CN110945123B - 生产可溶性重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)的方法 - Google Patents

生产可溶性重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)的方法 Download PDF

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Abstract

提供了一种生产可溶性的重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh‑bFGF)的方法，通过该方法获得的重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh‑bFGF)，以及编码该重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh‑bFGF)的突变核酸分子。

Description

生产可溶性重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)的 方法
技术领域
本发明涉及DNA重组和生物制药领域。更具体地，本发明涉及生产可溶性的重组人碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human-basic fibroblast growth factor,rh-bFGF)的方法，通过所述方法获得的重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)，以及编码所述重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)的突变核酸分子。
背景技术
成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)是一类结构类似、生物功能相近的肝素结合蛋白。目前已发现23种FGF，其中FGF-1(aFGF)、FGF-2(bFGF)和FGF-7(KGF)的研究较为深入。bFGF是哺乳动物和人体中一种非常微量的活性物质，因其具有广泛的生理功能和重要的临床应用价值而被高度重视。它不仅能刺激新生血管形成，还参与创伤愈合和组织再生，促进胚胎组织发育和分化等。近年来，重组bFGF已被应用于临床治疗创伤、溃疡及神经系统等疾病。
目前市场上bFGF绝大部分是用基因工程的方法在大肠杆菌中生产，但大肠杆菌的可溶性bFGF表达量低，大部分表达产物易形成无生物学活性的包涵体。包涵体纯化后还需进行复性处理，影响了产物的回收率和活性。而且，处理过程可能导致二聚体和三聚体等杂质产生。此外，bFGF存在两对半胱氨酸，极易形成分子间二硫键。如果保存不当，二聚体和三聚体占有一定比例，就会影响蛋白纯度。
因此有必要建立一种稳定的具有高表达量的生产可溶性bFGF的新方法。
发明内容
在一个方面，本发明提供一种生产可溶性的重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)的方法，包括：培养包含突变的核酸分子的宿主细胞；在适合于rh-bFGF表达的条件下在宿主细胞中表达rh-bFGF；通过纯化回收rh-bFGF。
在一个方面，本发明提供通过所述方法获得的重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)。
在一个方面，本发明提供一种编码所述重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)的突变核酸分子。
在一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含所述重组人碱性成纤维细胞生长(rh-bFGF)和至少一种药学上可接受的赋形剂。
在一个方面，本发明提供一种治疗干眼症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的所述药物组合物。
附图说明
图1为pET-30a(+)质粒结构图。
图2为rh-bFGF的Western Blot结果。
图3显示了通过高效液相色谱而检测的rh-bFGF纯度。
图4显示了rh-bFGF完整蛋白的分子量质谱图。
图5显示了天然人bFGF的cDNA序列、氨基酸序列以及经突变的人bFGF氨基酸序列。
图6显示了rh-bFGF体外活性检测的四参数拟合曲线，其中C为EC50值。
图7显示了在热压力条件下，不同氨基酸，包括组氨酸、甘氨酸和精氨酸以及吐温对rh-bFGF纯度变化的影响，其中95％LINE指rh-bFGF原液的纯度质量标准；原液纯度低于95％则表示纯度不合格。
图8显示了在热压力条件下，HSA对rh-bFGF纯度变化的影响。
图9显示了不同浓度的rh-bFGF滴眼液对碱烧伤新西兰兔干眼症模型泪液分泌的影响。符号“*”或“**”表示显著差异(p<0.05或p<0.01)。
图10显示了不同浓度的rh-bFGF滴眼液对碱烧伤新西兰兔干眼症模型泪膜破裂时间的影响。符号“*”或“**”表示显著差异(p<0.05或p<0.01)。
发明详述
本申请发明人开发了一种通过突变核酸分子而生产可溶性重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)的新方法。
通过突变核酸分子并构建原核表达系统，本发明预料不到地以可溶性形式和高表达量实现了bFGF的高效且均一的表达。该方法通过高效表达人bFGF，提高了重组人bFGF蛋白的回收率，且保留了天然人bFGF的生物学活性。
在一个方面，本发明提供一种生产可溶性的重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)的方法，包括：培养包含突变的核酸分子的宿主细胞；在适合于rh-bFGF表达的条件下在宿主细胞中表达rh-bFGF；通过纯化回收rh-bFGF。
在一个方面，所述突变的核酸分子包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3的序列，或包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少90％、至少95％同一性的序列，例如至少96％、97％、98或99％同一性的序列。
在一个方面，所述突变的核酸分子的序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3。
在一个方面，本发明提供一种载体，其包含所述核酸分子。优选的载体是原核表达载体，特别是适合在大肠杆菌中诱导表达的表达载体，包括但不限于，例如pET-30a(+)，pET-28a(+)，pET-23c(+)，pET-15b。特别优选的是pET-30a(+)。
在一个方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含所述表达载体。优选的宿主细胞是大肠杆菌，特别优选的是大肠杆菌BL21(DE3)。
在一个具体方面，将含有所述突变的核酸分子的原核表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，通过调节菌体培养温度、诱导温度、pH范围、葡萄糖浓度与诱导剂浓度，诱导表达可溶性人bFGF。通过中空纤维洗滤收集菌体；采用高压匀浆并保持低温而破碎发酵菌体；加入适量非离子表面活性剂后，低温高速离心收集上清液，弃去沉淀。
在一个具体方面，采用弱阳离子交换、肝素亲和层析等方法进行纯化，在纯化过程中加入适量的保护剂，如巯基乙醇，DTT等。
在一个具体方面，用于诱导表达可溶性人bFGF的具体参数如下：
上罐前OD600：约0.5-4.5
菌体培养温度：约25-45℃
菌体诱导温度：约20-50℃
pH范围：约6.8-8.5
葡萄糖浓度：约0.06-0.46％
诱导剂浓度：约0.0125-0.0925g/L
诱导前OD600范围：约10到45
诱导时间：约2-9h。
在一个具体方面，如下进行纯化：
发酵液用中空纤维截留，并洗滤，洗滤缓冲液为pH约7.0，含NaCl的PB溶液。
采用高压匀浆并保持低温破碎发酵菌体，加入适量曲那通(Triton)，通过低温高速离心收集上清液，并弃去沉淀。
在一个方面，本发明提供通过所述方法获得的重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)。在一个方面，所述重组人碱性成纤维细胞生长因子的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
在一个方面，本发明提供一种编码重组人碱性成纤维细胞生长因子的突变核酸分子，其包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的序列，或包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98或99％同一性的序列。
在一个方面，所述突变核酸分子的序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3。
在一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含所述重组人碱性成纤维细胞生长(rh-bFGF)和至少一种药学上可接受的赋形剂。在一个方面，所述赋形剂包括，但不限于，缓冲体系、增稠剂、稳定剂、中和试剂、保湿剂等。
在一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含所述重组人碱性成纤维细胞生长(rh-bFGF)和至少一种选自甘氨酸、组氨酸、精氨酸、肝素钠或人血白蛋白(HSA)的稳定剂。
在一个方面，将组合物缓冲至约6.0-8.0的pH，例如6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0的pH或其间的任何范围限定的pH。
在一个方面，本发明提供一种治疗干眼症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的所述药物组合物。
在一个方面，本发明提供用于治疗干眼症的所述药物组合物。
在一个方面，本发明还提供所述组合物在制备用于治疗干眼症的药物中的用途。
在一个方面，本发明的药物组合物为眼用药物组合物。特别地，本发明的药物组合物为滴眼液或凝胶的形式。
本发明所述方法的优点在于：以可溶性形式和高表达量实现了bFGF的高效且均一的表达。所述方法通过高效表达人bFGF，提高了重组人bFGF蛋白的回收率，且保留了天然人bFGF的生物学活性。
参考以下的非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例
实施例1.核酸突变
在不改变蛋白氨基酸序列的前提下，将编码天然人bFGF的cDNA序列(SEQ ID NO:4)进行突变，设计并合成了3种突变的cDNA序列(分别为如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQID NO:3所示的突变的cDNA序列1、序列2和序列3)：
突变的cDNA序列1(SEQ ID NO:1)
Figure BDA0002331159180000051
Figure BDA0002331159180000061
突变的cDNA序列2(SEQ ID NO:2)
Figure BDA0002331159180000062
突变的cDNA序列3(SEQ ID NO:3)
Figure BDA0002331159180000063
实施例2.原核表达以及蛋白质表征
2.1表达和纯化
所用的表达载体为pET-30a(+)(参见图1)，购自MerkKgsA公司(Cat.No.69909-3)，该载体带有T7启动子、T7转录起始位点、His Tag、编码序列、S Tag编码序列、多克隆位点(Multiple cloning sites，MCS)、T7终止子、乳糖编码序列、kan抗性编码序列和pBR322复制子和f1复制子。该MCS包含酶切位点XhoⅠ、NotⅠ、EagⅠ、HindⅢ、SalⅠ、SacⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ、EcoRⅤ、NcoⅠ、KpnⅠ、BglⅡ、NspⅤ、NdeⅠ。
为了克隆方便，在序列1(SEQ ID NO:1)的起始密码子上游设计了NdeⅠ酶切位点，在终止子附近设计了HindⅢ酶切位点。采用化学方法全基因合成该480bps序列，将此序列经NdeⅠ和HindⅢ双酶切后插入到经相同双酶切的表达载体pET-30a(+)上，得到了5724bps的重组质粒，经热激转化DH5α(TaKaRa，9057)，在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养。挑选单克隆，然后经NdeⅠ和HindⅢ双酶切筛选正确的转化子。转化子的正确性通过测序再次验证。
在另一个实例中，可以使用pET-28a(+)，pET-23c(+)或pET-15b等代替上述pET-30a(+)载体。
将含有所述序列1的原核表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，通过培养，诱导表达可溶性人bFGF，具体参数如下：
上罐前OD600：0.5-4.5
菌体培养温度：25-45℃
菌体诱导温度：20-50℃
pH范围：6.8-8.5
葡萄糖浓度：0.06-0.46％
诱导剂浓度：0.0125-0.0925g/L
诱导前OD600范围：10到45
诱导时间：2-9h。
通过中空纤维洗滤收集菌体：发酵液用500KD的中空纤维截留，并洗滤，洗滤缓冲液为pH7.0，含NaCl的25mMPB溶液。
采用高压匀浆并保持低温破碎发酵菌体，加入适量曲那通(Triton)，通过低温高速离心收集上清液，并弃去沉淀。
采用弱阳离子交换，在纯化过程中加入适量DTT。CM-Sepharose Fast Flow离子交换柱先用含氯化钠的25mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)平衡，然后将上清液过柱，以含0.05M、0.12M、0.4M氯化钠的25mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)进行梯度(三阶梯度)洗脱，收集第三洗脱峰(含0.4M氯化钠的25mM磷酸盐缓冲液洗脱)。
采用肝素亲和层析，在纯化过程中加入适量DTT。Heparin-Sepharose CL-6B亲和层析柱预先用含氯化钠的25mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)平衡，将离子交换层析的第三洗脱峰溶液过柱，用含0.4M、1.0M、1.8M氯化钠的25mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)进行梯度(三阶梯度)洗脱，收集第三洗脱峰(含1.8M氯化钠的25mM磷酸盐缓冲液洗脱)。
样品经过上述步骤纯化后，纯度达到95％以上。经实验证实，每100g菌体可制备重组人bFGF蛋白约600mg，实现显著高效表达。
2.2纯度和分子量检测以及测序
15％SDS-PAGE电泳显示，所得的人bFGF蛋白为约18.5KD的单一条带(参见图2)。高效液相色谱法C8反相柱检测结果显示，本发明所得人bFGF的纯度大于95％(参见图3)。
采用“超高分辨、超高准确、超高灵敏”Exactive Plus EMR进行精确分子量测定，4批rh-bFGF原液共检出6个组分(组分1、4、5比例基本>10％，表1)，组分4为主要成分，分子量平均值为17121.02Da，批间RSD％为0.0007，与理论值的偏差≤41ppm，相对比例(以峰强度计算)为70.7％-79.0％。。
表1：HPLC-Exactive Plus EMR质谱检测送检样本精确分子量
Figure BDA0002331159180000081
另外，重组制备的人bFGF蛋白经氨基酸序列分析，结果证实其氨基酸序列与天然人bFGF的氨基酸序列一致(参见图5)。
2.3生物学活性测定
使用balb/c3T3细胞对样品进行体外活性检测。用MTT法判断细胞增殖情况。结果表明所得人bFGF对balb/c3T3细胞的促进增殖作用与bFGF活性标准品(NISCB)一致(参见图6)。
实施例3.药物组合物的制备
药物组合物1：
Figure BDA0002331159180000091
1、所述缓冲体系可以是上述磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，也可以是硼酸-硼砂缓冲体系，枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲体系等。优选药物组合物的pH值为6.5-7.5。
2、所述增稠剂为聚乙烯醇，透明质酸钠、羟丙甲纤维素、泊洛沙姆等，优选聚乙烯醇。
3、制备方法：
(1)将聚乙烯醇分散溶解于适量的注射用水中，于121℃高压灭菌30min，冷却至室温，备用；
(2)将重组人碱性成纤维细胞生长因子、人血白蛋白、肝素钠、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠溶解于适量的注射用水中，用0.22μm滤膜无菌过滤；
(3)在无菌的条件下将步骤(1)和步骤(2)所得溶液混合均匀，用无菌注射用水定容，即得；
(4)无菌溶液使用吹、灌、封三合一灌装机进行一体化灌装，装量0.4mL，即得成品。
药物组合物2：
Figure BDA0002331159180000092
Figure BDA0002331159180000101
1、所述卡波姆为卡波姆940、卡波姆934、卡波姆974、卡波姆980等系列，优选卡波姆980系列；
2、所述中和试剂为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钾、硼砂及三乙醇胺，优选三乙醇胺。
3、制备方法：
(1)将卡波姆分散于适量的注射用水中，搅拌均匀后过夜溶胀，备用；
(2)在卡波姆分散液中加入三乙醇胺，搅拌成透明均匀凝胶基质，于121℃高压灭菌30min，灭菌完成后放冷至室温，备用；
(3)取适量室温的注射用水加入甘油、人血白蛋白、肝素钠、重组人碱性成纤维细胞生长因子，搅拌均匀后，在无菌条件下通过0.22μm滤膜，并与步骤(2)中凝胶基质混合，然后定量，搅拌均匀。
(4)无菌凝胶使用吹、灌、封三合一灌装机进行一体化灌装，装量0.4g，即得成品。
药物组合物3：
Figure BDA0002331159180000102
1、所述缓冲盐体系可以是上述磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，也可以是硼酸-硼砂缓冲体系，枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲体系等，优选所述pH值为6.5-7.5。
2、所述增稠剂为聚乙烯醇，透明质酸钠、羟丙甲纤维素、泊洛沙姆等，优选聚乙烯醇。所述保湿剂为甘油、丙二醇或其混合物。
3、制备方法：
(1)将增稠剂、氯化钠、分散溶解于适量的注射用水中，于121℃高压灭菌30min；
(2)将重组人碱性成纤维细胞生长因子、人血白蛋白、保湿剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠溶解于适量的注射用水中；
(3)将步骤(2)药液经过0.22μm微孔滤膜过滤后与步骤(1)所得药液混合，并用注射用水定容至1mL；
(4)灌装步骤(3)所得药液至不含抑菌剂的包装容器中，容器的容积范围为0.4g/支，即得到成品。
此外，还制备了以下药物组合物(参见表2)。其中，制备滴眼液均为100ml，制备外用凝胶均为100g。
Figure BDA0002331159180000121
制备实施例1：
(1)将1.0g聚乙烯醇分散溶解于适量的注射用水中，高压灭菌，冷却至室温，备用；
(2)将重组人碱性成纤维细胞生长因子500000IU、人血白蛋白25mg、肝素钠2.5mg、氯化钠800mg、磷酸二氢钠42.5mg、磷酸氢二钠250mg溶解于适量的注射用水中，用0.22μm滤膜无菌过滤；
(3)在无菌的条件下将步骤(1)和步骤(2)所得溶液混合均匀，用无菌注射用水定容至100mL，即得；
(4)无菌溶液使用吹、灌、封三合一灌装机进行一体化灌装，装量0.4mL，即得成品。
制备实施例2：
(1)将0.5g聚乙烯醇分散溶解于适量的注射用水中，高压灭菌，冷却至室温，备用；
(2)将重组人碱性成纤维细胞生长因子500000IU、人血白蛋白20mg、肝素钠2.0mg、氯化钠800mg、磷酸二氢钠42.5mg、磷酸氢二钠250mg溶解于适量的注射用水中，用0.22μm滤膜无菌过滤；
(3)在无菌的条件下将步骤(1)和步骤(2)所得溶液混合均匀，用无菌注射用水定容至100mL，即得；
(4)无菌溶液使用吹、灌、封三合一灌装机进行一体化灌装，装量0.4mL，即得成品。
制备实施例3：
(1)将1.0g聚乙烯醇分散溶解于适量的注射用水中，高压灭菌，冷却至室温，备用；
(2)将重组人碱性成纤维细胞生长因子420000IU、人血白蛋白20mg、肝素钠2.0mg、氯化钠800mg、磷酸二氢钠42.5mg、磷酸氢二钠250mg溶解于适量的注射用水中，用0.22μm滤膜无菌过滤；
(3)在无菌的条件下将步骤(1)和步骤(2)所得溶液混合均匀，用无菌注射用水定容至100mL，即得；
(4)无菌溶液使用吹、灌、封三合一灌装机进行一体化灌装，装量0.4mL，即得成品。
制备实施例4：
(1)将1.5g聚乙烯醇分散溶解于适量的注射用水中，高压灭菌，冷却至室温，备用；
(2)将重组人碱性成纤维细胞生长因子420000IU、人血白蛋白10mg、肝素钠1.0mg、氯化钠800mg、磷酸二氢钠42.5mg、磷酸氢二钠250mg溶解于适量的注射用水中，用0.22μm滤膜无菌过滤；
(3)在无菌的条件下将步骤(1)和步骤(2)所得溶液混合均匀，用无菌注射用水定容至100mL，即得；
(4)无菌溶液使用吹、灌、封三合一灌装机进行一体化灌装，装量0.4mL，即得成品。
制备实施例5：
(1)将1.0g聚乙烯醇分散溶解于适量的注射用水中，高压灭菌，冷却至室温，备用；
(2)将重组人碱性成纤维细胞生长因子420000IU、人血白蛋白20mg、肝素钠2.0mg、氯化钠800mg、枸橼酸370.6mg、磷酸氢二钠5.9g溶解于适量的注射用水中，用0.22μm滤膜无菌过滤；
(3)在无菌的条件下将步骤(1)和步骤(2)所得溶液混合均匀，用无菌注射用水定容至100mL，即得；
(4)无菌溶液使用吹、灌、封三合一灌装机进行一体化灌装，装量0.4mL，即得成品。
制备实施例6：
(1)将1.0g聚乙烯醇分散溶解于适量的注射用水中，高压灭菌，冷却至室温，备用；
(2)将重组人碱性成纤维细胞生长因子500000IU、人血白蛋白25mg、肝素钠2.5mg、氯化钠800mg、枸橼酸370.6mg、磷酸氢二钠5.9g溶解于适量的注射用水中，用0.22μm滤膜无菌过滤；
(3)在无菌的条件下将步骤(1)和步骤(2)所得溶液混合均匀，用无菌注射用水定容至100mL，即得；
(4)无菌溶液使用吹、灌、封三合一灌装机进行一体化灌装，装量0.4mL，即得成品。
制备实施例7：
(1)称取0.80g卡波姆940分散于适量的室温的注射用水中，搅拌60-120min，过夜溶胀，备用；
(2)在卡波姆940分散液中加入三乙醇胺0.60g，搅拌使成透明均匀凝胶基质，然后进行湿热灭菌(121℃，30min)，灭菌完成后放冷至室温，备用；
(3)取适量室温的注射用水加入2.50g甘油、30.0mg人血白蛋白、7.0mg肝素钠、重组人碱性成纤维细胞生长因子450000IU，搅拌均匀后，在无菌条件下通过0.22μm滤膜，并与步骤(2)中凝胶基质混合，并定量，搅拌均匀。
(4)无菌凝胶使用吹、灌、封三合一灌装机进行一体化灌装，装量0.4g，即得成品。
制备实施例8：
(1)称取0.60g卡波姆940分散于适量的室温的注射用水中，搅拌60-120min，过夜溶胀，备用；
(2)在卡波姆940分散液中加入三乙醇胺0.50g，搅拌使成透明均匀凝胶基质，然后进行湿热灭菌(121℃，30min)，灭菌完成后放冷至室温，备用；
(3)取适量室温的注射用水加入2.50g甘油、30.0mg人血白蛋白、7.0mg肝素钠、重组人碱性成纤维细胞生长因子420000IU，搅拌均匀后，在无菌条件下通过0.22μm滤膜，并与步骤(2)中凝胶基质混合，并定量，搅拌均匀。
(4)无菌凝胶使用吹、灌、封三合一灌装机进行一体化灌装，装量0.4g，即得成品。
制备实施例9：
(1)称取0.60g卡波姆974分散于适量的室温的注射用水中，搅拌60-120min，过夜溶胀，备用；
(2)在卡波姆974分散液中加入三乙醇胺0.50g，搅拌使成透明均匀凝胶基质，然后进行湿热灭菌(121℃，30min)，灭菌完成后放冷至室温，备用；
(3)取适量室温的注射用水加入2.50g甘油、30.0mg人血白蛋白、7.0mg肝素钠、重组人碱性成纤维细胞生长因子450000IU，搅拌均匀后，在无菌条件下通过0.22μm滤膜，并与步骤(2)中凝胶基质混合，并定量，搅拌均匀。
(4)无菌凝胶使用吹、灌、封三合一灌装机进行一体化灌装，装量0.4g，即得成品。
制备实施例10：
(1)称取0.50g卡波姆974分散于适量的室温的注射用水中，搅拌60-120min，过夜溶胀，备用；
(2)在卡波姆974分散液中加入三乙醇胺0.50g，搅拌使成透明均匀凝胶基质，然后进行湿热灭菌(121℃，30min)，灭菌完成后放冷至室温，备用；
(3)取适量室温的注射用水加入2.50g甘油、20.0mg人血白蛋白、5.0mg肝素钠、重组人碱性成纤维细胞生长因子420000IU，搅拌均匀后，在无菌条件下通过0.22μm滤膜，并与步骤(2)中凝胶基质混合，并定量，搅拌均匀。
(4)无菌凝胶使用吹、灌、封三合一灌装机进行一体化灌装，装量0.4g，即得成品。
实施例4.稳定性研究
1)氨基酸对rh-bFGF原液稳定性的影响研究
由于rh-bFGF原液本身性质不稳定，在室温下易发生聚合沉淀。因此选用不同的稳定剂对原液的稳定性进行初筛。选用5％与2％的甘露醇、5％与2％的甘氨酸以及2％葡聚糖，在25℃环境下放置17天。分别在第0、7与17天检测蛋白浓度，结果见表3。
表3：rh-bFGF原液稳定剂筛选试验的蛋白浓度变化率
样品 0天 7天 17天
无稳定剂 100.00％ 29.96％ 13.63％
5％甘露醇 100.00％ 49.80％ 17.31％
2％甘露醇 100.00％ 53.29％ 15.66％
5％甘氨酸 100.00％ 95.67％ 86.26％
2％甘氨酸 100.00％ 94.74％ 82.73％
2％葡聚糖 100.00％ 51.65％ 16.20％
结果表明5％甘氨酸可有效避免蛋白形成沉淀。蛋白在热破坏条件下放置17天仍可保持86.26％的蛋白。17天后，甘氨酸的效果显著优于甘露醇和葡聚糖，并且不加稳定剂的蛋白仅剩13.6％。
2)组氨酸对rh-bFGF原液稳定性的影响研究
进一步选用不同氨基酸(甘氨酸、组氨酸、精氨酸)和吐温20对原液的稳定性进行进一步的筛选，在25℃环境下放置18h，结果见图7。
结果表明与浓度为5％的甘氨酸相比，3％的组氨酸和0.03％的吐温20对于rh-bFGF原液的稳定性效果更好。蛋白在热破坏条件下放置18h天纯度仍可保持85％以上。组氨酸和吐温20对rh-bFGF的保护作用优于甘氨酸。
3)HSA对rh-bFGF原液稳定性的影响研究
由于HSA对蛋白含量测定有干扰，将含或不含HSA的原液在25℃环境下放置18h，使用高分辨率色谱检测经热破坏蛋白的纯度变化。结果显示在图8。
结果表明HSA能明显改善rh-bFGF的稳定性。以95％纯度变化率作为指标，不含HSA的样品，在压力条件下仅能维持4h，加入HSA后，可延长至15小时。证明对于bFGF，HSA为优秀的蛋白保护剂。
实施例5.动物干眼模型药效研究
本研究选用新西兰兔干眼模型，观察模型的临床指标(泪液分泌、泪膜破裂时间)，评价药物的干眼临床治疗效果。将新西兰兔分成阴性对照组(Negative control，未经处理)、模型对照组(Model，经碱烧伤处理但未加入任何滴眼液)、玻璃酸钠滴眼液处理组(HAgroup)，以及根据所用的制备实施例3的rh-bFGF滴眼液浓度而分成的组D(4.0μg/mL)、E(8.0μg/mL)、F(16.0μg/mL)、G(32.0μg/mL)。阴性对照组每组72只，其余组别每组8只，剂量300μl/眼/天。
(1)泪液分泌量(双眼)测定方法(酚红棉线湿润长度)：
采用Schirmer I实验(Schirmer I test)测量新西兰兔泪液的分泌。即，用眼科镊夹住酚红棉线，置于新西兰兔外眦部，60s后取出测量酚红棉线湿润的长度。酚红棉线湿润后变为红色，根据湿润长度判定眼睛湿润情况。实验结果显示在图9中。
如图9所示，与阴性对照眼相比，模型对照组的酚红棉线湿润长度均显著下降。与模型对照组相比，给药第10天，rh-bFGF滴眼液D、E、F、G组酚红棉线湿润长度均显著变长，具有显著统计学差异。
(2)泪膜破裂时间(双眼)测定方法：
使用可调移液器在新西兰兔眼下睑结膜囊内滴入2μl的0.5％荧光素钠溶液，以恒定力手动眨眼数次后，以恒定力撑开兔眼，用裂隙灯显微镜，钴蓝光观察角膜，当角膜绿色薄膜出现黑区时，表示泪膜破裂。连续测3次，取其平均值。泪膜破裂时间小于10秒，表明泪膜不稳定，是泪液中粘蛋白缺乏所致的KCS的突出标志，提示结膜的杯状细胞严重损害或丧失，容易造成干眼症。实验结果显示在图10中。
如图10所示，与阴性对照眼相比，给药第10天，模型对组泪膜破裂时间均显著短于阴性对照眼。与模型对照组相比，给药第10天，rh-bFGF滴眼液组D、E、F、G组泪膜破裂时间均显著延长，具有显著统计学差异。
综上，酚红棉线泪液分泌测试结果表明本发明的滴眼液能改善造模动物的泪液分泌量(见图9)；泪膜破裂时间测试显示对干眼模型的泪膜破裂时间有明显的改善作用(见图10)。rh-bFGF滴眼液随着剂量的升高，对碱烧伤新西兰兔干眼症模型有明显的改善作用。
虽然本发明某些特征已经在本文中阐释和描述，但本领域技术人员将想到许多修改、替代、变更和等同。因此，应理解的是，所附权利要求书意在涵盖落入本发明真实精神范围之内的所有此类修改和变更。
Figure IDA0002331159220000011
Figure IDA0002331159220000021
Figure IDA0002331159220000031
Figure IDA0002331159220000041
Figure IDA0002331159220000051
Figure IDA0002331159220000061

Claims (7)

1. 一种生产可溶性的重组人碱性成纤维细胞生长因子(rh-bFGF)的方法，包括：培养包含突变的核酸分子的宿主细胞；在适合于rh-bFGF表达的条件下在宿主细胞中表达rh-bFGF；通过纯化回收rh-bFGF，其中所述突变的核酸分子包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的序列。
2. 权利要求1的方法，其中所述突变的核酸分子的序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
3.权利要求1-2中任一项的方法，其中所述宿主细胞为大肠杆菌。
4. 一种编码重组人碱性成纤维细胞生长因子的突变核酸分子，其包含选自SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的序列。
5. 权利要求4的突变核酸分子，其序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
6.包含权利要求4或5的突变核酸分子的载体。
7.权利要求6的载体，其中出发载体为pET-30a(+)。
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