモジネートに対し、この細胞ホモジネートはすでに希釈されているので希釈工程を除き、可溶化封入体に関して上記したさらなる後処理を行う。

好ましい実施態様では、この可溶化物を、トリス／ＨＣｌの終濃度が１．５Ｍまで、好ましくは０．４〜１．２Ｍとなるようにトリス／ＨＣｌ含有バッファーで希釈する。あるいは、可溶化された封入体を適当なトリス／ＨＣｌ含有切断バッファーに対して透析することでも希釈が可能である。トリス／ＨＣｌは、適当な緩衝物質、例えば２０ｍＭリン酸ナトリウムが加えられる場合には、他の塩、例えば０．２〜１．５ＭＮａＣｌに置き換えることができる。

切断のための反応溶液の温度は、例えば０℃〜３０℃の間である。温度は好ましくは１０℃〜２０℃である。

反応溶液のｐＨは、例えば５．０〜９．０である。ｐＨは好ましくは７．０〜８．０、特には７．０〜７．５である。最も好ましくは、ｐＨは７．４である。

適当であれば、反応溶液は、０．５〜１００ｍＭ濃度のＤＴＴを含む。ＤＤＴ濃度は好ましくは約１０ｍＭである。

切断の際の反応溶液のタンパク質濃度は、例えば、２０〜１５０μｇ／ｍｌの領域である。タンパク質濃度は好ましくは４０μｇ／ｍｌ未満である。

反応溶液は、切断の際、例えば１．０Ｍまでの濃度のアルギニンを含み得る。トリス／ＨＣｌ濃度は好ましくは０．４Ｍ〜０．６Ｍの間である。

反応溶液は、例えば、０．２〜３０％の間の濃度範囲のグリセロールを含み得る。より好ましくは、グリセロール濃度は５％である。

特に好ましい実施態様では、切断バッファーのｐＨは７．４であり、切断の際の温度は１０℃〜２０℃であり、切断バッファーは、還元剤として約１０ｍＭのＤＴＴ、０．５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５％グリセロール、および２ｍＭＥＤＴＡを含む。

本発明を以下の実施例を参照してさらに説明するが、これらの実施例は単に例示であり、限定されるものではない。特に、これらの実施例は本発明の好ましい実施態様に関するものである。

本発明をもってすれば、広範な組換えタンパク質（または「対象ポリペプチド」）、特に、通常の系で発現すると問題となるタンパク質、例えば宿主細胞に毒性作用を有するタンパク質、不溶性または溶解度の低いタンパク質、溶解性に他の不利な点があるタンパク質（例えば、短いタンパク質）を発現および産生することができる。本誘導体はまた、特定の融合構築物または特定の活性化状態の形態で、切断率、発現率、全体的な産生率に向上を示す。さらに、本構築物を有する封入体での発現は、上述の問題に有利な結果を示す（例えば、実施例１１参照）。

例えば、小タンパク質は、細菌細胞内ですぐに分解されるので、一般に大腸菌での発現率は低いが、本発明の構築物は高い発現レベルを可能とする（実施例１４参照）。

実施例１、３、４、５、８および９では、本発明の方法の種々の態様を用いたプロインスリンの産生を記載する。プロインスリンの配列は下記の配列番号６に示され、この配列の太字でない部分を形成する。以下、便宜上、プロインスリンをインスリンと呼ぶ場合がある。

実施例１
配列番号５を有するＮ^ｐｒｏ誘導体（ＥＤＤＩＥ）を用いたリフォールディングによる対象異種ポリペプチド（インスリン）の産生
１．１誘導体の作製
１．１．１突然変異ＰＣＲ
Operon Biotechnologies Inc. (1000 Atlantic Avenue, Suite 108 Alameda, CA 94501, USA)により特注合成され、ｐＵＣ１１９(NCBI ＃U07650: National Centre for Biotechnology Information Plasmid Database, National Library of Medicine, Building 38A, Bethesda, MD 20894, USA)に挿入されたＮ^ｐｒｏ−プロ−インスリン（配列番号６）：

のＤＮＡ配列を含む構築物から。この構築物から、太字で示された必要なＮ^ｐｒｏ配列を、次のプライマー対：Ｎ^ｐｒｏ−Ｆ−ＮｄｅＩ（配列番号２０）とＮ^ｐｒｏ−Ｒ−ＳａｌＩ（配列番号２１）を用いてＰＣＲにより増幅し、新たに作出されたＮｄｅＩおよびＳａｌＩ（下記表１の太字の文字）を介してベクターｐＥＴ３０ａ（＃６９９０９−３、２００２−２００３カタログ，Novagen, CN Biosciences Inc., Merck KgaA, Darmstadt, Germany）に挿入し、Ｓ−Ｎｐ−６Ｈ−ｐＥＴ３０ａを作出する。Ｓ−Ｎｐ−６Ｈ−ｐＥＴ３０ａからＮ^ｐｒｏ配列を２種の標準的５０μｌＰＣＲ反応、すなわち、１つは５０ｐｍｏｌＮ^ｐｒｏ−Ｆ−ＮｄｅＩプライマー（配列番号２０）および表１（配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８）から選択される５０ｐｍｏｌの１つリバース突然変異、５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（＃ＧＣ００２００４，カタログ２００４ Genecraft, Treskow Strabe 10, D-48163 Munster, Germany）、１×ＰＣＲバッファー（＃ＧＣ００２００６カタログ２００４，Genecraft）および各 )２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰ混合物（＃ＧＣ０１３００４，カタログ２００４，Genecraft）；もう１つは５０ｐｍｏｌＮ^ｐｒｏ−Ｒ−ＳａｌＩプライマー（配列番号２１）および表１（配列番号７、９、１１、１３、１５、１７）から選択される５０ｐｍｏｌの１つのフォワード突然変異プライマー、５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、１×ＰＣＲバッファーおよび各２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰ混合物で増幅する。ＰＣＲ反応は、次のプログラム：９４℃３分；９４℃３０秒、５４℃３０秒、６８℃１分の２５サイクル；最後に６８℃、７分インキュベーションを用い、ヒートリッドサーモサイクラーにて行う。

１．１．２ＰＣＲによる変異体の増幅
表１に示す変異体プライマーを用いて個々のアミノ酸変化を導入する。両ＰＣＲを１００分の１ずつ組み合わせ、上記のように標準的５０μｌＰＣＲ反応にて、５０ｐｍｏｌのＮ^ｐｒｏ−Ｆ−ＮｄｅＩプライマー（配列番号２０）と５０ｐｍｏｌのＮ^ｐｒｏ−Ｒ−ＳａｌＩプライマー（配列番号２１）を用いて増幅させる。遊離プライマーをＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット(Qiagen GmbH, Qiagen Strasse 1, D 40724 Hilden, Cat. Nr.28104, Quiagen product guide 2005)により、製造業者の推奨に従って除去する。これらのＰＣＲ断片をＮｄｅＩおよびＳａｌＩ制限部位を介してベクターｐＥＴ３０ａに挿入する。その後、この構築物を次の突然変異工程に用いる。この突然変異工程は、目的のＮ^ｐｒｏ誘導体を作出するのに必要なアミノ酸変異を導入する複数の連続工程で行う。本実施例の場合、プロセスを６回繰り返す。個々のアミノ酸交換を表１に示す。各工程の結果得られたプラスミドは、記載のようにＤＮＡ配列分析により制御する（４．１参照）。突然変異Ｉ１５５ＴおよびＦ１５８Ｔは、プライマー対Ｎ^ｐｒｏ−Ｆ−ＮｄｅＩ（配列番号２０）と３’＿Ｉ１５５Ｔ、Ｆ１５８Ｔ（配列番号１９）を用いた１回のＰＣＲ反応により導入され、得られたＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩおよびＳｐｅＩ制限部位を介してＳ−Ｎｐ−６Ｈ−ｐＥＴ３０ａに挿入する。１１全てのアミノ酸変異の組合せの結果としてＥＤＤＩＥ−６Ｈ−ｐＥＴ３０ａが得られ、ここでＥＤＤＩＥは配列番号５を有するＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの変異体を表す。

表１：対応するアミノ酸変異を有する突然変異プライマー

１．２プラスミドの構築
この方法は４．１に記載されているものと同様に行う。

１．３宿主細胞の形質転換
この方法は下記の４．２に記載されているものと同様に行う。

１．４発現および発酵
これらの方法は下記の４．３に記載されているものと同様に行う。

１．５切断
４．２に記載されているように、構築物６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−ＳＤＤＩｎｓ−ｐＥＴ３０ａ（構築に関して４．１を参照）で形質転換した宿主細胞の一晩培養物１ｍｌを１００ｍｌのＭ９−ＫＡＮ培地（５０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、２０ｍＭＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭＭｇＳＯ４、０．４％ｗ／ｖグルコース、５０μｇ／ｍｌカナマイシン）に移し、３７℃、２２５ｒｐｍで、ＯＤ０．５までインキュートし、１ｍＭＩＰＴＧで３７℃にて２時間発現を誘導する。細胞を２５００ｇにて１５分回転沈降させる。このペレットを８ｍｌの溶解バッファー（２０ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、７５ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭＭｇＣｌ_２）に懸濁させ、予冷したプレスチャンバーに移し、１３８０バールで５分間インキュベートする。バルブをゆっくり開け、５００μｌアリコートを１．５ＭＬチューブに滴下する（２〜４滴／１０秒）。ホモジネートを４℃、１９０００ｇで１５分回転させ、上清を廃棄し、ペレットを３０μｌの溶解バッファー（またはＨ_２Ｏ）に懸濁させる。５００μｌのグアニジウムＨＣｌ溶液（５ＭグアニジニウムＨＣｌ、１２０ｍＭトリスｐＨ７．３、２５ｍＭＤＴＴ）を加え、室温で４０分インキュベートする。１０μｌをＴＣＡ沈降（ＩＢ対照）のために清浄な反応チューブに移し、別の１０μｌを清浄なチューブに移し、室温で４０分、４９０μｌのリフォールディングバッファー（０．５ＭＮａＣｌ、５％グリセロール、２ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＤＴＴ、ｐＨ７．４）で１：５０希釈することでin vitro復元させた後に、ＴＣＡ沈降させる。これらのＴＣＡ沈殿を回転沈降させ、上清を廃棄し、ペレットを１０μｌの１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥプローブバッファーに溶解させ、復元および切断の成否をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。このクーマシーブリリアントブルーＲ２５０(Fluka cat. n. 27816, Laborchemikalien und analytische Reagentien 2005/2006, Fluka Chemie GmbH, Industriestrasse 25, CH-9471 Buchs, Switzerland)で染色し、切断されなかった融合ポリペプチドと切断されたオートプロテアーゼのバンドを、濃度計により、染色剤による白色光の吸収の測定に基づき定量し、切断量を算出する。

実施例２
溶解度の測定
ＥＤＤＩＥ−６Ｈ−ｐＥＴ３０ａ（構築に関しては１．１．２を参照）で形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物８００ｍｌのペレットを４．３に記載されているように調製する。このペレットを４０ｍｌ／ｇの溶解バッファー(lysis puffer)（２０ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、７５ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、ｐＨ８）に懸濁させる。細胞の溶解は加圧セルを２回通すことより達成する（１３８０バール）。１％トリトンＸ−１００（５ｍｌ／ｇの溶解バッファー(lysis puffer)に溶解）とともに１５分インキュベートした後、細胞ホモジネートを２５０００ｇで４５分遠心分離し、上清を廃棄し、封入体（ＩＢ）を−２０℃で保存する。封入体を塩化グアニジニウム溶液（５ＭＧｕＣｌ、１２０ｍＭトリス、２５ｍＭＤＴＴ、ｐＨ７．５）中に１．３ｍｌ／ｇＩＢまで溶解させ、室温で３．５時間インキュベートし、２５０００ｇで１５分遠心分離する。上清をリフォールディングバッファー(puffer)（０．４Ｍトリス、１０ｍＭＤＴＴ、２ｍＭＥＤＴＡ、５％グリセロール、ｐＨ７．３）中に３０ｍｌ／ｇＩＢまで希釈し、室温で一晩インキュベートし、遠心分離し、濾過除菌する。Ｎ^ｐｒｏ誘導体を、５０ｍｌ容のＳＰセファロースカラムでのイオン交換クロマトグラフィーにより精製する。カラムを３カラム容の０．４ｍＭトリスｐＨ７．３で平衡化し、リフォールディング溶液を適用した後、１５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．５で洗浄する。溶出は３カラム容の６００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、５％グリセロール、ｐＨ７．５で行う。タンパク質を含有する画分８と９（各８．５ｍｌ）を合わせ、遠心分離（３０分、８０５ｇ）を用い、メンブラン濾過(Amicon Centricon plus-20, #UFC2LGC24, product catalogue 2004, Millipore Corporation, 290 Concord Rd. Billerica, MA 01821, USA)により濃縮し、得られた溶液に対し、(Amicon Microcon YM-10, #42407, product catalogue 2004, Millipore Corporation)を室温で３０分、１７０００ｇにて２回目の濃縮工程を行う。７２時間後、この濃縮溶液を遠心分離し（１０分、１７０００ｇ、室温）、ペレットを１０μｌの１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥプローブバッファーに溶解させ、ＳＤＳゲル電気泳動にかける。上清１０μｌを２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥプローブバッファー１０μｌと合わせ、ＳＤＳゲル電気泳動にかける。電気泳動後、バンドをクーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色し、記載のように（２）定量し、沈殿した物質の量を算出する。

実施例３
それぞれ配列番号２、３または４を有するＮ^ｐｒｏ−誘導体の１つを用いたリフォールディングによる対象異種ポリペプチド（インスリン）の産生
この方法の種々の工程は、配列番号２、３または４を有する３つの誘導体各々について同様に行う。これらの誘導体の結果は、配列番号５を有する誘導体で得られた結果に準じる（実施例１参照）。

３．１誘導体の作製
３．１．１突然変異ＰＣＲ
この方法は１．１．１に記載されているものと同様に行う。

３．１．２ＰＣＲによる変異体の増幅
この方法は１．１．２に記載されているものと同様に行う。

３．２プラスミドの構築
この方法は４．１に記載されているものと同様に行う。

３．３宿主細胞の形質転換
この方法は下記の４．２に記載されているものと同様に行う。

３．４発現および発酵
これらの方法は下記の４．３に記載されているものと同様に行う。

３．５切断
この方法は１．５に記載されているものと同様に行う。溶解度および切断効率は１．５および実施例２に開示されている技術を用いて試験することができる。

実施例４
配列番号５を有するＮ^ｐｒｏ−誘導体（ＥＤＤＩＥ）を用いたカラム上でのリフォールディングによる対象異種ポリペプチド（インスリン）の産生
以下、「ＥＤＤＩＥ」は配列番号５の配列を有するＣＳＦＶの天然型オートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの変異体を示す。

この実験では、構築物ｐＥＴ３０−６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−ＳＤＤ−Ｉｎｓを用いて融合ポリペプチド６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−ＳＤＤ−Ｉｎｓを発現させる。この融合ポリペプチドはＮ末端６×ヒスチジンタグ付き変異型のペスチウイルスオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏ、配列番号５、その後にＳＤＤ−リンカー（セリン、アスパラギン酸、アスパラギン酸）およびプロ−インスリンの配列を含む。

４．１プラスミドの構築
Ｎ^ｐｒｏ−プロ−インスリンのＤＮＡ配列（配列番号６）は、Operon Biotechnologies, Inc. (1000 Atlantic Avenue, Suite 108 Alameda, CA 94501, USA)により特注合成され、ｐＵＣ１１９(NCBI #U07650: National Center for Biotechnology Information Plasmid Database, National Library of Medicine, Building 38A, Bethesda, MD 20894, USA)に挿入されたものである。この構築物から、必要なＮ^ｐｒｏ−配列（太字で示す）を、次のプライマー対：Ｎ^ｐｒｏ−Ｆ−ＮｄｅＩ（配列番号２０）およびＩｎｓ−Ｒ−ＳａｌＩ（配列番号２２）、

を用いてＰＣＲにより増幅させ、得られた断片を、新たに作出されたＮｄｅＩおよびＳａｌＩの制限部位（太字の文字）を介してベクターｐＥＴ３０ａに挿入する。大腸菌ＤＨ５α株(# 10643-013, Invitrogen catalogue 2003, Invitrogen Life Technologies Corporation, 1600 Faraday Avenue, PO Box 6482 Carlsbad, California 92008)に形質転換し（４．２参照）、選択されたクローンからプラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡ配列解析によりＳ−Ｎｐ−Ｉｎｓ−ｐＥＴ３０ａを確認する。ＥＤＤＩＥ−６Ｈ−ｐＥＴ３０ａ（構築については１．１．２を参照）からＥＤＤＩＥ（配列番号５）を、次のプライマー対：６Ｈ−Ｎ^ｐｒｏ−Ｆ−ＮｄｅＩ（配列番号２３）

およびＮ^ｐｒｏ−Ｒ−Ｓａｌｌ（配列番号２１）を用いてＰＣＲにより増幅させ、得られた断片を用い、構築物Ｓ−Ｎｐ−Ｉｎｓ−ｐＥＴ３０ａにおいてＮｄｅＩおよびＳｐｅＩの制限部位（太字の文字）を介してＮ^ｐｒｏを置換し、６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−Ｉｎｓ−ｐＥＴ３０ａを作出する。Ｎ^ｐｒｏオートプロテアーゼの好適な切断部位を作出するため、プロ−インスリン配列をプラスミド６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−Ｉｎｓ−ｐＥＴ３０ａから、次のプライマー対：ＳＤＤＩｎｓ−Ｆ−Ｓｐｅ（配列番号２４）

およびＩｎｓＲＳａｌｌ（配列番号２２）を用いてＰＣＲにより増幅させ、得られた断片を用い、構築物６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−Ｉｎｓ−ｐＥＴ３０ａにおいてＳｐｅＩおよびＳａｌＩの制限部位（太字の文字）を介してプロ−インスリン配列を置換し、６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−ＳＤＤＩｎｓ−ｐＥＴ３０ａを作出する。これらの構築物の配列は、標準的な技術に従うＤＮＡシーケンシングにより確認する。

４．２形質転換
エレクトロコンピテント細胞を１リットルの細菌培養（３７℃、２２５ｒｐｍでＯＤ_６００＝０．５まで増殖させたもの）から調製する。この細胞懸濁液を氷上で１５分冷却し（絶えず振盪）、ペレットとし（４℃、２５００ｇ、１０分）、上清を除去する。残ったペレットを４℃の脱イオン水１リットルに再懸濁させ、再び回転沈降させ（４℃、２５００ｇ、１０分）、間に遠心分離工程（４℃、２５００ｇ、１０分）を挟み、５０ｍｌの脱イオン水（４℃）で２回洗浄する。最後にペレットを５０ｍｌの１０％無菌グリセロール溶液（４℃）で洗浄し、ペレットとし（４℃、２５００ｇ、１０分）、２．５ｍｌの１０％無菌グリセロール溶液（４℃）に再懸濁させ、４０μｌアリコートを−８０℃で凍結、保存する。１アリコートのエレクトロコンピテント細胞を氷上で解凍し、５ｎｇのＤＮＡを含む１μｌの連結反応液を加え、電極間１ｍｍのエレクトロポレーションキュベットに気泡が立たないように移す。エレクトロポレーションは、１．５ｋＶ、２５μＦ、２００Ｏｈｍｓ、時定数が４．４を超えるように設定したBIO-RAD pulse controller (Bio-Rad Laboratories Inc., 2000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547, USA; cat. n. 1652098, Life Science Research Products 1998)を含むBIO-RAD Gene Pulser（商標）(Bio-Rad Laboratories Inc., 2000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547, USA; cat. n. 1652077, Life Science Research Products 1998)で行い、これにより４．１に記載したように構築したプラスミドを細胞に移入する。その直後、１８０μｌのＴＹ培養液（１．０％ｗ／ｖペプトン、０．７％ｗ／ｖ酵母抽出物、０．２５％ｗ／ｖＮａＣｌ）を加え、この懸濁液を１４ｍｌ容の無菌プラスチックチューブに移し、３０分インキュベートする（３７℃、２２５ｒｐｍ）。その後、この懸濁液を選択培地に移す。３７℃で一晩インキュベートした後、コロニーを採取し、２ｍｌのＴＹ培養液に移し、３７℃、２２５ｒｐｍで一晩インキュベートする。一晩培養物１ｍｌを標準法によるプラスミド調製に用い、このプラスミド調製物に対して制限分析およびＤＮＡシーケンシングを行う。配列解析により確認した後、そのプラスミドを、本明細書に記載の方法によりさらなる発現株での形質転換に用いる。

４．３発現および発酵
上記の４．２に記載したように形質転換した細胞の一晩発現培養物１０ｍｌをＴＹ培地（１．１．２参照）で１０倍希釈し、３７℃、２２５ｒｐｍで３０分インキュベートした後、１ｍＭＩＰＴＧ（イソプロピル−チオガラクトシド）を用い、３７℃、２２５ｒｐｍで２時間、タンパク質発現を誘導する。２５００ｇ、１０分の遠心分離により細胞を採取し、このペレットを８ｍｌの溶解バッファー（２０ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、７５ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭＭｇＣｌ_２、ｐＨ８．０）に再懸濁させる。次に、この懸濁液を予冷した加圧セルに移し、１３８０バールで５分インキュベートする。バルブをゆっくり開けた後、破砕細胞の懸濁液を清浄な回収チューブに滴下する（２〜４滴／１０秒）。２回目に圧力セルに通した後、懸濁液を５００μｌずつのアリコートに分け、４℃、２００００ｇ、３０分の遠心分離により封入体を単離し、−２０℃で保存する（凍結前に上清を除去する）。

４．４カラム上でのインスリン切断
これらアリコートの１つを３０μｌのＨ_２Ｏに再懸濁させた後、５００μｌの５Ｍ塩酸グアニジンを加えて溶解させる。室温で４０分インキュベートした後、溶解した封入体を、固定化金属アフィニティーマトリックス(Quiagen GmbH, Quiagen Strasse 1, D 40724 Hilden, Cat. Nr 30210)を充填した５００μｌカラムに適用する。適用後、カラムを５カラム容（ＣＶ）の５Ｍ塩酸グアニジンで洗浄し、すぐにバッファーをリフォールディングバッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．３、５００ｍＭＮａＣｌ、５％グリセリン、２ｍＭＥＤＴＡ）に交換することにより、変異したＮ^ｐｒｏの復元を誘導する。リフォールディングバッファーは、流出液中に塩酸グアニジンが検出できなくなるまで適用し、その後、カラムを封止する。この封止カラムを少なくとも８０分インキュベートした後、ＳＤＤ−Ｉｎｓを洗浄し、単に１ＣＶのリフォールディングバッファーを適用することにより洗浄する。

実施例５
それぞれ配列番号２、３または４を有するＮ^ｐｒｏ−誘導体を用いたカラム上でのリフォールディングによる対象異種ポリペプチド（インスリン）の産生
この実験では、実施例４に記載されているものと同様の構築物を用いる。この融合ポリペプチドはＮ末端６×ヒスチジンタグ付き変異型のペスチウイルスオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏ（それぞれ配列番号２、３、４）、その後にＳＤＤ−リンカー（セリン、アスパラギン酸、アスパラギン酸）およびプロ−インスリンの配列を含む。

５．１プラスミドの構築
プラスミドの構築は、４．１に記載されている方法と同様に行う。

５．２形質転換
宿主細胞の形質転換は、４．２に記載されている方法と同様に行う。

５．３発現および発酵
発現および発酵は、４．３に記載されている方法と同様に行う。

５．４カラム上でのインスリン切断
カラム上でのインスリン切断は４．４に記載されている方法と同様に行い、同様の結果が得られる。

実施例６
配列番号５を有するＮ^ｐｒｏ−誘導体（ＥＤＤＩＥ）を用いたリフォールディングによる対象異種ポリペプチド（黄色ブドウ球菌由来Ａタンパク質のドメインＤ）の産生
この実験では構築物ｐＥＴ３０−ＥＤＤＩＥ−ｓＳｐＡ−Ｄを用いて融合タンパク質ＥＤＤＩＥ−ｓＳｐＡ−Ｄを発現させる。この融合タンパク質は配列番号５を有する変異型のペスチウイルスオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏ（ＥＤＤＩＥ）、その後に黄色ブドウ球菌Ａタンパク質のドメインＤを含む。

６．１プラスミドの構築
コドンを至適化した黄色ブドウ球菌Ａタンパク質のドメインＤのＤＮＡ配列（配列番号２５）：

を、６つの部分的に重複したオリゴヌクレオチド：
ＳｐＡＤ１Ｓｐｅ（配列番号２６）：

ＳｐＡ−Ｄ２（配列番号２７）：

ＳｐＡ−Ｄ３（配列番号２８）：

ＳｐＡ−Ｄ４（配列番号２９）：

ＳｐＡ−Ｄ５（配列番号３０）：

ＳｐＡ−Ｄ６Ｓａｌ（配列番号３１）：

の、５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Biotherm Kat. Nr. GC-002, Genecraft GmbH, Raiffeisenstr. 12, 59348 Ludinghausen, Germany)、１×ＰＣＲバッファー（Biotherm, Genecraftに同梱）、各２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰ混合物(GC-013-002, Genecraft)を含む
ＰＣＲ反応液５０μｌ中、次のプログラム：初期インキュベーション９４℃３分；９４℃３０秒、５４℃３０秒、６８℃３０秒の２５サイクル；最終インキュベーション６８℃７分を用いるＰＣＲにより構築する。最初のＰＣＲ１μｌをそのまま、５０ｐｍｏｌの５’−および３’−フランキングプライマー（ＳｐＡ−Ｄ１ＳｐｅおよびＳｐＡ−Ｄ６＿Ｓａｌ）を用いた標準的な５０μｌＰＣＲ反応にて増幅させる。この遺伝子構築手順の成否を、それ自体公知の方法で１％アガロースゲル電気泳動により分析する。精製したｓＳｐＡ−ＤＰＣＲ産物をＳｐｅＩおよびＳａｌＩで消化し、標準法に従い、脱リン酸化ｐＥＴ３０−ＥＤＤＩＥ−６Ｈａ（構築については１．１．２を参照）に連結する。大腸菌ＤＨ５α株(# 10643-013, Invitrogen catalogue 2003, Invitrogen Life Technologies Corporation, 1600 Faraday Avenue, PO Box 6482 Carlsbad, California 92008)への形質転換は、４．２に記載されている手順と同様に行う。選択されたクローンからのプラスミドＤＮＡの単離はそれ自体公知の方法で行い、それ自体公知のＤＮＡ配列解析によりｐＥＴ３０−ＥＤＤＩＥ−ｓＳｐＡ−Ｄを確認する。

６．２形質転換
宿主細胞の形質転換は、４．２に記載されている方法と同様に行う。

６．３発現および発酵
発現および発酵は、４．３に記載されている方法と同様に行う。

６．４黄色ブドウ球菌由来Ａタンパク質のドメインＤの切断
黄色ブドウ球菌由来Ａタンパク質のドメインＤの切断は、１．５に記載されている方法と同様に行う。

実施例７
配列番号３２の誘導体（ＥＤＤＩＥＮ３５Ｔ，Ｔ１５８Ｓ；アスパラギン３５がトレオニンに置換、かつ、トレオニン１５８がセリンに置換）の作製
配列番号５を含む誘導体（ＥＤＤＩＥ）から出発し、さらにＮ３５がＴに、かつ、Ｔ１５８がＳに置換されている誘導体を、１．１．２に記載されているように突然変異ＰＣＲにより構築する。プライマー対：５’＿Ｎ３５Ｔ(5'CTC TTT TTG GGA CCC CGT CCG AAG TG3)と３’＿Ｎ３５Ｔ(5'CAC TTC GGA CGG GGT CCC AAA AAG AG3')ならびにＥ５’Ｔ１５８Ｓ(5'GGA CCC GTA ACA GCA CTA ACT GTC C3')とＥ３’＿Ｔ１５８Ｓ(5'GGA CAG TTA GTG CTG TTA CGG GTC C3')を用いて連続的に２工程行う。得られた断片を用い、ＮｄｅＩおよびＳｐｅＩ制限部位を介し、ベクター６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−Ｉｎｓ−ｐｅｔ３０ａ中のＥＤＤＩＥを置換する。誘導体ＥＤＤＩＥＮ３５Ｔ，Ｔ１５８ＳのＤＮＡ配列をＤＮＡシーケンシングにより確認する。

実施例８
配列番号３３を有するＮ^ｐｒｏ−誘導体を用いた対象異種ポリペプチド（プロインスリン）の製造
８．１配列番号３３の誘導体の作製
１ｎｇのＥＤＤＩＥＮ３５Ｔ，Ｔ１５８Ｓ−Ｉｎｓ−ｐｅｔ３０ａを、ＰＣＲＩＩランダム突然変異誘発キット(Stratagen, 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037, USA, Cat#200550 catalog 2005)によるランダム突然変異誘発に用いる。詳しくは、５μｌ１０×バッファー(GeneMorphII)、１μｌ４０ｍＭｄＮＴＰミックス(GeneMorphII)、２．５μｌ（各１０３ｎｇ）プライマーミックスＩＦ−Ｎｐ−Ｎｄｅ−Ｆ (5'-AAG GAG ATA TAC ATA TGG AAC TCA ATC ATT TCG AAC TG-3') およびＩＦ−Ｎｐ−Ｉｎｓ−Ｓｐｅ−Ｒ (5'-TAA CGA AGC AAC TAG TGA CCC ACA GTG GAC AGT TAG T-3')、１μｌＭｕｔａｚｙｍｅ（登録商標）(GeneMorphII)、１ｎｇＥＤＤＩＥＮ３５Ｔ，Ｔ１５８Ｓ−Ｉｎｓ−ｐｅｔ３０ａを蒸留水で５０μｌとする。この混合物に対して次のＰＣＲプログラム：１分９４℃；１段階〜３０段階まで：３０秒９４℃、３０秒５５℃、１分７２℃；最終段階：１０分７２℃；１０℃で保持、を行う。所与の量のＤＮＡを用いて反応を行うと、Ｎ^ｐｒｏ遺伝子１つあたり平均４つの突然変異が生じる。ＰＣＲの後、この反応混合物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット(Qiagen GmbH, Qiagen Strasse 1, D 40724 Hilden, Cat#28104, Qiagen product guide 2005)を製造業者の推奨に従って用いて精製する。

８．２プラスミドの構築
プラスミドの構築は、４．１に記載されている方法と同様に行う。８．１に従って作製された断片を用い、ＮｄｅＩおよびＳｐｅＩ制限部位を介し、プラスミドＥＤＤＩＥ−Ｉｎｓ−ｐｅｔ３０ａ中のＮ^ｐｒｏ遺伝子を置換し、Ｎ^ｐｒｏ誘導体のランダム突然変異誘発プールを作出する。

８．３形質転換
宿主細胞の形質転換は、４．２に記載されている方法と同様に行う。

８．４発現および発酵
発現および発酵は、４．３に記載されている方法と同様に行う。

８．５切断分析
切断分析は、１．５に記載されているように行う。

実施例９
配列番号３２のＮ^ｐｒｏ−誘導体を用いた対象異種ポリペプチド（プロインスリン）の産生
あるいは、上記の方法において配列番号３３の誘導体を使用することもできる。この誘導体は実施例７に記載されているように作製する。
配列番号３２を有する誘導体についても同様に８．２〜８．５に記載されている工程を行う。

実施例１０
１０．１．ＥＤＤＩＥのトレオニン−セリン誘導体の作製
ＥＤＤＩＥの極性をさらに高めるために、遺伝子構築により、１０９番、１１４番、１５５番、１５８番のアミノ酸トレオニン（Ｔ）およびグルタミン（Ｑ）１４３をセリン（Ｓ）に置換する。このため、ＥＤＤＩＥの遺伝子を次のように１５の重複するオリゴヌクレオチドのセットに分割し、６．１に記載されたようにＰＣＲにより構築する。
プライマーリスト：

得られた断片を用い、ＮｄｅＩおよびＳｐｅＩ制限部位を介し、ｓ−Ｎｐ−６Ｈ−ｐｅｔ３０ａ中のＮ^ｐｒｏ遺伝子を置換する。誘導体９２のＤＮＡ配列をＤＮＡシーケンシングにより確認する。細菌細胞への形質転換ならびに発現および発酵の実施は４．２および４．３に記載の通りである。切断分析は１．５に記載されているように行う。

配列番号３４：

ＥＤＤＩＥ１４３誘導体：
アミノ酸Ｓ１４３を他のいくつかの極性アミノ酸（Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ）に交換するため、オリゴヌクレオチドｅ１４を、１４３番のコドンにヌクレオチド組成ＶＡＷ（Ｖ：ＡＣＧ；Ｗ：ＡＴ）を含む縮重オリゴヌクレオチドｅ１４ｖａｗで置換する。ｅ１４ｖａｗはリバースオリゴヌクレオチドであるので、これはリバース相補的トリプレットＷＴＢを含む。

同様の遺伝子構築法およびｓ−Ｎｐ−６Ｈ−ｐｅｔ３０ａへの挿入により、変異体の表に記載されている変異体が得られる。

細菌細胞への形質転換ならびに発現および発酵の実施は４．２および４．３に記載の通りである。切断分析は１．５に記載されているように行う。

変異体の表：

配列番号３５：

配列番号３６：

配列番号３７：

配列番号３８：

ｓＮｐ−ＦＶＮ−６Ｈ−ｐｅｔ３０ａの構築
インスリンの最初の３つのアミノ酸を含むペプチドＦＶＮ−６Ｈを挿入するために、プライマー対：ｓＮｐＦＶＮＲＳａｌ(5'-GAG AGT CGA CGT TAA CGA AGC AAC TAG TGA CCC ACA GTG-3')およびＮ^ｐｒｏ−Ｆ−ＮｄｅＩプライマー（配列番号２０）を用い、標準的なＰＣＲ反応により、プラスミドｓ−Ｎｐ−６Ｈ−ｐｅｔ３０ａから６Ｈｉｓタグ(FVNVDKLAAALEHHHHHH)Ｎ^ｐｒｏを増幅させ、得られた断片を用い、標準的な手順により、制限部位ＮｄｅＩおよびＳａｌＩを介してＮ^ｐｒｏ−６Ｈを置換し、プラスミドｓＮｐ−ＦＶＮ−６Ｈ−ｐｅｔ３０ａを作出する。

実施例１１
配列番号５のＮ^ｐｒｏ−誘導体（ＥＤＤＩＥ）およびアミノ酸置換Ｃ１３４ＥおよびＣ１３８Ｅを含むＮ^ｐｒｏ−誘導体を用いた対象異種ポリペプチド（黄色ブドウ球菌Ａタンパク質のドメインＤ）の産生
１１．１ｐＥＴ３０−６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−ｓＳｐＡ−Ｄ−ｓＳｐＡ−Ｄの構築
遺伝子構築（実施例６参照）により作製された黄色ブドウ球菌Ａタンパク質のドメインＤを、プライマー対（ＳｐＡ−Ｄ１；GCAGACGCACAACAGAATAAGTTTAACおよびＳｐＡ−Ｄ６；TTTTGGTGCCTGAGATTCGTTCAGTTTCTTTGCTTCGCCCAGAACGTT）を用い、本質的に実施例６と同様のＰＣＲ反応条件を用い、ｐＥＴ３０−ＥＤＤＩＥ−ｓＳｐＡ−Ｄ（６．１）からＰＣＲにより増幅させ、これに対してドメイン構築法を行う。第一工程で、ドメインをリンクプライマー対（ＳｐＡ−Ｄｌｉｎｋ２ＲＣ；CTGCTGGTCTTTGTTAAACTTATTCTGTTGTGCGTCTGCTTTTGGTGCCTGAGATTCGTTCおよびＳｐＡ−ＤＬｉｎｋ；GAACGAATCTCAGGCACCAAAAGCAGACGCACAACAGAATAAGTTTAACAAAGACCAGCAG）を用いてＰＣＲにより連結する。このＰＣＲ反応において、リンクプライマーの濃度を０．５ｐｍｏｌまで下げ、鋳型（シングルドメインＤ）の濃度は１０〜２５ｐｍｏｌに高める。このリバースリンクプライマーは、５’末端のリバース相補配列をモノマーの３’末端に接続し、フォワードリンクプライマーは３’末端のリバース相補配列を５’末端にそれぞれ接続する。ドメインＤのこれらの新たな５’および３’連結末端は、別のドメインＤの相補的３’および５’連結配列とそれぞれアニーリングする。ゆえに、ある特定のドメインが何単位も連結し、複数のドメインＤリピートを有する合成遺伝子が生じる。以降の単離およびクローニングを可能とするため、そして、最初のＰＣＲ中に付着した５’および３’末端を解除するために、アダプタープライマー対：ｆｉｓｈ−Ｒ−Ｓａｌ−ＳｐＡ；GATCTTCAGGTTGGTCAAGTGGGTCGACTTATTTTGGTGCCTGAGATTCGTTCAGTTTCおよびｆｉｓｈ２−Ｆ−Ｓｐｅ−ＳｐＡ；gagaGAAGAgTGGCTACTGTAgAGACTAGTTGCGCAGACGCACAACAGAATAAGTTTAACを用いた第二のＰＣＲにより、アンカーと制限部位を組み込む。最初のＰＣＲ反応液の１０分の１をそのまま、０．５ｐｍｏｌのアダプタープライマーを含む第二のＰＣＲ混合物に加える。これらの反応生成物をアガロースゲル電気泳動により分離し、このゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットにより、ダブルドメインＤを含む断片を抽出する。これらのダブルドメインＤ遺伝子を、５０ｐｍｏｌのアンカープライマー（ｆｉｓｈ２−Ｆ；gagaGAAGAgTGGCTACTGTAgAGおよびｆｉｓｈ−Ｒ；GATCTTCAGGTTGGTCAAGTGG）を用いてＰＣＲにより増幅させ、ゲル電気泳動により精製し、ＳｐｅＩ／ＳａｌＩで消化し、同じ酵素で消化したｐＥＴ３０−６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−Ｉｎｓにクローニングし、その結果としてダブルドメインＤ配列を有するプロインスリン配列の置換が生じ、それにより、構築物ｐＥＴ３０−６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−ｓＳｐＡ−Ｄ−ｓＳｐＡ−Ｄ（黄色ブドウ球菌Ａタンパク質のダブルドメインＤとＥＤＤＩＥとの融合物）が得られる。

１１．２ｐＥＴ３０−６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−ｓＳｐＡ−Ｄ−ｓＳｐＡ−Ｄの発現
細菌細胞への形質転換、発現および発酵の実施は４．２および４．３に記載の通りである。切断分析を１．５に記載されているように行ったところ、可溶性画分中には、切断されたＮ^ｐｒｏ−ＥＤＤＩＥタンパク質とダブルドメインＤの他、多数の未切断融合タンパク質（約９０％）も見られることが分かった。よって、アミノ酸置換Ｃ１３４ＥおよびＣ１３８Ｅを含むＮ^ｐｒｏ誘導体を用いたので、極めて低いin vivo切断率を示したものと考えられる。

１１．３ｐＥＴ３０−Ｎ^ｐｒｏＣ１３４Ｅ／Ｃ１３８Ｅ−ｓＳｐＡ−Ｄ−ｓＳｐＡ−Ｄの構築
Ｎ^ｐｒｏＣ１３４Ｅ／Ｃ１３８ＥＤＮＡ配列を、プライマー対：ＩＦＮｐ−Ｎｄｅ−Ｆ（５’ＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＡＡＣＴＣＡＡＴＣＡＴＴＴＣＧＡＡＣＴＧ３’）およびＩＦＮｐＳｐＡＤ−Ｓｐｅ−Ｒ（５’ＣＧＴＣＴＧＣＧＣＡＡＣＴＡＧＴＧＡＣＣＣＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＧＴＴＡＧＴ３’）を用いて増幅させ、制限酵素ＮｄｅＩ／ＳｐｅＩで切断し、ＮｄｅＩ／ＳｐｅＩで消化したベクターｐＥＴ３０−６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−ｓＳｐＡ−Ｄ−ｓＳｐＡ−Ｄに挿入６Ｈ−ＥＤＤＩＥをＮ^ｐｒｏＣ１３４Ｅ／Ｃ１３８Ｅに置換し、構築物ｐＥＴ３０−Ｎ^ｐｒｏＣ１３４Ｅ／Ｃ１３８Ｅ−ｓＳｐＡ−Ｄ−ｓＳｐＡ−Ｄを作製する。

１１．４ＮｐｒｏＣ１３４Ｅ，Ｃ１３８Ｅ−ｓＳｐＡ−Ｄ−ｓＳｐＡ−Ｄの発現
細菌細胞への形質転換、発現および発酵の実施は４．２および４．３に記載の通りである。切断分析を１．５に記載されているように行ったところ、フレンチプレスで細胞を破砕した後、不溶性画分にほとんどの未切断融合タンパク質が見られることが分かった。この結果は、種々のＮ^ｐｒｏ誘導体を用いることで、in vivo切断率および融合タンパク質の発現を封入体へ向けることが制御可能であることを示す。さらに、Ｎ^ｐｒｏＣ１３４Ｅ／Ｃ１３８Ｅ−ｓＳｐＡ−Ｄ−ｓＳｐＡ−Ｄのリフォールディングは、ほぼ０のin vivo切断の他、なお約３３％のin vitro切断産物を示す。

実施例１２：
配列番号５を有するＮ^ｐｒｏ−誘導体（ＥＤＤＩＥ）を用いた対象異種ポリペプチド（ＪＡＣ、発癌転写因子Ｊｕｎの直接的標的）の産生
１２．１６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−ＪＡＣの構築
細胞の悪性転換および腫瘍形成に関与する発癌転写因子Ｊｕｎの直接的標的であるＪＡＣの遺伝子をｃＤＮＡクローンｐＡＣ０１(Markus Hartl et. al. JAC, a direct target of oncogenic transcription factor Jun, is involved in cell transformation and tumorigenesis. PNAS 98, 13601-13606, 2001)から、１．１．１に記載のプロトコールに従い、ＳｐｅＩおよびＳａｌＩ制限部位を含むオリゴヌクレオチドプライマーＪＡＣ１(GATCACTAGTTGCATGCCCAACGGAGG)およびＪＡＣ２(GATCGTCGACTTAGTTGCCACAGCCACA)を用いてＰＣＲにより増幅させる。得られた断片を用い、６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−Ｉｎｓ−ｐｅｔ３０ａ由来のインスリン遺伝子を置換し、６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−ＪＡＣ−ｐｅｔ３０ａを作出する。これらの構築物の配列を、標準技術に従うＤＮＡシーケンシングにより確認する。

実施例１３：
配列番号５を有するＮ^ｐｒｏ−誘導体（ＥＤＤＩＥ）を用いた対象異種ポリペプチド（インターフェロンα１，ＩＦＮＡ１）の産生
１３．１６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−ｓＩＦＮＡ１−ｐｅｔ３０ａの構築：
ＩＦＮＡ１をコードする遺伝子（遺伝子バンク受託番号ＮＭ＿０２４０１３）を、次のオリゴヌクレオチドセット：

を用い、記載のように（１０．１）ＰＣＲにより構築する。

得られた断片を制限酵素ＳｐｅＩおよびＳａｌＩで消化し、これを用い、６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−Ｉｎｓ−ｐｅｔ３０ａ由来のインスリン遺伝子を置換し、６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−ｓＩＦＮＡ１−ｐｅｔ３０ａを作出する。これら構築物の配列を、標準技術に従うＤＮＡシーケンシングにより確認する。

実施例１４：
６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−Ｉｎｓを用いた対象異種ポリペプチド（Ｈｅｐｃｉｄｉｎ）の製造：
ヘプシジンのＤＮＡ配列を、プライマー対：「Ｈｅｐ２５ＦＳｐｅ」(5'-TCG ACT AGT TGC GAC ACC CAC TTC CCC ATC-3')'／「ＨｅｐＲＳａｌ」(5'-ATC GTC GAC TTA CGT CTT GCA GCA CAT CCC AC-3')を用い、鋳型「ｈｕｈｅｐｉｎｐＣＲ２．１」(S. Ludwiczek, Department of Internal Medicine, University of Innsbruck)からＰＣＲにより増幅させる。

得られたＤＮＡ断片をＳｐｅＩ／ＳａｌＩにより消化し、同じ酵素で消化したｐＥＴ３０−６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−Ｉｎｓにクローニングし、その結果としてプロインスリン配列がヘプシジン２５配列に置換され、これにより構築物ｐＥＴ３０−６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−Ｈｅｐ２５（ＥＤＤＩＥと成熟ヘプシジンとの融合物）が得られる。

ｐＥＴ３０−６Ｈ−ＥＤＤＩＥ−Ｈｅｐ２５の細菌細胞大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ(Cat. Nr. 230245, Stratgene, 11011 N.Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037, USA, 2004 Catalog)への形質転換、発現および発酵は４．２および４．３に記載のように行う。その後、細胞採取、細胞破砕、ＩＢ単離、復元および切断分析を１．５に記載のように行う。結果は約８０％のＥＤＤＩＥ−ヘプシジン２５切断を示す。

Claims

対象異種ポリペプチドの組換え産生のための方法であって、
（i）融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養すること、ここで、該融合ポリペプチドは、ペスチウイルスの天然型オートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの少なくとも１つのシステイン残基が別のアミノ酸残基で置換されているペスチウイルスのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体と、異種ポリペプチドであり、第一のポリペプチドと、その第一のポリペプチドのＣ末端において、第一のポリペプチドの自己タンパク質分解活性によりその融合タンパク質から第二のポリペプチドが切断され得るように連結されている、第二のポリペプチドとを含み、該培養は融合ポリペプチドを発現させ、対応する細胞質封入体を形成させる条件下で行う、
（ii）該宿主細胞から該封入体を単離すること、
（iii）単離した封入体を可溶化すること、
（iv）該融合ポリペプチドから対象異種ポリペプチドの自己タンパク質分解切断を誘導すること、および
（v）切断された対象異種ポリペプチドを単離すること
を含む方法。
ＣＳＦＶの天然型オートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの少なくとも１つのシステイン残基が別のアミノ酸残基で置換されている、ＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体。
Ｃ１１２、Ｃ１３４およびＣ１３８からなる群から選択されるＣＳＦＶの天然型オートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの少なくとも１つのシステイン残基が別のアミノ酸残基で置換されている、ＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体。
Ｃ１１２、Ｃ１３４およびＣ１３８からなる群から選択されるＣＳＦＶの天然型オートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの少なくとも１つのシステイン残基がグルタミン酸残基で置換されている、請求項３に記載のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体。
下記のアミノ酸配列：
配列番号２：

を含む、請求項４に記載のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体。
システイン残基の置換に加え、少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基が酸性アミノ酸残基で置換されている、請求項２〜５のいずれか一項に記載のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体。
システイン残基の置換に加え、下記のアミノ酸：Ｒ５３がＥに、Ｇ５４がＤに、Ｒ５７がＥに、そしてＬ１４３がＱに交換されている、請求項６に記載のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体。
下記のアミノ酸配列：
配列番号３：

を含む、請求項７に記載のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体。
システイン残基の置換に加え、少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基が親水性残基で置換されている、請求項２〜５のいずれか一項に記載のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体。
システイン残基の置換に加え、下記のアミノ酸：Ａ１０９、Ｖ１１４、Ｉ１５５およびＦ１５８がＴで置換されている、請求項９に記載のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体。
下記のアミノ酸配列：
配列番号４：

を含む、請求項１０に記載のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体。
システイン残基の置換に加え、下記のアミノ酸：Ａ１０９、Ｖ１１４、Ｉ１５５およびＦ１５８がＴに、Ｒ５３がＥに、Ｇ５４がＤに、Ｒ５７がＥに、そしてＬ１４３がＱに交換されている、請求項２〜５のいずれか一項に記載のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体。
下記のアミノ酸配列：
配列番号５：

を含む、請求項１２に記載のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体。
さらに下記のアミノ酸：Ｎ３５がＴに、そしてＴ１５８がＳに交換されている、請求項１２に記載のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体。
下記のアミノ酸配列：
配列番号３２：

を含む、請求項１４に記載のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体。
さらに下記のアミノ酸：Ａ２８がＥに、Ｓ７１がＦに、そしてＲ１５０がＨに交換されている、請求項１４に記載のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体。
下記のアミノ酸配列：
配列番号３３：

を含む、請求項１６に記載のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体。
システイン残基の置換に加え、下記のアミノ酸：アルギニン（Ｒ）５３、グリシン（Ｇ）５４、アルギニン（Ｒ）５７、トレオニン（Ｔ）１０９、１１４、１５５、１５８およびロイシン（Ｌ）１４３のうち少なくとも１つが置換されている、請求項２または３に記載のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体。
システイン残基の置換に加え、下記のアミノ酸のうち少なくとも１つが：アルギニン（Ｒ）５３がグルタミン酸（Ｅ）で、グリシン（Ｇ）５４がアスパラギン酸（Ｄ）で、アルギニン（Ｒ）５７がグルタミン酸（Ｅ）で、トレオニン（Ｔ）１０９、１１４、１５５、１５８がセリン（Ｓ）で、そしてロイシン（Ｌ）１４３がグルタミン（Ｑ）またはアスパラギン（Ｎ）またはアスパラギン酸（Ｄ）またはセリン（Ｓ）またはヒスチジン１９で置換されている、請求項２または３に記載のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体。
下記のアミノ酸配列：
配列番号３４：

を含む、請求項２または３に記載のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体。
下記のアミノ酸配列：
配列番号３５：

を含む、請求項２または３に記載のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体。
下記のアミノ酸配列：
配列番号３６：

を含む、請求項２または３に記載のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体。
下記のアミノ酸配列：
配列番号３７：

を含む、請求項２または３に記載のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体。
下記のアミノ酸配列：
配列番号３８：

を含む、請求項２または３に記載のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体。
請求項１の方法における、請求項２〜２４のいずれか一項に記載のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体の使用。
融合ポリペプチドが請求項２〜２４のいずれか一項に記載のＣＳＦＶのオートプロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体を含む、請求項１に記載の方法。