CZ98297A3 - Způsob purifikace keratinocytových růstových faktorů - Google Patents
Způsob purifikace keratinocytových růstových faktorů Download PDFInfo
- Publication number
- CZ98297A3 CZ98297A3 CZ97982A CZ98297A CZ98297A3 CZ 98297 A3 CZ98297 A3 CZ 98297A3 CZ 97982 A CZ97982 A CZ 97982A CZ 98297 A CZ98297 A CZ 98297A CZ 98297 A3 CZ98297 A3 CZ 98297A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- kgf
- seq
- solution
- oligo
- cells
- Prior art date
Links
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 title abstract description 13
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 32
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 10
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 5
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 claims description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims description 3
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 3
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims 1
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 105
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 95
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 42
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 36
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 35
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 31
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 26
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 20
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 19
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 6
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 4
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 4
- 101001060261 Homo sapiens Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- NGDIAZZSCVVCEW-UHFFFAOYSA-M sodium;butyl sulfate Chemical compound [Na+].CCCCOS([O-])(=O)=O NGDIAZZSCVVCEW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 101710159910 Movement protein Proteins 0.000 description 2
- 101100446506 Mus musculus Fgf3 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 108010029560 keratinocyte growth factor receptor Proteins 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- -1 sulfoethyl Chemical group 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- JEPVUMTVFPQKQE-AAKCMJRZSA-N 2-[(1s,2s,3r,4s)-1,2,3,4,5-pentahydroxypentyl]-1,3-thiazolidine-4-carboxylic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C1NC(C(O)=O)CS1 JEPVUMTVFPQKQE-AAKCMJRZSA-N 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000003971 Fibroblast Growth Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000380 Fibroblast growth factor 5 Proteins 0.000 description 1
- 102100028073 Fibroblast growth factor 5 Human genes 0.000 description 1
- 108090000382 Fibroblast growth factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 102100028075 Fibroblast growth factor 6 Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100446513 Mus musculus Fgf4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100030856 Myoglobin Human genes 0.000 description 1
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 1
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 1
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- VJHCJDRQFCCTHL-UHFFFAOYSA-N acetic acid 2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VJHCJDRQFCCTHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012925 biological evaluation Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+3].N#[C-].N([C@@H]([C@]1(C)[N-]\C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C(\C)/C1=N/C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C\C1=N\C([C@H](C1(C)C)CCC(N)=O)=C/1C)[C@@H]2CC(N)=O)=C\1[C@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](N2C3=CC(C)=C(C)C=C3N=C2)O[C@@H]1CO FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001944 cysteine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000005175 epidermal keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001400 expression cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical class N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010085617 glycopeptide alpha-N-acetylgalactosaminidase Proteins 0.000 description 1
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000057239 human FGF7 Human genes 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000035992 intercellular communication Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940085991 phosphate ion Drugs 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 1
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 1
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 210000002325 somatostatin-secreting cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
.. . .. , ... .Oblast techniky. - - - - Prezentovaný vynález se vztahuje k oblasti purifikace proteinů. Konkrétně se předkládaný vynález vztahuje k oblasti purifikace keratinocytových růstových faktorů.
- . ..... Dosavadní stav techniky • Polypeptidové růstové faktory jsou důležitými prostředníky mezibuněčné komunikace (Rubin et. al. (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86: 802-806). Tyto molekuly jsou obecně .uvolňovány jedním typem buněk a ovlivňují množení (proliferaci) jiných typů buněk.
Jednu rodinu růstových faktorů tvoří fibroblastové růstové faktory. V současné době je známo osm členů rodiny FGF (fibroblast growth factors), které vykazují příbuznost v primární struktuře: základní fibroblastový růstový faktor (basic fibroblast growth factor), bFGF (Abraham et al. (1986), EMBO J.,5:2523-2528); kyselý fibroblastový růstový faktor (acidic fibroblast growth factor), aFGF (Jaye et al. (1986), Science, 233:541-545); produkt int-2 genu, int2 (Dickson & Peters (1987), Nátuře, 326:833); hst/kFGF (Delli-Bovi et al. (1987), Cell, 50:729-737 a Yoshida et al. (1987), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84:7305-7309); FGF-5 (Zhan et al. (1988), Mol. Cell. Biol., 8:3487-3495), FGF-6 (Marics et al. (1989), Oncogene, 4:335340); keratínocytový růstový faktor (keratinocyte growth factor) (Finch et al. (1989) Science,., 24:752-755; Rubin et al. (1989), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86:802-806;\Ron et al. (1993), The Journal, of Biological Chemistry, 268(4):2984-2988 a Yan et al. (1991), In Vitro Cell. Dev. Biol., 27A:427-438) a hisactophilin (Habazzettl et al. (1992), Nátuře, 359:855-858).
V rodině FGF proteinů je keratínocytový růstový faktor jedinečným efektorem proliferace nefibroblastových epiteliálních (zejména keratinocytových) buněk odvozených z mesenchymálních • · · · • · ·· <
pletiv. Pojem „nativní KGF se vztahuje k přírodnímu lidskému '(hKGF) nebo rekombinantnímu (rKGF) polypeptidu (se signální sekvenci nebo bez ní), jak je znázorněno sekvencí aminokyselin uvedených v SEQ ID NO:2~nebo^v_ její.alelické„variantě. [Pokud není^uvedeno jinak, číslování aminokyselin pro molekuly popsané v tomto dokumentu bude odpovídat prezentované konečné formě přirozené molekuly (tj. bez signální sekvence), jak je znázorněno aminokyselinami 32-194 SEQ ID NO:2.]
.......Nativní-KGF může-být izolován z-přirozených zdrojů.- Například hKGF může být izolován z média upraveného linií embryonálních plicních fibroblastů (embryonic lung fibroblast) (Rubín et al.
(1989), viz předchozí text). Pro přípravu purifikovaného hKGF preparátu byly použity tři chromatografické kroky, jmenovitě afinitní chromatografie na heparin-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA), HPLC gelová filtrace a HPLC v reversní fázi. Z 10 litrů upraveného média bylo takto získáno zhruba 6 mg hKGF. Tyto chromatografické kroky umožní získat pouze 0,8% celkového množství hKGF (stanoveného zkouškou mitogenní aktivity). Další příklad ukazuje použití jiného chromatografického kroku - použití afinitní chromatografie (heparin-Sepharose) a iontoměničové chromatografie (Mono-S - Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) pro izolaci rKGF produkovaného v bakteriích (Ron et al. (1993), Journal of Biological Chemistry, 268:2984-2988).
Vlastnosti keratinocytových růstových faktorů naznačují možnosti pro jejich aplikace, jako například léků pro podporu specifické stimulace růstu epiteliálních buněk. Bylo by proto žádoucí mit k dispozici metodu nebo metody pro získání relativně velkého množství homogenních keratinocytových růstových faktorů, pro získání dostatečného množství materiálu na komplexní in vitro a in vivo biologické hodnocení a pro potenciální terapeutické použití.
Předmětem tohoto vynálezu je popis nové. metody purifikace keratinocytových růstových faktorů.
·· · *· ·«· • v · * · · · • · · · · ··· ·»·»·« · • · * · · · ··· · * · · ♦ * * ·< ·· » « « « * • · · ·· ··
Podstata vynálezu
Prezentovaný vynález je zaměřený na první metodu purifikace keratinocytóyého růstovéhofaktoru (KGF) zahrnující -..,.,1.- Tr -.· f-----..
a) získání roztoku obsahujícího KGF
b) vazbu KGF v roztoku (krok a) na kationtový iontoměničový nosič
c) vymytí KGF elučním roztokem z kationtového iontoměničového nosiče
.... d)--rozdělení e-luovaného roztoku (krok c) na matr-ix molekulového-·vylučovacího síta (gelovou chromatografií)
e) opětovné získání KGF z matrix molekulového vylučovacího síta
Vynález je dále zaměřen na druhou metodu purifikace J . keratínocytového růstového faktoru (KGF), zahrnující:
a) získání roztoku obsahujícího KGF
b) vazbu KGF na kationtový iontoměničový nosič
c) vymytí KGF elučním roztokem z kationtového iontoměničového nosiče
d) hydrofobní chromatografii eluovaného roztoku (krok c)
e) opětovné získání KGF po hydrofobní chromatografii (krok d)
Obecně, krok kationtové výměnné chromatografie první i druhé metody může být proveden s jakýmkoliv vhodným pufrem (například fosfátovým pufrem - PBS, pufrem octanu sodného nebo Tris-HCl) nejlépe při pH mezi 6,8 a 7,5. Mezi vhodné kolony pro tento krok patří karboxymetyl celulóza (carboxymethyl cellulose), karboxymetyl agaróza (carboxymethyl agarose) a sulfatovaná agaróza (sulfated agarose) a celulózové kolony (například kolony s nosiči S-Sepharose Fast Flow™, Mono-S™ a CM-cellulose™, komerčně dostupné od Pharmacia, Piscataway, NJ, USA). Rychlost průtoku kolonou bude závislá na rozměru kolony.
Krok gelové filtrace prvního postupu může být prováděn s jakýmkoliv vhodným pufrem (například fosfátový pufr - PBS) nejlépe při pH mezi 7,0 - 7,5. Mezi vhodné kolony pro tento krok patří • « * ** nosiče pro rozlišení podle velikosti založené na akrylamidu (acrylamide-based), křemičitanech (silica-based) nebo polymerech (polymer-based) (například kolony s nosičem Sephadex G-75™,
Superdex-75™_komerčně^dostupné u firmy Phannarí?p ... .^,- minrrPři použití druhé metody je možné začlenit oxidace volných SH skupin před krokem využívajícím hydrofobní interakce (viz další text). K tomu může být využita jakákoliv metoda. Například protein může být vystaven přiměřenou dobu působení atmosférického kyslíku. Nebo mohou být použité jiné oxidační postupy. Jedna taková metoda je zejména vhodná pro keratinocytový růstovýfaktor, kdy je jeden nebovíce cysteinových zbytků (při porovnání s přirozenou molekulou keratinocytového růstového faktoru) odstraněn nebo nahrazen.
Při tomto postupu se může působit oxidačním činidlem přidaným do vhodné konečné koncentrace (např. cystamin dihydrochloridem'nebo jiným vhodným oxidačním činidlem, například cystinem, oxidovaným glutationem nebo dvojmocnou mědí; upraví se také pH nejlépe na hodnotu 7,0-9,5 - pro cystamin hydrochlorid je nejvhodnější pH 9,0 ±0,3) při teplotě nejlépe mezi 10-30 °C, po příslušně vhodnou dobu. Druhý postup může být použitý pro oxidaci cysteinových zbytků přirozeného KGF a ostatních keratinocytových růstových faktorů stejným způsobem. Při tomto postupu může být oxidace dosaženo přidáním vhodného množství látky upravující iontovou silu (např. síranu amonného) a úpravou pH nejlépe na hodnotu mezi 7,5-9,5 s teplotou udržovanou mezi 23 ±5°C po příslušnou dobu.
Krok hydrofobních interakcí u druhé metody může být proveden s využitím vhodného pufru (např. pufr fosfátu sodného) nejlépe při pH mezi 6,0-8,0 (nejlépe 7,0) as použitím klesajícího lineárního gradientu vymývacího roztoku síranu amonného v koncentracích-2-0 M. Pro tento krok jsou vhodné nosiče se substituovanými alkylovými nebo fenylovými skupinami (například Butyl-650M Toyopearl™, komerčně dostupný od Tosohaas, lne., Montgomeryville, PA°, USA a kolony phenyl Sepharose™ a phenyl Superose™, komerčně dostupné od Pharmacia}.
Postup předkládaného vynálezu může být použit pro purifikaci keratinocytového růstového faktoru KGF. Mělo by být jasné, že ·»·» ·« ··« * · · · · · · > « * · · · · · · ··«« «· ·· ·*· ·· ·· termíny „keratinocytový růstový faktor a „KGF používané v tomto popisu je možné (pokud není uvedeno jinak) zaměňovat; nativní KGF a analoga proteinů KGF (nebo „muteiny) jsou charakterizované sekvencí peptidů,_ která je v,podstatě stejná jako sekvence nativního KGF. Vykazují také některé nebo všechny biologické aktivity nativního KGF, zejména proliferaci nefibroblastických epiteliálních buněk (například vykazují alespoň 500x větší stimulaci keratinocytových buněk BALB/MK než NIH/3T3 fibroblastových buněk a alespoň 50x větší stimulaci BALB/MK buněk než epiteliálních buněk BS/589 nebo epiteliálních buněk CC1208 při stanovení· testem--inkorporace H- thymidinu). Frází „charakterizované peptidovou sekvencí v podstatě shodnou se sekvence nativního KGF je míněna peptidová sekvence, která je kódovaná sekvencí DNA schopnou hybridizace k nukleotidům 201 až 684 SEQ ID NO:1, přednostně za stringentních hybridizačníchpodmínek.
Odpovídající pozice aminokyseliny mezi dvěmi sekvencemi aminokyselin může být určena připojením dvou sekvencí tak, aby se maximalizovala shoda residuí včetně posunu amino a/nebo karboxy konce,zavedením potřebných mezer a/nebo odstraněním residuí přítomných ve formě insertů u možných kandidátů. Vyhledávání v databázích, analýza sekvence a zpracování dat se může provést s použitím některého dobře známého algoritmu - programu běžně používaného pro prohledávání na homologie/totožnost v sekvenci, (například Pearson a Lipman (1988), Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444-2448; Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol., 215:403-410; Lipman and Pearson (1985), Science, 222:1435 nebo Devereux et al. (1984), Nuc. Acids Res., 12:387-395).
Stringentní podmínky (týkající se hybridizace) se dosáhnou kombinací koncentrace solí, teploty, organických rozpouštědel a ostatních parametrů běžně kontrolovaných v hybridizačních reakcích. Vzorové hybridizační podmínky představuje hybridizace v 4x SSC při 62-67 eC, následovaná promýváním v 0,lx SSC při 62-67 ’C po dobu zhruba jedné hodiny. Nebo další vzorové hybridizační podmínky představuje hybridizace v 45-55% formamidu, 4x SSC při 40-45 °C.
• · · ·
[viz. T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A laboratory manual); Cold Spring Harbor Laboratory (1982), stránky 387 -389].
Proteiny zahrnují variace alel, nebo deleci (delece), substi t uc i (substituce) či^inzeřci (inzerce ^aminokyselin, »včetně . fragmentů, chimérických nebo hybridních molekul přirozeného . . (nativního) KGF. Jeden příklad KGF zahrnuje proteiny mající residua odpovídající Cysl a Cysl5 SEQ ID N0:2 nahrazené nebo odstraněné, přičemž výsledná molekula má při porovnání s mateřskou molekulou zlepšenou stabilitu (jak je uvedeno v běžně přístupném U.S.S.N. 08/487, 825, ...zařazeným 7. července 1995)·. Jiný příklad KGF zahrnuje polypeptid se změněným nábojem, kde jeden nebo více aminokysélinových zbytků na pozicích 141-154 nativního KGF (nejlépe residua Arg41, Gln43, Lys55, Lys95, Lysl28, Asnl37, Glnl38, Lysl39, Argl44, Lysl47,. Glnl52, Lysl53 nebo Thrl54) je odstraněn nebo vyměněn neutrálním nebo negativně nabitým zbytkem s cílem ovlivnit protein redukováním pozitivního náboje (jak je uvedeno v běžně přístupném U.S.S.N. 08/323, 337, zařazeným 13. října 1994). Ještě další příklad KGF představuje protein vytvořený substituováním alespoň jedné aminokyseliny s velkým potenciálem tvořit smyčku nebo alespoň jedné aminokyseliny uvnitř oblasti tvořící smyčku (Asnll5 Hisll6 - Tyrll7 - Asnll8 - Thrll9) nativního KGF (jak je uvedeno v běžně přístupném U.S.S.N. 08/323, 473, zařazeným 13. října 1994). Ještě další příklad zahrnuje proteiny mající nahrazenu jednu nebo více aminokyselin uvnitř oblasti 123-133 (aminokyseliny 154-164 SEQ ID NO:2) nativního KGF nahrazenou, odstraněnou nebo přidanou; tyto proteiny můžou mít agonistickou nebo antagonistickou aktivitu.
Speciálně objevené proteiny zahrnují následující KGF molekuly (zmíněné vzhledem k zbytku nalezeným v místě nativního proteinu (be signální sekvence) uvedeném v SEQ ID NO:2, následovaném pozicí aminokyseliny v. závorkách a potom buď substitujícím reziduem nebo „ „ k označení delece): C(1,15)S, ΔΝ15-ΔΝ24, AN3/C(Í5)S, ΔΝ3/Ο(15)-, AN8/C(15)S, Δν8/0(15)-, C (1,15)S/R(144)E, C(1,15)S/R(144)Q,
AN23/R(144)Q, C(l,15,40)S, C(1,15,102)S, C (1, 15,102,106)S, ΔΝ23/Ν(137)Ε, ΔΝ23/Κ(139)E, ΔΝ23/Κ{139}Q, AN23/R(144)A, *· ♦*«· I 9 9
I 9 9 9 9
9· ·99
AN23/R(144)E, ÁN23/R (144)L, ΔΝ23/Κ{147)E, ΔΝ23/Κ(147)Q,
ΔΝ23/Κ(153) E, ΔΝ23/Κ{153)0, AN23/Q(152)E/K(153)E; R(144)Q a H(116)G. Jak odborníci v této problematice ocení, k expresi sekvence kódující_KGF protein může být-použita řada systémů^hostitel1 vektor. Ty zahrnují- (ale nejsou omezena pouzena ně) systémy eukariotických buněk, jako například systémy savčích buněk infikovaných virem (například virem neštovic, adenovirem a podobně); hmyzí buněčné systémy infikované virem (například bacilovirem); mikroorganismy - například kvasnice obsahující kvasnicové vektory; nebo přokaryoťické. buněčné systémy jako například bakterie transformované bakteriofágovou DNA, plasmidovou DNA nebo kosmidovou DNA. Expresní prvky těchto vektorů se liší co do síly a specifity.
V závislosti na tom, jaký systém vektor-hostitel je použit, může být použit jakýkoliv z velkého počtu vhodných transkripčních a translačních prvků.
Jakmile je proteinový produkt exprese KGF izolován, purifikován a otestován na KGF aktivitu (s použitím postupů odborníkům všeobecně známých), může být použit v řadě farmaceutických výrobků.. Typicky takovýto výrobek zahrnuje vhodný, zpravidla chemicky definovaný nosič pro terapeutickou látku a ( v závislosti na zamýšlené formě aplikace) také další látky. Výrobek může zahrnovat vodné nosiče nebo se může skládat z pevné fáze, kde je KGF začleněn do nevodných nosičů, jako je například kolagen, kyselina hyaluroniková (hyaluronic acid) a nebo nej různější polymery. Složení může být vhodně upravené pro aplikaci nej různějšími způsoby, včetně podávání injekčního, orálního, lokálního, intranasálního či plicního.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1 ukazuje nukleotidové (SEQ ID NO:1) a aminokyselinové (SEQ ID NO:2) sekvence nativního KGF (nukleotidy kódující konečnou formu nativního KGF jsou popsány bázemi 201 až 684 SEQ ID NO:1 a konečná forma KGF je určená aminokyselinovými zbytky 32 až 194 SEQ ID NO:2).
Í5 3 3 >A • · « · · · * • t ft · * * * · ······ * ♦ · · · * » «*·t Φ · * · · ·· ?» a» • « · • · ··* · * « » * • · * ·
Obrázky 2A, 2B a 2C ukazují mapy plasmidů pCFM1156, pCFM1656 a PCFM3102.
Obrázek 3 ukazuje nukleotidové (SEQ ID NO:3) a aminokyselinové (SEQ ID NO:_4) sekvence konstruktu obsaženého v konstruktu,RSH-KGF.
Obrázek 4 ukazuje nukleotidové (SEQ ID NO:5) a aminokyselinové (SEQ ID NO:6) sekvence konstruktu obsaženého v plasmidů KGF.
Obrázek 5. ukazuje chemicky syntetizované OLIGA (OLIGO 6 až OLIGO 11; SEQ ID NO:12-17) použité k náhradě DNA sekvence mezi místy Kpní a EcoRI od místa KpnI (pozice aminokyselin 46 až 85 SEQ ID No: 6)· v konstruktu plasmidů KGF,·· aby se· tak vytvořil konstruktplasmidů KGF (dsd).
Obrázek 6 ukazuje chemicky syntetizované OLIGA (OLIGO 12 až 24; SEQ ID NO:18-30) použité pro tvorbu KGF (optimalizovaný kodon).
Obrázek 7 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:31) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:32) sekvenci C(l,15)S, analogu KGF se substitucí šeřinu místo cysteinu v pozici aminokyselin 1 a 15 nativního KGF.
Obrázek 8 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:33) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:34) sekvenci. C(l, 15) S/R(144) E, analogu KGF se substitucí šeřinu místo cysteinu v pozicích aminokyselin 1 a 15 a substituci glutamové kyseliny za arginin na aminokyselinové pozici 144 nativního KGF.
Obrázek 9 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:35} a aminokyselinovou (SEQ ID NO-.36) sekvenci C(1,15) S/R(144)Q, analogu KGF se substitucí šeřinu za cystein na pozicích 1 a 15 a substitucí glutaminu za arginin na aminokyselinové pozici 144 nativního KGF.
Obrázek 10 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:37) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:38) sekvenci ΔΝ15, analogu KGF s delecí prvních 15 aminokyselin na N-konci nativního' KGF.
Obrázek 11 ukazuje sekvenci nukleotidů a (SEQ ID NO:39) a aminokyselin (SEQ ID NO:40) analogu KGF ΔΝ23 s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci nativního KGF.
Obrázek 12 ukazuje nukleotidovou (SEQ ID NO:41) a aminokyselinovou (SEQ ID NO:42) sekvenci áN23/R(144)Q, analogu KGF
1'
3 • · · · · • · ♦ · * · · · · • · · · »·»» φ·
55 • ♦ 4 • ·· « · · · I • · 4 s delecí prvních 23 aminokyselin na N-konci a náhradou glutaminu za arginin na aminokyselinové pozici 144 nativního KGF.
.J-. L.- ... Ι|·.·|1· ·”? *- .......
Příklady provedení vynálezu . . .
Standardní metody mnoha procedur popsaných v následujících příkladech (nebo vhodných alternativních postupech), jsou popsány v běžně rozšířených molekulárně biologických manuálech, jako například-Molecular Cloning, Second Edition, Sambrook et al.Cold- Spring Harbor Laboratory Press (1987) a Current Protocols in Molecular Biology, Ausabel et al., Greene Publishing
Associates/Wiley-Interscience, New York (1990) .
Příklad 1: Příprava DNA kódující KGF a analoga KGF
Klonování celého genu lidského KGF (kódujícího polypeptid se sekvencí nativního KGF) bylo provedeno jednak polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) s RNA ze zvířecích buněk a pomocí PCR chemicky syntetizovaných (optimalizovaný kodon E. coli) oligonukleotidů („OLIGA). Obě procedury jsou popsány dále:
Byla provedena amplifikace s použitím RNA izolované z buněk (o kterých víme že produkují polypeptid) pomocí PCR. Nejprve se provede rozrušení buněk z buněčné linie lidských fibroblastů AG1523A (získané od Human Genetic Mutant Cell Culture, Repository Institute For Medícal Research, Camden, New Jersey) pomocí guanidin thiokyanátu; pak následuje extrakce RNA (podle metody popsané v práci Chomzynski et al. (1987), Anal. Biochem., 172:156). S použitím standardního protokolu pro reversní transkripci byla z celkové RNA vytvořena cDNA pro KGF. PCR amplifikace (PCR 1) genu KGF byla provedena s použitím cDNA KGF jako templátu a primerů OLIGO 1 a OLIGO 2, které kódují DNA sekvence bezprostředně na 5' a 3' genu KGF [teplotní cyklátor model 9600 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT); 28 cyklů, každý zahrnující denaturaci - jednu minutu při 94°C, annealing - dvě minuty při 60°C a elongaci - tři minuty při 72°C].
« * « · k · ♦ *» w»*· ^9 99 « * · · · · * • · · « · · · · * · ·« · · · · ·
V · · · · · ·« ·*» *· ··
Malé alikvotní části produktu první PCR reakce byly potom použity jako templát pro druhou KGF PCR amplifikaci (PCR 2) za podmínek shodných s první reakcí kromě teploty pro annealing, která byla 50°C. Pro expresní klonování ^genu^KGF. bylý dále,.použity, primery pro „nested PCR generující vhodná restrikční místa na obou koncích genu KGF - k modifikaci KGF DNA produktu z PCR 2 byly tak použity OLIGO 3 a OLIGO 4 (začlenění restríkčních míst pro Mlul a BamHI na 5' a 3' konci genu) [PCR 3; 30 cyklů, každý zahrnující denaturaci - jedna minuta při 94°C, annealing - dvě minuty při 60 eC a elongaci - tři minuty při 72 °C]. Tato DNA byla následovně’štěpena restrikčními x enzymy Mlul a BamHI, extrahovaná fenolem a precipitována etanolem.
Poté byla rozpuštěna a ligována (s použitím T4 ligázy) do plasmidu pCFM1156 (obrázek 2A), který obsahuje „RSH signální sekvenci, čímž vznikl konstrukt RSH-KGF (obrázek 3). Tímto ligačním produktem byly transformovány (podle metody popsané Hanahanem (1983) J. Mol. Biol., 166:557) buňky £. coli (kmen FM5 - ATCC:53911) a následně bylo těmito buňkami inokulováno LB médium s kanamycinem při 28 °C.
Několik vybraných transformantů bylo dále pěstováno v malých tekutých kulturách obsahujících kanamycin v koncentraci 20 ug/ml.
každé kultury byl isolován RSH-KGF plasmid.a,jeho DNA byla sekvenována. Vzhledem k vnitřnímu Ndel restrikčnímu místu v genu KGF nebylo možné přímo klonovat nativní sekvenci genu do příslušného expresního vektoru do míst ohraničeních Ndel a BamHI. Toho se dosáhlo trojcestnou ligací·. Plasmid RSH-KGF byl štěpen v jedinečných restríkčních místech BsmI a Sstl a fragment DNA asi 3 kb velký (obsahující 3' konec KGF genu) byl izolován následnou elektroforézou v 1% agarózovém gelu. Další PCR (PCR 4) byla provedena za stejných podmínek jako PCR 3 s primerem OLIGO 5 místo OLIGO 3. DNA produkt PCR reakce byl pak štěpen enzymy Ndel a BsmI a pomocí elektroforézy ve 4% agaróze byl izolován DNA fragment 311 párů bází dlouhý. Třetí fragment použitý v ligací byl fragment DNA 1,8 kilobází dlouhý z pCFMH56 vyštěpený s Ndel a Ěstl a izolovaný elektroforézou v 1% agarózovém gelu. Po následující ligací (T4 ligáza), transformaci, selekci na kanamycinu a sekvenování DNA (jak je popsáno výše) byl vybrán klon obsahujicí konstrukt na obrázku 4 a tento plasmid byl
* « · · ·
·. · · označený jako KGF. Vzhledem k internímu ribosomálnímu vazebnému místu, které vede k tvorbě zkrácených produktů, byla sekvence KGF DNA mezi jedinečnými KpnI a EcoRI místy nahrazena chemicky syntetizovanými OLIGO (OLIGO 6 až OLIGO 11/ tak, aby_se^ minimalizovalo použití interního startovacího místa, pro začáteksyntézy proteinů (obrázek 5).
OLIGOttl (SEQ ID NO:7): 5'-CAATGACCTAGGAGTAACAATCAAC-3'
OLIGO#2 (SEQ ID NO:8)5’-AAAACAAACATAAATGCACAAGTCCA-3’
OLIGO#3· (SEQ ID N0:9): - 5'-ACAACGCGTGCAATGACATGACTGCA-3'
OLIGO#4 (SEQ ID NO: 10) :
5' -ACAGGATCCTATTAAGTTATTGCCATAGGAA-3'
OLIGO#5 (SEQ ID NO:11):
. .5'-ACACATATGTGCAATGACATGACTCCA-3'
OLIGO#6 (SEQ ID NO:12):
5' -CTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCC-3'
OLIGO#7 (SEQ ID NO:13):
' -AAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTT-3'
OLIGO#8 (SEQ ID NO:14):
; -GCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTG-3'
OLIGO#9 (SEQ ID NO:15):
5'-TCTTGGGTGCCČTTGACTTTGCCGCGTTTGTCGATACGCAGGTAC-3' OLIGO#10 (SEQ ID NO:16):
5' -ACAGCAACAGTACGGATTTCCATAATATTGTAGTTGTTTTTCATC-3' OLIGOH1 (SEQ ID NO:17):
5' -AATTCAGATTCAACACCTTTGATTGCAACGATACCA-3'
OLIGA byla fosforylována T4 polynukleotid kinázou a poté tepelně denaturována. Pomalým snížením teploty na úroveň laboratoře potom tato jednopramenné (ss - single stranded). OLIGA vytvořila dvoupramenné (ds) fragmenty DNA. Poté byla použita T4 ligáza ke kovalentnímu připojení jak interních OLIGO shodných (sticky) konců tak celého ds OLIGO fragmentu do KGF plasmidu štěpeného enzymy KpnI a EcoRI. Nový plasmid byl označen jako KGF(dsd).
* · ·· · · « · Λ Ο . Ů ί • »·· « · ·· • · · * · · · « · · · · • φ «·· · · ·*
KGF gen s úplně optimalizovaným £. coli kodónem byl vytvořen amplifikací pomocí PCR s chemicky syntetizovanými OLIGO 12 až 24.
OLIGO#12»(SEQ.ID N0:18): OLIGO#13 (SEQ ID NO:19): OLIGO#14 (SEQ ID NO:20):
5'-AGTTTTGATCTAGAAGGAGG-3
5'-TCAAAACTGGATCCTATTAA-3'
5’-AGTTTTGATCTAGAAGGAGGAATAACATATGTGCAACGACATGACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTGCTCCAGCCCGGAACGT-3'
OLIGOU5 (SEQ ID N0:21) :
- · 5' -CACACCCGTAGCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGTGTTC---GTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAA-3'
OLIGO#16 (SEQ ID N0:22):
5'-CGTGGTAAAGTTAAAGGTACCCAGGAAATGAAAAACAACTACAACATCATGGAAATCCGTACTGTTGCT.GTTGGŤATCGTTGCAATCAAA-3'
OLIGO#17 (SEQ ID NO:23):
5'-GGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAA- 3'
OLIGO#18 (SEQ. ID N0:24) :
5' -CTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGT-3'
OLIGO#19 (SEQ ID NO:25):
5' -ATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAATAGGATCCAGTTTTGA-3'
OLIGO#20 (SEQ ID NO:26}:51-TACGGGTGTGACGTTCCGGG-3'
OLIGOS21 (SEQ ID NO:27):5'-CTTTACCACGTTTGTCGATA-3'
OLIGO#22 (SEQ ID NO:28):5'-ATTCAACACCTTTGATTGCA-3'
OLIGO#23 (SEQ ID NO:29):5'-CCAGGATCAGTTCTTTGAAG-3'
OLIGO#24 (SEQ ID NO:30):5'-GAACCGGGATACCTTTCTGG-3'
OLIGA 12 až 24 byla navržena tak, aby celá DNA sekvence kódující nativní KGF byla representována OLIGY z „Watsonova nebo „Crickova pramene a aby PCR poskytla žádanou dvoupramenou DNA sekvenci (obrázek 6) [PCR 5, teplotní cyklátor model 9600 (PerkinElmer Cetus); 21 cyklů skládajících se z denaturace - 31 vteřin př 94 eC, annealingu - 31 vteřin při 50 °C a elongace - 73 °C po 31 ·*«« »· «99 5359 • 9 ··> < * 99 • 9 99 »t«9 9
9 · 9 9 · «9 99« 9 9 · * vteřin; po těchto 21 cyklech byla PCR reakce zakončena závěrečným sedmi minutovým elongačním krokem]. Po PCR amplifikaci byl výsledný DNA fragment štěpen enzymy Xbal a BamHI a fragment 521 bp byl ligován-doíexpresního,.plasmidu pCFM1156, který_byl<Štěpen_stejnými enzymy. PCR 5 používala jako vnější primery (100 pmolů/100 ul rxn)· OLIGO 12 a OLIGO 13 a lul/100 ul rxn KGF templátu odvozeného ligací (T4 ligázou) OLIGO 14 až 19 (OLIGO 15 až 18 byly fosforylovány'T4 polynukíeotid kinázou) s použitím OLIGO 20 až 24 jako pomocných oligonukleotidů (band-aid oligos) pro ligaci (Jayraman et al.
(1992) , Biotechniques,·· 12 :-392)-. Konečný produkt byl označená jako KGF(optimalizovaný kodon).
Všechna zde popsaná analoga KGF jsou složena z částí sekvencí DNA nalézajících se v KGF (dsd) nebo KGF (optimalizovaný kodon) nebo z kombinace.obou. Tyto.sekvence jsou dále modifikované inzercí do vhodných restrikčních míst DNA sekvencí, které kódují specifická aminokyselinová KGF analoga, s použitím jedné nebo více technik pro. syntézu DNA fragmentů popsaných výše. Jakýkoliv analog může být vytvořen v celém svém rozsahu jednou z výše popsaných technik.
Obecně se při konstrukci OLIGO používali optimalizované E. coli kodony tam, kde to bylo vhodné, i když přítomnost optimalizovaných E. coli kodonů (v části nebo v celku jakéhokoliv z genů, kde byl tento vliv zjišťován) nezvýšila významně výnos proteinu, který mohl být získán z kultivovaných bakteriálních buněk. Obrázky 7-12 jsou vhodným příkladem konstrukce nukleotidových a aminokyselinových sekvencí konkrétních KGF analogů: C(1,15)S (obrázek 7);
C(1,15)S/R(144)E (obrázek 8); C(1,15)S/R(144)Q (obrázek 9); ΔΝ15 (obrázek 10) ΔΝ23 (obrázek 11) a AN23/R(144)Q (obrázek 12). DNA sekvence všech konstruktů KGF analogů zde popsaných byla ověřena . sekvenováním.
Příklad 2: Purifikace z E. coli
Při klonování analogů genu KGF byly použity tři různé expresní plasmidy. Jednalo se o pCFM1156 (ATCC 69702), pCFM1656 (ATCC 69576) a pCFM3102 (obrázky 2A, 2B a 2C). Plasmid p3102 může být odvozen ♦
• •Φ Φ
Φ *
Φ · β Ο • ··· ··* * Φ • Φ Φ
Φ» ·· z plazmidu pCFM1656 sérií místních mutagenezí (změn bází) pomocí PCR s přesahujícími oligo (PCR overlaping oligo mutagenesis). Začíná se na BglII místě (v plasmidu pCFM1656 180 pár bází) bezprostředně u 5' replikačníhoupromotoru 'plasmidu, PcopB, a pokračuje» se., směrem ke Ί genům replikace plasmidu, přičemž dochází k těmto změnám:
| pCFMl656 bp # | bp in pCFM1656 | bp changed to in pCFM31O2 |
| # 204 | T/A | C/G |
| # 428 | A/T | G/C |
| # 509 | G/Č | A/T |
| # 617 | — | insert two G/C bp |
| # 677 | G/C | T/A |
| # 978 | T/A | C/G |
| # 992 | G/C | A/T |
| # 1002 | A/T | C/G |
| # 1005 | C/G | T/A |
| # 1026 | A/T | T/A |
| # 1045 | C/G | T/A |
| # 1176 | G/C | T/A |
| # 1464 | G/C | T/A |
| # 2026 | G/C | bp deletion |
| # 2186 . | C/G | T/A |
| # 2479 | A/T | T/A |
| # 2498-2501 | AGTG | GTCA |
| TCAC | CAGT | |
| # 2641-2647 | TCCGAGC AGGCTCG | bp deletion |
| # 3441 | G/C | A/T |
| # 3452 | G/C | A/T |
| # 3649 | A/T | T/A |
| # 4556 | — | insert bps |
(SEQ ID NO:43) 5’-GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG-3’ (SEQ ID NO:44) 51-CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC-31
Jak je vidět z výše uvedeného, plasmidy pCFMH56, pCFM1656 a pCFM3102 jsou si vzájemně velmi podobní a obsahují mnoho stejných restrikčních míst. Plasmidy byly vybrány podle jejich vhodnosti a části vektorové DNA mohou být jednoduše změněny pro potřeby nových konstruktů. Hostitelským organismem použitým pro všechna klonování byla E. coli, kmen FM5 (ATCC: 53911) a transformace byla prováděna podle metody Hanahana (1983, viz předchozí text) nebo elektroelucí v · ··** ·· ♦· • * · a » · ·· • « · · · · a • · · α «· ·· s použitím přístroje Gene Pulser transfection apparatus (BioRad Laboratories, lne., Hercules, CA, USA}, podle protokolu dodaného výrobcem.
— 11 Nejprve. bylo».připraveno malé» čerstvé inokuluru^žádaného, rekombinantního klonu E.coli, obsahujícího na jednom ze tří pCFM vektorů žádaný konstrukt. 0,1 ml zmražené zásobní kultury vhodného kmene v glycerolu bylo přeneseno do dvoulitrové lahve obsahující 500 ml Luriova bujónu. Kultura byla třepána při 30°C po 16 hodin. Poté byla kultura přenesena do 15 1 fermentoru obsahujícího 8 1 sterilního media· používaného-pro fermentace ve'větších objemech (Tsai, et al.(1987), J.Industrial Microbiol., 2:181-187).
Na začátku fermentace bylo dodáváno živné medium Feed #1 (Tsai, et al. (1987), viz předchozí text). V okamžiku, kdy hodnota OD600 dosáhla hodnoty 35, byla rychlým zvýšením teploty kultury na 37°C indukována exprese žádaného analogu KGF. Při této teplotě se plasmid amplifikuje. Po dvou hodinách při 37°C byla teplota kultury dále rychle zvýšena na 42°C, čímž byl denaturován Cl represor. Přidávání. Feed 1 bylo přerušeno a místo něj bylo poté přidáváno živné medium Feeu 2 v množství 300 ml za hodinu. Feed 2 obsahovalo 175g/l peptonu (trypticase-peptone), 87,5g/l kvasničného extraktu a 260g/l glukosy. Po jedné hodině kultivace při 42°C byla teplota kultury snížena na 36°C a tato teplota byla dále udržována po následujících šest hodin.
Fermentor byl poté zastaven a buňky byly koncentrovány centrifugací v plastikových pytlících vložených do jednolitrových centrifugačních kyvet. Medium bylo centrifugováno 60 minut při 400 otáčkách za minutu. Supernatant byl poté odebrán a pelet (sedimentované buňky) byl zmrazen při -90°C.
Následujícím způsobem byla purifikována tato analoga KGF (získána expresí v E. Coli): přirozený KGF, C(1,15)S,
C(1,15)S/R(144)E, C(1,15)S/R(144)Q, ΔΝ15, ΔΝ23 a AN23/R(144)Q..Pelet (hustá buněčná suspenze)získaný centrifugací. z vysokohustotní fermentace byl resuspendován pomocí vhodného výkonného (poskytujícího velké střižné síly) mixeru při 4°C v roztoku 0,2 M NaCl v 20 mM NaPO4, pH 7,5 tak, aby výsledná suspenze byla 10-20% • » ♦ · • * · v • * · · • · · · • · · * · · • · · ···· ·· • · · ·· (hm./obj.). Resuspendované buňky byly poté lysovány trojitým homogenizováním v homogenizéru (APV Gaulin, lne., Everett, MA, USA). Homogenát vytékající z homogenizátoru byl ochlazován na 4-8°C pomocí vhodného»ehladícího zařízení .--Zbytky buněk bylv^odstranény-..... . . ..
centrifugací lysátu při 4200 ot./min., 4°C, po dobu 30-60 minut v centrifuze J-6B (Beckman Instruments, lne., Brea, CA, USA, použitý rotor JS 4.2). Supernatant byl poté opatrně dekantován a nanesen na předem připravenou kolonu (450ml, 5 cm.x 23 cm) S-Sepharosy Fast Flow (Pharmacia). Kolona byla ekvilibrována roztokem 0,2 M NaCl v 20 mM NaPO4, pH 7,5, při 4°C. Kolona byla poté promyta 2250 ml (pětinásobný objem kolony) roztoku 0,4 M NaCl v 20 mM NaPO4, pH 7,5, při 4°C. Purifikovaný protein byl eluován z kolony 5 1 roztoku 0,5 M NaCl v 20 mM NaPO4, pH 7,5. Absorbaňce eluátu při 28Onm byla kontinuálně zaznamenávána a eluát byl jímán do frakcí o objemu 50 ml. Frakce obsahující eluované látky (identifikované pomocí absorbaňce při 280nm) byly dále analyzovány pomocí SDS-PAGE elektroforézy (14% gel). Touto metodou byla potvrzena přítomnost požadovaného proteinu ve frakcích.
Frakce obsahující purifikované proteiny byly spojeny a následně k nim byla přidána destilovaná voda v poměru 1:1. Zředěný roztok byl poté nanesen ha předem připravenou kolonu (450ml, 5 cm x 23 cm) Ssepharosy Fast Flow ekvilibrovanou roztokem 0,4 M NaCl v 20 mM NaPO,, pH 6,8, při 4°C. Kolona byla poté promyta 2250 ml roztoku 0,4 M NaCl v 20 mM NaPO4, pH 6,8. Proteiny byly poté eluovány dvacetinásobným objemem kolony pomocí lineárního gradientu roztoku NaCl v 20 mM NaP04, pH 6,8 od 0,4 M do 0,6 M NaCl. Opět byly jímány 50 ml frakce, při současném měření absorbaňce.eluátu při 280nm. Frakce obsahující purifikovaný protein (stanoveno pomocí 14% SDS PAGE) byly spojeny a zkoncentrovány filtrací přes membránu (YM-10, 10000 molecular weight cutoff) v 350 ml nádobách za současného míchání(Amicon, lne.
Mayberry, MA, USA) na výsledný objem 30-40ml.
Koncentrát byl poté nanesen na kolonu Superdex-75 (Pharmacia)(1300ml, 4,4cm x 85cm) ekvilibrovanou pufrem obsahujícím IX PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Salině, „D-PBS, bez obsahu vápenatých a hořečnatých iontů) nebo roztokem 0,15 M NaCl v 20 mM ** «Μ* ·· ·« ···· · ·· • · * » · * «· ···· • * 9 9 · * 9 · ··*» ·* ·· *· »« ··
NaPO4, pH 7,0. Po nanesení vzorku byly proteiny eluovány z kolony použitím kolonového pufru. Desetimililitrové frakce byly jímány a ty, které obsahovaly požadovaný analog (stanoveno pomocí 14% SDS»PAGE)»»byly> spojeny.-Koncentrace proteinů v .takto,získané^frakci. bylaM běžně asi 5-10 mg/ml. Pokud není uvedeno jinak byly všechny výše uvedené kroky prováděny při 4°-8°C.
Alternativní postup purifikace byl použit v případě přirozeného KGF, C(1,15)S a ΔΝ23. Pokud není uvedeno jinak byly všechny kroky prováděny při 23 ± 5°C; tuto teplotu měly i veškeré použité roztoky a zařízení. ...1.'.
Po dokončení produkční fáze bakteriální fermentace byla buněčná kultura ochlazena na 4-8°C a buňky byly izolovány centrifugací či jiným podobným způsobem. Na základě očekávaného., výtěžku, proteinu na jednotku buněčné hmoty a množství požadovaného purifikovaného proteinu bylo přiměřené množství buněčné hmoty resuspendováno v pětinásobku (váhově) slabého pufru (0,2 M NaCl·,· 20 mM NaPO4, pH 7,5). Buňky byly resuspendovány na homogenní suspenzi pomocí vysokoobrátkového (hígh shearing)mixeru. Teplota buněčné suspenze byla během homogenizace udržována na 4-8°C.
Buňky byly poté lysovány tlakem, např. dvojnásobnou homogenizací buněčné suspenze ve vhodně velkém buněčném homogenizátoru. Homogenát byl udržován chladný (5 ± 3°C). K vyčištění buněčného lysátu byl použit předem připravený „hluboký filtr (depth filtr housing, Cuno,lne.,Meriden. CT, USA) vybavený filtrem s odpovídající plochou. Filtr byl ekvilibrován přiměřeným množstvím 0,2 M NaCl, připraveného v 20 mM NaPO4, pH 7,5. Ekvilibrace a promytí bylo prováděno při 5 ± 3°C. Po vyčištění lysátu filtrací přes vhodně upravený filtr byl tento promyt roztokem 0,2 M NaCl v 20 mM NaP04, pH 7,5. Filtrát a všechny další promývací roztoky byly jímány do chlazené nádoby odpovídajícího objemu. Všechny operace byly prováděny při teplotě nižší.než 10°C.
Lysát byl dále přečištěn na předem připravené koloně SPSepharosy Fast Flow obsahující minimálně 1 ml Sepharosy na 2g buněk. Kolona SP-Sepharosy Fast Flow byla ekvilibrována vychlazeným (5 ± ·« »* ** ·♦»· ·· • · · « · · « «··· • * · · * ·· · * ·· * * · · · 4 · · »»· · · « · · 9 · * ··· f«*« *· ·· ·♦· ft» ··
3°C) roztokem 0,2 M NaCl.v 20 mM NaPO4, pH 7,5. Teplota kolony byla udržována na hodnotě nižší než 10°C. Přečištěný lysát (5 ± 3°C) byl poté nanesen na kolonu iontoměniče a absorbance eluátu byla kontinuálněmonitorována při- 280nm. Po nanesení-vzorku.byla kolona _ promyta vychlazeným roztokem 0,2 M NaCl v 20 mM NaPO4, pH 7,5 a následně ještě promyta roztokem 0,3M NaCl v 20 mM NaPO4, pH 7,5 při teplotě 23 ±5°C.
Požadovaný protein.byl eluován pomocí lineárního gradientu o koncentraci 0,2-1 M NaCl připraveného v 20 mM NaPO4, pH 7,5. Převážná část-produktu1· byla sebrána v několika frakcích na základě měření absorbance při 280nm.
K oxidaci volných SH skupin byl proveden oxidační krok. Pro proteiny se změněným obsahem cysteinu, (v porovnáni s přírodním KGF) bylo přidáno oxidační.činidlo, (např. cystamin dihydrochlorid, nebo jiné vhodné oxidační činidlo, například cystein, oxidovaný glutathion nebo ionty Cuz+) ták, aby výsledná koncentrace byla 1-20 mM a pH bylo upraveno na 7-9,5. V případě, že byl použit cystamin dihydrochlorid, bylo pH upraveno na 9,0 ± 0,3. Oxidace byla ____— j:
piuvduciia F vhodnou dobu
V případě přírodního KFG byla oxidace provedena přídavkem vhodného množství (NH4)2SO4» např. 1-2 M {NHJ2SO4 a pH bylo upraveno na hodnotu 7,5-9,5 , přičemž teplota byla udržována na 23 ± 5ŮC po přiměřenou dobu. v případě potřeby byl do roztoku přidán pevný (NH4)2SO4 tak, aby výsledná koncentrace byla 2 M. Roztok byl zbaven pevných částic přečištěním filtrací přes vhodný filtr.
Filtrát - oxidovaný produkt byl dále dělen pomocí HIC (hydrophobic interaction chromatography). Jako matrice pro HIC byl použit Butyl-650M Toyopearl (Tosohaas, lne., Montgomeryville, PA,
USA). Roztok obsahující protein byl nanesen na kolonu, která byla předem ekvilibrována roztokem obsahujícím 2 M (NH4)2SO4, 0,15 M-NaCl, 20 mM NaP04, pH 7,0. Po nanesení vzorku byla kolona promyta roztokem 2 M (NH4)2SO4, 0,15 M NaCl a 20 mM NaPO4, pH 7,0. Požadovaný protein byl poté eluován snižujícím se lineárním gradientem 2 až 0 M (NHíUSOí, který byl rozpuštěn v roztoku 0,15 M NaCl a 20 mM NaPCL/ pH 7,0. V okamžiku, kdy se začal požadovaný protein z kolony vymývat, *· 9« ··*· 99 · • * · · 9 · 9 » « « 9 ♦ · 9 9 9 9·9 9 «99
9 9 ♦ 9 9 9 · 9999 9 · 9 9 · 9 9 9 9 »•99 9» 9» 999 99 »9 což bylo indikováno zvyšující se absorbancí eluátu při 280 nm, byly jímány frakce. Část každé frakce byla poté analyzována pomoci SDSPAGE. Frakce obsahující požadovaný protein byly spojeny, dobře •promíchány*a-byl stanoven,objem takto získané spojené^frakce^a^také koncentrace proteinů v této frakci.
Spojený eluát po HIC, obsahující protein, byl poté ,-zkoncentrován a eluční pufr vyměněn. Běžně byly proteiny zkoncentrovány na 5,0-10,0 mg/ml. Ultrafiltrace byla provedena s použitím ultrafiltračniho zařízení vybaveného kazetovým systémem Pellicon (Millipore, lne., Bedford, MA, USA) s membránami· o vhodné velikosti pórů.
Po zkoncentrování byl vzorek dialyzován (diafiltered) ve vhodnému pufru obsahujícím 0,15 M NaCl a 20 mM NaPO4, pH 7,0, a to tak dlouho, dokud se nelišila vodivost koncentrátu od vodivosti roztoku 0,15 M NaCl a 20 mM NaPO4, pH 7,0 o méně než 5%.
Kromě toho byl koncentrovaný vzorek obsahující proteiny přefiltrován přes filtry Posidyne s velikostí pórů 0,1 pm (Pall, lne.,Cortland, NY, USA). Důvodem bylo odstranění vysráženého materiálu a bakteriálních endotoxinů, které se mohou ve vzorku vyskytovat. Po stanovení koncentrace proteinů v roztoku a na základě požadavku na konečnou koncentraci produktu byl roztok zředěn roztokem 0,15 M NaCl a 20 mM fosforečnanu draselného, pH 7.0.
Závěrém byla provedena sterilizace filtrací přes 0,22 |im filtr.
Konečný produkt byl přenesen do apyrogenní nádoby ke skladování (cca při 5°C) před dalším zpracování.
Příklad 3.: Purifikace ze savčí buněčné kultury
Tento příklad popisuje expresi, izolaci a charakterizaci dvou biologicky aktivních rekombinantních KGF (rKGF), produkovaných v savčím expresním systému.
Lidský gen pro KGF byl izolován pomocí PCR, amplifikací cDNA získané z buněk normálních kožních lidských fibroblastů (Clonetec, lne., Palo AIto, CA, USA). cDNA byla připravena pomocí reverzní «« * » ·· ·· ·· « · · · » · ♦ • · * · » · ·· « · » * · · · • * · * · transkriptázi a poté byla použita PCR k amplifikaci genu pro KGF. OLIGO25 a OLIGO26 byly použity k amplifikaci genu z cDNA a OLIGO27 a OLIGO28 byly pomocí druhé PCR amplifikace použity k vnesení restrikčních„míst HindlII a Bglll na konce fragmentu,^tak.jak je vidět na obrázku 1.
OLIGO#25
OLIGO#26
OLIGO#27
OLIGQ#28 (SEQ ID NO :45) (SEQ ID NO : 46) (SEQ ID N0:47) (SEQ ID NO:48)
5'-CAATCTACAATTCACAGA-3'
5'-TTAAGTTATTGCCATAGG-3’
5'-AACAAAGCTTCTACAATTCACAGATAGGA-3’ 5'-AACAAGATCTTAAGTTATTGCCATAGG-3'
Následovalo klonování a potvrzení sekvence DNA. Poté byl gen pro KGF použit. Amplifikace byla provedena s použitím dvou primerů:
OLIGO#29 (SEQ. ID. N0:49):
5'-CGGTCTAGACCACCATGCACAAATGGATACTGACATGG-3'
OLIGO#30 {SEQ. ID. N0:50):
5'-GCCGTCGACCTATTAAGTTATTGCCATAGGAAG-3'
Primer - OLIGO29 - (sense primer) obsahoval místo Xbal a Kozákovu translační sekvenci (5'-CCACC-3 ') (consensus Kozák translationn sequence) před startovacím kodonem ATG ve směru k 5' konci. Antisence primer - OLIGO30 - obsahoval klonovací místo Sáli a další stop kodon. Po 18 cyklech amplifikace PCR (30 sekund denaturace při 94®C, 40 sekund annealirig při 55°C a 40 sekund elongace při 72°C) byl produkt štěpen Xbal a Sáli a ligován se stejně vyštěpenou DNA z pDSRaa2 (podle metody Bourdrela et al. (1993), Protein Exp. and Purif, 4:130-140 a Lu et al. (1992),
Arch.Biochem.Biophys.298: 150-158). Výsledkem byl plasmid KGF/pDSRa2, v kterém byl lidský gen pro KGF umístěn mezi časný promotor SV40 a α-FSH polyadenylovou sekvenci. Byly vybrány dva klony a analýzou sekvence DNA se potvrdila konstrukce žádaného vektoru.
Dva mikrogramy DNA KGF/pDSRa2 byly poté línearizovány s použitím Pvul. CHO buňky (Chinese hamster ovary cells) byly den před použitím vysety v množství 0,8 x 106 buněk na 60 mm petriho misku. Takto »· ·* ·» ·
4**1 · » · 4 4 · 4 · · · · · · · * · · ·· » « · .· 4 · ··· · *
4*4 · · 4 4 4 4 ««Μ 4» ' · ··· ·· ** připravená vajíčka byla transfekována připravenou DNA s použitím standardní metody vysrážením pomocí vápenatých a fosfátových iontů (Bourdrel et al., viz předchozí text). Po dvou týdnech byly vybrány ujednotlivébkolonie.a přeneseny na 24 jamkové destičky.^Upravená média se po dosažení konfluence považovala za prostá séra- a aliquoty byly analyzovány s využitím Western blotů a s použitím polyklonálního králičího antísera proti lidskému KGF exprimovanému v E-coli.
Western bloty byly provedeny nanesením vzorku na 12,5 % (w/v)
SDS polyakrylamidové gely a následnou elektroforézou;Poté následovalo přenesení proteinů pomocí semidry elektroblotovacího zařízení (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA, USA) na nitrocelulózovou membránu. Přenesení probíhalo jednu hodinu při 400 mA. Jako přenosový pufr byl použit 20 mM Tris, 150 mM glycin a 20% metanol. Nitrocelulózové membrány byly blokovány inkubací v roztoku 101 normálního kozího sera v PBS. Jako primární protilátky bylo použito králičí antiserum připravené proti KGF z E-coli. Protilátky byly ředěny pro použití 1:10000 v normálním kozím séru v PBS a inkubovány 12 hodin při pokojové teplotě s blokovanými nitrocelulózovými membránami. Nenavázané protilátky byly poté odstraněny třemi třicetíminutovými promytími v PBS.
Nitrocelulózové membrány byly poté inkubovány ve 100 ml roztoku 1% normálního kozího séra v PBS obsahujícího sekundární protilátky (Vectastain biotinylované kozí protilátky proti králičímu IgG,
Vector Labs, Burlingame,USA). Inkubace probíhala 30 minut při pokojové teplotě. Následovalo trojnásobné desetiminutové promytí v PBS a poté 30 minutová inkubace při pokojové teplotě s 100 ml roztoku 1% normálního .kozího séra obsahujícího streptavidin a biotinylovanou peroxidázu, připravenou podle návodu výrobce {Vector Labs). Opět následovalo trojnásobné promytí v PBS. Látky křížově reagující s protilátkami proti KGF byly vizualizovány inkubací membrán ve směsi 60 μΐ 30% (hm./obj.) H2O2 ve 100 ml PBS a 50 mg 4chlornaftolu ve 20 ml metanolu. Reakce byla zastavena po 10 minutách opláchnutím membrán ve vodě.
* a · I 9 9 9 · • 9 9 9 9··· 9 999
9 9*9 9 * v 9999 9
9 9 ·· 9 999
9999 9« 99 999 99 ·*
Analýza blotů ukázala, že specifické protilátky proti KGF reagují se třemi zřetelně oddělenými proužky proteinů. Dva z nich byly blízko sebe s molekulovou hmotností okolo 25-29 kDa a jeden měl přibližnou.molekulovou.,hmotnost.. 17_kDa, přičemž,předpokládaná , molekulová hmotnost konečného proteinu o 163 aminokyselinách byla 18,8 kDa. Několik vysoce exprimovaných klonů sekretujících více než 2,0 mg rKGF na litr (jak bylo možné odhadnout z analýzy Western blotů), bylo dále vyčleněno a přeneseno (podle metody Lu, et al., viz předchozí text) do lahví, kde byly pěstovány tak, aby výsledkem bylo velké množství -média bez séra,· vhodného k purifikaciKGF pomocí iontoměničové chromatografie s využitím katexu a následně gelové chromatografie podle postupu popsaného dále.
KGF bylo purifikováno ze třech litrů upraveného bezsérového média tak, že medium bylo- přímo naneseno na iontoměničovou kolonu (5 x 24 cm) naplněnou 450 ml sulfoetyl SP-Sepharosy Fast Flow (Pharmacia), ekvilibrovanou 20 mM fosforečnanem sodným, pH 7,5. Po promytí kolony pětinásobným objemem kolony roztokem 20 mM fosforečnanu sodného, 0,2M NaCl, pH 7,5 byl rKGF vymyt lineárním gradientem od 0,2 do 1,0 M NaCl rozpuštěného v 20 mM fosforečnanu sodném (pH 7,5). Objem použitého roztoku se rovnal dvacetinásobku objemu kolony. Byly sbirány 50 ml frakce a absorbance při 280 nm byla průběžně monitorována. Protein KGF byl detekován analýzou alikvotů každé frakce pomocí SDS-PAGE. SDS-PAGE byla prováděna s použitím elektroforetického systému (Novex, San Diego, CA,' USA) a s použitím předpřipravených 14% Tris-glycin gelů (podle metody Laemliho (1970), Nátuře, 227:680-685). Vzorky byly smíchány s neredukujícím SDS vzorkovým pufrem bez zahřívání před nanášením. Proteiny byly detekovány barvením Coomassie blue nebo barvením stříbrem. Dva píky, které byly eluovány později obsahovaly proteinové proužky odpovídající molekulové hmotnosti 25-29 kDa a proužek o hmotnosti 17 kDa, který byl detekován Western blotem.
Frakce obsahující každý z těchto dvou plků byly separátně koncentrovány na objem menší než 1 ml a poté byly dále děleny gelovou filtrací.
• 1 ·« ♦ · » · ♦ · *» » « · » · « · · · « ♦ » · * * · **· · · ·· « » »»« · · « ·· ♦ · · • * · · · i · * · *»·! *· *« ·«· «· ··
Ke gelové filtraci byly použity kolony Superdexu-75 {HR 10/30, Pharmacia) ekvilibrované PBS o pH 7,2. Kolona byla nakalibrována s použitím následujících známých standardů molekulových vah (BioRad, —**wSan»Francisco,v CA,.*USA) : thyroglobulin <670^ kDa) ,_gama-globulin (158 kDa), ovalbumin (44 kDa), myoglobin (17 kDa) a vitamín B-12 (1,4 kDa). Tyto purifikační kroky vedly k přibližně 2000 násobnému obohacení o rKGF, zvláště o 17 kDa a 30kDa proteiny, jak ukázalo barvení stříbrem.
V případě látky s vyšší molekulovou hmotností, byl rKGF eluován jako-vel-ký symetrický-pík, který byl· nazýván KGF-a. Jestliže bylo pomocí SDS-PAGE analyzováno menší množství látek z této frakce (3pg/linii oproti 6pg/linii)objevily se dva proužky s rozdílem molekulových vah cca l-2kDa. V případě látek s nižší molekulovou váhou, které byly nazývány 'KGF-b, vedla gelová filtrace k přípravě proteinu majícího předpokládanou pohyblivost. Pro oba typy proteinů (KGF-a i KGF-b) byla celková výtěžnost purifikace asi 30-40%.
Dále bylo analyzováno aminokyselinové složení KGF-a i KGF-b. Tyto analýzy byly provedeny na automatickém sekvenátoru (Model 477A nebo 470A, Applied Bíosystm. Inc., Foster City, CA, USA) vybaveném on-line PTH aminoanalyzátorem (Model 120A) a systémem sběru dat (Model 900A)(podle metody Lu et al., (1997), J.Biol Chem., 266: 8102-8107) . Edmanovy sekvenační analýzy KGF-a ukázaly N-terminální sekvenci X^N-D-M-T-P-E-Q-M-A-T-A-V-Xa-Xj-S- (SEQ ID NO:51).
Minoritní sekvence začínající od třetí N-terminální aminokyseliny kyseliny aspartamové - byly přítomny v množství 1,6% celkového sekvenovatelného proteinu. Xl, X2 a X3 nebyly určeny z důvodů nepřítomnosti PTH (phenylthiohydantoinyl) aminokyselinového signálu během sekvenční analýzy.
Je, zajímavé, že analýza sekvence N-terminálového konce KGF-b odhalila sekvenci S-Y-D-Y-M-E-G-G-D-I-R-V- (SEQ ID NO:52), naznačující, že se jedná o formu KGF zkrácenou na N-terminálovém konci, kde byl KGF proteolyticky rozštěpen v peptidové vazbě Arg23Ser24.
K další charakterizaci purifikovaných KGF-a a KGF-b byly proteiny za použití známých, technik vystaveny působení glykosidáz ·♦ ·· .··*· 99 99 • 99 9 « 99 9 99 9
9 9 9999 9 9 ··
99« 9 9 9 9999 9
9 9 9 9 9 999
9999 ·9 *9 999 99 9* (neuraminidáze, O-glycanáze a/nebo N-glykanáze)(Sasaki et al.
(1987), J.Biol.Chem, 262:12059-12076; Takuchi et al. (1988), J.Biol.Chem., 263:3657-3663, Zseboetal. (1990), Cell, 63:195-201). Výsledky-ukazují,--že«KGF-a.,obsahuje N- a O--vázané,cukry,„ačkoliv forma KGF-a s nižší molekulovou hmotností obsahuje pravděpodobně pouze N- vázané cukry. Použití glykosidáz nezpůsobilo snížení molekulové hmotnosti u KGF-b, což naznačuje, že molekula je neglykosilovaná.
Příklad vynálezu č.4
Biologická aktivita
Každý z analogů KGF byl zředěn a měřením příjmu [3h] thymidinu buňkami Balb/MK (podle metody Rubina et al. (1989, viz předchozí text)byla změřena jeho biologická aktivita. Vzorky byly nejdříve naředěny pomocí media složeného z 50% Eagle's MEM média (připraveného na zakázku), 50% F12 taktéž připraveného na zakázku, 5 pg/ml transferrinu, 5 ng/ml seleničitanu sodného, 0,0005% HSA a 0,-005% Tween 20. Vzorky KGF byly poté přidány do 96 jamkových destiček Falcon Primeria, v kterých byly již Balb/MK buňky. Bylo měřeno zabudovávání [3H] thymidinu během syntézy DNA. Tato inkorporace byla poté přepočítána na vliv přirozeného KGF porovnáním se standardní křivkou pro přirozený KGF. Všechna testovaná analoga vykazovala mitogenní aktivitu.
Interakce s receptorem pro KGF byla stanovena s použitím izolovaných receptorových membrán pro KGF připravených z myších epidermálních keratinocytů Balb/MK (byl použit postup popsaný Massague (19932), J.Biol.Chem., 258:13614-13620). Různé formy KGF byly naředěny 50 mM Tris-HCl pufrem o pH 7,5, obsahujícím 0,2% hovězí serumalbumin a to tak,, aby výsledné koncentrace byly od 0,8 ng do 100 ng /50 μΐ. Poté byly individuálně inkubovány s membránovým preparátem (75 ng/ml) a 125I-značeným KGF (1,5 ng) získaným z E-coli. Vazebné a kompetitivní experimenty byly prováděny při 4°C po 16 hodin. Po této době byly vzorky zcentrifugovány a promyty dvakrát výše uvedeným ředícím pufrem tak, aby byl odstraněn nenavázaný a
9« Μ .99 · · ♦ ♦ 9 9 99 • * 9 9 9 9' 9 · 9 · ·
9 9 9 9 9 99 9 9*9
9« 9*9 * 99 ·! I »
9999 9 999
9999 99 99 999 99 99 nespecificky vázaný značený KGF. Poté byla ve vzorcích měřena zbylé radioaktivita.
Kompetitívní křivky pro vazbu na receptor mezi vzorky KGF a značeným KGF byly vyneseny jako procenta nevytěsněné vazby versus koncentrace každého ze vzorků KGF. Kompetiční ťesťy V použitím
- značeného KGF ukázaly, že KGF z E. coli, KGF-a a KGF-b mají podobnou vazebnou aktivitu.
Předkládaný vynález bylvýše popsán obecně i na konkrétních příkladech. Je zřejmé, že odborníci odhalí další obměny a modifikace výše popsaných postupů.
·« ·· φ · φ • · β « · φφφ · φ φ ··«
ΦΦ ·Φ : » · · *
I · ΦΦ
ΦΦ Φ Φ '
Claims (10)
- PATENTOVÉ NÁROKY1, Způsob purifikace keratinocytových růstových faktorů (KGF) vyznačující se tím, že sea) získá roztok obsahující KGFb) naváže KGF v roztoku (krok a) na kationtovýJiontoměničový nosičc) vymyje KGF elučním roztokem z kationtového iontoměničového nosičed) rozdělí eluovaný roztok (krok c) na matrix molekulového vylučovacího síta (gelovou chromatografií)e) opětovně získá KGF z matrix molekulového vylučovacího síta
- 2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se KGF produkuje v prokaryotických buňkách.
- 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se KGF produkuje v E.coli.
- 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se KGF produkuje v savčích buňkách.
- 5. Způsob podle nároku 4,vyznačující se tím, že se KGF produkuje v CHO (Chinese hamster ovary)buňkách.
- 6. Způsob purifikace keratinocytových růstových faktorů (KGF) vyznačujícísetím, žese a, získá roztok obsahující KGFb) naváže KGF v roztoku (krok a) na kationtový iontoměničový nosičc) vymyje KGF elučním roztokem z kationtového iontoměničového nosičed) eluovaný roztok (krok c) rozdělí hydrofobní chromatografiíe) KGF opětovně získá po hydrofobní chromatografií (krok d)
- 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se oxidují volné SH skupiny v KGF6. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se KGF produkuje v prokaryotických buňkách.
- 9. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že se KGF produkuje v E.coli,99 »9 · «»9» »9 ·* » · · 9 9 9» »99·9» 9 « 9 99» 9 99»99 »99 9 «9 9··· »9 9 9 9 9 » 9 9 99999 99 99 999 99 99
- 10. Způsob podle nároku 6, vyznačuj ící produkuje v savčích buňkách.se t í m, že se KGF
- 11. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se KGF produkuje v CHO (Chinese hamster ovary)buňkách.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US32333994A | 1994-10-13 | 1994-10-13 | |
| US08/487,830 US6008328A (en) | 1994-10-13 | 1995-06-07 | Method for purifying keratinocyte growth factors |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ98297A3 true CZ98297A3 (cs) | 1998-08-12 |
Family
ID=26983902
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ97982A CZ98297A3 (cs) | 1994-10-13 | 1995-10-12 | Způsob purifikace keratinocytových růstových faktorů |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0785949B1 (cs) |
| JP (1) | JP3877226B2 (cs) |
| CN (1) | CN1161380C (cs) |
| AT (1) | ATE239038T1 (cs) |
| CA (1) | CA2201762C (cs) |
| CZ (1) | CZ98297A3 (cs) |
| DE (2) | DE122006000019I1 (cs) |
| DK (1) | DK0785949T3 (cs) |
| ES (1) | ES2197926T3 (cs) |
| HU (1) | HU220584B1 (cs) |
| IL (3) | IL147575A (cs) |
| LU (1) | LU91235I2 (cs) |
| NL (1) | NL300229I2 (cs) |
| NO (1) | NO971567L (cs) |
| PT (1) | PT785949E (cs) |
| SI (1) | SI0785949T1 (cs) |
| SK (1) | SK43097A3 (cs) |
| WO (1) | WO1996011952A1 (cs) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6693077B1 (en) | 1995-02-14 | 2004-02-17 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 |
| US6077692A (en) * | 1995-02-14 | 2000-06-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 |
| US7232667B2 (en) | 1995-02-14 | 2007-06-19 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 polynucleotides |
| US6743422B1 (en) | 1996-10-15 | 2004-06-01 | Amgen, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 products |
| US6869927B1 (en) | 1997-12-22 | 2005-03-22 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 formulations |
| CA2316015A1 (en) | 1997-12-22 | 1999-07-01 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 formulations |
| CN1491231A (zh) * | 2001-02-06 | 2004-04-21 | Ĭ��ר������˾ | 免疫原性减弱的经修饰角质形成细胞生长因子(kgf) |
| US7265089B2 (en) | 2001-08-21 | 2007-09-04 | Chiron Corporation | KGF polypeptide compositions |
| CN102242124B (zh) * | 2010-05-10 | 2013-05-22 | 齐鲁制药有限公司 | 改造的角化细胞生长因子基因及其在酵母中的表达 |
| CN102675449B (zh) * | 2011-03-17 | 2016-06-08 | 重庆富进生物医药有限公司 | 缺失型人角质细胞生长因子-ⅰ二硫键变构体及其用途 |
| CN109402130A (zh) * | 2018-11-23 | 2019-03-01 | 成都中医药大学附属医院 | 一种重组人角质细胞生长因子-1及其制备方法和用途 |
| CN110183529B (zh) * | 2019-05-23 | 2023-06-02 | 重庆派金生物科技有限公司 | 一种缺失型人角质细胞生长因子-1的重组制备方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0555205B1 (en) * | 1989-01-31 | 2000-11-29 | RUBIN, Jeffrey S | Dna encoding a growth factor specific for epithelial cells |
| JPH06503962A (ja) * | 1990-12-18 | 1994-05-12 | アムジエン・インコーポレーテツド | 増強された安定性及び生物学的活性を有する酸性線維芽細胞成長因子の類似体 |
| PT706563E (pt) * | 1993-06-29 | 2005-01-31 | Chiron Corp | Factor de crescimento de queratinocitos (kgf) truncado, com actividade biologica aumentada |
| WO1995008630A1 (en) * | 1993-09-24 | 1995-03-30 | American Cyanamid Company | Surface loop structural analogues of fibroblast growth factors |
| WO1996022369A1 (en) * | 1994-10-13 | 1996-07-25 | Amgen Inc. | Analogs of acidic fibroblast growth factor having enhanced stability and biological activity |
| CA2202390C (en) * | 1994-10-13 | 2005-05-17 | Bao-Lu Chen | Keratinocyte growth factor analogs |
| CA2202075C (en) * | 1994-10-13 | 2003-12-09 | Charles F. Morris | Analogs of keratinocyte growth factor, nucleic acids encoding such analogs, processes of making and methods of using |
-
1995
- 1995-10-12 ES ES95936309T patent/ES2197926T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-12 CA CA002201762A patent/CA2201762C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-12 AT AT95936309T patent/ATE239038T1/de active
- 1995-10-12 CZ CZ97982A patent/CZ98297A3/cs unknown
- 1995-10-12 SK SK430-97A patent/SK43097A3/sk unknown
- 1995-10-12 IL IL14757595A patent/IL147575A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-10-12 IL IL11560595A patent/IL115605A/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-10-12 WO PCT/US1995/013099 patent/WO1996011952A1/en active IP Right Grant
- 1995-10-12 EP EP95936309A patent/EP0785949B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-12 DE DE1995630599 patent/DE122006000019I1/de active Pending
- 1995-10-12 DE DE69530599T patent/DE69530599T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-12 CN CNB951967959A patent/CN1161380C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-12 EP EP02028624A patent/EP1334981B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-12 JP JP51337696A patent/JP3877226B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-12 SI SI9530657T patent/SI0785949T1/xx unknown
- 1995-10-12 PT PT95936309T patent/PT785949E/pt unknown
- 1995-10-12 HU HU9701514A patent/HU220584B1/hu unknown
- 1995-10-12 DK DK95936309T patent/DK0785949T3/da active
-
1997
- 1997-04-04 NO NO971567A patent/NO971567L/no unknown
-
2002
- 2002-01-10 IL IL14757502A patent/IL147575A0/xx active IP Right Grant
-
2006
- 2006-04-11 NL NL300229C patent/NL300229I2/nl unknown
- 2006-04-12 LU LU91235C patent/LU91235I2/fr unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2202075C (en) | Analogs of keratinocyte growth factor, nucleic acids encoding such analogs, processes of making and methods of using | |
| KR100205078B1 (ko) | 염기성 섬유 아세포 성장인자 및 이의 생산방법 | |
| AU638402B2 (en) | Analogs of fibroblast growth factor | |
| JPH0763378B2 (ja) | ＴＧＦ−βをコードしているＤＮＡ | |
| CZ98297A3 (cs) | Způsob purifikace keratinocytových růstových faktorů | |
| WO1993003757A1 (en) | Muteins of epidermal growth factor exhibiting enhanced binding at low ph | |
| CA2202390C (en) | Keratinocyte growth factor analogs | |
| JP2010213699A (ja) | 組換えヒトエリスロポイエチンを発現する宿主細胞 | |
| JP2002509691A (ja) | 生物学的活性が改変された組換えタンパク質多量体の製造及び使用 | |
| US6008328A (en) | Method for purifying keratinocyte growth factors | |
| US6531134B1 (en) | Mammalian milk growth factor | |
| AU709362C (en) | Method for purifying keratinocyte growth factors | |
| AU730935C (en) | Bovine milk growth factor | |
| MXPA97002481A (en) | Method for the purification of growth factors of queratinoci | |
| AU2813399A (en) | Analogs of keratinocyte growth factor, nucleic acids encoding such analogs, processes of making and methods of using | |
| AU5068502A (en) | Analogs of keratinocyte growth factor | |
| PL184188B1 (pl) | Sposób stymulacji produkcji niefibroblastowych komórek nabłonkowych | |
| JPH06279497A (ja) | トロンビン結合性物質及びその製造法 |