JPH10507452A - ケラチノサイト成長因子の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明はケラチノサイト成長因子の精製に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ケラチノサイト成長因子の精製法 発明の分野 本発明は、タンパク質精製の分野に関する。特に、本発明は、ケラチノサイト 成長因子の精製の分野に関する。 発明の背景 ポリペプチド成長因子は、細胞間の連絡の重用な媒介物である（ルビン（Ｒｕ ｂｉｎ）ら，（１９８９年），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，８６巻：８０２〜８０６頁）。これらの分子は通常一つの細胞型から放出され 、他の細胞型の増殖に影響を与えるように作用する。 生長因子の一つのファミリーは、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）である。現在 のところ一次構造間に関係を有する８つのＦＧＦファミリーメンバーが知られて いる：塩基性線維芽細胞成長因子、ｂＦＧＦ（アブラハム（Ａｂｒａｈａｍ）ら ，（１９８６年）、ＥＭＢＯ Ｊ．，５巻：２５２３〜２５２８頁）；酸性線維 芽細胞成長因子、ａＦＧＦ（ジェイェ（Ｊａｙｅ）ら，（１９８６年）、Ｓｃｉ ｅｎｃｅ．，２３３巻：５４１〜５４５頁）；ｉｎｔ−２遺伝子産物、ｉｎｔ− ２ （ディクソン（Ｄｉｃｋｓｏｎ）およびピーター（Ｐｅｔｅｒｓ），（１９８７ 年）、Ｎａｔｕｒｅ，３２６巻：８３３頁）；ｈｓｔ／ｋＦＧＦ（デリーボビ（ Ｄｅｌｌｉ−Ｂｏｖｉ）ら，（１９８７年），Ｃｅｌｌ，５０巻：７２９〜７３ ７頁およびヨシダ(Ｙｏｓｈｉｄａ)ら，(１９８７年)，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４巻：７３０５〜７３０９頁）；ＦＧＦ−５（ツア ン（Ｚｈａｎ）ら，（１９８８年），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８巻：３ ４８７〜３４９５頁）；ＦＧＦ−６（マリクス(Ｍａｒｉｃｓ)ら，（１９８９年 ），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．，４巻：３３５〜３４０頁）；ケラチノサイト成長因子 （フィンチ(Ｆｉｎｃｈ)ら，（１９８９年），Ｓｃｉｅｎｃｅ．，２４巻：７５ ２〜７５５頁）；ルビン（Ｒｕｂｉｎ）ら，（１９８９年），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６巻：８０２〜８０６頁；ロン（Ｒｏｎ）ら ，（１９９３年），ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｔ ｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ)， ２６８（４）巻：２９８４〜２９８８頁：およびヤン（Ｙａｎ）ら，（１９９１ 年），Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ． Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２７Ａ巻：４３７〜４３８頁；およびヒサクトフィリン（ ハバッツェトゥル(Ｈａｂａｚｚｅｔｔｌ)ら，（１９９２），Ｎａｔｕｒｅ，３ ５９巻：855〜858頁）。 タンパク質のＦＧＦファミリー中、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）は、間 葉組織から誘導される非線維芽細胞上皮（特に、ケラチノサイト）細胞増殖の独 自のエフェクターである。 「天然ＫＧＦ」という用語は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列により示 される天然ヒト（ｈＫＧＦ）または組み換え（ｒＫＧＦ）ポリペプチド（シグナ ル配列を有するまたは有さない）あるいはその対立遺伝子変異体を意味する。［ 特記しない限り、本明細書に記載の分子のアミノ酸番号は、配列番号：２のアミ ノ酸３２〜１９４により示される天然分子の成熟型（すなわち、シグナル配列が ない）について示されるものに対応する。］ 天然ＫＧＦは、天然源から単離することができる。例えば、ｈＫＧＦを胚性肺 線維芽細胞系によるならし培地から単離することができる（ルビン（Ｒｕｂｉｎ ）ら，（１９８９年），前記）。精製されたｈＫＧＦ製剤を得るために、三つの クロマトグラフィー工程、すなわちヘパリン−セファロース（Ｓｅｐｈ ａｒｏｓｅ^TM）（ニュージャージー州ピスキャットアウェイ在ファーマシア社（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製）アフィニティクロマトグラフィー、ＨＰＬＣゲル濾過 、および逆相ＨＰＬＣが用いられた。ならし培地１０リッターからｈＫＧＦ約６ ｍｇが得られ、これらのクロマトグラフィー工程によって、有糸分裂活性アッセ イを基に０．８％の全ｈＫＧＦしか回収されなかった。さらなる例は、バクテリ ア中で生成されたｒＫＧＦを単離するためにヘパリン−セファロース（Ｓｅｐｈ ａｒｏｓｅ^TM）アフィニティおよびモノ−エス（Ｍｏｎｏ−Ｓ^TM）イオン交換ク ロマトグラフィー（ニュージャージー州ピスキャットアウェイ在ファーマシア社 （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製）を用いる別のクロマトグラフィー工程を用いること を教示している。（ロン（Ｒｏｎ）ら，（１９９３年），ザ・ジャーナル・オブ ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏ ｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２６８巻：２９８４〜２９８８頁）。 ケラチノサイト成長因子の特性は、上皮細胞成長の特異的刺激を促進するため の薬剤としてのその可能な用途を示している。従って、包括的インビトロおよび インビボ生物学的評価および 可能性のある治療用途に充分な量の材料を提供するために、均質のケラチノサイ ト成長因子を比較的高レベルで得るための方法を開発することが望ましい。 本発明の目的はケラチノサイト成長因子を精製するための新規方法を提供する ことにある。 発明の概要 本発明は、 （ａ）ＫＧＦを含む溶液を得る工程、 （ｂ）工程（ａ）の溶液からのＫＧＦをカチオン交換樹脂に結合させる工程、 （ｃ）カチオン交換樹脂からＫＧＦを溶離溶液中に溶離する工程、 （ｄ）工程（ｃ）からの溶離溶液を分子量排除マトリックスを通過させる工程 、および （ｅ）分子量排除マトリックスからＫＧＦを回収する工程 を含んでなる、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）を精製するための第１の方法 に関する。 本発明は、さらに、 （ａ）ＫＧＦを含む溶液を得る工程、 （ｂ）工程（ａ）の溶液からのＫＧＦをカチオン交換樹脂に結合させる工程、 （ｃ）カチオン交換樹脂からＫＧＦを溶離溶液中に溶離する工程、 （ｄ）工程（ｃ）の溶離溶液に疎水性相互作用クロマトグラフィーを行う工程 、および （ｅ）工程（ｄ）の疎水性相互作用クロマトグラフィー段階からＫＧＦを回収 する工程 を含んでなる、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）を精製するための第２の方法 に関する。 通常、第１および第２の方法のカチオン交換クロマトグラフィー段階は、適当 な緩衝液（例えば、リン酸塩緩衝塩水、酢酸ナトリウムまたはｔｒｉｓ−ＨＣｌ ）を用いて好ましくは６．８〜７．５のｐＨで行うことができる。この段階で用 いるための適当なカラムは、カルボキシメシルセルロース、カルボキシメチルア ガロースおよび硫酸アガロースおよびセルロースカラムを含む（例えば、ニュー ジャージー州ピスキャットアウェイ在ファーマシア社製エス−セファロース・フ ァースト・フロー（Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ^TM）樹脂、 モノ−エス（Ｍｏｎｏ−Ｓ^TM）樹脂およびシーエム−セルロース（ＣＭ−ｃｅｌ ｌｕｌｏｓｅ^TM）樹脂）。流速はカラム寸法に依存して変化し得る。 第１の方法のゲル濾過段階は、任意の好適な緩衝液（例えば、リン酸塩緩衝塩 水）中において好ましくは約７．０〜７．５のｐＨで行うことができる。この段 階で用いるための適当なカラムは、アガロース系、アクリルアミド系、シリカ系 またはポリマー系のサイズ排除カラムを含む（例えば、ファーマシア社製セファ デックス ジ−７５（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５^TM）樹脂およびスーパーデッ クス−７５（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５^TM）樹脂）。 第２の方法の特に好ましい態様において、以下に記述するように疎水性相互作 用段階の前に遊離スルフヒドリル基を酸化することができる。任意の酸化方法を 用いることができる。例えば、タンパク質を大気の酸素に適当な期間晒してもよ い。また、種々の酸化手順を用いてもよい。一つのそのような手順は、１以上の システイン残基が、天然のＫＧＦ分子と比較して除去または置換されているケラ チノサイト成長因子に特に好適である。この手順において、酸化剤（例えば、シ スタミンジヒドロクロ ライドまたは別の適当な酸化剤、例えばシスチン、酸化型グルタチオンまたは２ 価銅）を最終濃度まで添加することができ、ｐＨが好ましくは約７〜９．５に調 節され、シスタミンジヒドロクロライドを用いる場合９．０±０．３のｐＨがよ り好ましく、温度は好ましくは約１０〜３０℃に適当な期間保持される。第２の 手順は、天然ＫＧＦ、およびシステイン残基の同等のパターンを有する他のケラ チノサイト成長因子を酸化するために用いることができる。この手順において、 酸化は、適当な量のイオン強度調整剤（例えば（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄）を添加するこ とにより達成することができ、ｐＨが好ましくは約７．５〜９．５に調節され、 温度が好ましくは約２３±５℃に適当な期間保持される。 第２の方法の疎水性相互作用段階は、任意の適当な緩衝液(例えばリン酸ナト リウム)を好ましくは約６．０〜８．０、より好ましくは約７．０のｐＨで用い 、および２〜０Ｍの範囲の減少濃度の直線的（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄グラジエントで溶 離することにより行うことができる。この段階で用いるための好適なカラムは、 アルキルまたはフェニル置換樹脂を含む（例えば、ペンシルバニア州モントゴメ リービル在トーソハース社（Ｔｏｓｏ ｈａａｓ，Ｉｎｃ．）から市販されているブチル−６５０Ｍトヨパール（Ｂｕｔ ｙｌ−６５０Ｍ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ^TM）樹脂のカラム、およびファーマシア社 （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から市販されているフェニルセファロース（ｐｈｅｎｙ ｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^TM）樹脂およびフェニルスーパーローズ（ｐｈｅｎｙｌ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ^TM）樹脂のカラム）を含む。 本発明の方法は、ＫＧＦの精製に用いることができる。すなわち、この明細書 で用いられる「ケラチノサイト成長因子」および「ＫＧＦ」という用語は、天然 ＫＧＦのペプチド配列と実質的に同じペプチド配列により、および天然ＫＧＦの 生物学的活性の全てまたは一部、特に非線維芽細胞上皮細胞増殖（例えば、ＮＩ Ｈ／３Ｔ３線維芽細胞よりも少なくとも約５００倍大きいＢＡＬＢ／ＭＫケラチ ノサイト細胞の刺激、およびＢＳ／５８９上皮細胞またはＣＣ１２０８上皮細胞 に対するより少なくとも約５００倍大きいＢＡＬＢ／ＭＫケラチノサイト細胞の 刺激（Ｈ−チミジンの組み込みにより決められる。）を示す。）を保持すること により特徴付けられるＫＧＦ類似タンパク質（または「ムテイン」）と天然ＫＧ Ｆとを、特記しない限り交換可能に含むまたは意味するものと解すべきである。 「天然Ｋ ＧＦのペプチド配列と実質的に同じペプチド配列により特徴付けられる」という 表現は、好ましくはストリンジエントハイブリダイゼーション条件下に、配列番 号：１のヌクレオチド２０１〜６８４にハイブリダイズすることのできるＤＮＡ 配列によりコードされるペプチド配列を意味する。 二つのアミノ酸配列間の対応するアミノ酸の位置は、アミノおよび／またはカ ルボキシル末端の移動、必用に応じてのギャップの導入および／または候補物質 中に挿入体として存在する残基の欠失を含む残基を最大にマッチさせるように二 つの配列を整列させることにより決定される。データベース検索、配列解析およ び処理は、一つのよく知られた日常的に用いられる配列相同性／同一性走査アル ゴリズムプログラムを用いて行われる（例えば、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）お よびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ ．Ｓ．Ａ．，８５巻：２４４４〜２４４８頁；アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕ ｌ）ら，（１９９０年），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５巻：４０３〜４１０ ；リップマン（Ｌｉｐｍａｎ）およびピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ），（１９８５ 年），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２巻：１４３５頁ま たはデベロークス（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）ら，（１９８４年），Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ ｓ．Ｒｅｓ．，１２巻：３８７〜３９５）。 ハイブリダイゼーションに関するストリンジェント条件は、塩、温度、有機溶 媒、およびハイブリダイゼーション化反応において典型的に制御される他のパラ メーターの組み合わされたストリンジエント条件である。例示としてのストリン ジェントハイブリダイゼーション条件は、６２〜６７℃で４ × ＳＳＣでのハ イブリダイゼーション化、およびその後の約１時間６２〜６７℃で０．１ × ＳＳＣでの洗浄である。または、例示としてのストリンジェントハイブリダイゼ ーション条件は、４５〜５５％のホルムアミド中、４０〜４５℃での４ × Ｓ ＳＣでのハイブリダイゼーションである。[マニアティス(Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ )ら，モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（実 験室マニュアル）；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２年），３８７ 〜３８９頁]。 すなわち、タンパタ質は、対立遺伝子の変異、または、天然 型ＫＧＦのフラグメント、キメラもしくはハイブリッド分子を含むアミノ酸の欠 失、置換または挿入を含む。ＫＧＦの一つの例は、親分子と比較して向上した安 定性を有する分子が得られるように、配列番号：２のＣｙｓ¹およびＣｙｓ¹⁵が 置換又は欠失された対応する残基を有するタンパク質を含む（１９９５年７月７ 日に出願された同一所有者の米国特許出願第０８／４８７，８２５号に教示）。 ＫＧＦのもう一つの例は、天然型ＫＧＦのアミノ酸残基４１〜１５４（好ましく は、Ａｒｇ⁴¹、Ｇｌｎ⁴³、Ｌｙｓ⁵⁵，Ｌｙｓ⁹⁵、Ｌｙｓ¹²⁸、Ａｓｎ¹³⁷、Ｇｌｎ¹³⁸ 、Ｌｙｓ¹³⁹、Ａｒｇ¹⁴⁴、Ｌｙｓ¹⁴⁷、Ｇｌｎ¹⁵²、Ｌｙｓ¹⁵³またはＴｈｒ^{15 4} ）の一つ以上が、タンパク質の陽電荷を減少させるように選択された電気的に 陰性の残基または中性の残基で置換されるかまたは欠失された、電荷を変化させ たポリペプチドを含む（１９９４年１０月１３日に出願された同一所有者の米国 特許出願第０８／３２３，３３７号に教示）。ＫＧＦのさらなる例は、天然型Ｋ ＧＦのＡｓｎ¹¹⁵−Ｈｉｓ¹¹⁶−Ｔｙｒ¹¹⁷−Ａｓｎ¹¹⁸−Ｔｈｒ¹¹⁹のループ形成 領域内の少なくとも一つのアミノ酸を、高いループ形成能を有する少なくとも一 つのアミノ酸で置 換することにより生じるタンパク質を含む（1994年10月13日に出願された同一所 有者の米国特許出願第 08/323,473に教示）。さらなる例は、天然型ＫＧＦの１ ２３〜１３３（配列番号：２のアミノ酸１５４〜１６４）の領域内における一つ 以上のアミノ酸置換、欠失または付加を有するタンパク質を含み、これらのタン パク質は作働活性または拮抗活性を有する。 具体的に記載されたタンパク質は、以下のＫＧＦ分子を含む（配列番号：２に 示される成熟型タンパタ質（シグナル配列がない）中の位置に認められる残基、 その後丸括弧内にアミノ酸の位置、その後に、置換された基かまたは欠失を示す 「−」により示される）：Ｃ（１，１５）Ｓ、ΔＮ１５−ΔＮ２４、ΔＮ３／Ｃ （１５）Ｓ、ΔＮ３／Ｃ（１５）−、ΔＮ８／Ｃ（１５）Ｓ、ΔＮ８／Ｃ（１５ ）−、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ 、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑ、Ｃ（１，１５，４０）Ｓ、Ｃ（１，１５，１０２ ）Ｓ、Ｃ（１，１５，１０２，１０６）Ｓ、ΔＮ２３／Ｎ（１３７）Ｅ、ΔＮ２ ３／Ｋ（１３９）Ｅ、ΔＮ２３／Ｋ（１３９）Ｑ、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ａ、 ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｅ、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｌ、ΔＮ２３／Ｋ（１４７ ）Ｅ、ΔＮ ２３／Ｋ（１４７）Ｑ、ΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｅ、ΔＮ２３／Ｋ（１５３）Ｑ 、ΔＮ２３／Ｑ（１５２）Ｅ／Ｋ（１５３）Ｅ；Ｒ（１４４）ＱおよびＨ（１１ ６）Ｇ。 当業者が同様に考えるような、ＫＧＦタンパク質コード配列を発現するために 種々の宿主ベクター系を利用することができる。これらは、限定されないが、ウ イルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等）に感染される哺乳動 物細胞系のような真核生物細胞系；ウイルス（例えばバキュロウイルス）に感染 される昆虫細胞系；酵母含有酵母ベクターのような微生物；または、バクテリオ ファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡで形質転換されたバク テリアのような原核生物細胞系を含む。これらのベクターの発現要素は、強度お よび特異性が変化する。利用される宿主ベクター系に依存して、多くの適当な転 写および翻訳要素の任意の一つを用いることができる。 ＫＧＦ発現のタンパク質生成物を一旦単離し、精製し、ＫＧＦ活性を（当業者 に知られている手順を用いて）アッセイすると、それは種々の医薬組成物に調製 することができる。典型的に、そのような組成物は、適当な、通常化学的に規定 され た、治療薬のためのキャリアまたは賦形剤、および意図する投与形態により、他 の成分も含む。組成物は、水性キャリアを含むことができる、またはコラーゲン 、ヒアルロン酸および種々のポリマーのような非水性キャリア中にＫＧＦが組み 込まれた固相製剤からなることができる。組成物は、注射、経口、局所的、鼻腔 内および肺投与を含む種々の方法で投与されるように調製することができる。 図面の簡単な説明 図１は、天然型ＫＧＦのヌクレオチド（配列番号：１）およびアミノ酸（配列 番号：２）配列を示す（成熟型天然ＫＧＦをコードするヌクレオチドは配列番号 ：１の塩基２０１〜６８４により示され、成熟型ＫＧＦは配列番号：２のアミノ 酸残基３２〜１９４により示される。）。 図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、それぞれｐＣＦＭ１１５６、ｐＣＦＭ１６５６お よびｐＣＦＭ３１０２のプラスミドマップを示す。 図３は、構築物ＲＳＨ−ＫＧＦのヌクレオチド（配列番号：３）およびアミノ 酸（配列番号：４）配列を示す。 図４は、プラスミドＫＧＦに含まれる構築物のヌクレオチド （配列番号：５）およびアミノ酸（配列番号：６）配列を示す。 図５は、構築物を含有するプラスミドＫＧＦ中のＫｐｎＩ部位（配列番号：６ のアミノ酸位置４６〜８５）をＫｐｎＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間のＤＮＡ配 列で置換してプラスミドＫＧＦ（ｄｓｄ）中に構築物を形成するのに用いられる 化学的に合成されたＯＬＩＧＯ（ＯＬＩＧＯ＃６〜ＯＬＩＧＯ＃１１；それぞれ 配列番号：１２〜１７）を示す。 図６は、ＫＧＦ（最適化コドン）を構築するのに用いられる化学的に合成され たＯＬＩＧＯ（ＯＬＩＧＯ＃１２〜ＯＬＩＧＯ＃２４；それぞれ配列番号：１８ 〜３０）を示す。 図７は、Ｃ（１，１５）Ｓ、すなわち天然型ＫＧＦのアミノ酸位置１および１ ５のシステインがセリンに置換されたＫＧＦ類似体のアミノ酸配列（配列番号： ３２）およびヌクレオチド配列（配列番号：３１）を示す。 図８は、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１１４）Ｅ、すなわち天然型ＫＧＦのアミノ 酸位置１４４のアルギニンがグルタミン酸に置換され、アミノ酸位置１および１ ５のシステインがともにセリンに置換されたＫＧＦ類似体のアミノ酸配列（配列 番号：３４）およびヌクレオチド配列（配列番号：３３）を示す。 図９は、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１１４）Ｑ、すなわち天然型ＫＧＦのアミノ 酸位置１４４のアルギニンがグルタミンに置換され、アミノ酸位置１および１５ のシステインがともにセリンに置換されたＫＧＦ類似体のアミノ酸配列（配列番 号：３６）およびヌクレオチド配列（配列番号：３５）を示す。 図１０は、ΔＮ１５、すなわち天然型ＫＧＦのＮ−末端の最初の１５アミノ酸 が欠失したＫＧＦ類似体のアミノ酸配列（配列番号：３８）およびヌクレオチド 配列（配列番号：３７）を示す。 図１１は、ΔＮ２３、すなわち天然型ＫＧＦのＮ−末端の最初の２３アミノ酸 が欠失したＫＧＦ類似体のアミノ酸配列（配列番号：４０）およびヌクレオチド 配列（配列番号：３９）を示す。 図１２は、ΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑ、すなわち天然型ＫＧＦのアミノ酸位置 １４４のアルギニンがグルタミンに置換され、Ｎ−末端の最初の２３アミノ酸が 欠失したＫＧＦ類似体のアミノ酸配列（配列番号：４２）およびヌクレオチド配 列（配列番号：４１）を示す。 特定態様の説明 以下の実施例に記載の多くの手順または適当な別の手順のための標準的方法が 、例えば、モレキュラークローニング(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ), 第２版，サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら，コールド・スプリング・ハーバ ー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），（１９８７年）およびカレント・プロトコールズ ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），アウサベル（Ａｕｓａｂｅｌ） ら,グリーネ・パブリッシング・アソシエーツ(Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉ ｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）／ウィリーインターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉ ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ），ニューヨーク（１９９０年）のような分子生物学の 広く認められているマニュアルに提供されている。実施例１ ＫＧＦおよびＫＧＦ類似体をコードするＤＮＡの調製 全長ヒトＫＧＦ遺伝子（天然型ＫＧＦの配列をもつポリペプチドをコードする ）のクローニングを、動物細胞からのＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） および化学的に合成した(Ｅ． ｃｏｌｉ優先コドン)オリゴヌクレオチド（「ＯＬＩＧＯ」）のＰＣＲの両方に より行った。これらの両方の手順を以下に記載する。 上記ポリペプチドを生成することが知られている細胞から単離したＲＮＡを用 いてＰＣＲ増幅を行った。まず、ヒト線維芽細胞系ＡＧ１５２３Ａ（ニュージャ ージー州カムデン在ヒューマン・ジェネティック・ミュータント・セル・カルチ ャー・レポジトリー・インスティチュート・フォア・メディカル・リサーチ（Ｈ ｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｕｔａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｒｅｐ ｏｓｉｔｏｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ）から得られる）からの細胞をチオシアン酸グアニジンで分解し、次に抽出 した（コミジンスキー（Ｃｈｏｍｙｚｉｎｓｋｉ）ら，（１９８７年版），Ａｎ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７２巻：１５６頁）。全ＲＮＡ用標準的逆転写酵素 プロトコールを用いて、ＫＧＦｃＤＮＡを生成させた。ＫＧＦ遺伝子の５’およ び３’の直のところのＤＮＡ配列をコードするプライマーＯＬＩＧＯ＃１および ＯＬＩＧＯ＃２ならびに鋳型としてのＫＧＦ ｃＤＮＡを用いて、ＫＧＦ遺伝子 のＰＣＲ（ＰＣＲ＃１）増幅を行った［モ デル９６００サーモサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）（コネチカット州 ノーウォーク在パーキンエルマー・セタス社（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅ ｔｕｓ）製;２８サイクル；各サイクルは変性のために９４℃で１分、アニーリ ングのために６０℃で２分、および伸長のために７２℃で３分からなる］。次に 、アニーリング温度が５０℃である以外は前述と同じサイクル条件で第２のＫＧ Ｆ ＰＣＲ（ＰＣＲ＃２）増幅のための鋳型として少量のＰＣＲ＃１産物を用い た。ＫＧＦ遺伝子の発現クローニングのために、ＫＧＦ遺伝子の両末端に都合の よい制限部位を形成するためにネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲプライマーを 用いた。ＯＬＩＧＯ＃３およびＯＬＩＧＯ＃４を使用して、ＰＣＲ＃２からのＫ ＧＦ ＤＮＡ産物を改変して、遺伝子の５’および３’末端にそれぞれＭｌｕＩ およびＢａｍＨＩ制限部位を含ませた［ＰＣＲ＃３：３０サイクル；各サイクル は変性のために９４℃で１分、アニーリングのために６０℃で２分、および伸長 のために７２℃で３分からなる］。次に、このＤＮＡをＭｌｕＩおよびＢａｍＨ Ｉで切断し、フェノールで抽出し、エタノールで沈殿させた。それを次に再懸濁 させ、「ＲＳＨ」シグナル配列を含むｐＣＦＭ１１５６プラス ミド（図２Ａ）内に（Ｔ４リガーゼを用いて）結合させて構築物ＲＳＨ−ＫＧＦ をつくった（図３）。連結生成物をＥ．ｃｏｌｉ株ＦＭ５（ＡＴＣＣ：５３９１ １）に（ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）（１９８３），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， １６６巻：５５７頁の方法により）形質転換し、ＬＢ＋カナマイシン上に２８℃ でプレーティングした。幾つかの形質転換株を選択し、カナマイシン２０μｇ／ ｍｌを含む少量の液状培地中で成長させた。各培養細胞からＲＳＨ−ＫＧＦプラ スミドを単離し、ＤＮＡ配列決定した。ＫＧＦ遺伝子中の内部ＮｄｅＩ部位のた めに、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩの括弧内の制限部位を有する所望の発現ベクタ ー内に天然型遺伝子配列を直接クローニングすることはできなかった。これは、 ３通り結合（ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ）として達成された。Ｂｓ ｍＩおよびＳｓｔＩの各単一の制限部位でプラスミドＲＳＨ−ＫＧＦを切断し、 １％アガロースゲル電気泳動により〜３ｋｂｐ ＤＮＡフラグメント（ＫＧＦ遺 伝子の３’末端を含む）を単離した。ＯＬＩＧＯ＃３をＯＬＩＧＯ＃５で置換す る以外はＰＣＲ＃３について記載したようにＰＣＲ（ＰＣＲ＃４）を行った。次 に、ＰＣＲ ＤＮＡ産物を、ＮｄｅＩおよびＢｓｍＩで切断し、４％ アガロースゲル電気泳動により３１１ ｂｐ ＤＮＡフラグメントを単離した。 結合で使用した第３のフラグメントを、１％アガロースゲル電気泳動により単離 したＮｄｅＩおよびＳｓｔＩで切断されたｐＣＦＭ１１５６の１．８ ｋｂｐ ＤＮＡフラグメントであった。前述のような結合（Ｔ４リガーゼ）、形質転換、 カナマイシン選択およびＤＮＡ配列の後に、図４の構築物を含みＫＧＦとして示 されるプラスミドを含むクローンを得た。切頭型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）産物を 生成する内部リボソーム結合部位のために、単一のＫｐｎＩ部位とＥｃｏＲＩ部 位との間のＫＧＦ ＤＮＡ配列を、化学的に合成されたＯＬＩＧＯ（ＯＬＩＧＯ ＃６〜ＯＬＩＧＯ＃１１）で置換して内部側開始部位の使用を最小化した（図５ ）。 ＯＬＩＧＯをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、次に熱変性した。 次に、温度をゆっくりと室温まで低下させることにより１本鎖（ｓｓ）ＯＬＩＧ Ｏから二本鎖（ｄｓ） ＤＮＡを形成した。次に、ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで 切断したＫＧＦプラスミドに、内部ＯＬＩＧＯ付着末端および全ｄｓＯＬＩＧＯ フラグメントの両方をＴ４リガーゼを用いて共有結合させた。新規のプラスミド をＫＧＦ（ｄｓｄ）と称した。 化学的に合成したＯＬＩＧＯ＃１２〜２４のＰＣＲ増幅により完全にＥ．ｃｏ ｌｉコドンに最適化したＫＧＦ遺伝子を構築した。 天然型ＫＧＦをコードする全ＤＮＡ配列が「ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）」また は「クリック（Ｃｒｉｃｋ）」ストランドからのＯＬＩＧＯにより表され、ＰＣ Ｒ増幅時に所望の２本鎖ＤＮＡ配列を形成するようにＯＬＩＧＯ＃１２〜２４を 設計した（図６）［ＰＣＲ＃５，モデル９６００サーモサイクラー（Ｔｈｅｒｍ ｏｃｙｃｌｅｒ）（パーキンエルマー・セタス社（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）製）；２１サイクル；各サイクルは変性のために９４℃で３１秒、 アニーリン グのために５０℃で３１秒、および伸長のために７３℃で３１秒からなり、２１ サイクルの後、最終伸長段階を７分行ってＰＣＲを終了した。］。ＰＣＲ増幅後 、ＤＮＡフラグメントをＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、同じ酵素で切断し た発現プラスミドｐＣＦＭ１１５６中に５２１ ｂｐフラグメントを結合した。 ＰＣＲ＃５は、結合のために、ＯＬＩＧＯ＃２０〜ＯＬＩＧＯ＃２４をバンド補 助オリゴ（ｂａｎｄ−ａｉｄ ｏｌｇｏｓ）として用いる（ジャヤラマン（Ｊａ ｙａｒａｍａｎ）ら，（１９９２），バイオテクニークス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ ｑｕｅｓ），１２巻：３９２頁）ＯＬＩＧＯ＃１４〜＃１９（ＯＬＩＧＯ＃１５ 〜＃１８はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化された）の（Ｔ４リガ ーゼによる）結合により誘導されるＫＧＦ鋳型１μｌ／１００μｌ ｒｘｎ、お よび外側プラィマー（１００ｐｍｏｌｅｓ／１００μｌ ｒｘｎ）ＯＬＩＧＯｓ ＃１２およびＯＬＩＧＯ＃１３を利用した。最終的構造物をＫＧＦ（最適化コド ン）と呼ぶ。 本明細書に記載のＫＧＦ類似体の全てが、ＫＧＦ（ｄｓｄ）またはＫＧＦ（最 適化コドン）中に見られるＤＮＡ配列から部分的になる、またはその二つの組み 合わせからなる。前述のＤ ＮＡフラグメント合成技術の一つ以上を利用して製造された特定のＫＧＦ類似体 アミノ酸をコードするＤＮＡ配列を都合のよい制限部位に挿入することにより配 列がさらに改変される。前述の技術のいずれかにより任意の類似体を全体として 生成することができる。しかしながら、試験した任意の遺伝子の一部または全体 におけるＥ．ｃｏｌｉ最適化コドンの存在は、細菌培養細胞から得ることのでき たタンパク質の収率を有意に増加させなかったが、適切な場合には通常のＯＬＩ ＧＯ設計の一部として最適化Ｅ．ｃｏｌｉコドンを用いた。図７〜１２は、都合 のよい実施例として特定のＫＧＦ類似体ヌクレオチドおよびアミノ酸配列構築物 を示す：Ｃ（１，１５）Ｓ（図７）；Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｅ（図８ ）；Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ（図９）；ΔＮ１５（図１０）；ΔＮ２ ３（図１１）及びΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑ（図１２）。本明細書に記載の全て のＫＧＦ類似体構築物は、そのＤＮＡ配列が確認された。実施例２ Ｅ．ｃｏｌｉからの精製 ＫＧＦ類似体遺伝子のクローニングにおいて三つの異なる発現プラスミドを使 用した。それらは、ｐＣＦＭ１１５６（ＡＴ ＣＣ６９７０２）、ｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ６９５７６）およびｐＣＦＭ３ １０２（それぞれ、図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ）である。ＰＣＲ重複オリゴ変異誘 発で一連の部位特異的塩基変換を行うことにより、プラスミドｐ３１０２をプラ スミドｐＣＦＭ１６５６から誘導することができる。プラスミド複製プロモータ ーＰ_copBの５’の直のところのＢｇｌＩＩ（ｐＣＦＭ１６５６プラスミドｂｐ＃ １８０）から出発し、プラスミド複製遺伝子に向かって進んで、塩基対は次のよ うに変化する。 前記内容からわかるように、ｐＣＦＭ１１５６、ｐＣＦＭ１６５６およびｐＣ ＦＭ３１０２は互いに非常に類似しており、多くの同じ制限部位を含む。プラス ミドは都合よく選択され、ベクターＤＮＡ成分は新しい構築物のために容易に交 換することができる。全てのクローニングに用いた宿主はＥ．Ｃｏｌｉ菌株ＦＭ ５（ＡＴＣＣ：５３９１１）であり、形質転換は前記ハナハン（ｈａｎａｈａｎ ）（１９８３）の方法によりまたはジーン・パルサー（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ^TM ）トランスフェクション装置（カリフォルニア州ヘルキュール在バイオラッド ・ラボラトリーズ社（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）製）を用い製 造者のプロトコールに従って電気溶離することにより行った。 最初に、三つのｐＣＦＭベクターの一つに所望の構築物を有する所望の組み換 えＥ．ｃｏｌｉクローンの小さい新しく培養した接種体を、適当な菌株の凍結グ リセロールストック０．１ｍＬをルリアブロス（Ｌｕｒｉａ ｂｒｏｔｈ）５０ ０ｍＬを含む２Ｌフラスコに移すことにより開始した。培養物を３０℃で１６時 間振盪した。その後、培養物を、滅菌バッチ培地（ツァイ（Ｔｓａｉ）ら，（１ ９８７），Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒ ｉａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２巻：１８１〜１８７頁）８Ｌを含む１５Ｌ発 酵器に移した。 フィードバッチ発酵を、フィード＃１培地の供給により始める（前記ツァイ（ Ｔｓａｉ）ら，（１９８７））。ＯＤ₆₀₀が３５に達すると、プラスミドを増幅 させるように培養温度を３７℃に迅速に昇温させることにより所望のＫＧＦ類似 体の発現を誘発した。３７℃で２時間後、ＣＩリプレッサーを変性させるために 培養温度を迅速に４２℃に昇温し、フィード１の添加をフィード２のために停止 し、その添加速度は３００ｍＬ／時から始めた。フィード２は、トリプチカーゼ −ペプトン１７５ｇ／Ｌ、酵母抽出物８７．５ ｇ／Ｌおよびグルコース２６０ ｇ／Ｌからなっていた。４２℃で１時間後、培養温度を３６℃に下げ、この温度 をさらに６時間維持した。 次に発酵を停止し、１Ｌ遠心分離瓶内に配置されたプラスチックバッグ内に遠 心分離により細胞を収集した。細胞を４００ｒｐｍで６０分間遠心分離によりペ レット化し、その後、上澄み液を除去し、細胞ペーストを−９０℃で凍結した。 Ｅ．ｃｏｌｉにおける種々のＫＧＦ類似体の発現に続いて、天然型ＫＧＦ、Ｃ （１，１５）Ｓ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ （１４４）Ｅ、Ｃ（１，１５）Ｓ／Ｒ（１４４）Ｑ、ΔＮ１５、ΔＮ２３、およ びΔＮ２３／Ｒ（１４４）Ｑタンパタ質を、以下の手順を用いて精製した。高細 胞密度発酵からの細胞ペーストを、０．２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ₄ 、ｐＨ７．５中の１０〜２０％溶液（容量当たり重量）に４℃で適当な高剪断ミ キサーを用いて懸濁させた。懸濁した細胞を、次に、溶液をホモジナイザー（マ サチューセツ州エベレット在ガウリン社（ＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ．）製 ）に３回通すことにより溶解した。あふれ出る均一液を適当な熱交換機を用いて ４〜８℃に冷却した。次に、ＪＳ４．２ローターを備えたＪ−６Ｂ^TM遠心分離器 （カリフォルニア州ブリー在ベックマン・インストルーメンツ社（Ｂｅｃｋｍａ ｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）製）で４２００ｒｐｍにて４℃で３０ 〜６０分間遠心分離することにより細胞破片を除去した。次に、上澄み液を注意 深く除去し、０．２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａｐＯ₄、ｐＨ７．５により４ ℃で平衡化させたエス−セファロース・ファースト・フロー（Ｓ−Ｓｅｐｈａｒ ｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ^TM）樹脂（ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） 製）カラムの予め調製した４５０ｍＬ（５ｃｍ×２３ｃｍ） カラムにロードした。次に、５カラム体積（２２５０ｍＬ）の０．４Ｍ ＮａＣ ｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ₄、ｐＨ７．５により４℃でカラムを洗った。カラムを ５Ｌの０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ₄、ｐＨ７．５で洗うことによ り所望のタンパク質を溶離した。再び、フラクション５０ｍＬを収集し、溶離液 のＡ₂₈₀を連続的にモニターした。次に、溶離物質を含んでいるとＡ₂₈₀により確 認されたフラクションを１４％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して所望のポ リペプチドの存在を確認した。 次に、所望のタンパク質を含むこれらのフラクションを溜め、等量の蒸留水を 添加した。希釈サンプルを、０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ₄、ｐＨ ６．８により４℃で平衡化させたエス−セファロース・ファースト・フロー（Ｓ −Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ^TM）樹脂の予め調製した４５０ｍＬ （５ｃｍ×２３ｃｍ）カラムにロードした。カラムを、２２５０ｍＬの０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ₄、ｐＨ６．８で洗い、０．４Ｍ ＮａＣｌ、 ２０ｍＭ ＮａＰＯ₄、ｐＨ６．８から０．６Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰ Ｏ₄、ｐＨ６．８の２０カラム体積の直線グラジエントを用いてタン パク質を溶離した。再度、流出液を定常的にＡ₂₈₀でモニターしつつフラクショ ン５０ｍＬを収集した。タンパク質（１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決められる ）を含むこれらのフラクションを溜め、３５０ｃｃ攪拌セル（マサチューセッツ 州メイベリー在アミコン社（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．））中、ＹＭ−１０膜（分 子量１００００カットオフ）を通して３０〜４０ｍＬの容量まで濃縮した。 次に、濃縮液を、１×ＰＢＳ（ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）のリン酸塩緩 衝塩水、「Ｄ−ＰＢＳ」、カルシウムおよびマグネシウム非含有）または０．１ ５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ₄、ｐＨ７．０を含むカラム緩衝液中で平 衡化させたスーパーデックス−７５（Ｓｕｐｅｒ−ｄｅｘ−７５^TM）樹脂（ファ ーマシア社製）の予め調製した１３００ｍＬ（４．４ｃｍ×８５ｃｍ）カラムに ロードした。サンプルをカラム内を通した後、タンパク質をゲル濾過マトリック スからカラム緩衝液を用いて溶離した。その後、フラクション１０ｍＬを回収し 、類似体（１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決められる）を含む液を溜めた。典型 的に、得られる貯溜液中のタンパク質濃度は約５〜１０ｍｇ／ｍＬであった。前 記全ての手順は、特記しない 限り４〜８℃で行った。 天然型ＫＧＦ、Ｃ（１，１５）ＳおよびΔＮ２３を精製するために別の精製手 順を用いた。手順は以下の段階を含み、特記しない限り、全ての手順、溶液およ び材料は２３±５℃で処理した。 細菌発酵の製造工程の終了時に、培養細胞を４〜８℃に冷却し、遠心分離また は同様のプロセスにより細胞を収集した。細胞ペーストの単位重量当たりのタン パク質の予想される収量および必用とされる精製タンパク質の量を基準として、 適当な重量の細胞ペーストを、２０ｍＭ ＮａＰＯ₄、０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐ Ｈ７．５を含みかつ懸濁すべき細胞ペーストの約５倍の重量の穏和な緩衝溶液中 に懸濁させた。細胞を、高剪断ミキサーを用いて均一溶液中に分散した。細胞ペ ースト分散液の温度は均一化中、４〜８℃に維持した。 細胞を圧力により、例えば適当な寸法の細胞ホモジナイザーに細胞ペースト分 散液を２回通すことにより溶解した。均一液を５±３℃で冷却維持した。細胞溶 解液を清澄化するために、適当な容量の０．２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰ Ｏ₄、ｐＨ７．５で平衡化した、適当な大きさのフィルター表面積を 有するフィルターを備えている予め調製されたデプスフィルターハウジング（コ ネチカット州メリデンのクノ社（Ｃｕｎｏ，Ｉｎｃ．））を用いた。平衡化およ び遠心分離は５±３℃で行った。清澄化の前に、適量の好適なフィルター助剤を 使用してフィルターを予備被覆し、細胞溶解物と充分に混合し、その後、溶液を フィルター装置を通過させることにより溶解液を清澄化した。フィルターを０． ２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７．５で洗った。濾液およびいかな るその後の洗浄液も、適当な容積の冷却容器に収集し、１０℃未満の温度に維持 した。 清澄化に続いて、次に溶解液を、細胞ペースト２ｇ当たり少なくとも１ｍＬの 樹脂を含む予め調製しておいたＳＰ−セファロース・ファースト・フローのカラ ムを通過させた。ＳＰ−セファロース・ファースト・フローのカラムを、冷たい （５±３℃）、０．２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ₄、ｐＨ７．５で平衡 化させた。カラムの温度を１０℃末満に維持した。次に、清澄化溶解液（５±３ ℃）を２８０ｎｍ（Ａ₂₈₀）における溶離液の吸収率を連続的にモニターしなが らイオン交換カラムにロードした。サンプルをロードした後、カラムを、冷 たい０．２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ₄、ｐＨ７．５で洗い、２３±５ ℃で０．３Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ₄、ｐＨ７．５で洗った。 所望のタンパク質を溶離するために、０．２〜１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｎ ａＰＯ₄、ｐＨ７．５の直線グラジエントを用いた。溶離液のＡ₂₈₀を基準にした 幾つかのフラクションとして生成物のバルクを収集した。溶離に続いて、これら のフラクションを溜め、容量を記録した。 遊離スルフヒドリル基を酸化するために、酸化段階を実施した。天然型ＫＧＦ と比較して、変化したシステインパターンを有するタンパク質については、酸化 剤（例えば、シスタミンジヒドロクロライドまたは他の適当な酸化剤、例えば、 シスチン、酸化型グルタチオン、または２価の銅）を最終濃度が１〜２０ｍＭに なるように添加しおよびｐＨを７〜９．５に調節し、シスタミンジヒドロクロラ イドを用いる場合はｐＨを９．０±０．３に調節する。酸化は、１０〜３０℃の 温度で適当な期間行った。天然型ＫＧＦタンパク質の場合、酸化は、１〜２Ｍの （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄のような適量の（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を添加し、ｐＨを７．５〜９． ５に調節し、温度を２３±５℃に適当な時 間保持する事により行った。 酸化後、溶液のｐＨを６．５〜９．５に調節した。必用な場合、固体の（ＮＨ₄ ）₂ＳＯ₄を最終濃度が２Ｍになるように溶液に添加した。粒子を除去するため に、溶液を、適当な清澄化フィルターを通過させた。 次に、濾過され酸化した生成物を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩ Ｃ）に掛けた。ＨＩＣマトリックスは、ブチル−６５０Ｍトヨパール（Ｂｕｔｙ ｌ−６５０Ｍ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ^TM）樹脂（ペンシルバニア州モントゴメリー 在トーソハース社（Ｔｏｓｏｈａａｓ）製）であった。タンパク質含有溶液を、 ２Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ₄、ｐＨ７． ０により予め平衡化させておいたカラムにロードした。サンプルをロードした後 、カラムを、２Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰ Ｏ₄、ｐＨ７．０で洗った。次に、所望のタンパク質を、０．１５Ｍ ＮａＣｌ 、２０ｍＭ ＮａＰＯ₄、ｐＨ７．０中に２〜０Ｍの濃度で展開した減少濃度の 直線的（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄グラジエントを用いて溶離した。溶離液のＡ₂₈₀の増加に より示される所望のタンパク質の溶離が開始すると、フラクショ ンを収集した。各フラクションのアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した 。所望のタンパク質を含むこれらのフラクションを溜め、充分に混合し、貯溜液 の容量を、そこのタンパク質濃度とともに決定した。 次に、溜めたＨＩＣタンパク質含有溶離液を濃縮し、溶離緩衝液を交換した。 典型的に、タンパク質を５．０〜１０．０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。適当な寸法の カットオフ膜を有するペリコン（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ^TM）カセットシステム（マサ チューセッツ州ベッドフォード在ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．） 製）が備えられた限外濾過システムを用いて限外濾過を行った。 濃縮後、サンプルを適当な緩衝液に対して透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ ）した。濃縮段階からの残留物を、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ₄ 、ｐＨ７．０溶液の導電率の５％以内に残留物の導電率が入るまで、０．１５ Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ₄、ｐＨ７．０に対して透析濾過した。 さらに、存在し得る沈殿物およびバクテリアのエンドトキシンを除去するため に、濃縮・透析濾過したタンパク質含有サン プルを０．１μｍポジダイン（Ｐｏｓｉｄｙｎｅ^TM）フィルター（ニューヨーク 州コートランド在ポール社（Ｐａｌｌ，Ｉｎｃ．）製）を通過させた。溶液のタ ンパク質濃度を決めた後、最終のバルク生成物の所望の濃度を基準として溶液を 、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ₄、ｐＨ７．０で所望の最終濃度 に希釈した。最終のバルク生成物を、さらなる組成物調製のために貯蔵（約５℃ で）のための発熱物質を含まない容器に移すときに、最終的な０．２２μｍフィ ルターを通す滅菌濾過を実施した。実施例３ 哺乳動物細胞培養物からの精製 この実施例は、哺乳動物発現系において生成された二つの生物学的に活性な組 み換えＫＧＦ（ｒＫＧＦ）の発現、単離、および特性付けを記載する。 ヒトＫＧＦ遺伝子を、正常なヒト皮膚線維芽細胞から製造されるｃＤＮＡのＰ ＣＲ増幅により単離した(カリフォルニア州パロ・アルト在クロネテック社(Ｃｌ ｏｎｅｔｅｃ，Ｉｎｃ．))。逆転写酵素によるｃＤＮＡの製造後に、ＫＧＦ遺伝 子の増幅のためにＰＣＲを使用した。図１に示されるように、ｃＤＮＡか ら遺伝子を増幅するためにＯＬＩＧＯ＃２５およびＯＬＩＧＯ＃２６を使用し、 第２のＰＣＲ増幅によりフラグメント末端にＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩ制 限部位を入れるためにＯＬＩＧＯ＃２７およびＯＬＩＧＯ＃２８を用いた。 クローニングおよびＤＮＡ配列の確認に続いて、ＫＧＦ遺伝子ＤＮＡを使用し た。二つのプライマーを用いて増幅を行った。 センスプライマーＯＬＩＧＯ＃２９は、開始コドンＡＴＧの上流のコンセンサ スＫｏｚａｋ翻訳配列（５’−ＣＣＡＣＣ−３’）およびＸｂａＩ部位を含んで いた。アンチセンスプライマーＯＬＩＧＯ＃３０は、ＳａｌＩクローニング部位 および追加の停止コドンを含んでいた。１８サイクルのＰＣＲ増幅 （９４℃での変性３０秒、５５℃でのアニーリング４０秒、および７２℃での伸 長４０秒間）後、生成物をＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化し、同様に消化したｐ ＤＳＲα２ＤＮＡと結合させた（バードレル（Ｂｏｕｒｄｒｅｌ）ら，（１９９ ３），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．＆ Ｐｕｒｉｆ．，４巻：１３０〜１４０頁お よびルー（Ｌｕ）ら，（１９９２），Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ ｓ．，２９８巻：１５０〜１５８頁の方法による）。これにより、ＳＶ４０初期 プロモーターとα−ＦＳＨポリアデニル化配列との間にヒトＫＧＦ遺伝子が組み 込まれたプラスミドＫＧＦ／ｐＤＳＲα２を得た。二つのクローンを取り出し、 ＤＮＡ配列分析により所望のベクターの構築を確認した。 次に、ＫＧＦ／ｐＤＳＲα２ ＤＮＡ２μｇをＰｖｕＩで直線化した。前日に ０．８×１０⁶細胞／６０ｍｍ培養皿で接種したチャイニーズハムスター卵巣（ ＣＨＯ）細胞を、標準的リン酸カルシウム沈降法（前記バードレルら）を用いて 、処理したＤＮＡでトランスフェクションした。２週間後、個々のコロニーを取 り出し、２４ウエルプレートに移した。細胞が集密状態に達し、そのアリコート をＥ．ｃｏｌｉ発現ヒトＫＧＦに対 して反応性のポリクローナルウサギ抗体を用いるウエスタンブロッティングによ り分析したとき、ならし培地は血清を含まないと考えられた。 ウエスタンブロッティングは、サンプルを１２．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳポリア クリルアミドゲル上で電気泳動し、続いて半乾燥トランスファー装置（カリフォ ルニア州サンフランシスコ在ヘーファー・サイエンティフィック・インスツルー メンツ(Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ)）を用いて ニトロセルロース膜上で４００ｍＡで１時間エレクトロブロッティングすること により実施した。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭグリシン、２０％メタノール をトランスファー緩衝液として使用した。ニトロセルロースシートを、ＰＢＳ中 １０％正常ヤギ血清と一緒にインキュベートすることによりブロックした。Ｅ． ｃｏｌｉ誘導ＫＧＦに対するウサギ抗血清を第一抗体として用いた。使用のため に、それを、ＰＢＳ中１％正常ヤギ血清中に１／１００００に希釈し、ブロック されたニトロセルロースシートと一緒に室温で１２時間インキュベートし、その 後、過剰の抗体を、ＰＢＳ中で３０分間の洗浄を３回行って除去した。次に、ニ トロセルロース膜を、ベクタスタイ ン（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ^TM）ビオチニル化ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（第二抗体； カリフォルニア州バーリンガム在ベクター・ラブス社（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ ）製）を含むＰＢＳ中１％正常ヤギ血清１００ｍＬ中で室温にて３０分間インキ ュベートした。ＰＢＳ中での１０分間の洗浄を３回行った後、製造者（ベクター ・ラブス社）の指示に従って調製したビオチニル化ペルオキシダーゼおよびスト レプトアビジンを含む１％正常ヤギ血清の１００ｍＬ溶液中で、３０分間、室温 でのインキュベーションを行った。ＰＢＳ中での３回の洗浄に続いて、ＰＢＳ１ ００ｍＬ中３０％（ｗ／ｖ）Ｈ₂Ｏ₂６０μＬとメタノール２０ｍＬ中４−クロロ ナフトール５０ｍｇとの混合物中でインキュベートすることによりＫＧＦ交差反 応性物質を視覚化した。１０分後に水中で濯ぐことにより反応を停止した。 ブロットの分析により、ＫＧＦ特異抗体が三つの異なるタンパク質バンド、す なわち、１６３アミノ酸の成熟型タンパク質の約１８．８ｋＤａの予想される分 子量と比較して、その二つが約２５〜２９ｋＤａの分子量に密接に係わり、また 一つが約１７ｋＤａの推定分子量に係わる前記三つのバンドと結合することがわ かった。さらに、ウエスタン分析により判断される１ リッター当たり２．０ｍｇを越えるｒＫＧＦを分泌する幾つかの高発現クローン を選択し、（前記ルーらの方法により）ローラー瓶中に増殖させて、後述するゲ ル濾過およびカチオン交換クロマトグラフィーによるＫＧＦの精製のために大量 の無血清ならし培地を生成した。 無血清ならし培地３ＬからのＫＧＦを、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７． ５で予め平衡化されたＳＰ−セファロース・ファースト・フロー（ファーマシア 社製）の４５０ｍＬのスルホエチル樹脂を詰めたカチオン交換カラム（５×２４ ｃｍ）に直接培地をロードすることにより精製した。５倍カラム体積の２０ｍＭ リン酸ナトリウム、０．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で洗浄した後、２０ｍＭリ ン酸ナトリウム中０．２〜１．０ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５の２０倍カラム体積の 直線グラジエントを用いてｒＫＧＦを溶離した。連続的にＡ₂₈₀をモニターしな がらフラクション５０ｍＬを収集した。各フラクションのアリコートをＳＤＳ− ＰＡＧＥで分析することによりＫＧＦタンパク質を検出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ は、予め流延した１４％Ｔｒｉｓ−グリシン予備流延ゲルを用いる電気泳動シス テム（カリフォルニア州サンジエゴ在ノヴェックス社（Ｎｏｖｅｘ）製） で行った（レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）（１９７０），Ｎａｔｕｒｅ，２２７巻： ６８０〜６８５頁）。サンプルを、ローディング前に加熱することなく非還元性 ＳＤＳサンプル緩衝液と混合した。タンパク質を、クマシーブルーまたは銀染色 で検出した。二つの後期溶離ピークが、ウエスタンブロットにより検出される１ ７ｋＤａバンドおよび２５〜２９ｋＤａに相当するタンパク質バンドを含むこと がわかった。これらのピークの各々を含むフラクションを別々に１．０ｍＬ未満 の体積に濃縮し、ゲル濾過した。 ゲル濾過は、ＰＢＳで予め平衡化されたスーパーデックス−７５（Ｓｕｐｅｒ ｄｅｘ−７５^TM）樹脂（ＨＲ １０／３０，ファーマシア社製）のカラムであっ て、以下の既知の分子量標準により検量されたカラム（カリフォルニア州サンフ ランシスコ在バアイオラッド社（ＢｉｏＲａｄ）製）を用いた：チログロブリン （６７０ｋＤａ）、ガンマグロブリン（１５８ｋＤａ）、オボアルブミン（４４ ｋＤａ）、ミオグロビン（１７ｋＤａ）およびビタミンＢ−１２（１．４ｋＤａ ）。これらの精製段階により、銀染色により推定されるように特に１７ｋＤａお よび３０ｋＤａの物質を含むｒＫＧＦが約２０００倍精製された。 より高分子量の物質の場合、ｒＫＧＦは主要の対称ピークとして溶離され、そ れはＫＧＦ−ａと呼ばれた。この物質のより少量（３μｇ／レーン対６μ／レー ン）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析すると、分子量の差が１〜２ｋＤａである二つのバ ンドに分離した。ＫＧＦ−ｂと呼ぶ低分子量物質の場合、ゲル濾過により子想さ れた移動度を有するタンパク質調製物が得られた。ＫＧＦ−ａとＫＧＦ−ｂの両 方について、精製後の全収率は約３０〜４０％であった。 ＫＧＦ−ａおよびＫＧＦ−ｂのアミノ酸配列も分析した。これらの分析は、モ デル１２０ＡオンラインＰＴＨ−アミノ酸分析器およびモデル９００Ａデータ収 集システムが備えられた自動シーケンサー（カリフォルニア州フォスターシティ ー在アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ，Ｉｎｃ．）製のモデル４４７Ａ又は４７０Ａ）で行った（ルー（Ｌｕ）ら，（ １９９１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６巻：８１０２〜８１０７頁の方 法による）。ＫＧＦ−ａのエドマン（Ｅｄｍａｎ）配列分析は、主にＮ−末端配 列 Ｘ₁−Ｎ−Ｄ−Ｍ−Ｔ−Ｐ−Ｅ−Ｑ−Ｍ−Ａ−Ｔ−Ｎ−Ｖ−Ｘ₂−Ｘ₃−Ｓ− （配列番号：５１）を示した。３番目の Ｎ−末端アミノ酸であるアスパラギン酸から始まるマイナーな配列も、全配列決 定可能タンパク質の１．６％の量で存在していた。Ｘ₁、Ｘ₂およびＸ₃は、配列 分析中、フェニルチオヒダントイニル（ＰＴＨ）アミノ酸シグナルの不在のため に帰属できなかった。 興味深いことに、ＫＧＦ−ｂのＮ−末端配列分析は、Ｎ−末端アミノ酸配列Ｓ −Ｙ−Ｄ−Ｙ−Ｍ−Ｅ−Ｇ−Ｇ−Ｄ−Ｉ−Ｒ−Ｖ−（配列番号：５２）を示し、 それは、Ａｒｇ²³−Ｓｅｒ²⁴ペプチド結合でタンパク質分解されたＫＧＦのＮ− 末端切頭型であることを示している。 精製されたＫＧＦ−ａおよびＫＧＦ−ｂをさらに特性付けるために、既知の技 術（ササキ（Ｓａｓａｋｉ）ら，（１９８７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２ ６２巻：１２０５９〜１２０７６頁；タケウチ（Ｔａｋｅｕｃｈｉ）ら，（１９ ８８），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３巻：３６５７〜３６６３頁；ツェボ （Ｚｓｅｂｏ）ら，（１９９０），Ｃｅｌｌ，６３巻：１９５〜２０１頁）を用 いてタンパク質をグリコシダーゼ（ノイラミニダーゼ、Ｏ−グリカナーゼ、およ び／またはＮ−グリカナーゼ）処理に付した。これらのデータは、ＫＧＦ −ａのより低分子量型のものは、おそらくＮ−結合糖のみを含むが、ＫＧＦ−ａ はＮ−およびＯ−結合炭水化物を含むことを示している。グリコシダーゼ処理は 、ＫＧＦ−ｂについて分子量低下を引き起こさず、それは分子がグリコシル化さ れていないことを示している。実施例４ 生物学的活性 各ＫＧＦ類似体を希釈し、Ｂａｌｂ／ＭＫ細胞の［³Ｈ］−チミジン取り込み を測定することにより生物学的活性を検定した（前記ルビンら（１９８９）の方 法による）。まず、サンプルを、５０％カスタマーメイドＥａｇｌｅ'ｓ ＭＥ Ｍ、５０％カスタマーメイドＦ１２、５μｇ／ｍＬトランスフェリン、５ｎｇ／ ｍＬ亜セレン酸ナトリウム、０．０００５％ＨＳＡおよび０．００５％ Ｔｗｅ ｅｎ２０からなるバイオアッセイ培地中に希釈する。次に、ＫＧＦサンプルを、 Ｂａｌｂ／ＭＫ細胞を接種したファルコン・プリメリア（Ｆａｌｃｏｎ ｐｒｉ ｍｅｒｉａ）９６−ウエルプレートに添加した。ＤＮＡ合成中における［³Ｈ］ −チミジンの組み込みを測定し、天然型ＫＧＦ標準曲線と比較することにより、 組み込まれた天然型ＫＧＦ濃 度に変換された。試験した各類似体は、有糸分裂活性を示した。 Ｂａｌｂ／ＭＫマウス上皮ケラチノサイトから調製した単離ＫＧＦレセプター 膜調製物を用いてＫＧＦレセプターとの相互作用を試験した（マッサージュ（Ｍ ａｓｓａｇｕｅ）（１９９３２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈeｍ．，２５８巻：１３ ６１４〜１３６２０頁に記載の手順による）。特に、５０μＬ当たり０．８ｎｇ 〜１００ｎｇの濃度範囲になるように０．２％ウシ血清アルブミンを含む５０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で種々の形態のＫＧＦを希釈した。それらは 、個々に、前記膜調製物（７５ｎｇ／ｍＬ）および¹²⁵Ｉ−標識化Ｅ．ｃｏｌｉ 誘導ＫＧＦ（１．５ｎｇ）と一緒にインキュベートした。レセプター結合および 競合実験を４℃で１６時間行い、その後、サンプルを取り出し、遠心分離し、前 記希釈緩衝液で２回洗って非結合および非特異的結合の標識化ＫＧＦを除去した 。次に、サンプルの残留放射能を計数した。各ＫＧＦサンプルの濃度に対して非 競合％をプロットすることにより、ＫＧＦサンプルと標識化ＫＧＦとの間のレセ プター結合の競合曲線をつくった。放射性レセプターアッセイ非競合実験は、Ｅ −ｃｏｌｉ誘導ＫＧＦ、ＫＧＦ−ａおよびＫＧＦ−ｂが類似するレセプター結合 活性を有することを示した。 本発明を、一般的におよび好ましい実施態様について記載したが、前記記載に 照らして当業者は他の変更および変形を行い得るものと解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ケニー，ウイリアム・シー アメリカ合衆国、カリフオルニア・91320 −1789、サウザンド・オークス、カステイ ーリヨ・サークル・2654 (72)発明者 トレツセル，テイム アメリカ合衆国、カリフオルニア・91320 −1789、サウザンド・オークス、フアーン デイル・プレイス・1975

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． （ａ）ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）を含む溶液を得る工程、 （ｂ）工程（ａ）の溶液からのＫＧＦをカチオン交換樹脂に結合する工程、 （ｃ）カチオン交換樹脂からの溶離溶液中にＫＧＦを溶離する工程、 （ｄ）工程（ｃ）からの溶離溶液を適当な分子量排除マトリックスを通過させ る工程、および （ｅ）分子量排除マトリックスからＫＧＦを回収する工程 を含んでなる、ＫＧＦの精製方法。 ２． ＫＧＦが原核生物細胞内で生成される請求項１に記載の方法。 ３． ＫＧＦがＥ．ｃｏｌｉ内で生成される請求項１に記載の方法。 ４． ＫＧＦが哺乳動物細胞内で生成される請求項１に記載の方法。 ５． ＫＧＦがチャイニーズハムスター卵巣細胞内で生成され る請求項４に記載の方法。 ６． （ａ）ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）を含む溶液を得る工程、 （ｂ）工程（ａ）の溶液からのＫＧＦをカチオン交換樹脂に結合する工程、 （ｃ）カチオン交換樹脂からの溶離溶液中にＫＧＦを溶離する工程、 （ｄ）工程（ｃ）の溶離溶液で疎水性相互作用クロマトグラフィーを行う工程 、および （ｅ）工程（ｄ）の疎水性相互作用クロマトグラフィー段階からＫＧＦを回収 する工程 を含んでなる、ＫＧＦの精製方法。 ７． ＫＧＦ中の遊離スルフヒドリル基を酸化することをさらに含む請求項６に 記載の方法。 ８． ＫＧＦが原核生物細胞内で生成される請求項６に記載の方法。 ９． ＫＧＦがＥ．ｃｏｌｉ内で生成される請求項７に記載の方法。 １０． ＫＧＦが哺乳動物細胞内で生成される請求項６に記載 の方法。 １１． ＫＧＦがチャイニーズハムスター卵巣細胞内で生成される請求項１０に 記載の方法。