KR20080030551A

KR20080030551A - 융합 단백질의 자가단백질분해성 절단에 의한 재조합단백질 생산

Info

Publication number: KR20080030551A
Application number: KR1020077024875A
Authority: KR
Inventors: 플로리안 베르더; 클레멘스 아흐뮐러; 필립 베흐너; 베른하르트 아우어; 실비오 포드미르세그
Original assignee: 산도즈 아게; 베링거 인겔하임 오스트리아 게엠베하
Priority date: 2005-04-26
Filing date: 2006-04-25
Publication date: 2008-04-04
Also published as: US20090306343A1; DK1874932T3; AU2006239721B2; EP1874825B1; EP1874932B1; CA2605149A1; US8163890B2; EP1874933A2; AU2006239723B2; SI1874825T1; WO2006113958A2; JP5909172B2; WO2006113957A3; KR101289728B1; KR20080036545A; ES2342100T3; JP2015226547A; JP2008538897A; AU2006239723A1; WO2006113957A2

Abstract

본 발명은 관심 있는 이종 폴리펩티드의 재조합체 생산 공정에 관한 것으로, (ⅰ) 융합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자로서, 상기 융합 폴리펩티드는 페스티바이러스의 자연발생적인 오토프로테아제 N^pro의 적어도 하나의 시스테인 잔기가 다른 아미노산 잔기로 대체되는 핵산분자와, 변이체의 자가단백질분해 활성으로 융합 폴리펩티드에서 절단될 수 있는 방식으로 변이체의 C-말단에서 변이체에 결합되고 이종 폴리펩티드인 제2 폴리펩티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 박테리아 숙주 세포 배양으로서, 융합 폴리펩티드의 발현과 상응하는 세포질 봉입체의 형성을 야기하는 조건하에서 실시하는 배양 공정; (ⅱ) 상기 숙주세포로부터 봉입체의 단리 공정; (ⅲ) 상기 단리된 봉입체의 가용화 공정; (ⅳ) 상기 융합 폴리펩티드에서 이종 폴리펩티드의 자가단백질 절단 유도 공정; 및 (ⅴ) 상기 단리된 이종 폴리펩티드의 단리 공정을 포함한다.

Description

융합 단백질의 자가단백질분해성 절단에 의한 재조합 단백질 생산{PRODUCTION OF RECOMBINANT PROTEINS BY AUTOPROTEOLYTIC CLEAVAGE OF A FUSION PROTEIN}

본 발명은 박테리아 숙주 세포에서 관심 있는 바람직한 이종 폴리펩티드와 명확히 정의된 균질한 N-말단의 재조합체 생산에 관한 것으로, 페스티바이러스의 오토프로테아제(autoprotease) N^pro 변이체와 관심 있는 이종 폴리펩티드로 구성된 융합 폴리펩티드가 초기에 숙주세포에서 발현에 의해 형성된다. 관심 있는 이종 폴리펩티드는 숙주 세포에서 세포질 봉입체의 형태로 생산되어, 동정되고 바람직한 이종 폴리펩티드가 융합 폴리펩티드에서 N^pro 자가단백질분해 활성에 의해 절단되도록 처리된다.

박테리아 세포에서 인간 또는 기타 진핵생물 단백질의 발현 등 이종 생물체의 재조합 단백질 생산에 있어서 가능한 거의 100% 균질하고 명확히 정의된 N-말단을 얻는 것이 어려운 경우가 있다. 이것은 많은 경우에 있어서 아미노산 서열이 사람/동물에서 자연적으로 발생하는 아미노산 서열과 동일해야 하는 재조합 의약용 단백질에 특히 적합하다.

자연 발현에 대해서 예를 들면 인간에 있어서 치료용으로도 사용되는 의약용 단백질은 세포외 공간으로 운반되는 것이 많다. 이 목적을 위해서 전구체 단백질에 신호 서열이 존재하고 이 신호 서열이 절단되어 명확히 정의된 N-말단을 얻는다. 몇 가지 이유 때문에 박테리아 세포 등에서 균질한 N-말단을 생성하기가 늘 쉬운 것은 아니다.

공업적 규모 생산을 위해서 의약용 단백질은 박테리아 세포(예, Escherichia coli)의 세포질에서 생산되는 것이 많다. 이들 숙주 세포에서 의약용 단백질이 적정량 축적되고 세포 내에 불용성 봉입체(IBs)로 퇴적되는 경우가 있다. 이들 IBs는 목적 단백질의 가공과 정제에 유리하다. 또한, IBs 형태로 발현된 단백질은 세포내 프로테아제에 의한 프로테아제 분해로부터 보호된다.

여기서 사용된 "봉입체(inclusion body)"는 형질전환된 숙주 세포의 세포질에 존재하는 이종 폴리펩티드를 함유한 응집체를 말하는 것이다. 이들은 현미경 하에서 밝은 점으로 나타나고 세포질 단리에 의해 회수될 수 있다.

그러나, IB 물질의 생산은 발현된 단백질의 in vitro 리폴딩(refolding)이 필요하다. 이것은 많은 경우 공지된 방법으로 발생될 수 있다.

원핵 또는 진핵생물의 신호 서열의 도움으로 박테리아 원형질막공간(periplasm)으로 목적 단백질 수송이 적합한 경우는 드물다. 박테리아 수송 기구의 낮은 수송 능력 때문에 통상 매우 소량의 생산물만 축적할 수 있다.

그러나, 박테리아 세포질은 진핵생물의 세포외 공간과 상당히 다르다. 차이점 하나는 박테리아 세포질 내는 환원 상태가 우세하고, 또한 N-말단 선도 서열을 절단하여 성숙 단백질을 형성하는 메커니즘이 결여되어 있다는 것이다. 모든 세포질 단백질의 합성은 적절한 개시 코돈(ATG = 번역 개시)에 의해 특정되는 메티오닌으로 개시된다. 이 N-말단 메티오닌은 많은 단백질 내에 보유되어 있으나, 다른 것에서는 세포질 내에 존재하는 메티오닌 아미노펩티다제(methionine aminopeptidase, MAP)에 의해 절단되며 숙주에 대해 고유하다. 절단 효율은 본질적으로 두 가지 요소 - 1. 다음에 계속되는 아미노산의 성질 및 2. 단백질의 삼차원 구조에서 N-말단의 위치 - 로 좌우된다. 다음에 계속되는 아미노산이 세린, 알라닌, 글리신, 메티오닌 또는 발린인 경우 및 N-말단이 노출되어 있는, 즉 단백질 내부에 "감추어져" 있지 않는 경우에 N-말단 메티오닌은 우선적으로 제거된다. 다음에 계속되는 아미노산이 다른 것인 경우, 특히 하전된 것(글루탐산, 아스파르트산, 리신, 아르기닌)이거나, 또는 N-말단이 단백질 내에 위치하면 대부분의 경우에서 N-말단 메티오닌의 절단이 일어나지 않는다.

절단을 촉진하는 아미노산이 2 위치에 존재할지라도, 절단이 좀처럼 완료되지 않는다. 목표 단백질의 상당한 부분(1~50%)이 MAP에 의해 영향받지 않고 남아있는 것이 일반적이다.

그러나 자연적인 서열의 비균질성 또는 편차는 용인되지 않는 경우가 많은데, 이들의 산물이 다른 면역학적(예, 항체 형성 유도) 및 약리학적(반감기, 약물동태) 특성을 보이는 경우가 빈번하기 때문이다. 이러한 이유로 대부분의 경우 네이처-아이덴티컬(nature-identical) 산물(균질하고 N-말단에 외래 아미노산이 없음)을 생산할 필요가 있다. 세포질 발현의 경우, 대부분 경우에서 의약품은 특정 엔도펩티다아제(예, 인자 Xa, 엔테로키나아제, KEX 엔도펩티다아제, IgA 프로테아제)에 대한 절단 서열(선도) 또는 아미노펩티다아제(예, 디펩티딜 아미노펩티다아제)를 목표 단백질의 N-말단에 융합하는 것이다. 그러나, 이것은 가공을 더 하는 동안 비용과 재료 소비를 하는 소위 단백질의 다운 스트림 공정이라 하는 부가 단계를 요한다. 또한, IBs의 존재하에서 선도 서열에 의한 리폴딩을 저해하거나 완료를 방해하는 경우가 많다.

페스티바이러스의 오토프로테아제 N^pro를 포함하는 융합 폴리펩티드는 이러한 면에서 특히 유용하다. 페스티바이러스의 오토프로테아제 N^pro는 명확히 정의된 사이트에서 융합 파트너를 절단하여 균질의 N-말단을 갖는 관심 있는 폴리펩티드를 방출한다. 또한, N^pro의 자가단백질분해 활성이 in vitro에서 특정 버퍼의 적용으로 유도될 수 있어서 IBs에서 발현된 융합 폴리펩티트를 절단하여 관심 있는 폴리펩티드를 얻을 수 있다.

페스티바이러스는 직접 mRNA로서 작용하고 크기가 12.3kb인 게놈으로서 세포질에서 바이러스 유전자 산물이 이로부터 전사되는 게놈을 갖는 작은 외피보유바이러스이다. 이는 약 4000개 아미노산을 포함하고 바이러스와 세포 프로테아제에 의해 분해되어 약 12개 성숙한 단백질로 되는 단일 폴리프로틴의 형태로 발생한다.

페스티바이러스는 아강 CSFV(classical swine fever virus, 돼지 콜레라 바이러스), BDV(border disease virus, 보더병 바이러스) 및 BVDV(bovine viral diarrhoea virus, 소 바이러스 설사병 바이러스)를 포함한다.

N^pro는 168개 아미노산 길이와 약 20,000(in vivo)의 겉보기 M_r을 갖는 오토프로테아제이다. 페스티바이러스의 폴리프로틴 중 첫 번째 단백질 C이며 다음에 이어지는 뉴클레오캡시드 단백질로부터 자가단백질분해 절단된다. 이 절단은 N^pro의 서열중 마지막 아미노산인 Cys168 다음에서 발생한다.

관심 있는 이종 폴리펩티드의 생산을 위해 페스티바이러스의 자연 발생적인 오토프로테아제 N^pro의 사용은 제한될 수 있지만, in vitro에서 N^pro의 자가단백질분해 기능의 활성화는 특정 재생 조건에서만 가능하다. in vitro에서 N^pro의 절단 활성을 부여하는 이들 조건은 관심 있는 이종 폴리펩티드 생산을 위한 환경들에서 필요하거나 바람직한 특정의 다른 상호작용들을 저해한다. 그러한 상호작용의 예로서 예를 들면 선택적 펩티드-단백질 친화성 등과 같은 특정 생체특이성 친화력을 들 수 있다. 또한, 다른 요소에 대한 요구로 인해 특정 공정은 N^pro에 대한 바람직한 재생 조건을 생성할 수 없고, 그 결과 N^pro는 이들 공정에서 사용될 수 없다. 그러므로 페스티바이러스의 자연 발생적인 N^pro는 관심 있는 특정 폴리펩티드 생산 및 특정 조건 하에서 사용에 적합하지 않을 수 있다. 향상된 특성을 갖는 페스티바이러스의 N^pro에 대한 요구에 따라 절단 효율을 향상시키고, 관심 있는 폴리펩티드의 수율이 더 높게 하고 더욱 광범위한 조건에서 N^pro를 사용할 수 있도록 하기 위해 새로운 생산 공정의 적용을 하도록 한다.

본 발명에서 더 낮은 pI와 향상된 용해성을 갖고 있는 페스티바이러스의 자연발생적인 오토프로테아제 N^pro의 어떤 변이체들은 더 광범위한 조건에서 사용하기에 적합하다는 놀라운 발견을 했다. 또한, 이들 변이체들은 놀랍게도 in vitro에서 향상된 자가단백질분해 활성을 갖는다는 것을 알았다.

그에 따라 본 발명의 범위 내에서 균질의 N-말단을 갖는 관심 있는 이종 폴리펩티드의 생산을 위한 개선된 공정이 제공되고, 이는 또한 본 발명의 일부인 페스티바이러스의 오토프로테아제 N^pro의 변이체를 사용하는 것이다.

본 발명은 관심 있는 이종 폴리펩티드의 재조합체 생산을 위한 공정에 관한 것으로,

(ⅰ) 융합 폴리 펩티드를 암호화하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 박테리아 숙주 세포 배양으로서, 상기 융합 폴리펩티드는 페스티바이러스의 자연발생적인 오토프로테아제 N^pro의 적어도 하나의 시스테인 잔기가 다른 아미노산 잔기로 대체되는 페스티바이러스의 오토프로테아제 N^pro의 유도체와, 변이체의 자가단백질분해 활성으로 융합 폴리펩티드에서 절단될 수 있는 방식으로 변이체의 C-말단에서 제1 폴리펩티드와 결합되고 이종 폴리펩티드인 제2 폴리펩티드를 포함하며, 상기 배양은 융합 폴리펩티드의 발현 및 상응하는 세포질 봉입체의 형성을 야기하는 조건하에서 실시하는 배양공정;

(ⅱ) 상기 숙주 세포로부터 봉입체의 단리 공정;

(ⅲ) 상기 단리된 봉입체의 가용화 공정;

(ⅳ) 상기 융합 폴리펩티드에서 이종 폴리펩티드의 자가단백질 절단 유도 공정; 및

(ⅴ) 관심 있는 상기 절단된 이종 폴리펩티드의 단리 공정을 포함한다.

본 발명에 따른 변이체가 유도되는 바람직한 페스티바이러스의 오토프로테아제 N^pro는 다음 아미노산 서열을 갖는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro이다.

SEQ ID NO 1 :

본 발명에서 상기 서열은 향상된 특성을 갖는 융합 폴리펩티드를 생성하기 위하여 돌연변이되고, 상기 융합 폴리펩티드는 페스티바이러스의 오토프로테아제 N^pro의 변이체이며, 자연 발생적인 페스티바이러스의 오토프로테아제 N^pro의 적어도 하나의 시스테인 잔기가 다른 아미노산 잔기로 대체되고, 제2 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드가 오토프로테아제 변이체의 자가단백질분해 활성에 의해 융합 폴리펩티드에서 절단될 수 있는 방식으로 그 C-말단에서 상기 변이체에 연결되며, 상기 제2 폴리펩티드는 이종 폴리펩티드이다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 공정에서 융합 단백질의 N-말단부로서 이용되는 페스티바이러스의 자연 발생적인 N^pro의 변이체에 관한 것이다. 또한 본 발명에 관한 것인 이종 단백질의 생산 공정에서 사용되는 융합 단백질의 일부라는 의미에서 상기 변이체는 본 발명의 일부이다.

다른 형태에 있어서 본 발명은 응집하는 경향이 감소된 페스티바이러스의 자연 발생적인 N^pro의 변이체에 관한 것이다.

본 발명에서 시스테인 잔기 숫자가 감소한 페스티바이러스의 자연 발생적인 N^pro의 그 변이체가 바람직하다.

본 발명에서 CSFV의 자연 발생적인 N^pro의 변이체가 특히 바람직하다.

따라서 본 발명은 CSFV의 자연발생적인 오토프로테아제 N^pro의 적어도 하나의 시스테인 잔기가 다른 아미노산 잔기로 대체된 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체에 관한 것이다.

따라서 본 발명은 또한 다른 형태에 있어서 상술한 바와 같은 공정에 관한 것으로서, 여기서 상기 융합 폴리펩티드는 CSFV의 자연 발생적인 오토프로테아제 N^pro의 변이체를 포함하며, 상기 CSFV의 자연 발생적인 오토프로테아제 N^pro의 적어도 하나의 시스테인 잔기는 다른 아미노산 잔기로 대체된다.

바람직하게는 본 발명은 C112, C134 및 C138로 이루어진 군에서 선택된 CSFV의 자연 발생적인 오토프로테아제 N^pro의 적어도 하나의 시스테인의 잔기는 다른 아미노산 잔기로 대체된 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체에 관한 것이다.

따라서 다른 형태에 있어서 본 발명은 바람직하게는 상술한 바와 같은 공정에 관한 것으로서, 여기서 상기 융합 폴리펩티드는 C112, C134 및 C138로 이루어진 군에서 선택된 CSFV의 자연 발생적인 오토프로테아제 N^pro의 적어도 하나의 시스테인 잔기는 다른 아미노산 잔기로 대체된 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체를 포함한다.

C112, C123 및 C138로 이루어진 군에서 선택된 CSFV의 자연 발생적인 오토프로테아제 N^pro의 적어도 하나의 시스테인 잔기는 글루탐산 잔기로 대체된 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체가 더욱 바람직하다.

따라서 다른 형태에 있어서 본 발명은 더욱 바람직하게는 상술한 공정에 관한 것으로, 여기서 상기 융합 폴리펩티드는 C112, C123 및 C138로 이루어진 군에서 선택된 CSFV의 자연 발생적인 오토프로테아제 N^pro의 적어도 하나의 시스테인 잔기는 글루탐산 잔기로 대체된 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체를 포함한다.

다음의 아미노산 서열을 포함하는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체가 더욱 바람직하다.

SEQ ID NO 2 :

따라서 다른 형태에 있어서 본 발명은 더욱 바람직한 상술한 바와 같은 공정에 관한 것으로서, 여기서 상기 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO 2에 따른 서열을 갖는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체를 포함한다.

변이체의 용해도는 다음 방식으로 측정된다 :

각각의 N^pro 변이체의 농축액을 원심분리한 72시간 후, 펠렛을 용해하여 SDS 겔-전기영동을 실시한다. 상징액의 일부를 프로브 버퍼와 혼합하여 SDS 전기영동을 실시한다. 전기영동 후 그 밴드를 Coomassie blue로 염색하고 AlphaDigiDoc^TM 시스템을 갖는 농도측정계(densitometry)로 정량하여 침전된 물질의 양을 산출한다. 실험의 상세한 사항은 실시예 2를 참조.

버퍼의 이온 강도는 특정 생산 공정으로 한정하는 경우가 있다. 그러므로 본 발명은 또 다른 형태에 있어서 페스티바이러스의 자연 발생적인 N^pro 보다 더욱 중성 pI를 갖는 페스티바이러스의 자연 발생적인 N^pro 변이체에 관한 것이다. 제2 폴리펩티드(관심 있는 폴리펩티드)의 pI에 근접하게 발현되는 융합 단백질의 페스티바이러스 부분의 N^pro의 pI를 적응시키는 것이 바람직하다. 예를 들면, 융합 폴리펩티드의 페스티바이러스 부분의 N^pro는 5.5~9.5, 특히 6.0~9.0의 pI를 가질 수 있다.

따라서, 본 발명 내에서 상술한 바와 같이 적어도 하나의 시스테인 잔기의 대체 외에 적어도 하나의 염기성 아미노산 잔기가 산성 아미노산 잔기로 대체되는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro 변이체가 더욱 바람직하다.

따라서 다른 형태에 있어서 본 발명은 더욱 바람직하게는 상술한 바와 같은 공정에 관한 것으로서, 여기서 상기 융합 폴리펩티드는 상술한 바와 같이 적어도 하나의 시스테인 잔기의 대체 외에 적어도 하나의 염기성 아미노산 잔기가 산성 아미노산 잔기로 대체된 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체를 포함한다.

상술한 바와 같이 적어도 하나의 시스테인 잔기의 대체 외에 또한 다음 아미노산 H5, K16, N35, R53, G54, R57, L143, K154 및 R150 중 적어도 하나가 교체되는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체가 더욱 바람직하다. 바람직한 예는 다음 아미노산이 교체된 변이체이다. 글루탐산(E)을 갖는 아르기닌(R)53, 아스파르트산(D)을 갖는 글리신(G)54, 글루탐산(E)을 갖는 아르기닌(R)57 및 글루타민(Q)을 갖는 류신(L)143.

따라서 다른 형태에 있어서 본 발명은 더욱 바람직하게는 상술한 바와 같은 공정에 관한 것으로, 여기서 상기 융합 폴리펩티드는 상술한 바와 같이 적어도 하나의 시스테인 잔기의 대체 외에 다음 아미노산이 교체된 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체를 포함한다. 글루탐산(E)을 갖는 아르기닌(R)53, 아스파르트산(D)을 갖는 글리신(G)54, 글루탐산(E)을 갖는 아르기닌(R)57 및 글루타민(Q)을 갖는 류신(L)143.

본 발명의 다른 바람직한 실시예에 있어서 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체는 다음 아미노산 서열을 포함한다.

SEQ ID NO 3 :

따라서 다른 형태에 있어서 본 발명은 또한 상술한 바와 같은 공정에 관한 것으로, 여기서 상기 융합 폴피펩티드는 SEQ ID NO 3에 따른 서열을 갖는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체를 포함한다.

다른 형태에 있어서 본 발명은 페스티바이러스의 자연 발생적인 N^pro에 비해서 응집 감소와 용해도가 더욱 향상된 보다 중성의 pI를 보이는 페스티바이러스의 자연 발생적인 N^pro의 변이체에 관한 것이다.

용해도는 상술한 바와 같이 측정된다.

따라서 본 발명은 상술한 바와 같이 적어도 하나의 시스테인 잔기의 대체 외에 적어도 하나의 소수성 아미노산 잔기가 친수성 잔기로 대체된 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체에 관한 것이다.

따라서 다른 형태에 있어서 본 발명은 또한 상술한 바와 같은 공정에 관한 것으로, 여기서 상기 융합 폴리펩티드는 상술한 바와 같이 적어도 하나의 시스테인 잔기의 대체 외에 적어도 하나의 소수성 아미노산 잔기가 친수성 잔기로 대체된 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체를 포함한다.

본 발명 내에서 상술한 바와 같이 적어도 하나의 시스테인 잔기의 대체 외에 다음 아미노산 V24, A27, L32, G54, L75, A109, V114, V121, L143, I155 및 F158 중 적어도 하나로 더 대체된 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체가 바람직하다. 바람직한 실시예는 다음 아미노산 알라닌(A)109, 발린(V)114, 이소류신(I)155 및 페닐알라닌(F)158이 트레오닌(T)으로 교체된 변이체이다.

따라서 다른 형태에 있어서 본 발명은 바람직하게는 상술한 바와 같은 공정에 관한 것으로서, 여기서 상기 융합 폴리펩티드는 상술한 바와 같이 적어도 하나의 시스테인 잔기의 대체 외에 다음 아미노산 알라닌(A)109, 발린(V)114, 이소류신(I)155 및 페닐알라닌(F)158이 트레오닌(T)으로 교체된 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체를 포함한다. 또한, 본 발명 내에서 더욱 바람직한 변이체는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체는 다음 아미노산 서열을 포함한다.

SEQ ID NO 4 :

따라서 다른 형태에 있어서 본 발명은 더욱 바람직하게는 상술한 바와 같은 공정에 관한 것으로, 여기서 상기 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO 4에 따른 서열을 갖는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체를 포함한다.

본 발명에서 상술한 바와 같이 적어도 하나의 시스테인 잔기의 대체 이외에 다음 아미노산 알라닌(A)109, 발린(V)114, 이소류신(I)155 및 페닐알라닌(F)158이 트레오닌(T), 글루탐산(E)을 갖는 아르기닌(R)53, 아스파르트산(D)을 갖는 글리신 (G) 54 및 글루타민(Q)을 갖는 류신(L)으로 교체된 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체가 더욱 바람직하다.

따라서 다른 형태에 있어서 본 발명은 더욱 바람직하게는 상술한 바와 같은 공정에 관한 것으로, 여기서 상기 융합 폴리펩티드는 상술한 바와 같은 적어도 하나의 시스테인 잔기의 대체 이외의 다음 아미노산 알라닌(A)109, 발린(V)114, 이소류신(I)155 및 페닐알라닌(F)158이 트레오닌(T), 글루탐산(E)을 갖는 아르기닌(R)53, 아스파르트산(D)을 갖는 글리신(G)54, 글루탐산(E)을 갖는 아르기닌(R)57 및 글루타민(Q)를 갖는 류신(L)으로 교체된 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체를 포함한다.

가장 바람직하게는 본 발명에 따른 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체는 다음 아미노산 서열을 포함한다:

SEQ ID NO 5 :

따라서 가장 바람직한 다른 형태에 있어서 본 발명은 또한 상술한 바와 같은 공정에 관한 것으로, 상기 융합 폴리펩티드가 SEQ ID NO 5에 따른 서열을 갖는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체를 포함한다.

동일하게 바람직한 다른 형태에 있어서 본 발명은 상술한 바와 같은 이종 단백질 생산을 위한 공정에 관한 것으로, 여기서 상기 융합 폴리펩티드는 SEQ. ID NO 5에 따른 서열을 갖는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체를 포함하며, 또한 아스파라긴(N)35는 트레오닌으로 대체되고 트레오닌(T)158은 세린(S)으로 대체된다.

본 발명의 상술한 형태에 따른 공정에서 사용되는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체는 또한 본 발명의 부분을 형성하고 다음 아미노산 서열을 포함한다.

SEQ ID NO 32 :

다른 바람직한 형태에 있어서 본 발명은 상술한 바와 같이 이종 단백질의 생산 공정에 관한 것으로서, 여기서 상기 융합 폴리펩티드는 SEQ.ID NO.32에 따른 서열을 갖는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체를 포함하며 또한 알라닌(A)28이 글루탐산(E)으로 대체되고, 세린(S)71은 페닐알라닌(F)과 대체되고 아르기닌(R)150은 히스티딘(H)과 대체된다.

본 발명의 상기 형태에 따른 공정에 사용되는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체는 또한 본 발명의 일부를 형성하고 다음 아미노산 서열을 포함한다.

SEQ ID NO 33 :

바람직하게는 본 발명에 따른 공정에서 SEQ ID NO 32에 따른 서열을 갖는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체는 프로인슐린 생산을 위해서 프로인슐린의 적어도 세 개의 첫 번째 아미노산을 함유하는 단백질과, 더욱 바람직하게는 프로인슐린과, 더 더욱 바람직하게는 인간 프로인슐린과, 가장 바람직하게는 재조합 인간 프로인슐린과 융합하는데 사용된다.

CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체가 상술한 바와 같이 또한 적어도 하나의 시스테인 잔기의 대체를 갖는다면 본 발명에 따라 다음 아미노산 아르기닌(R)53, 글리신(G)54, 아르기닌(R)57, 트레오닌(T)109, 114, 155, 158 및 류신(L)143 중 적어도 하나가 교체되는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 바람직한 변이체는 또한 상술한 바와 같이 적어도 하나의 시스테인 잔기의 대체를 가지며, 다음 아미노산이 대체된다. 글루탐산을 갖는 아르기닌(R)53, 아스파르트산(D)을 갖는 글리신(G)54, 글루탐산(E)을 갖는 아르기닌(R)57, 세린(S)을 갖는 트레오닌(T)109, 114, 155, 158 및 글루타민(Q), 아스파라긴(N), 아스파르트산(D), 세린(S) 또는 히스티딘을 갖는 류신(L)143.

본 발명의 상기 형태에 따른 공정에서 사용되는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 바람직한 변이체는 또한 본 발명의 일부를 형성하고 다음 아미노산 서열을 포함한다.

SEQ ID 92 :

SEQ ID 95 :

SEQ ID 96 :

SEQ ID 97 :

SEQ ID 98 :

본 발명의 일부인 상술한 CSFV의 자연 발생적인 N^pro의 변이체는 CSFV의 자연 발생적인 N^pro보다 향상된 특성을 가지므로 단백질 생산의 효율을 향상시키기에 적합하다. 본 발명에서 기술하는 변이체의 리폴딩은 in vitro에서 광범위한 조건, 예를 들면, 자연 발생적인 N^pro가 정상적인 기능을 하지 않을 수 있는 낮은 이온 강도 하에서 유도될 수 있다. 그러므로 상술한 변이체는 자연 발생적인 N^pro를 성공적으로 이용할 수 없는 반응 조건 하에서 사용하기에 적합하다. 여기서 앞서 기술된 변이체는 특히 광범위한 반응 조건에서 사용하기가 적합하여서 본 발명에서 특히 바람직하다.

다른 형태에 있어서 본 발명은 본 발명에 의한 관심 있는 이종 폴리펩티드의 생산 공정에서 상술한 CSFV의 오토프로테아제 N^pro 변이체 중 어느 것의 사용에 관한 것이다.

따라서 본 발명에 따른 관심 있는 이종 폴리펩티드의 재조합체 생산 공정에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 상술한 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체 중의 어느 하나를 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 있어서 이종 폴리펩티드의 자가단백질분해성 절단 유도가 리폴딩을 촉진하는 조건 하에서 융합 폴리펩티드의 희석으로 실시된다. 이로써 불활성 융합 폴리펩티드가 리폴드되어 활성화된다.

특히 바람직한 실시예에서 아르기닌의 최종 농도가 1.0M, 바람직하게는 0.4~0.6M에 이르도록 솔루빌리제이트(solubilizate)는 아르기닌 함유 버퍼로 희석된다. 또는, 적절한 아르기닌 함유 절단 버퍼에 대하여 가용화된 봉입체를 투석함으로써 희석도 가능하다.

절단용 반응액의 온도는 예를 들면 0℃ 및 30℃ 이다. 온도는 바람직하게는 10℃~20℃가 될 수 있다.

상기 반응액의 pH는 예를 들면 5.0~9.0이다. pH는 7.0~8.0이 바람직하고, 특히 7.0~7.5이다. pH가 7.4인 것이 가장 바람직하다.

필요에 따라서, 반응액은 0.5~100mM 농도로 DTT를 함유한다. DDT 농도는 약 5.5mM가 바람직하다.

절단하는 동안 반응액 중 단백질 농도는 예를 들면 20~150㎍/㎖ 부근이 될 수 있다. 단백질 농도는 40㎍/㎖ 미만이 바람직하다.

반응액은 절단하는 동안 예를 들면 1.5M까지 농도로 tris/HCl을 함유할 수 있다. tris/HCl 농도는 0.4M과 1.2M 사이가 바람직하다.

반응액은 예를 들면 0.2% 및 1% 사이 범위의 농도로 글리세롤을 함유할 수 있다. 더욱 바람직하게는 글리세롤 농도는 5%이다.

또한, 반응액은 약 1~3mM EDTA 범위에서 EDTA를 함유한다. 바람직하게는 EDTA 농도는 2mM이다.

아르기닌 함유 및/또는 tris/HCl 함유 버퍼 대신에 다른 완충계도 가능하다.

특히 바람직한 실시예에서 절단 버퍼의 pH는 7.4이고, 절단하는 동안 온도는 10℃~20℃이고, 상기 절단 버퍼는 환원제로서 약 10mM DTT, 0.5M NaCl, 5% 글리세롤 및 2mM EDTA를 함유한다.

마지막으로 융합 폴리펩티드에서 절단된 이종 폴리펩티드는 본래 공지된 방식으로 단리된다.

본 발명의 다른 바람직한 실시예에서 이종 폴리펩티드의 자가단백질분해성 절단 유도를 그 자가단백질분해성 부분을 불활성 형태와 친화성 크로마토그래피 시스템에 융합 폴리펩티드를 결합하여 실시하고 이어서 리폴딩 버퍼를 적용한다. 특히 첫 번째 단계에서 융합 폴리펩티드는 크로마토그래피 시스템에 결합된다. 결합은 융합 폴리펩티드의 자가단백질분해성 부분이 그 활성을 다시 얻도록 조건이 변하는 동안 유지된다. 관심 있는 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드의 자가단백질분해성 부분이 크로마토그래피 시스템에 결합하여 잔존하는 동안 절단되고 용리된다.

본 발명의 특히 바람직한 실시예에서 친화성 크로마토그래피 시스템은 컬럼이며 상기 융합 폴리펩티드는 변성으로 불활성화된다. 그러므로 자가단백질분해 활성의 재활성화는 리폴딩 버퍼를 적용하여 융합 폴리펩티드를 리폴딩하여 유도된다.

본 발명의 특히 바람직한 실시예에서 리폴딩은 다음 조성을 갖는 버퍼에서 실행된다. 0.5M NaCl, 20mM 인산나트륨, 5% 글리세롤, 2mM EDTA, 10mM DTT, 0.01% Brij, pH7.4.

여기서 사용된 다음 용어들은 후술하는 의미를 갖는다.

"관심 있는 동종 폴리펩티드"란 자연 발생적인 융합 폴리펩티드 또는 폴리프로틴으로부터 페스티바이러스 오토프로테아제 N^pro에 의해 자연적으로 절단된 것이 아닌 폴리펩티드를 의미한다. 이종 폴리펩티드의 예는 공업용 효소(프로세싱 효소) 또는 약제 활성, 특히 인체 약제 활성을 갖는 폴리펩티드이다.

"융합 폴리펩티드"란 2 이상의 폴리펩티드로 구성된 폴리펩티드를 말한다. 특히 여기서 융합 폴리펩티드는 친화성 표지, 자가단백질분해성 부분, 바람직하게는 오토프로테아제 및 관심 있는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

"관심 있는 폴리펩티드"란 균질한 N-말단으로 생성되는 폴리펩티드를 말한다.

본 발명에 의하면 자가단백질분해성으로 절단되어야 하는 융합 폴리펩티드의 일부로서 관심 있는 폴리펩티드로는 암호화발현 벡터가 사용될 수 있다. 본 발명에 따르면, 그러한 발현 벡터를 사용하여 다양한 관심 있는 폴리펩티드가 제조될 수 있다. 예를 들면, 관심 있는 폴리펩티드는 약리활성을 발휘하고 예를 들면 인터페론, 인터루킨, 성장 호르몬, 성장 인자, 사이토카인, 효소, 효소 저해제, 항체와 항체 단편 등 예를 들면 인터페론 알파 2A, 인터페론 알파 2B, 인터루킨-3, 인터루킨-6, 인간 성장 호르몬, (프로)인슐린, 인슐린 유사 성장인자(IGFs), 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구 대식 콜로니 자극인자(GM-CSF), 매크로파지-콜로니 자극인자, 인터페론 베타 1, 소 소마트로핀, 돼지 소마트로핀, 인터루킨 11, 인터루킨-2, Fab-단편 및 칼시토닌, 부갑상선 호르몬(PTH) 또는 글루카곤 등의 작은 펩티드, CD 40 리간드 가용형, 플라스미노겐 활성화인자, 성 스테로이드 결합 단백질, 상피성장인자, 조직인자 세포외 영역으로 이루어진 군에서 선택될 수 있는 것이다.

또한 관심 있는 폴리펩티드는 GFP(Green Fluorescent Protein) 등 분석 방법에 특히 적합한 폴리펩티드 중 어느 폴리펩티드일 수 있다.

본 발명에 따른 공정에 사용되는 발현 벡터에 있어서, 융합 폴리펩티드는 적어도 하나의 발현 조절 서열에 조작가능하게 연결된다. 발현 조절 서열은 특히 프로모터(lac, tac, T3, T7, trp, gac, vhb, λ pL 또는 phoA 프로모터 등), 리보솜 결합부위(예들 들면, 상술한 프로모터에 속하는 천연 리보솜 결합부위, cro 또는 합성 리보솜 결합부위), 또는 전사 종결인자(예들 들면, rrnB T1T2 또는 bla)이다.

벡터는 후술하는 바와 같이 또한 융합 폴리펩티드의 N-말단측 종단에 존재하고 친화성 크로마토그래피계, 예를 들면 폴리리신 같은 폴리아미노산에 결합하거나, 또는 특정 항체로 사용할 수 있는 일반적으로 짧은 펩티드 서열인 소위 "에피토프 표지"라 하는 면역친화성 크로마토그래피를 필요로 하는 융합 영역을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 특정 단일클론항체를 용이하게 사용할 수 공지의 에피토프 표지는 FLAG, 인플루엔자 바이러스 적혈구응집소(HA) 및 c-myc 표지를 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서 발현 벡터는 플라스미드이다.

본 발명에 따른 공정에서 사용되는 박테리아 숙주 세포는 E. coli 등 Escherichia 종과 같은 그람음성 박테리아 또는 Pseudomonas aeruginosa 등 Pseudomonas sp. 또는 Caulobacter crescendos 등 Caulobacter sp. 등의 다른 그람음성 박테리아, 또는 Bacillus sp. 특히 Bacillus subtilis 등 그람양성 박테리아 로 이루어진 미생물 군에서 선택될 수 있다. E. coli가 숙주 세포로서 특히 바람직하다.

여기서 사용된 "형질전환된 숙주 세포"란 이종 폴리펩티드를 암호화한 벡터를 함유한 세포를 말한다.

박테리아 숙주 세포, 즉 발현 균주는 원래 공지된 미생물학적 시행에 따라 배양된다. 균주는 일반적으로 영양 배지 상에 단일 콜로니로부터 배양하지만, 냉동 보존된 세포 현탁액(세포 은행)을 사용할 수도 있다. 균주는 일반적으로 앞으로의 사용을 위해 충분한 생물량을 얻기 위해서 다단계 공정으로 배양된다.

작은 규모에서 이는 진탕 플라스크에서 이루어지고, 이것은 대부분의 경우 복합 배지(예를 들면, LB 브로스)를 사용할 수 있다. 그러나, 제한 배지(예를 들면, 시트레이트 배지)도 사용할 수 있다. 배양을 위해서 소량 전배양(단일 콜로니로 접종하거나 냉동 배양의 세포 현탁액을 접종) 숙주 균주가 증식되고, 이 배양을 위한 온도는 후 발현 결과에 일반적으로 중요하지 않으므로 통상 상대적으로 고온(예를 들면, 30℃ 또는 37℃)에서 조작이 가능하다. 주배양은 더 큰 용량(예를 들면, 500㎖)으로 제공되는데, 특히 양호한 통기(내용물의 용량에 비해 큰 용량의 플라스크, 고속 회전) 확보가 필요하다. 발현은 불용성 봉입체의 형태로 발현되도록 하였기 때문에 주배양도 대부분의 경우 상대적으로 고온(예를 들면, 30℃ 또는 37℃)에서 실시될 것이다. 유도계는 특히 봉입체(예를 들면, trp, lac, tac 또는 phoA 프로모터) 생산에 적합하다. 지연 대수기에 도달한 후(보통 진탕 플라스크에서 광학 밀도 0.5~1.0), 이러한 경우 유도 물질(예를 들면, 인돌아크릴산, 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노사이드 = IPTG)이 첨가되고 배양을 1~5 시간 동안 지속한다. 이 시간 동안 N^pro 융합 폴리펩티드의 대부분은 박테리아 세포질에 봉입체로서 퇴적된다. 결과 세포들을 수거하여 더 처리할 수 있다.

좀 더 큰 규모에서 다단계 시스템은 복수의 생물반응기(발효조)로 구성되고 공정의 공정공학제어를 향상시키기 위해서 이 경우에 제한 영양 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 특정 영양분을 측정하여 생물량 및 산물형성을 크게 증가시킬 수 있다(유가 배양). 그렇지 않으면 공정은 진탕 플라스크와 유사하다. 예를 들면, 예비 단계 발효조 및 주요 단계 발효조가 사용되고, 배양 온도는 진탕 플라스크의 온도와 유사하게 선택된다. 예비 단계 발효조는 일반적으로 진탕 플라스크 중의 단일 콜로니 또는 냉동 배양에서 성장된 소위 접종재료로 접종된다. 또한 발효조는, 특히 이의 중심 단계에서는 양호한 통기 및 충분한 유도물질 농도가 확보되어야 한다. 그러나, 일부의 경우 유도기는 진탕 플라스크와 비교하여 명백하게 더 길게 제조되어야 한다. 결과 세포는 더 처리되도록 다시 한번 운반된다.

본 발명에 따른 공정에서 봉입체는 원래 알려진 방식으로 숙주세포로부터 단리된다.

예를 들면, 발효가 일어난 후, 숙주 세포는 원심분리, 마이크로 여과, 응집 또는 이들의 병합으로 수거될 수 있고, 바람직하게는 원심분리에 의한다. 습윤세포집단을 고압 호모지나이저, 비드밀, 프렌치 프레스, 휴즈 프레스, 삼투압 충격, 세정제, 효소 용해 또는 이들의 병합 등 기계적, 화학적 또는 물리적 수단으로 분해한다. 바람직하게는 세포의 파괴는 고압 호모지나이저에 의해 발생한다. 재조합 융합 폴리펩티드가 봉입체로서 퇴적되는 바람직한 경우에 있어서, 봉입체는 예를 들면 고압 분산에 의해서 또는 바람직하게는 낮은 회전속도로 간단한 원심분리에 의해 얻어질 수 있다. 봉입체는 원심분리, 마이크로여과 또는 이들의 조합으로 분리될 수 있다. 바람직한 관심 있는 폴리펩티드에 관해서 순도는 예를 들면 NaCl(예를 들면 0.5~1.0M) 및/또는 세정제(예를 들면 Triton X-100) 존재 하의 다양한 버퍼에서 봉입체의 다중 재현탁에 의해서 향상될 수 있다. 바람직하게는 봉입체 조합액의 순도는 다양한 버퍼(예를 들면, 0.5% 데옥시콜레이트 다음 1M NaCl 용액으로 2회, 최종적으로 증류수)로 수회의 세척하는 단계들로 인해 향상된다. 이것은 통상 봉입체 중 대부분의 외래 폴리펩티드를 제거한다.

여기서 사용된 "가용화"란 봉입체를 용해하기 위해 필요한 공정을 말하는 것일 수 있다. 가용화는 최소화된 분자내 및 분자간 상호작용으로 폴리펩티드의 단분자 분산을 야기한다.

본 발명의 범위 내에서 봉입체의 바람직한 가용화 방법은 최종적으로 현재의 시스테인 잔기의 산화를 방지하기 위하여 환원제, 예를 들면, 50mM DTT, 4~8M 구아니디늄 HCl 또는 구아니디늄 SCN을 첨가한 50mM Tris/HCl, 8M 우레아, pH7.3 중에 현탁하여 실시된다. 필요에 따라서 용해되지 않는 물질을 예를 들면, 원심분리에 의해 제거할 수 있다.

불활성 융합 폴리펩티드가 세포 내에서 용해성으로 생산되는 경우, 세포 파쇄액은 이미 희석되었기 때문에 희석 단계를 제외하고 가용화된 봉입체에 대해 특정 세포 파쇄액을 상기 서술된 반응을 더 시킨다.

바람직한 실시예에서 솔루빌리제이트는 Tris/HCl의 최종 농도가 1.5M, 바람직하게는 0.4~1.2M가 되도록 버퍼를 함유한 Tris/HCl로 희석한다. 또는 희석은 또한 절단 버퍼를 함유한 적절한 Tris/HCl에 대해서 가용화된 봉입체를 투석함으로써 가능하다. Tris/HCl은 적절한 버퍼 물질, 예를 들면 20mM 인산 나트륨이 첨가되면 다른 염들 예를 들면 0.2~1.5M NaCl로 대체될 수 있다.

절단을 위한 반응액의 온도는 예를 들면 0℃와 30℃ 사이이다. 온도는 바람직하게는 10℃~20℃가 될 수 있다.

반응액의 pH는 예를 들면 5.0~9.0이다. pH는 7.0~8.0이 바람직하고, 특히 7.0~7.5이다. pH는 7.4가 가장 바람직하다.

필요에 따라서는 반응액은 0.5~100mM의 농도로 DTT를 함유한다. DDT 농도는 약 10mM이 바람직하다.

절단하는 동안 반응액 중의 단백질 농도는 예를 들면 20~150㎍/㎖ 범위 내일 수 있다. 단백질 농도는 40㎍/㎖ 미만이 바람직하다.

반응액은 절단하는 동안 아르기닌을 예를 들면 1.0M까지 농도로 함유할 수 있다. Tris/HCl 농도는 0.4M과 0.6M 사이가 바람직하다.

반응액은 글리세롤을 예를 들면 0.2와 30% 사이 범위 농도로 함유할 수 있다. 더욱 바람직한 글리세롤의 농도는 5%이다.

또한, 반응액은 약 1~3mM 범위로 EDTA를 함유할 수 있다. 바람직하게는 EDTA 농도는 2mM이다.

아르기닌 함유 및/또는 Tris/HCl 함유 버퍼 대신에 다른 버퍼계도 가능하다.

특히 바람직한 실시예에서 절단 버퍼의 pH는 7.4이고, 절단하는 동안 온도는 10℃~20℃이며, 절단 버퍼는 환원제로서 약 10mM DTT, 0.5M NaCl, 20mM 인산나트륨, 5% 글리세롤 및 2mM EDTA를 함유한다.

마지막으로 융합 단백질로부터 절단된 이종 폴리펩티드는 원래 공지된 방식으로 단리된다.

본 발명을 다음 실시예를 참고로 더 기술하는데, 이는 예시하는 것일 뿐 한정하는 것이 아니다. 특히, 실시예들은 본 발명의 바람직한 실시예에 관한 것이다.

본 발명으로 광범위한 재조합 단백질(또는 "관심 있는 폴리펩티드"), 특히 통상의 시스템에서 예를 들면, 숙주세포에 유독 작용을 하는 단백질 발현에 문제가 있는 단백질, 불용성 또는 낮은 용해도를 갖는 단백질, 기타 용해도의 불리한 점(예를 들면 더 짧은 단백질)을 갖는 단백질을 발현하고 생산할 수 있다. 본 발명의 변이체는 또한 특정 융합 구조체 또는 특정 활성 조건의 형태로 절단율, 발현율, 총생산율의 향상을 보인다. 또한, 본 발명의 구조체를 갖는 봉입체에서 발현은 상기한 문제에 대해서 유리한 결과를 보인다(실시예 11 참조).

예를 들면, 저분자 단백질은 일반적으로 E. coli에서 낮은 발현율을 갖는데, 이들이 박테리아 세포에서 빠르게 분해되기 때문이고, 본 발명의 따른 구조체는 발 현 수준의 상승을 가능하게 한다(실시예 14 참조).

실시예 1, 3, 4, 5, 8 및 9는 본 발명에 따른 공정의 다른 면을 이용하는 프로인슐린의 생산을 기술한다. 프로인슐린 서열은 서열의 비볼드체 부분을 형성한 하기 SEQ ID NO 6으로 주어진다. 이하에서는 편의상 프로인슐린을 인슐린으로 언급하기도 한다.

실시예 1

SEQ ID NO 5( EDDIE )를 갖는 N ^pro -변이체를 이용하여 리폴딩에 의한 관심 있는 이종 폴리펩티드(인슐린)의 생산

1.1 변이체의 생성

1.1.1 돌연변이 PCR

N^pro 프로인슐린에 대한 DNA 서열(SEQ ID NO 6)을 포함하는 구조체로부터 Operon Biotechnologies Inc.(1000 Atlantic Avenue, Suite 108 Alameda, CA 94501, USA)에 의해 맞춤합성되어 pUC119(NCBI #U07650 : National Centre for Biotechnology Information Palsmid Database, National Library of Medicine, Building 38A, Bethesda, MD 20894, USA)에 삽입되었다. 이 구조체로부터 볼드체로 표시된 필요한 N^pro 서열은 다음 프라이머 쌍, N^pro-F-Ndel, (SEQ ID NO 20) 및 N^pro-R-Sall, (SEQ ID NO 21)을 사용하여 PCR로 증폭되어 Ndel 및 Sall(굵은 글자, 이하의 표 1)에 대해 새로이 형성된 제한부위를 통해서 벡터 pET30a(#69909-3, 2002-2003 카탈로그, Novagen, CN Biosciences Inc., Merck KgaA, Darmstadt, Germany) 에 삽입되어 S-Np-6H-pET30a를 형성한다. S-Np-6H-pET30a로부터 N^pro서열이 두 개의 표준 50㎕ PCR 반응으로 증폭된다: N^pro-F-Ndel 프라이머(SEQ ID NO 20) 50pmol 및 표 1에서 선택된 하나의 복귀 돌연변이(SEQ ID NO 8, 10, 12, 14, 16, 18) 50pmol, 5 units Taq DNA-중합효소(#GC 002004, 카탈로그 2004 Genecraft, Treskow Strasse 10, D-48163 Muenster, Germany), 1x PCR 버퍼(#GC 002006, 카탈로그 2004 Genecraft) 및 각각 20nmol의 dNTP 혼합물(#GC 013004, 카탈로그 2004, Genecraft)의 PCR과 N^pro-R-Sall 프라이머(SEQ ID NO 21) 50 pmol 및 표 1에서 선택된 전진 돌연변이 프라이머(SEQ ID NO 7, 9, 11, 13, 15, 17)의 50pmol, 5 units Taq DNA-중합효소, 1x PCR 버퍼 및 각각 20nmol의 dNTP 혼합물의 PCR. PCR 반응은 다음의 프로프램을 사용하여 가열된 lid thermocycler에서 일어난다 : 3분 동안 94℃ ; 25 싸이클: 30초 동안 94℃, 30초 동안 54℃, 1분 동안 68℃; 7분 동안 68℃에서 최종 배양.

SEQ ID NO 6

1.1.2 PCR 에 의한 돌연변이체 증폭

표 1에 주어진 돌연변이 프라이머가 각각의 아미노산 변화를 도입하는데 사용된다. 두 PCR의 1/100이 병합되어 상술한 바와 같이 50pmol N^pro-F-Ndel 프라이머(SEQ ID NO 20)와 50pmol N^pro-R-Sall 프라이머(SEQ ID NO 21)의 표준 50㎕ PCR 반응으로 증폭된다. 프리 프라이머는 제조자의 추천에 따라 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen GmbH, Qiagen Strasse 1, D 40724 Hilden, Cat. Nr.28104, Qiagen product guide 2005)로 제거된다. PCR 단편은 Ndel과 Sall 제한 부위를 통해서 벡터 pET30a로 삽입된다. 그래서 구조체는 다음 돌연변이 단계에 사용된다. 이것은 다수의 연속적인 단계로 희망하는 N^pro 변이체를 생성에 필요한 아미노산 변화를 도 입하여 된다. 이 실시예의 경우 공정이 6회 반복된다. 각 아미노산 교체은 표 1에 나타내었다. 각 단계의 생성 플라스미드는 기술된 바와 같이(4.1 참조) DNA 서열 분석으로 조절된다. 돌연변이 I155T와 F158T는 프라이머 쌍 N^pro-F-Ndel 프라이머(SEQ ID NO 20)와 3'_I155T, F158T(SEQ ID NO 19)으로 단일 PCR 반응에 의해 도입되어 그 결과 PCR 생성물이 Ndel과 Spel 제한 부위를 통해서 S-Np-6H-pET30a로 삽입된다. 전체 11개 아미노산 변화의 병합은 EDDIE-6H-pET30a를 얻으며, EDDIE는 SEQ ID NO 5를 갖는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 돌연변이체를 나타낸다.

1.2 플라스미드의 제조

이 공정은 4.1에 기술된 것과 유사하게 실시된다.

1.3 숙주세포의 형질전환

이 공정은 4.2에 기술된 것과 유사하게 실시된다.

1.4 발현과 발효

이들 공정은 4.3에 기술된 것과 유사하게 실시된다.

1.5 절단

4.2에 기술된 바와 같이 구조체 6H-EDDIE-SDDIns-pET30a(제조에 대해서는 4.1참조)로 형질전환된 숙주 세포를 밤새 배양한 1㎖를 100㎖ M9-KAN 배지(50mM Na₂HPO₄, 20mM KH₂PO₄, 10mM NaCl, 20mM NH₄Cl, 1mM MgSO₄, 0.4%w/v 글루코오스, 50㎍/㎖ 카나마이신)에 이송하여 OD를 0.5까지 37℃, 225rpm로 배양하여 37℃에서 2시간 동안 1mM IPTG로 발현을 유도한다. 세포는 15분 동안 2500g에서 침강된다. 펠렛을 8㎖ 용균 버퍼(20mM Na₂HPO₄, 75mM NaCl, 5mM EDTA, 2mM MgCl₂)중에 현탁시켜 미리 냉각된 프레스 챔버에 옮겨서 5분 동안 1380bar로 배양한다. 밸브가 천천히 열리고 500㎕ aliquot을 조금씩(2~4방울/10sec) 1.5㎖ 시험관에 붓는다. 균질현탁액은 15분 동안 19000g, 4℃에서 회전시켜 상징액은 버리고 펠렛은 30㎕ 용균 버퍼(또는 H₂O) 중에 현탁시킨다. 500㎕ 구아니디늄 HCl-용액(5M 구아니디늄 HCl, 120mM Tris pH7.3, 25mM DTT)을 첨가해서 실온에서 40분간 배양한다. 10㎕를 TCA-침전(IB 콘트롤)을 위해 깨끗한 반응관에 넣고, 다른 10㎕를 RT에서 40분 동안 490㎕ 리폴딩 버퍼(0.5M NaCl, 5% 글리세롤, 2mM EDTA, 10mM DTT, pH7.4)로 1:50 희석에 의한 in vitro 재생을 위해서 깨끗한 시험관에 넣고 TCA-침전을 한다. TCA 침전물을 침강시키고, SN은 버리고 펠렛은 10㎕ 1x SDS-PAGE 프로브 버퍼에 용해하고 재생과 절단 성공을 SDS-PAGE로 분석한다. 겔은 Coomassie Brilliant Blue R250(Fluka cat. n. 27816, Laborchemikalien und analytische Reagentien 2005/2006, Fluka Chemie GmbH, Industriestrasse 25, CH-9471 Buchs, Switzerland)으로 염색하고 미절단 융합 폴리펩티드와 절단 오토프로테아제의 밴드를 염색에 의한 백색광의 흡수 측정을 기초로 농도측정계로 정량하여 절단량을 산출한다.

실시예 2

용해도 측정

EDDIE-6H-pET30a(제조는 1.1.2 참조)로 형질전환된 E. coli BL21(DE3)의 800㎖ 배양의 펠렛을 4.3에 기술된 바와 같이 제조한다. 펠렛은 40㎖/g 용균 버퍼(20mM Na₂HPO₄, 75mM NaCl, 5mM EDTA, 2mM MgCl₂, 10mM 2-머캅토에탄올, pH8)에 현탁된다. 세포의 용균이 압력 세포(1380bar)를 통해 2 passage에 의해 이루어진다. 1% Triton X-100(5㎖/g 용균 버퍼에 용해)로 15분 동안 배양 후 세포 균질 현탁액을 25000g에서 45분 동안 원심분리하여 상징액은 버리고 봉입체(IB)는 -20℃에 보관한다. 봉입체는 염화 구아니디늄 용액(5M GuCl, 120mM Tris, 25mM DTT, pH7.5)에서 1.3㎖/g IB으로 용해되어 실온에서 3.5시간 동안 배양하여 15분 동안 25000g에서 원심분리한다. 상징액을 리폴딩 버퍼(0.4M Tris, 10mM DTT, 2mM EDTA, 5% 글리세롤, 7.3pH)로 30㎖/g IB로 희석하고 실온에서 밤새 배양하여 원심분리하고 멸균여과한다. N^pro 변이체는 SP 세파로즈 컬럼상에서 용량 50㎖ 이온 교환 크로마토그래피에 의해서 정제된다. 컬럼은 0.4mM Tris pH7.3의 3CV와 평형을 이루고 리폴딩 용액 적용 후에 150mM NaCl 20mM Na₂HPO₄, pH7.5로 세정한다. 3CV 600mM NaCl, 20mM Na₂HPO₄, 5% 글리세롤, pH7.5로 용출을 실시한다. 단백질 함유 분급물(fraction) 8 및 9(각 8.5㎖)를 혼합하고 원심분리기(30분 805g)를 이용하여 막여과(Amicon Centricon plus-20, #UFC2LGC24, product catalogue 2004, Millipore Corporation, 290 Concord Rd. Billerica, MA 01821, USA)로 농축하여 결과 용액을 30분 동안 17000g, 실온에서 제2 농축 단계(Amicon Microcon YM-10, #42407, product catlogue 2004, Millipore Corporation)를 적용한다. 72시간 후에 농축액을 원심분리(10분, 17000g, 실온)하고, 펠렛을 10㎕ 1x SDS-PAGE 프로브 버퍼에 용해하여 SDS 겔-전기영동을 실시한다. 상징액 10㎕를 10㎕ 2x SDS-PAGE 프로브 버퍼와 혼합하여 SDS 겔-전기영동을 실시한다. 전기영동 후 밴드를 Coomassie Brilliant Blue R250으로 염색하여 기술된 바와 같이(2) 정량하여 침전된 물질의 양을 산출한다.

실시예 3

각각 SEQ ID NO 2, 3 또는 4를 갖는 N ^pro 변이체 중 하나를 사용하여 리폴딩에 의해 관심 있는 이종 폴리펩티드(인슐린)의 생산

공정의 다른 단계들을 SEQ ID NO 2, 3 또는 4를 갖는 세 개의 변이체 각각에 대해 유사하게 실시한다. 이들 변이체에 대해 산물은 SEQ ID NO 5(실시예 1 참조)를 갖는 변이체로 얻은 결과에 따른 것이다.

3.1 변이체 생성

3.1.1 돌연변이 PCR

이 공정은 1.1.1에 기술된 것과 유사하게 실시된다.

3.1.2 PCR 에 의한 돌연변이체 증폭

이 공정은 1.1.2에 기술된 것과 유사하게 실시된다.

3.2 플라스미드의 제조

이 공정은 4.1에 기술된 것과 유사하게 실시된다.

3.3 숙주세포의 형질전환

이 공정은 4.2에 기술된 것과 유사하게 실시된다.

3.4 발현과 발효

이들 공정은 4.3에 기술된 것과 유사하게 실시된다.

3.5 절단

이 공정은 1.5에 기술된 것과 유사하게 실시된다.

용해도와 절단 효율은 1.5 및 실시예 2에 기술된 기술을 사용하여 시험할 수 있다.

실시예 4

컬럼상에서 SEQ ID NO 5( EDDIE )를 갖는 N ^pro 변이체를 사용하여 리폴딩에 의해 관심 있는 이종 폴리펩티드(인슐린)의 생산

이하에서 "EDDIE"는 SEQ ID NO 5에 따른 서열을 갖는 CSFV의 자연 발생적인 오토프로테아제 N^pro의 돌연변이체를 표시한다.

이 실험을 위해 구조체 pET30-6H-EDDIE-SDD-Ins는 융합 폴리펩티드 6H-EDDIE-SDD-Ins를 발현하는데 사용된다. 이 융합 폴리펩티드는 SDD-링커(세린, 아스파르트산, 아스파르트산)과 프로-인슐신 서열이 이어진 페스티바이러스의 오토프로테아제 N^pro, SEQ ID NO 5의 N-말단 6x 히스티딘 표지된 돌연변이체 형태를 포함한다.

4.1 플라스미드의 제조

N^pro 프로-인슐린(SEQ ID NO 6)에 대한 DNA 서열은 Operon Biotechnologies, Inc.(1000 Atlantic Avenue, Suite 108 Alameda, CA 94501, USA)에 의해서 맞춤합성되고 pUC119(NCBI #U07650 : National Center for Biotechnology Information Plasmid Database, National Library of Medicine, Building 38A, Bethesda, MD 20894, USA)에 삽입된다.

이 구조체로부터 필요한 N^pro 서열(볼드체로 표시)이 다음 프라이머쌍 N^pro-F-Ndel(SEQ ID NO 20) 및 Ins-R-Sall(SEQ ID NO 22), (5'-CTT TCG TCG ACT TAT TAA TTG CAG TAG TTT TC-3')을 이용하는 PCR로 증폭되고 그 결과 단편이 새로이 생성된 Ndel 및 Sall(볼드체 글자)에 대한 제한 부위를 통해서 벡터 pET30a에 삽입된다. E. coli 균주 DH5alpha(#10643-013, Invitrogen catalogue 2003, Invitrogen Life Technologies Corporation, 1600 Faraday Avenue, PO Box 6482 Carisbad, California 92008)로 형질전환(4.2 참조), 선택된 클론에서 플라스미드 DNA 단리 및 DNA 서열 분석이 S-Np-Ins-pET30a를 검증한다. EDDIE-6H-pET30a(1.1.2의 제조 참조)에서 EDDIE(SEQ ID NO 5)는 다음 프라이머 쌍 6H-N^pro-F-Ndel(SEQ ID NO 23), (5'-CTC TCA TAT GCA TCA CCA TCA TCA TCA CGA ACT CAA TCA TTT CGA ACT GCT C-3') 및 N^pro-R-Sall(SEQ ID NO 21)을 이용하여 PCR로 증폭되고 그 결과 단편을 6H-EDDIE-Ins-pET30a를 생성하는 구조체 S-Np-Ins-pET30a의 Ndel 및 Spel에 대한 제한 부위(볼드체 글자)를 통해서 N^pro를 대체하는데 사용한다. N^pro 오토프로테아제에 대한 적절한 절단 부위를 생성하기 위해서 프로-인슐린 서열을 다음 프라이머 쌍 SDDIns-F-Spe(SEQ ID NO 24)(5'-GTA ACT AGT TGC AGC GAT GAC TTC GTT AAC CAA CAT CTG TGC-3') 및 Ins R Sall, (SEQ ID NO 22)을 이용하여 PCR로 플라스미드 6H-EDDIE-Ins-pET30a로부터 증폭되고 그 결과 단편들을 6H-EDDIE-SDDIns-pET30a를 생성하는 구조체 6H-EDDIE-Ins-pET30a의 Spel 및 Sall에 대한 제한 부위(볼드체 글자)를 통해서 프로-인슐린 서열을 대체하는데 사용한다. 그 구조체의 서열은 표준 기술에 따른 DNA 염기서열분석으로 검증된다.

4.2 형질전환

Electrocompetent cell은 박테리아 배양물(37℃ 및 225rpm에서 OD₆₀₀=0.5로 증식) 1리터로 제작된다. 세포 현탁액을 15분 동안 얼음에서 냉각시켜(연속 교반) 펠렛화하여(4℃, 2500g, 10분) 상징액은 제거한다. 잔존하는 펠렛은 4℃에서 탈이온수 1리터 중에 재현탁하여 단속적인 원심분리 단계로(4℃, 2500g, 10분) 다시 침전시키고(4℃, 2500g, 10분) 50㎖ 탈이온수(4℃)로 2회 세정한다. 펠렛은 최종적으로 50㎖ 10% 멸균 글리세롤 용액(4℃)으로 세정하여 펠렛화하고(4℃, 2500g, 10분) 2.5㎖ 10% 멸균 글리세롤 용액(4℃) 중에 재현탁하여 동결하고 -80℃에서 40㎕ aliquots으로 보관한다. Electrocompetent cell의 1 aliquot를 얼음 상에서 해동시켜 5ng DNA를 함유하는 연결반응 반응물 1㎕을 기포없이 전극갭이 1㎜인 전기천공 큐벳(electroporation cuvette)으로 첨가수송한다. 1.5kV, 25μF, 200옴으로 설정한 BIO-RAD 펄스 콘트롤러(Bio-Rad Laboratories Inc., 2000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547, USA; cat. n. 1652098, Life Science Research Products 1998)를 포함하는 시간 상수가 4.4분보다 긴 BIO-RAD Gene Pilser^TM(Bio-Rad Laboratories Inc., 2000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547, USA; cat. n. 1652077, Life Science Research Products 1998)로 전기천공이 생김으로써 4.1에 기술된 바와 같이 제조된 플라스미드가 세포에 전사된다. 그 직후에 180㎕ TY-브로스(1.0% w/v 펩톤, 0.7% w/v 효모추출물, 0.25% w/v NaCl)를 첨가하여 현탁액을 멸균 14㎖ 플라스틱 시험관에 옮겨서 30분 동안 배양(37℃, 225rpm)한다. 다음으로 현탁액을 선택배지에 도말한다. 37℃에서 밤새 배양한 후 콜로니를 취해서 2㎖ TY-브로스에 옮기고 37℃, 225rpm에서 밤새 배양한다. 밤새 배양한 배양물 1㎖를 표준 방법에 의해 플라스미드 정제에 사용하고 그 정제된 플라스미드를 제한 분석 및 DNA 염기서열분석에 적용한다. 서열 분석에 의해 검증한 후 플라스미드는 여기서 기술된 방법으로 발현된 균주에서 더 형질전환하는데 이용된다.

4.3 발현 및 발효

상기 4.2에서 기술된 바와 같이 밤새 배양한 형질 변환된 세포의 발현 배양물 10㎖를 TY-배지(1.1.2 참조)로 10배 희석하여 37℃, 225rpm에서 30분 동안 배양하고 37℃, 225rpm에서 2시간 동안 1mM IPTG(Isopropyl-thiogalactoside)로 단백질 발현을 유도한다. 2500g에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수거하고 펠렛을 8㎖ 용균 버퍼(20mM Na₂HPO₄, 75mM NaCl, 5mM EDTA, 2mM MgCl₂, pH 8.0)중에 재현탁한다. 다음으로 현탁액은 미리 냉각된 압력세포로 옮겨서 1380bar에서 5분 동안 배양한다. 그 후로 밸브를 천천히 열고 파괴된 세포의 현탁액을 깨끗한 컬렉션 시험관에 조금씩(2~4 방울/10sec) 붓는다. 압력 세포를 통한 제2 passage 후에 현탁액을 500㎕의 aliquot으로 나누고 봉입체를 4℃, 20000g에서 30분 동안 원심분리하여 단리로 -20℃에서 보관한다(상징액은 동결하기 전에 제거한다).

4.4 컬럼 상에서 인슐린의 절단

이들 aliquot 중 하나를 30㎕ H₂O 중에 재현탁하고 이어서 5M 구아니딘 하이드로클로라이드의 500㎕를 첨가하여 용해한다. 실온에서 40분 동안 배양한 다음 용해된 봉입체를 고정화 금속 친화성 매트릭스(Qiagen GmbH, Qiagen Strasse 1, D 40724 Hilden, Cat. Nr 30210)로 충전한 500㎕ 컬럼에 적용한다. 적용 후에 5 컬럼체적(CV)의 5M 구아니딘 하이드로클로라이드로 컬럼을 세정하고 리폴딩 버퍼(20mM 인산 나트륨 pH 7.3, 500mM NaCl, 5% 글리세린 2mM EDTA)로 신속하게 버퍼를 교체하여 돌연변이된 N^pro의 복원을 유도한다. 리폴딩 버퍼는 구아니딘 하이드로클로라이드를 유량에서 검출할 수 없을 때까지 적용하고, 그 후에 컬럼을 밀봉한다. 이 밀봉된 컬럼을 적어도 80분 동안 배양한 다음 SDD-Ins를 리폴딩 버퍼 1CV를 적용하여 간단히 씻어낸다.

실시예 5

컬럼상에서 각 SEQ ID NO 2, 3 또는 4를 갖는 N ^pro 변이체를 사용하여 리폴딩에 의해 관심 있는 이종 폴리펩티드(인슐린)의 생산

이 실험을 위해 실시예 4에서 기술된 것과 유사한 구조체를 사용한다. 이 융합 폴리펩티드는 SDD-링커(세린, 아스파르트산, 아스파르트산)과 프로-인슐린 서열이 이어진 페스티바이러스의 오토프로테아제 N^pro, (각각 SEQ ID NO 2, 3, 4)의 N-말단 6x 히스티딘 표지된 돌연변이체 형태를 포함한다.

5.1 플라스미드의 제조

플라스미드의 제조는 4.1에 기술된 공정과 유사하게 실시된다.

5.2 형질전환

숙주세포의 형질전환은 4.2에 기술된 공정에 유사하게 실시된다.

5.3 발현 및 발효

발현 및 발효는 4.3에 기술된 공정에 유사하게 실시된다.

5.4 컬럼 상에서 인슐린의 절단

컬럼 상에서 인슐린의 절단은 4.4에 기술된 공정에 유사하게 실시되며 유사한 결과를 갖는다.

실시예 6

SEQ ID NO 5( EDDIE )를 갖는 N ^pro 변이체를 사용하여 리폴딩에 의한 관심 있는 이종 폴리펩티드( Staphylococcus aureus 로부터 단백질 A의 도메인 D)의 생산

이 실험을 위해 구조체 pET30-EDDIE-sSpA-D를 융합 단백질 EDDIE-sSpA-D를 발현하는데 사용한다. 이 융합 단백질은 Staphylococcus aureus 단백질 A의 도메인 D가 이어진 (SEQ ID NO 5), (EDDIE)를 갖는 페스티바이러스의 오토프로테아제 N^pro의 돌연변이체 형태를 포함한다.

6.1 플라스미드의 제조

Staphylococcus aureus 단백질 A의 도메인 D, (SEQ ID NO 25)에 대해 최적화된 DNA 서열 코돈은 5 units Taq DNA-중합효소(Biotherm Kat. Nr. GC-002, Genecraft GmbH, Raiffeisenstr. 12, 59348 Luedinghausen, Germany), 1x PCR 버퍼(Biotherm 포함, Genecraft), 각 20nmol dNTP 혼합물(GC-013-002, Genecraft)의 50㎕ PCR 반응액에서 부분적으로 오버랩핑된 6개의 올리고뉴클레오티드를 다음 프로그램을 이용한 PCR에 의해 어셈블된다: 94℃에서 3분 동안 초기 배양, 94℃ 30초, 54℃ 30초, 68℃ 30초의 25 싸이클 및 68℃에서 7분 동안 최종배양. 제1 PCR 1㎕는 5'- 및 3'-플랭킹 프라이머(SpA-D1 Spe 및 SpA-D6_Sal) 50pmol의 표준 50㎕ PCR 반응액에서 직접적으로 증폭된다. 유전자 어셈블리 공정의 성공은 공지된 방식인 1% 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석된다. 정제된 sSpA-D PCR 생산물은 표준 방식에 따라 Spel 및 Sall로 분해되고 탈인산화된 pET30-EDDIE-6Ha(제조에 대해서는 1.1.2 참조)에 연결된다. E. coli 균주 DH5alpha(#10643-013, Invitrogen catalogue 2003, Invitrogen Life Technologies Corporation, 1600 Faraday Avenue, PO Box 6482 Carlsbad, California 92008)로 형질전환은 4.2에 기술된 공정과 유사하게 실시된다. 공지된 방식으로 선택된 클론으로부터 플라스미드 DNA의 단리 및 본 기술분야에서 공지된 바와 같은 DNA 서열 분석은 pET30-EDDIE-sSpA-D를 검증한다.

(SEQ ID NO 25):

SpAD1Spe(SEQ ID NO 26):

SpA-D2(SEQ ID NO 27):

SpA-D3(SEQ ID NO 28):

SpA-D4(SEQ ID NO 29):

SpA-D5(SEQ ID NO 30):

SpA-D6 Sal(SEQ ID NO 31):

6.2 형질전환

6.3 발현 및 발효

발현 및 발효는 4.3에 기술된 공정에 유사하게 실시된다.

6.4 Staphlococcus aureus 로부터의 단백질 A의 도메인 D의 절단

Staphylococcus aureus로부터의 단백질 A의 도메인 D의 절단은 1.5에 기술된 공정에 유사하게 실시된다.

실시예 7

SEQ ID NO 32( EDDIEN35T , T158S ; 트레오닌으로 대체된 아스파라긴 35, 및 세린으로 대체된 트레오닌 158)에 따른 변이체의 생성 :

SEQ ID NO 5(EDDIE)를 포함하는 변이체로부터 출발하여 또한 N35는 T에 의해 대체되고 T158은 S에 의해 대체된 변이체가 1.1.2에 기술된 바와 같이 돌연변이 PCR에 의해 구성된다. 두 개의 연속적인 단계는 다음 프라이머쌍을 이용하여 실시된다. 5'_N35T(5'CTC TTT TTG GGA CCC CGT CCG AAG TG3) 및 3'_N35T(5'CAC TTC GGA CGG GGT CCC AAA AAG AG3')와 E 5'_T158S(5'GGA CCC GTA ACA GCA CTA ACT GTC C3') 및 E 3'_T158S(5'GGA CAG TTA GTG CTG TTA CGG GTC C3'). 그 결과 단편은 벡터 6H-EDDIE-Ins-pet30a에서 Ndel 및 Spel 제한 부위를 통해서 EDDIE를 대체하는데 사용된다. 변이체 EDDIEN35T,T158S의 DNA 서열은 DNA 염기서열분석에 의해 검증된다.

실시예 8

SEQ ID NO 33을 갖는 N ^pro -변이체를 사용하여 관심 있는 이종 폴리펩티드(프로인슐린)의 생산 :

8.1 SEQ ID NO 33에 따른 변이체의 생성 :

EDDIEN35T,T158S-Ins-pet30a의 1ng는 GeneMorph PCRⅡ 랜덤 돌연변이 유발 키트(Stratagene, 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037, USA, Cat#200550 catalog 2005)에 의한 랜덤 돌연변이 유발에 사용된다. 상세하게는 5㎕ 10x 버퍼(GeneMorphⅡ), 1㎕ 40mM dNTP-mix(GeneMorphⅡ), 2.5㎕(각 103ng) 프라이머-mix IF-Np-Nde-F(5'-AAG GAG ATA TAC ATA TGG AAC TCA ATC ATT TCG AAC TG-3') 및 IF-Np-Ins-Spe-R(5'-TAA CGA AGC AAC TAG TGA CCC ACA GTG GAC AGT TAG T-3'), 1㎕ Mutazyme^®(GeneMorphⅡ), 1ng EDDIEN35T, T158S-Ins-pet30a, A. dest. ad 50㎕. 이 혼합물에 다음 PCR-프로그램을 실시한다: 1분 94℃; 단계 1~30: 30초 94℃, 30초 55℃, 1분 72℃; 최종 단계: 10분 72℃; 10℃ 유지. 소정량의 DNA를 갖는 반응액은 N^pro 유전자 당 평균 4번의 돌연변이를 일으킨다. PCR후 반응액 mix는 제조자의 권유에 따라서 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen GmbH, Qiagen Strasse 1, D 40724 Hilden, Cat#28104, Qiagen product guide 2005)를 사용하여 정제한다.

8.2 플라스미드 제조

플라스미드 제조는 4.1에 기술된 공정에 유사하게 실시된다. 8.1에 따라서 생성된 단편은 플라스미드 EDDIE-Ins-pet30a 중에서 Ndel 및 Spel 제한 부위를 통해서 N^pro 유전자를 대체하는데 사용됨으로써 N^pro 변이체의 랜덤 돌연변이유발 풀을 생성한다.

8.3 형질전환

8.4 발현 및 발효

발현 빛 발효는 4.3에 기술된 공정에 유사하게 실시된다.

8.5 절단 분석

절단 분석은 1.5에 기술된 바와 같이 실시된다.

실시예 9

SEQ ID NO 32에 따른 N ^pro -변이체를 사용하여 관심 있는 이종 폴리펩티드(프로인슐린)의 생산 :

또는 SEQ ID NO 32에 따른 변이체를 상술한 공정에서 사용할 수 있다. 변이체는 실시예 7에서 기술된 바와 같이 생산된다. 8.2~8.5에 기술된 단계는 SEQ ID NO 32를 갖는 변이체와 유사하게 실시된다.

실시예 10

10.1 EDDIE 의 트레오닌-세린 변이체 생성 :

EDDIE의 극성을 더 증가시키기 위해서 109, 114, 155, 158 위치의 아미노산 트레오닌(T) 및 글루타민(Q) 143을 유전자 어셈블리에 의해 세린(S)으로 대체한다. 이를 위해 EDDIE에 대한 유전자들은 다음의 15개 오버랩핑 올리고뉴클레오티드의 세트로 분할되어 6.1에 기술된 바와 같은 PCR에 의해 어셈블된다.

프라이머 목록 :

그 결과 단편은 Ndel 및 Spel 제한 부위를 통해서 s-Np-6H-pet30a 중에서 N^pro 유전자를 대체하는데 사용된다. 변이체 92의 DNA 서열은 DNA 염기서열분석으로 검증된다. 박테리아 세포로의 형질전환과 발현 및 발효는 4.2 및 4.3에 기술된 바와 같이 이루어진다. 절단 분석은 1.5에 기술된 바와 같이 실시된다.

no.	N^pro 변이체 중 아미노산 변화
92	R53E, G54D, R57E, A109S, C112E, V114S, C134E, C138E, L143S, I155S, F158S

SEQ ID 92 :

EDDIE 143 변이체 :

아미노산 S143을 다수의 다른 극성 아미노산(D, G, H, K, N, Q)으로 교체하기 위해서 143 위치의 코돈에 대한 뉴클레오티드 조성 VAW(V : ACG; W : AT)를 포함하는 변성 올리고뉴클레오티드 e14vaw에 의해 올리고뉴클레오티드 e14가 대체된다. e14vaw는 리버스 올리고뉴클레오티드이기 때문에 역상보 트리플렛 WTB를 포함한다.

s-Np-6H-pet30a의 동일 유전자 어셈블리 공정과 삽입은 돌연변이체의 표에 기술된 돌연변이체를 얻는다.

박테리아 세포로의 형질전환과 발현 및 발효는 4.2 및 4.3에 기술된 바와 같이 된다. 절단 분석이 1.5에 기술된 바와 같이 실시된다.

돌연변이체의 표 :

no.	N^pro 변이체 중 아미노산 변화
95	R53E, G54D, R57E, A109S, C112E, V114S, C134E, C138E, L143N, I155S, F158S
96	R53E, G54D, R57E, A109S, C112E, V114S, C134E, C138E, L143D, I155S, F158S
97	R53E, G54D, R57E, A109S, C112E, V114S, C134E, C138E, L143H, I155S, F158S
98	R53E, G54D, R57E, A109S, C112E, V114S, R120C, C134E, C138E, L143Q, I155S, F158S

SEQ ID 95 :

SEQ ID 96 :

SEQ ID 97 :

SEQ ID 98 :

sNP - FVN -6H- pet30a 의 제조

인슐린의 처음 세 개의 아미노산과 6His 표지(FVNVDKLAAALEHHHHHH)를 포함하는 펩티드 FVN-6H를 삽입하기 위해 N^pro는 프라이머쌍 sNp FVN R Sal(5'-GAG AGT CGA CGT TAA CGA AGC AAC TAG TGA CCC ACA GTG-3')과 N^pro-F-Ndel 프라이머(SEQ ID NO 20)으로 플라스미드 s-Np-6H-pet30a에서 표준 PCR 반응에 의해 증폭되어 그 결과 단편을 제한 부위 Ndel 및 Sall을 통해서 표준 공정에 의해 N^pro-6H를 대체하는데 사용하여 플라스미드 sNp-FVN-6H-pet30a를 생성한다.

실시예 11

SEQ ID NO 5( EDDIE )에 따른 N ^pro -변이체 및 아미노산 치환 C134E 및 C138E 를 함유하는 N ^pro -변이체를 사용하는 관심 있는 이종 폴리펩티드( Staphylococcus aureus 단백질 A의 이중 도메인 D)의 생산

11.1 pET30 -6H- EDDIE - sSpA -D- sSpA -D의 제조

유전자 어셈블리에 의해 생성된 Staphylococcus aureus 단백질 A의 도메인 D는(실시예 6 참조) 기본적으로 실시예 6과 동일한 PCR 반응 조건을 사용하는 프라이머 쌍 (SpA-D1 ; GCAGACGCACAACAGAATAAGTTTAAC 및 SpA-D6 ; TTTTGGTGCCTGAGATTCGTTCAGTTTCTTTGCTTCGCCCAGAACGTT)을 사용하여 pET30-EDDIE-sSpA-D(6.1)로부터 PCR에 의해 증폭되고 도메인 어셈블리 공정에 적용된다. 제1 단계에서 단일 도메인들은 링크 프라이머쌍(SpA-Dlink2RC ; CTGCTGGTCTTTGTTAAACTTATTCTGTTGTGCGTCTGCTTTTGGTGCCTGAGATTCGTTC 및 SpA-DLink ; GAACGAATCTCAGGCACCAAAAGCAGACGCACAACAGAATAAGTTTAACAAAGACCAGCAG)으로 PCR에 의해 상호 연결된다. 이 PCR 반응에서 링크 프라이머 농도는 0.5pmol로 감소되는 반면 주형(단일 도메인 D)의 농도는 10~25pmol로 상승된다. 각각 리버스 링크 프라이머는 모노머의 3'말단에 5' 말단의 역상보 서열을 붙이고 포워드 링크 프라이머는 5'말단에 3'말단의 역상보 서열을 붙인다. 이들 도메인 D의 새로운 5' 및 3' 연결 말단은 각각 다른 도메인 D의 3' 및 5' 연결 서열에 붙는다. 그러므로 하나의 특정 도메인의 많은 유닛들은 상호 연결되어 도메인 D의 다중 반복을 갖는 합성 유전자를 생산한다. 제1 PCR 반응을 하는 동안 연속적인 단리와 클로닝을 하고 및 붙어있는 5'와 3' 말단을 제거하기 위해서 앵커와 제한 부위를 어댑터 프라이머쌍 fish-R-Sal-SpA ; GATCTTCAGGTTGGTCAAGTGGGTCGACTTATTTTGGTGCCTGAGATTCGTTCAGTTTC 및 fish2-F-Spe-SpA ; gagaGAAGAgTGGCTACTGTAgAGACTAGTTGCGCAGACGCACAACAGAATAAGTTTAAC으로 제2 PCR을 하여 편입한다. 제1 PCR 반응물의 1/10을 0.5pmol 어댑터 프라이머를 함유하는 제2 PCR에 직접 첨가한다. 반응 산물은 아가로스 겔 전기영동으로 분리하여 이중 도메인 D를 함유하는 단편을 QIAquick 겔 추출 키트로 겔에서 추출한다. 이중 도메인 D 유전자는 앵커 프라이머(fish2-F ; gagaGAAGAgTGGCTACTGTAgAG 및 fish-R ; GATCTTCAGGTTGGTCAAGTGG) 50pmol을 사용하는 PCR로 증폭하여 겔 전기영동으로 정제하고 Spel/Sall로 분해하여 이중 도메인 D 서열과 프로인슐린 서열을 치환하는 상기 동일한 효소로 분해된 pET30-6H-EDDIE-Ins로 복제함으로써 구조체 pET30-6H-EDDIE-sSpA-D-sSpA-D(Staphylococcus aureus 단백질 A의 이중 도메인 D와 EDDIE의 융합)를 생성한다.

11.2 pET30 -6H- EDDIE - sSpA -D- sSpA -D의 발현

박테리아 세포로의 형질전환, 발현 및 발효는 4.2 및 4.3에 기술된 바와 같이 된다. 1.5에 기술된 바와 같이 실시된 절단 분석은 절단된 N^pro-EDDIE 단백질과 이중 도메인 D 외에 절단되지 않은 융합 단백질의 대다수(약 90%)도 용해성분 중에서 발견된다는 것을 보여준다. 그러므로 in vivo 절단율이 매우 낮은 아미노산 치환 C134E 및 C138E를 포함하는 N^pro 변이체를 사용하는 것이 고려된다.

11.3 pET30 - N ^pro C134E / C138E - sSpA -D- sSpA -D의 제조

N^proC134E/C138E DNA 서열을 제한 효소 Ndel/Spel로 절단한 프라이머 쌍 IF NP-Nde-F(5'AAGGAGATATACATATGGAACTCAATCATTTCGAACTG3') 및 IF NP SpAD-Spe-R(5'CGTCTGCGCAACTAGTGACCCACAGTGGACAGTTAGT3')로 증폭하여 Ndel/Spel로 분해된 벡터 pET30-6H-EDDIE-sSpA-D-sSpA-D에 삽입함으로써 N^proC134E/C138E로 6H-EDDIE를 대체하여 구조체 pET30-N^proC134E/C138E-sSpA-D-sSpA-D를 생성한다.

11.4 N ^pro C134E , C138E - sSpA -D- sSpA -D의 발현

박테리아 세포로의 형질전환, 발현 및 발효는 4.2 및 4.3에 기술된 바와 같이 실시된다. 1.5에 기술된 바와 같이 실시된 절단 분석은 대부분의 절단되지 않은 융합 단백질은 프렌치 프레스를 통해 세포파괴를 한 후 불용성 성분에서 발견되는 것을 보여준다. 이 결과는 다른 N^pro 변이체를 사용함으로써 in vivo 절단율의 양과 융합 단백질의 봉입체로의 발현 방향이 제어될 수 있다는 것을 보여준다. 또한, N^proC134E/C138E-sSpA-D-sSpA-D의 리폴딩은 in vivo 절단이 거의 제로라는 것 외에 그래도 in vitro에서 분해된 산물이 약 33%임을 보여준다.

실시예 12

SEQ ID NO 5( EDDIE )를 갖는 N ^pro -변이체를 사용하는 관심 있는 이종 폴리펩티드( JAC, 발암성 전사인자 Jun의 직접 표적)의 생산

12.1 6H- EDDIE - JAC 의 제조

JAC에 대한 유전자, 세포의 형질전환 및 종양발생에 관련된 발암성 전자인자 Jun의 직접 표적을 cDNA 클론 pAC01(MarKus Hartl et. al. JAC, 발암성 전사인자 Jun의 직접 표적은 세포 형질 변환 및 종양발생에 관련되어 있다. PNAS 98, 13601-13606, 2001)로부터 1.1.1에 기술된 프로토콜에 따른 Spel 및 Sall 제한 부위를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 JAC1(GATCACTAGTTGCATGCCCAACGGAGG) 및 JAC2(GATCGTCGACTTAGTTGCCACAGCCACA)로 PCR에 의해 증폭된다. 그 결과 단편은 6H-EDDIE-Ins-pet30a로부터 인슐린 유전자를 대체하는데 사용되어 6H-EDDIE-JAC-pet30a를 생성한다. 구조체의 서열은 표준 기술에 따라서 DNA 염기서열분석에 의해 검증된다.

박테리아 세포로의 형질전환과 발현 및 발효는 4.2 및 4.3에 기술된 바와 같이 실시된다. 절단 분석은 1.5에 기술된 바와 같이 실시된다.

실시예 13

SEQ ID NO 5( EDDIE )를 갖는 N ^pro -변이체를 사용하여 관심 있는 이종 폴리펩티드(인터페론 알파 1, IFNA1 )의 생산

13.1 6H- EDDIE - sIFNA1 - pet30a 의 제조:

IFNA1(유전자은행 등록번호 NM_024013)을 암호화하는 유전자는 다음 올리고뉴클레오티드 세트를 사용하여 (10.1)에 기술된 바와 같이 PCR에 의해 어셈블된다.

그 결과 단편은 제한 효소 Spel 및 Sall로 분해되어 6H-EDDIE-Ins-pet30a로부터 인슐린 유전자를 대체하는데 사용하여 6H-EDDIE-sIFNA1-pet30a를 생성한다. 구조체의 서열은 표준 기술에 따라서 DNA 염기서열분석에 의해 검증된다.

실시예 14

6H- EDDIE - Ins 를 사용하여 관심 있는 이종 폴리펩티드( 헵시딘 )의 생산

헵시딘 DNA 서열은 프라이머쌍 "Hep25 F Spe"(5'-TCG ACT AGT TGC GAC ACC CAC TTC CCC ATC-3')/"Hep R Sal"(5'-ATC GTC GAC TTA CGT CTT GCA GCA CAT CCC AC-3')를 사용하여 주형 "huhep in pCR2.1"(S. Ludwiczek, Department of Internal Medicine, University of Innsbruck)로부터 PCR에 의해 증폭된다.

결과 DNA 단편은 Spel/Sall에 의해 분해되고 헵시딘25 서열로 프로인슐린 서열이 대체하는 상기 동일한 효소로 분해된 pET30-6H-EDDIE-Ins에 복제됨으로써 구조체 pET30-6H-EDDIE-Hep25(성숙한 헵시딘과 EDDIE의 융합)가 생성된다.

pET30-6H-EDDIE-Hep25의 E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(Cat. Nr. 230245, Stratgene, 11011 N. Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037, USA, 2004 Catalog)박테리아 세포로의 형질전환, 발현 및 발효는 4.2 및 4.3에 기술된 바와 같이 실시된다. 세포 수거, 세포 파괴, IBs의 단리, 재생 및 절단 분석은 1.5에 기술된 바와 같이 실시된다. 그 결과는 EDDIE-헵시딘25의 약 80% 절단을 보인다.

<110> Sandoz AG Boehringer Ingelheim GmbH <120> Organic Compounds <130> r47645 <140> PCT/AT2006/000165 <141> 2006-04-25 <150> GB0508434.8 <151> 2005-04-26 <150> GB0508435.5 <151> 2005-04-26 <150> GB0605379.7 <151> 2006-03-16 <160> 38 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 168 <212> PRT <213> pestivirus <400> 1 Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gln Lys 1 5 10 15 Pro Val Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu 20 25 30 Phe Gly Asn Pro Ser Glu Val His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu Pro 35 40 45 His Asp Arg Gly Arg Gly Asp Ile Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro 50 55 60 Arg Lys Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly 65 70 75 80 Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gln Asp Tyr Thr Gly Pro 85 90 95 Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gln Phe Cys 100 105 110 Glu Val Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu 115 120 125 Tyr His Ile Tyr Val Cys Val Asp Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu Ala 130 135 140 Lys Arg Gly Thr 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Gly Glu Asp Asp Ile Glu Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro 50 55 60 Arg Lys Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly 65 70 75 80 Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gln Asp Tyr Thr Gly Pro 85 90 95 Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Thr Gln Phe Glu 100 105 110 Glu Thr Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu 115 120 125 Tyr His Ile Tyr Val Glu Val Asp Gly Glu Ile Leu Leu Lys Gln Ala 130 135 140 Lys Arg Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp Thr Arg Asn Thr Thr Asn 145 150 155 160 Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys 165 <210> 6 <211> 768 <212> DNA <213> artificial <220> <223> plasmid <400> 6 atggaactca atcatttcga actgctctac aaaactagca agcaaaaacc tgttggcgtt 60 gaagagccgg tctacgatac tgcaggtcgt cctctttttg ggaatccgtc cgaagtgcac 120 ccccagtcaa ccctcaagct tccccatgac cgcggacgcg gtgacattcg tacaacgctg 180 cgcgatctgc ctcgtaaagg cgattgtcgc tctggaaacc acctaggtcc ggtgtcgggc 240 atttacatta aaccaggtcc cgtctattac caagactaca ctggtccggt ttaccatcgt 300 gcacctctgg aattctttga tgaagctcaa ttttgcgaag tgactaaacg tattggccgt 360 gtaaccggtt cggacgggaa actgtaccac atctacgtgt gcgttgatgg ctgtatcctg 420 ctgaaactcg cgaagcgcgg aacccctcgc accctgaaat ggatccgtaa cttcactaac 480 tgtccactgt gggtcactag ttgcttcgtt aaccaacatc tgtgcggttc acaccttgtg 540 gaagccctgt atctggtgtg tggcgaacgc ggattctttt ataccccgaa aacgcggcgc 600 gaagccgaag atcttcaggt tggtcaagtg gaactgggcg gaggtccggg agccgggagc 660 ctgcaaccgc tggcgcttga agggtcgctg caaaaacgcg gtattgttga acagtgctgt 720 acctccatct gctctctgta tcagctggaa aactactgca attaataa 768 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 7 gctcaatttg aggaagtgac taaacg 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 8 cgtttagtca cttcctcaaa ttgagc 26 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 9 catctacgtg gaggttgatg gc 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 10 gccatcaacc tccacgtaga tg 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 11 gttgatggcg agatcctgct g 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 12 cagcaggatc tcgccatcaa c 21 <210> 13 <211> 50 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 13 ctggaattct ttgatgaaac ccaatttgag gaaaccacta aacgtattgg 50 <210> 14 <211> 50 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 14 ccaatacgtt tagtggtttc ctcaaattgg gtttcatcaa agaattccag 50 <210> 15 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 15 catgaccgcg gagaagatga cattgaaaca acgctgc 37 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 16 gcagcgttgt ttcaatgtca tcttctccgc ggtcatg 37 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 17 gatcctgctg aaacaggcga agcgcggaac 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 18 gttccgcgct tcgcctgttt cagcaggatc 30 <210> 19 <211> 52 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 19 gcaactagtg acccacagtg gacagttagt ggtgttacgg gtccatttca gg 52 <210> 20 <211> 30 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aaagaccagc ag 52 <210> 27 <211> 50 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 27 catgttcaga atttcgtaga atgcgctctg ctggtctttg ttaaacttat 50 <210> 28 <211> 50 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 28 cattctacga aattctgaac atgccgaatc tgaatgagga acaacgtaat 50 <210> 29 <211> 50 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 29 gggtcgtctt ttaaagactg aataaagcca ttacgttgtt cctcattcag 50 <210> 30 <211> 50 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 30 tcagtcttta aaagacgacc catctcagag caccaacgtt ctgggcgaag 50 <210> 31 <211> 48 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 31 ttttggtgcc tgagattcgt tcagtttctt tgcttcgccc agaacgtt 48 <210> 32 <211> 168 <212> PRT <213> artificial <220> <223> derivative <400> 32 Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gln Lys 1 5 10 15 Pro Val Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu 20 25 30 Phe Gly Thr Pro Ser Glu Val His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu Pro 35 40 45 His Asp Arg Gly Glu Asp Asp Ile Glu Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro 50 55 60 Arg Lys Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly 65 70 75 80 Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gln Asp Tyr Thr Gly Pro 85 90 95 Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Thr Gln Phe Glu 100 105 110 Glu Thr Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu 115 120 125 Tyr His Ile Tyr Val Glu Val Asp Gly Glu Ile Leu Leu Lys Gln Ala 130 135 140 Lys Arg Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp Thr Arg Asn Ser Thr Asn 145 150 155 160 Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys 165 <210> 33 <211> 168 <212> PRT <213> artificial <220> <223> derivative <400> 33 Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gln Lys 1 5 10 15 Pro Val Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Glu Gly Arg Pro Leu 20 25 30 Phe Gly Thr Pro Ser Glu Val His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu Pro 35 40 45 His Asp Arg Gly Glu Asp Asp Ile Glu Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro 50 55 60 Arg Lys Gly Asp Cys Arg Phe Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly 65 70 75 80 Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gln Asp Tyr Thr Gly Pro 85 90 95 Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Thr Gln Phe Glu 100 105 110 Glu Thr Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu 115 120 125 Tyr His Ile Tyr Val Glu Val Asp Gly Glu Ile Leu Leu Lys Gln Ala 130 135 140 Lys Arg Gly Thr Pro His Thr Leu Lys Trp Thr Arg Asn Ser Thr Asn 145 150 155 160 Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys 165 <210> 34 <211> 168 <212> PRT <213> artificial <220> <223> derivative <400> 34 Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gln Lys 1 5 10 15 Pro Val Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu 20 25 30 Phe Gly Asn Pro Ser Glu Val His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu Pro 35 40 45 His Asp Arg Gly Glu Asp Asp Ile Glu Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro 50 55 60 Arg Lys Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly 65 70 75 80 Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gln Asp Tyr Thr Gly Pro 85 90 95 Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ser Gln Phe Glu 100 105 110 Glu Ser Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu 115 120 125 Tyr His Ile Tyr Val Glu Val Asp Gly Glu Ile Leu Leu Lys Ser Ala 130 135 140 Lys Arg Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ser Arg Asn Ser Thr Asn 145 150 155 160 Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys 165 <210> 35 <211> 168 <212> PRT <213> artificial <220> <223> derivative <400> 35 Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gln Lys 1 5 10 15 Pro Val Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu 20 25 30 Phe Gly Asn Pro Ser Glu Val His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu Pro 35 40 45 His Asp Arg Gly Glu Asp Asp Ile Glu Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro 50 55 60 Arg Lys Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly 65 70 75 80 Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gln Asp Tyr Thr Gly Pro 85 90 95 Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ser Gln Phe Glu 100 105 110 Glu Ser Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu 115 120 125 Tyr His Ile Tyr Val Glu Val Asp Gly Glu Ile Leu Leu Lys Asn Ala 130 135 140 Lys Arg Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ser Arg Asn Ser Thr Asn 145 150 155 160 Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys 165 <210> 36 <211> 168 <212> PRT <213> artificial <220> <223> derivative <400> 36 Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gln Lys 1 5 10 15 Pro Val Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu 20 25 30 Phe Gly Asn Pro Ser Glu Val His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu Pro 35 40 45 His Asp Arg Gly Glu Asp Asp Ile Glu Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro 50 55 60 Arg Lys Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly 65 70 75 80 Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gln Asp Tyr Thr Gly Pro 85 90 95 Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ser Gln Phe Glu 100 105 110 Glu Ser Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu 115 120 125 Tyr His Ile Tyr Val Glu Val Asp Gly Glu Ile Leu Leu Lys Asp Ala 130 135 140 Lys Arg Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ser Arg Asn Ser Thr Asn 145 150 155 160 Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys 165 <210> 37 <211> 168 <212> PRT <213> artificial <220> <223> derivative <400> 37 Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gln Lys 1 5 10 15 Pro Val Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu 20 25 30 Phe Gly Asn Pro Ser Glu Val His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu Pro 35 40 45 His Asp Arg Gly Glu Asp Asp Ile Glu Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro 50 55 60 Arg Lys Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly 65 70 75 80 Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gln Asp Tyr Thr Gly Pro 85 90 95 Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ser Gln Phe Glu 100 105 110 Glu Ser Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu 115 120 125 Tyr His Ile Tyr Val Glu Val Asp Gly Glu Ile Leu Leu Lys His Ala 130 135 140 Lys Arg Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ser Arg Asn Ser Thr Asn 145 150 155 160 Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys 165 <210> 38 <211> 168 <212> PRT <213> artificial <220> <223> derivative <400> 38 Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gln Lys 1 5 10 15 Pro Val Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu 20 25 30 Phe Gly Asn Pro Ser Glu Val His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu Pro 35 40 45 His Asp Arg Gly Glu Asp Asp Ile Glu Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro 50 55 60 Arg Lys Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly 65 70 75 80 Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gln Asp Tyr Thr Gly Pro 85 90 95 Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ser Gln Phe Glu 100 105 110 Glu Ser Thr Lys Arg Ile Gly Cys Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu 115 120 125 Tyr His Ile Tyr Val Glu Val Asp Gly Glu Ile Leu Leu Lys Gln Ala 130 135 140 Lys Arg Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ser Arg Asn Ser Thr Asn 145 150 155 160 Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys 165

Claims

(ⅰ) 융합 폴리 펩티드를 암호화하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 박테리아 숙주 세포 배양으로서, 상기 융합 폴리 펩티드는 페스티바이러스의 자연발생적인 오토프로테아제 N^pro의 적어도 하나의 시스테인 잔기가 다른 아미노산 잔기로 대체되는 페스티바이러스의 오토프로테아제 N^pro의 유도체와, 제1 폴리펩티드의 자가단백질분해 활성으로 융합 폴리펩티드에서 절단될 수 있는 방식으로 제1 폴리펩티드의 C-말단에서 제1 폴리펩티드와 결합되고 이종 폴리펩티드인 제2 폴리펩티드를 포함하며, 상기 배양은 융합 폴리펩티드의 발현 및 상응하는 세포질 봉입체의 형성을 야기하는 조건하에서 실시하는 배양공정;

(ⅱ) 상기 숙주 세포로부터 봉입체의 단리 공정;

(ⅲ) 상기 단리된 봉입체의 가용화 공정;

(ⅳ) 상기 융합 폴리펩티드에서 이종 폴리펩티드의 자가단백질 절단 유도 공정; 및

(ⅴ) 관심 있는 상기 절단된 이종 폴리펩티드의 단리 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 관심 있는 이종 폴리펩티드의 재조합체 생산 공정.
CSFV의 자연 발생적인 오토프로테아제 N^pro의 하나 이상의 시스테인 잔기가 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것을 특징으로 하는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체.
C112, C134 및 C138로 이루어진 군에서 선택된 CSFV의 자연 발생적인 오토프로테아제 N^pro의 하나 이상의 시스테인 잔기가 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것을 특징으로 하는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체.
제 3 항에 있어서,

상기 C112, C134 및 C138로 이루어진 군에서 선택된 CSFV의 자연 발생적인 오토프로테아제 N^pro의 하나 이상의 시스테인 잔기가 글루탐산 잔기로 대체되는 것을 특징으로 하는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체.
제 4 항에 있어서,

하기 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체.

SEQ ID NO 2 :
제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 대체된 시스테인 잔기 외에 하나 이상의 염기성 아미노산 잔기가 산성 아미노산 잔기로 대체되는 것을 특징으로 하는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체.
제 6 항에 있어서,

상기 대체된 시스테인 잔기 외에 다음 아미노산들, E를 갖는 R53, D를 갖는 G54, E를 갖는 R57 및 Q를 갖는 L143이 교체되는 것을 특징으로 하는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체.
제 7 항에 있어서,

하기 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체.

SEQ ID NO 3 :
제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 대체된 시스테인 잔기 외에 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기가 친수성 아미노산 잔기로 대체되는 것을 특징으로 하는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체.
제 9 항에 있어서,

상기 대체된 시스테인 잔기 외에 다음 아미노산들, A109, V114, I155 및 F158은 T로 대체되는 것을 특징으로 하는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체.
제 10 항에 있어서,

하기 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체.

SEQ ID NO 4 :
제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 대체된 시스테인 잔기 외에 다음 아미노산들, A109, V114, I155 및 F158은 T, E를 갖는 R53, D를 갖는 G54, E를 갖는 R57 및 Q를 갖는 L143으로 교체되는 것을 특징으로 하는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체.
제 12 항에 있어서,

하기 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체.

SEQ ID NO 5 :
제 12 항에 있어서,

아미노산 N35는 T로 교체되고 T158은 S로 교체되는 것을 특징으로 하는 CSFV 의 오토프로테아제 N^pro의 변이체.
제 14 항에 있어서,

하기 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체.

SEQ ID NO 32 :
제 14 항에 있어서,

아미노산 A28은 E로, S71은 F로 그리고 R150은 H로 교체되는 것을 특징으로 하는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체.
제 16 항에 있어서,

하기 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체.

SEQ ID NO 33 :
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,

상기 대체된 시스테인 잔기 외에 아르기닌(R)53, 글리신(G)54, 아르기닌(R)57, 트레오닌(T)109, 114, 155, 158 및 류신(L)143 아미노산들 중 하나 이상은 대체되는 것을 특징으로 하는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체.
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,

상기 대체된 시스테인 잔기 외에 글루탐산(E)을 갖는 아르기닌(R)53, 아스파르트산(D)을 갖는 글리신(G)54, 글루탐산(E)을 갖는 아르기닌(R)57, 세린(S)을 갖는 트레오닌(T)109, 114, 155, 158 및 글루타민(Q), 아스파라긴(N), 아스파르트산(D), 세린(S) 또는 히스티딘을 갖는 류신(L)143 아미노산들 중 하나 이상은 대체되는 것을 특징으로 하는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체.
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,

하기 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체.

SEQ ID 92 :
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,

하기 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체.

SEQ ID 95 :
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,

하기 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체.

SEQ ID 96 :
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,

하기 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체.

SEQ ID 97 :
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,

하기 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체.

SEQ ID 98 :
제 1 항에 따른 공정 중에서 제 2 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 기재된 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체의 용도.
제 1 항에 있어서,

상기 융합 폴리펩티드는 제 2 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 기재된 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 관심 있는 이종 폴리펩티드의 재조합체 생산 공정.