缺失型人角质细胞生长因子-Ⅰ二硫键变构体及其用途
技术领域
本发明属于重组蛋白及其在制药领域的应用,特别是涉及一种缺失型人角质细胞生长因子-Ⅰ二硫键变构体及其制备方法以及作为药物在预防和治疗纤维化增生性疾病和血管增生性疾病中的应用。本发明是发明名称为“新型人角质细胞生长因子突变体”(专利号CN03101156.X)的发明专利的延伸。
背景技术
角质细胞生长因子(keratinocytegrowthfactor,KGF)属于成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor,FGF)家族,具有肝素结合特性。目前已发现两种角质细胞生长因子,即角质细胞生长因子-Ⅰ(KGF-Ⅰ)和角质细胞生长因子-Ⅱ(KGF-Ⅱ),又分别被命名为FGF-7和FGF-10(AaronosonSAetal,AnnNYAcadSci,1991,638:62-77)。人角质细胞生长因子-Ⅰ(hKGF-Ⅰ)最初由Rubin等人(RubinJSetal,ProcNatlAcadSciUSA,1989,86:802-806)从人胚胎肺成纤维细胞的生长培养液中分离纯化,因具有促进小鼠角质细胞有丝分裂的作用,故被命名为角质细胞生长因子;hKGF-Ⅱ是Emoto等人(EmotoHetal,JBiolChem,1997,272:23191-23194)从肺中分离出编码KGF-Ⅱ的cDNA。
hKGF-Ⅰ基因位于15号染色体,编码含194个氨基酸残基的蛋白前体,包含一段31个氨基酸残基的分泌信号肽,成熟的hKGF-Ⅰ是一个含163个氨基酸残基的单链多肽。大量研究结果显示,hKGF-Ⅰ由间质细胞表达,通过旁分泌的方式作用于上皮细胞,是一种多功能的细胞生长因子,具有广泛的生物学作用。hKGF-Ⅰ能够促进包括肝实质细胞、胃肠上皮细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞、尿道上皮细胞、角膜上皮细胞和各种鳞状上皮的角化细胞等多种上皮细胞(FinchPWetal,Science,1989,245:752-755;FarrellCLetal,IntJRadiatBiol,1999,75:609-20;FarrellCLetal,CancerRes,1998,58:933-939;EllisonCAetal,JClinImmunol,2008,28:600-615;TerryNHetal,IntJRadiatOncolBiolPhys,2004,58:435-444;ImayasuMetal,CurrEyeRes2003,27:133-141)的增殖、迁移、分化、存活,维持细胞骨架结构蛋白的稳定,拮抗辐射损伤、促进DNA修复以及诱导解毒酶的表达来加强上皮功能,有效保护上皮细胞免于毒性物质和射线的损伤。损伤修复过程中hKGF-Ⅰ可被大量诱生表达,促进伤口愈合,加快角膜上皮细胞损伤恢复的速度,缩短角膜上皮细胞愈合时间。
天然野生型hKGF-Ⅰ由163个氨基酸组成,分子量为21KD,含5个Cys,分别位于第1位、第15位、第40位、第102位和第106位,其中形成Cys1-Cys15、Cys102-Cys106两对二硫键,Cys40以游离巯基形式存在于分子内部(OsslundTDetal,ProteinSci,1998,7:1681-1690)。全长hKGF-Ⅰ蛋白质具有不稳定性,容易发生断裂和聚集,利用基因工程技术,通过突变或缺失某些氨基酸可以改善蛋白质的稳定性。文献报道(OsslundTDetal,ProteinSci,1998,7:1681-1690;HsuEetal,ProteinEngDesSel,2006,19:147-153和美国专利US5677278)缺失N端23个氨基酸,且形成Cys102-Cys106二硫键(记为Δ23hKGF-Ⅰ)时,不影响其生物活性,且会提高稳定性。该事实说明,N端第1-23位氨基酸及Cys1-Cys15二硫键与KGF-Ⅰ的生物学活性无关。本发明人曾将hKGF-Ⅰ天然序列第102位的Cys突变为Ser,使之无法形成Cys102-Cys106二硫键,并缺失N端24个氨基酸,形成新型的hKGF-Ⅰ突变体(记为102SΔ24hKGF-Ⅰ)。该新型hKGF-Ⅰ突变体能促进角质细胞增殖和抑制成纤维细胞生长,具有抗疤痕、抗纤维化和促进表皮愈合的功能,该发明已获得中国专利(CN03101156.X)授权。
在上述专利的基础上,本发明通过二硫键配对分析发现,重组表达的缺失型hKGF-Ⅰ(Δ23hKGF-Ⅰ)及上述的102SΔ24hKGF-Ⅰ突变体均未形成对应于天然hKGF-Ⅰ第40位和第106位Cys间的二硫键,其中Δ23hKGF-Ⅰ仅有Cys102和Cys106间的二硫键形成,102SΔ24hKGF-Ⅰ中无二硫键形成。本发明对二种序列中对应于天然hKGF-Ⅰ的Cys40和Cys106人为形成分子内二硫键的方法进行了详细的研究摸索,并对该二硫键形成后分子构象进行了确证。与Cys40和Cys106间未形成二硫键的结构相比,形成非天然Cys40-Cys106二硫键后的hKGF-Ⅰ缺失型突变体在空间构象上有显著变化,并经系列研究发现,出现了新的生物学功能,既能促进上皮细胞增殖,又可逆转组织纤维化,并有效抑制新生血管生长。同时,本发明人构建和制备了将第106位Cys突变成Ser的106SΔ23hKGF-Ⅰ缺失型突变体重组蛋白,采用本专利实施例的方法,结果未能实现非天然二硫键Cys40-Cys102的有效形成。
组织纤维化是一种严重危害人类健康的慢性疾病,是许多疾病致残、致死的主要原因。世界卫生组织的统计表明,全球因各种疾病致死的病人中,约40%可以归因于组织纤维化疾病,如矽肺、肺囊虫感染、病毒性肝硬化、酒精性肝硬化、肾小球肾炎、肾盂肾炎等。组织纤维化可导致器官组织内结缔组织增多,实质细胞减少,持续发展可致组织硬化,使器官功能减退乃至衰竭,严重威胁人类健康和生命。
到目前为止,尚无治疗组织纤维化的有效药物。而本发明提供的缺失型hKGF-Ⅰ二硫键变构体具有新的抑制纤维增生的生物学作用,能逆转组织纤维化,有望开发成液体水针、冻干粉针、缓控释剂和滴眼药剂等形式的制剂,临床上用于治疗慢性肝纤维化、肺纤维化、肾纤维化、角膜纤维化和皮肤纤维化等组织纤维化疾病。还可开发成外用药剂用于防治因皮肤纤维化导致的疤痕形成。
本发明提供的缺失型hKGF-Ⅰ二硫键变构体还具有新的抑制新生血管生长的生物学作用,可用于抑制新生血管瘤的生长以及肿瘤的血管增生,有望开发成抗癌药物。
检索国内外专利和文献发现,尚无关于hKGF-Ⅰ的非天然二硫键形成、构象变化及其生物学作用的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有新的生物学作用的缺失型人角质细胞生长因子-Ⅰ(hKGF-Ⅰ)二硫键变构体,其核心特征在于含有对应于天然hKGF-Ⅰ第40位和第106位半胱氨酸(Cys)间的非天然二硫键结构,其新的生物学作用包括抑制纤维增生和抑制新生血管生长。
在本发明的第一个方面,提供了一种具有新的生物学作用的缺失型hKGF-Ⅰ二硫键变构体的氨基酸序列或组成。
本发明所述的二硫键变构体是指含有对应于天然hKGF-Ⅰ第40位和第106位半胱氨酸(Cys)间的非天然二硫键结构,其分子构象已发生显著改变的hKGF-Ⅰ缺失型突变体。该突变体在非天然二硫键形成以前既可特指本发明的二硫键变构体,也可更广义地被称为突变体;在非天然二硫键形成后,因分子构象已发生显著变化,更狭义地被称为二硫键变构体。
本发明所述的二硫键变构体的氨基酸序列是指在天然野生型hKGF-Ⅰ的氨基末端缺失23个氨基酸的缺失突变体(即Δ23hKGF-Ⅰ),具有SeqIDNo:1的氨基酸序列特征。序列中第17位、第79位和第83位的半胱氨酸(Cys)分别对应于天然hKGF-Ⅰ的第40位、第102位和第106位。
本发明同时包含在SeqIDNo:1序列的基础上,氨基末端增加或减少1-5个氨基酸的突变体。如在SeqIDNo:1序列的氨基末端增加一个甲硫氨酸(Met),或增加序列为Pro-Glu-His-Thr-Arg或Met-Glu-His-Thr-Arg的5个氨基酸;或从SeqIDNo:1序列的氨基末端减少一个丝氨酸(Ser),或减少序列为Ser-Tyr-Asp-Tyr的4个氨基酸,或减少序列为Ser-Tyr-Asp-Tyr-Met的5个氨基酸。
本发明同时也包含在SeqIDNo:1序列的基础上,将第79位的Cys(对应于天然hKGF-Ⅰ的第102位)突变为非极性氨基酸。所述非极性氨基酸主要指Ser、Ala、Gly、Thr、Leu或Ile,本发明优选的非极性氨基酸是Ser,记为Δ23S79hKGF-Ⅰ,具有SeqIDNo:2的氨基酸序列特征。
本发明上述的任何一种缺失型hKGF-Ⅰ的二硫键变构体或突变体,通过重组DNA技术制备而成。所述的重组DNA技术是指利用分子生物学技术,合成或提取外源目的基因,对外源基因进行缺失或点突变,然后将外源基因转入表达宿主,利用表达宿主表达外源目的蛋白。表达宿主可以是原核系统,也可以是真核系统,其中的原核表达系统可以是大肠杆菌,真核表达系统可以是酵母和哺乳动物细胞。本发明优选大肠杆菌原核表达系统。
在本发明的第二个方面,提供了一种能够促使上述任何一种缺失型hKGF-Ⅰ二硫键变构体形成非天然二硫键(即Cys17-Cys83二硫键)的制备方法。
本发明的核心特征在于,上述的任何一种缺失型hKGF-Ⅰ的二硫键变构体含有第17位和第83位(对应于天然hKGF-Ⅰ第40位和第106位)半胱氨酸间的非天然二硫键结构。
本发明上述的任何一种hKGF-Ⅰ的二硫键变构体或突变体的获得是通过重组DNA技术、微生物大规模培养技术和生物工程下游纯化技术实现的。根据变构体的氨基酸序列,结合宿主菌的遗传密码子偏好型,化学合成对应的缺失型hKGF-Ⅰ突变体cDNA,连接到重组质粒载体中,并成功构建高效表达工程菌株;接种到培养基,采用微生物大规模培养技术,高密度表达缺失型hKGF-Ⅰ突变体蛋白;离心收集菌体并破菌后,采用生物工程下游纯化技术,通过色谱层析手段,得到纯度95%以上的缺失型hKGF-Ⅰ的突变体重组蛋白。
本发明所述的色谱层析手段,主要指离子交换层析、肝素亲和层析、反相层析和凝胶过滤层析,更优选地,为离子交换层析和肝素亲和层析。
本发明通过特有的二硫键配对复性方法,促使第17位与第83位的Cys之间形成非天然二硫键,即Cys17-Cys83二硫键(对应于天然hKGF-Ⅰ的Cys40-Cys106二硫键)。其主要步骤为:
①将得到的纯度95%以上的缺失型hKGF-Ⅰ突变体重组蛋白,在碱性条件下用还原剂处理,使其第17位和第83位的Cys的巯基(-SH)均处于游离状态;
②在碱性条件下经菲洛林和铜离子配对复性,促进形成Cys17-Cys83二硫键,获得具有第17位和第83位Cys间非天然二硫键的变构体。
③采用色谱层析手段,从复性样品中分离并得到纯度95%以上的缺失型hKGF-Ⅰ二硫键变构体。
本发明上述的制备方法中,所述的还原剂主要指二硫苏糖醇(Dithiothreitol,DTT)、β-巯基乙醇、三[2-羧乙基]膦(Tris[2-carboxyethyl]phosphine,TCEP)以及半胱氨酸等试剂,更优选地,为DTT。
本发明所述的菲洛林是指1,10-菲洛林(1,10-Phenanthroline),铜离子主要是指硫酸铜,但不限于硫酸铜,还可以是其它形式的铜离子。菲洛林和铜离子的摩尔比例范围1∶10~100∶1均可,更优选地,为1∶1~5∶1。
本发明所述的碱性条件是指7.0~12.0的pH值范围,更优选地,为9.0~11.0。
本发明所述的色谱层析手段,主要指离子交换层析、肝素亲和层析、反相层析和凝胶过滤层析,更优选地,为反相层析。
本发明上述的任何一种缺失型hKGF-Ⅰ的二硫键变构体或突变体在非天然二硫键形成后,因分子构象已发生显著变化,更狭义地被称为二硫键变构体,并在其代号后追加“-M”以示区别。具有SeqIDNo:1的氨基酸序列特征的缺失突变体(Δ23hKGF-Ⅰ),形成非天然二硫键后被记为Δ23hKGF-M,具有SeqIDNo:2的氨基酸序列特征的突变体(Δ23S79hKGF-Ⅰ),形成非天然二硫键后被记为Δ23S79hKGF-M。
在本发明的第三个方面,提供了上述任何一种缺失型hKGF-Ⅰ二硫键变构体在预防和治疗纤维化增生性疾病和血管增生性疾病上的应用。
本发明所述的缺失型hKGF-Ⅰ二硫键变构体,与天然hKGF-Ⅰ相比,构象上发生了显著变化。首先经质量肽图结果证实了其中的Cys17-Cys83二硫键(对应于天然hKGF-Ⅰ的Cys40-Cys106二硫键)的形成。计算机模建数据表明,与未形成前相比和与形成Cys79-Cys83二硫键结构相比(Δ23hKGF-Ⅰ),形成Cys17-Cys83二硫键后的分子构象发生了极显著变化(附图1)。利用本发明提供的方法,制备获得的二硫键变构体重组蛋白进行的圆二色谱(CD)分析结果同样表明,形成非天然Cys17-Cys83二硫键后CD图谱出现明显差异(附图2)。
本发明所述的缺失型hKGF-Ⅰ二硫键变构体,发现具有抑制纤维增生和抑制新生血管生长的生物学作用。本发明通过细胞体外活性测定实验证明,形成Cys17-Cys83二硫键后的缺失型hKGF-Ⅰ二硫键变构体重组蛋白除保留原有促上皮细胞增殖(附图3)的生物学活性外,还出现了新的生物学作用,能够较明显地抑制人组织纤维细胞(附图4)和人血管内皮细胞(附图5)的生长和增殖。此外,本发明通过SD大鼠肝纤维化模型、SD大鼠肺纤维化模型和鸡胚绒毛尿囊膜实验证明,形成Cys17-Cys83二硫键后的缺失型hKGF-Ⅰ变构体重组蛋白能够有效地逆转慢性肝损伤造成的肝纤维化(附图6和附图7)和急性肺损伤造成的肺纤维化(附图8),并能够有效地抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管生长(附图9)。
本发明所述的抑制纤维增生的生物学作用适用于预防和治疗纤维化增生性疾病,包含但不限于慢性肝纤维化、肺纤维化、肾纤维化、角膜纤维化和皮肤纤维化,还包含其它组织器官的纤维化。
本发明所述的抑制新生血管生长的生物学作用适用于预防和治疗血管增生性疾病,包含但不限于视网膜黄斑、新生血管瘤以及肿瘤的血管增生。
本发明所述的预防和治疗纤维化增生性疾病和血管增生性疾病的应用,是通过含缺失型hKGF-Ⅰ二硫键变构体重组蛋白的药物组合物来实现。
本发明所述的药物组合物适用于各种给药方式,例如口服给药、静脉内给药、肌肉内给药、局部给药、经皮给药、经鼻给药等。根据所采用的给药方式,可将含有本发明缺失型hKGF-Ⅰ二硫键变构体重组蛋白的药物组合物制成合适的剂型,其中包含在有效剂量范围的缺失型hKGF-Ⅰ二硫键变构体重组蛋白和至少一种药学上可接受的药用载体。
本发明所述的适当剂型的实例包含但不限于片剂、胶囊、粒剂、糖浆、口服溶液、气雾胶、鼻喷剂、滴眼剂、缓控释剂、透皮制剂、用于皮肤表面的油膏和药贴、以及可用于注射的无菌溶液等。
含有本发明缺失型hKGF-Ⅰ二硫键变构体重组蛋白的药物组合物可以制成无菌液体或者冻干粉末,优选地,用于胃肠外给药。
本发明所述的适当剂型中还可含有其它常规组分,如防腐剂、稳定剂、表面活性剂、缓冲剂、乳化剂、增甜剂、着色剂、调味剂、调节渗透压的盐等等。本发明药物组合物中使用的稳定剂优选柠檬酸钠、甘氨酸、甘露醇等。含有本发明药物组合物的无菌液体或者冻干粉末更优选的配方包括:缺失型hKGF-Ⅰ二硫键变构体重组蛋白0.1-5.0mg,甘露醇15-60mg,甘氨酸0.1-8.0mg,pH3.0-6.0,液体配方还含有注射用水0.5-2.0ml。
若有特殊治疗要求,本发明所述的药物组合物还可包含其他活性药理成分,这种相伴使用有利于疾病的预防和治疗。
本发明所述的药物组合物中,缺失型hKGF-Ⅰ二硫键变构体重组蛋白的用量可以在一个较大范围内变动,本领域技术人员可以根据一些已知的因素,诸如疾病的种类、病情严重程度、病人体重、剂型、所选给药途径等很容易的加以确定。每日用量根据制剂和治疗目的的不同而有较大差异,通常的人体用量范围为1.0-100μg/kg,但不限于此范围。
至此已对本专利进行了详细的描述,通过参考下面的实施例能够更清楚地理解本发明,所述实施例仅为说明目的而并不旨在对本发明进行限制。
附图说明
附图1:缺失型hKGF-Ⅰ二硫键异构体中不同二硫键配对的计算机模拟分子构象比较图。其中,图A为不含二硫键的Δ23hKGF-Ⅰ的构象图,图B为含Cys79-Cys83二硫键的Δ23hKGF-Ⅰ的构象图,图C为含Cys17-Cys83二硫键的Δ23hKGF-Ⅰ二硫键变构体的构象图,图D为不含二硫键的Δ23S79hKGF-Ⅰ的构象图,图E为含Cys17-Cys83二硫键的Δ23S79hKGF-Ⅰ二硫键变构体的构象图。
附图2:缺失型hKGF-Ⅰ二硫键异构体中不同二硫键配对的圆二色谱(CD)比较图。其中,图A为不含二硫键的Δ23hKGF-Ⅰ的CD图,图B为含Cys79-Cys83二硫键的Δ23hKGF-Ⅰ的CD图,图C为含Cys17-Cys83二硫键的Δ23hKGF-Ⅰ二硫键变构体的CD图,图D为不含二硫键的Δ23S79hKGF-Ⅰ的CD图,图E为含Cys17-Cys83二硫键的Δ23S79hKGF-Ⅰ二硫键变构体的CD图。
附图3:NBL-7细胞株体外生物学活性测定刺激细胞生长最大百分率示意图。其中,A为对照品hKGF-Ⅰ,B为Δ23突变体,C为Δ23-M变构体,D为Δ23S79-M变构体。
附图4:HSC细胞体外生物学活性测定刺激或抑制细胞生长最大百分率示意图。其中,A为对照品hbFGF,B为Δ23突变体,C为Δ23-M变构体,D为Δ23S79-M变构体。
附图5:HUVEC细胞体外生物学活性测定刺激或抑制细胞生长最大百分率示意图。其中,A为对照品hVEGF,B为Δ23突变体,C为Δ23-M变构体,D为Δ23S79-M变构体。
附图6:CCl4肝损伤SD大鼠慢性肝纤维化模型中预防给药各实验组的病理照片(VG染色)。其中,图A为模型对照组,图B为Δ23突变体组,图C为Δ23-M变构体组,图D为Δ23S79-M变构体组。
附图7:CCl4肝损伤SD大鼠慢性肝纤维化模型中治疗给药各实验组的病理照片(Masson染色)。其中,图A为正常对照组,图B为模型对照组,图C为Δ23突变体组,图D为Δ23-M变构体组,图E为Δ23S79-M变构体组。
附图8:博莱霉素肺损伤SD大鼠急性肺纤维化模型中各实验组的病理照片(HE染色)。其中,图A为正常对照组,图B为模型对照组,图C为Δ23突变体组,图D为Δ23-M变构体组,图E为Δ23S79-M变构体组。
附图9:鸡胚绒毛尿囊膜新生血管生长实验照片示意图。其中,图A为生理盐水组,图B为bFGF组,图C为Δ23S79-M变构体组。
附图10:cDNA测序图谱结果。其中,图A为pET-3C-Δ23的测序报告,其中的第35位至第454位为Δ23hKGF-Ⅰ的cDNA序列;图B为pET-3C-Δ23S79测序报告,其中的第46位至第465位为Δ23S79hKGF-Ⅰ的cDNA序列。
附图11:Δ23S79hKGF-M二硫键变构体的胰蛋白酶酶切质量肽图色谱图。其中,图A为非还原肽图,图B为还原肽图。
附图12:家兔角膜损伤修复实验中各组的角膜病理显微照片图(HE染色)。其中,图A为模型对照组,图B为bFGF对照组,图C为Δ23S79-M变构体组。
具体实施方式
实施例一:编码人野生型KGF-Ⅰ的cDNA序列的获得
根据天然野生型hKGF-Ⅰ的氨基酸和cDNA序列(GI:186738),并按照大肠杆菌偏爱的密码子,设计以下SeqIDNo:3的碱基序列(共489bp),委托宝生物(大连)有限公司(TAKARA,大连)进行全基因合成,嵌入pUC18载体且命名为pUC18-KGF。
TGCAATGACATGACTCCTGAACAAATGGCTACCAATGTCAACTGTTCCTCTCCGGAGCGCCACACCCGGAGTTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGTGTTCGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAACGTGGTAAAGTTAAAGGTACCCAGGAAATGAAAAACAACTACAACATCATGGAAATCCGTACCGTTGCTGTTGGTATCGTTGCTATCAAAGGTGTTGAATCTGAGTTCTACCTGGCTATGAACAAAGAAGGTAAACTGTACGCTAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAACTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCTTCTGCTAAATGGACCCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAGGTATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTCACTTCCTGCCGATGGCTATCACC。
实施例二:缺失型Δ23hKGF-Ⅰ重组质粒和工程菌株的构建
根据Δ23hKGF-Ⅰ的氨基酸序列(SeqIDNo:1)设计并合成引物P1和P2:
P1:5′-gCATATgTACgACTACATggAAggTggTgAC-3′(SeqIDNo:4)
P2:5′-gggATCCTCAggTgATagCCATCgg-3′(SeqIDNo:5)
P1为Δ23正向引物,其中g为保护碱基,CATATg为NdeⅠ酶切位点;
P2为Δ23反向引物,其中g为保护碱基,ggATCC为BamHⅠ酶切位点。
以pUC18-KGF质粒为模板,用引物P1和P2扩增Δ23hKGF-Ⅰ基因片段。PCR反应条件为:94℃1min,56℃1min,72℃1min,共30个循环,第一个循环94℃变性10min,最后一个循环72℃延伸10min,结果显示获得了420bp的扩增片段。PCR产物经低熔点琼脂糖回收后,用NdeⅠ和BamHⅠ双酶切,回收目的片段,再用T4DNA连接酶与质粒pET-3C(购于Invitrogen)同样经NdeⅠ和BamHⅠ酶切回收的片段连接,转化大肠杆菌克隆宿主菌Top10,用酶切和PCR验证的方法筛选重组质粒pET-3C-Δ23。经DNA测序(TAKARA,大连)证明重组质粒中Δ23hKGF-Ⅰ的cDNA序列正确后(附图10A图),转化大肠杆菌表达宿主菌BL21Star(DE3)plysS(Novagen),成功构建pET-3C-Δ23/BL21Star(DE3)plysS重组表达工程菌。
实施例三:突变型Δ23S79hKGF-Ⅰ重组质粒和工程菌株的构建
根据Δ23S79hKGF-Ⅰ的氨基酸序列(SeqIDNo:2)设计并合成两对引物:
P3:5′-gCATATgTACgACTACATggAAggTggTgAC-3′(SeqIDNo:4)
P4:5′-gggATCCTCAggTgATagCCATCgg-3′(SeqIDNo:5)
P5:5′-gCTAAAAAAgAATCCAACgAAgACC-3′(SeqIDNo:6)
P6:5′-TTCgTTggATTCTTTTTTAgCgTA-3′(SeqIDNo:7)
P3为正向引物,与P1相同;
P4为反向引物,与P2相同;
P5为正向引物,用于对应于天然序列第102位Ser点突变的扩增;
P6为反向引物,用于对应于天然序列第102位Ser点突变的扩增。
以pET-3C-Δ23质粒为模板,用引物P3和P6扩增含突变点的5′端的cDNA片段,用引物P4和P5扩增含突变点的3′端的cDNA片段。再将扩增后得到的两个片段混合后作为模板,用引物P3和P6扩增含Ser突变位点的Δ23S79hKGF-Ⅰ基因片段(420bp)。PCR产物经低熔点琼脂糖回收后,用NdeⅠ和BamHⅠ双酶切,回收目的片段,再用T4DNA连接酶与质粒pET-3C(购于Invitrogen)同样经NdeⅠ和BamHⅠ酶切回收的片段连接,转化大肠杆菌克隆宿主菌Top10,用酶切和PCR验证的方法筛选重组质粒pET-3C-Δ23S79。经DNA测序(TAKARA,大连)证明重组质粒中Δ23S79hKGF-Ⅰ的cDNA序列正确后(附图10B图),转化大肠杆菌表达宿主菌BL21Star(DE3)plysS(Novagen),成功构建pET-3C-Δ23S79/BL21Star(DE3)plysS重组表达工程菌。
实施例四:缺失型突变体Δ23和Δ23S79hKGF-Ⅰ的微生物大规模培养
将表达最佳的pET-3C-Δ23/BL21Star(DE3)plysS和pET-3C-Δ23S79/BL21Star(DE3)plysS重组工程菌划线接种于LA琼脂平板,37℃培养过夜。从过夜培养的LA平板上挑取菌苔接种于含LB液体培养基(胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl10g,加水定容至1000ml,121℃,高压灭菌30min)试管中,37℃培养12小时,然后按1%的比例转接到含200mlLB培养液的1000ml三角瓶中,37℃培养过夜即成为上罐种子液。将上罐种子液按5%的比例接种于含YT培养液(胰蛋白胨4g/L,酵母提取物3g/L,Na2HPO4·12H2O30g/L,KH2PO43g/L,NaCl1g/L,MgSO4·7H2O1g/L,葡萄糖8g/L,121℃,高压灭菌30min)的30L发酵罐中,37℃培养,整个发酵过程中,通过调节转速、通空气量、通纯氧量来保持溶氧在30%以上,用28%的氨水调节pH并保持在7.0。至菌液OD600达到10~14时,加入终浓度为0.2mM的IPTG,继续培养4小时后停止发酵,收集菌液,8000rpm离心10分钟,弃上清,收集菌体放入-20℃冰箱保存备用。
实施例五:缺失型突变体Δ23和Δ23S79hKGF-Ⅰ重组蛋白的分离纯化
(1)破菌:
从-20℃冰箱中取出菌体,放入细菌裂解液(50mMPB,pH7.0,10mMEDTA,0.2g/L溶菌酶),37℃低速搅拌1小时,冷却后超声(400W,工作时间5s,间歇5s,超声40个循环),12000rpm离心10分钟,弃沉淀,取上清。
(2)粗纯化:
将破菌上清用CM-SepharoseFF柱层析进行粗纯化。用平衡液(50mMPB,pH7.0)平衡后,破菌上清上样,复平衡。用含50mMPB的0~500mM的NaCl线性梯度洗脱,收集含目的蛋白的洗脱峰。
(3)精纯化:
将粗纯化收集的目的蛋白洗脱峰,用HeparinCL-6B亲和柱层析进行精纯化。用平衡液(50mMPB,pH7.0)平衡后,上CM-SepharoseFF分离纯化的目的蛋白,用含50mMPB的0~1000mM的NaCl线性梯度洗脱,收集含目的蛋白的洗脱峰。
将纯化后的二种重组蛋白经12%的聚丙酰胺凝胶电泳后,考马斯亮蓝显示分子量约为16KD的单一条带,纯度均大于95%,C18柱RP-HPLC检测均为单一色谱峰。纯化制备的Δ23和Δ23S79hKGF-Ⅰ重组蛋白经过N端序列分析,其N端15个氨基酸序列均为Ser-Tyr-Asp-Tyr-Met-Glu-Gly-Gly-Asp-Ile-Arg-Val-Arg-Arg-Leu,与理论序列一致;MALDI-TOF质谱测定的分子量分别为16279.8和16263.7,与理论分子量一致。
实施例六:含Cys17-Cys83非天然二硫键的Δ23-M和Δ23S79-M变构体的制备
将纯度达95%以上的Δ23和Δ23S79hKGF-Ⅰ重组蛋白溶液(Heparin亲和层析后),调节pH至10.5,加入终浓度5mM的DTT,4℃反应2h。再透析过夜(透析液为20mM乙醇胺,pH10.5)后,补入终浓度0.2mM的菲洛林铜离子复性液,25℃搅拌反应2h,补入10mM的EDTA,25℃搅拌反应1h。
复性液经过C18制备型RP-HPLC(流动相A液为5%乙腈、0.1%三氟乙酸;流动相B液为95%乙腈、0.1%三氟乙酸;洗脱条件为A液从100%至0%,B液从0至100%),分离除去未形成Cys17-Cys83二硫键的其它蛋白,得到纯度95%以上的二硫键变构体Δ23-M和Δ23S79-M重组蛋白。
实施例七:二硫键变构体Δ23S79-M和Δ23-M的二硫键配对分析
原理:缺失型hKGF-Ⅰ二硫键变构体Δ23S79-M蛋白的氨基酸序列中仅含有两个Cys残基(第17位和第83位),本发明通过特有的二硫键配对复性方法,促使第17位与第83位的Cys之间形成一对非天然二硫键,即Cys17-Cys83二硫键(对应于天然野生型hKGF-Ⅰ的Cys40-Cys106二硫键)。为了证明Cys17-Cys83非天然二硫键已正确形成,通过选用专一性强的胰蛋白酶进行酶切后,再用还原剂(TCEP)进行酶切后肽段的还原处理。采用液质联用的质谱分析还原处理前后的各个肽段的差异,从而确定其中参与二硫键形成的肽段以及Cys的配对形式。
Δ23S79hKGF-M经胰蛋白酶酶切的理论肽段序列表
方法:将Δ23S79-M样品透析除盐后冻干,用1%NH4HCO3溶解成2mg/ml,取0.9ml样品两份,分别补加入50μl胰蛋白酶(质量比1∶50,sigma公司),37℃反应24小时。一份样品再补加入0.4MTCEP10μl,另一份样品再补加入相同体积纯化水,37℃反应30min,再经RP-HPLC液相色谱质谱联用仪(LC1100,MSDG1956B,Agilent公司)分析两个样品的质量肽图,记录RP-HPLC色谱图,并记录经质谱测定的各色谱图中肽段的分子量。
结果:Δ23S79-M非还原肽图(附图11A图)分析发现,保留时间为19.185分钟的肽段的分子量为1621.4道尔顿,通过与酶切理论肽段的序列表对比,未发现肽段与之对应。而TCEP处理后的还原肽图(附图11B图),保留时间为19.185分钟的肽段消失,同时增加了保留时间分别为17.994分钟和22.053分钟的新肽段色谱峰,分子量分别为538.2和1085.3道尔顿,与酶切理论肽段的序列表对比发现,这两个肽段分别为序号为4和17的LFCR和ESNEDCNFK。两者均含有Cys残基,前者Cys位于第17位,后者Cys位于第83位,证明该二个肽段由Cys17和Cys83形成一对二硫键,在非还原肽图中出现保留时间为19.185分钟的肽段。该二个肽段形成二硫键后肽段分子量之和为1621.5道尔顿,与保留时间为19.185分钟的肽段的分子量完全一致。
采用同样方法证明Δ23-M中的二硫键配对位于第17位和第83位Cys之间。
实施例八:体外生物学活性测定
样品:Δ23:形成Cys79-Cys83天然二硫键的rhKGF-Ⅰ突变体;
Δ23-M:形成Cys17-Cys83非天然二硫键的rhKGF-Ⅰ变构体;
Δ23S79-M:形成Cys17-Cys83非天然二硫键的rhKGF-Ⅰ变构体。
对照品:hKGF-Ⅰ,购于NIBSC,每支10μg或1×104IU;
hbFGF,购于中国药品生物制品检定所,每支40μg或1×105IU;
hVEGF,购于R&D公司,每支100μg。
(1)貂肺上皮细胞株NBL-7测活
将上述各样品和hKGF-Ⅰ对照品用含0.25%胎牛血清的1640培养基稀释至1μg/ml,每个样品按1∶4梯度稀释8个浓度。将NBL-7细胞按每孔3.0×103个的细胞量,接种于96孔细胞培养板,在37℃、5%CO2条件下置于二氧化碳培养箱培养过夜。吸净上清后各孔依次加入上述不同稀释浓度的样品和对照品,相同条件继续培养48~72h。取出后每孔加MTT10μl染色,再培养4~6h后弃掉培养液,每孔加入100μl的DMSO,振荡混匀后在570nm波长下测定各孔OD值。与空白对照组相比,计算对照品和样品刺激细胞生长的最大百分率,其中hKGF-Ⅰ对照品的刺激细胞生长率为210%,Δ23的刺激细胞生长率为194%,Δ23-M和Δ23S79-M刺激细胞生长率分别为160%和142%(附图3)。
(2)人肝星状细胞(HSC)测活
将上述各样品和hbFGF对照品用含2.0%胎牛血清的MEM培养基稀释至1μg/ml,每个样品按1∶4梯度稀释8个浓度。将HSC细胞按每孔1.0×104个的细胞量,接种于96孔细胞培养板,在37℃、5%CO2条件下置于二氧化碳培养箱培养过夜。吸净上清后各孔依次加入上述不同稀释浓度的样品和对照品,相同条件继续培养72h。取出后每孔加MTT10μl染色,再培养4~6h后弃掉培养液,每孔加入100μl的DMSO,振荡混匀后在570nm波长下测定各孔OD值。与空白对照组相比,计算对照品和样品刺激或抑制细胞生长的最大百分率,其中hbFGF对照品的刺激细胞生长率达80%,Δ23刺激细胞生长率达18%;而Δ23-M和Δ23S79-M抑制HSC细胞生长,最大抑制率分别为54%和69%(附图4)。
(3)人脐静脉内皮细胞(HUVEC)测活
将上述各样品和hVEGF对照品用含0.5%胎牛血清的1640培养基稀释至1μg/ml,每个样品按1∶4梯度稀释8个浓度。将HUVEC细胞按每孔5.0×103个的细胞量,接种于96孔细胞培养板,在37℃、5%CO2条件下置于二氧化碳培养箱培养过夜。吸净上清后各孔依次加入上述不同稀释浓度的样品和对照品,相同条件继续培养48h。取出后每孔加MTT10μl染色,再培养4~6h后弃掉培养液,每孔加入100μl的DMSO,振荡混匀后在570nm波长下测定各孔OD值。与空白对照组相比,计算对照品和样品刺激或抑制细胞生长的最大百分率,其中hVEGF对照品的刺激细胞生长率达57%,Δ23样品对HUVEC细胞无明显作用;而Δ23-M和Δ23S79-M抑制HUVEC细胞生长,最大抑制率分别为32%和41%(附图5)。
实施例九:家兔角膜损伤修复实验
取健康家兔24只,随机分为4组,每组6只,分别为溶媒对照组、bFGF对照组、Δ23-M变构体组和Δ23S79-M变构体组。采用对侧眼自身对照法和组间对照进行实验,在实验前24h,检查每只家兔两眼的刺激性体征,并用检眼镜检查角膜、结膜有无损伤,所有兔眼用2%荧光素钠溶液染色,检查证实没有角膜损伤。
将家兔左眼睑拉成杯状,于眼结膜囊内滴入无水乙醇,第1天滴入0.135ml(即3滴),第2天0.09ml,第3天0.045ml,轻合眼睑约10s,右眼滴加相同体积的生理盐水作对照。自第4天起,各组家兔左眼滴入0.135ml含相应药物(50μg/ml)的滴眼液或生理盐水,右眼滴加生理盐水作对照,上、下午各一次,连续滴加14天,其中第7天和第14天做眼刺激评分(包括角膜、虹膜、结膜的损伤及充血、水肿以及分泌物),并于第14天取角膜做病理切片。病理结果见附图12,眼刺激评分结果见下表。
眼刺激性评价结果分值越高,说明眼刺激性越严重。病理结果显示,Δ23-M和Δ23S79-M二硫键变构体组的角膜恢复良好,无血管增生,纤维排列尚整齐,有部分水肿。而bFGF对照组具有明显的角膜血管增生和角膜过度增生。结果表明,Δ23-M和Δ23S79-M能促进角膜损伤后的修复作用,同时抑制纤维和血管增生。
实施例十:CCl4诱导的SD大鼠慢性肝纤维化模型实验
(一)预防给药
取SD大鼠(180g-240g)50只,随机分为5组,每组10只,分别为正常对照组、模型对照组、Δ23突变体组、Δ23-M变构体组和Δ23S79-M变构体组,每日皮下注射2mg/kg相同剂量。除正常对照组外,其余各组于实验第1天开始灌服20%CCl4(灌胃量为2ml/kg体重),以后每隔3天灌胃1次。30天后,取血清测定谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST),同时解剖大鼠取出肝脏,取肝部分左叶固定于10%中性甲醛液,常规石蜡包埋,作HE和Masson染色,显微镜下观察,记录肝纤维增生程度。剩余肝组织于-20℃冻存,用于测定羟脯氨酸含量。
病理组织切片结果见附图6。病理组织切片结果显示,与模型组相比,Δ23突变体组的抗纤维化作用不明显,而Δ23-M和Δ23S79-M组的动物肝纤维化明显减轻。从下表中可见该两组中转氨酶ALT和AST、羟脯氨酸含量均显著低于模型组。
(二)治疗给药
取SD大鼠70只,于实验第1天开始灌胃20%CCl4(灌胃量为2ml/kg体重),以后每天灌服1次。连续42天后,取6只动物做病理切片并测定羟脯氨酸含量,证实有明显肝纤维化形成后,随机分成4组,每组10只,分别为模型对照组、Δ23突变体组、Δ23-M变构体组和Δ23S79-M变构体组,每日皮下注射2mg/kg相同剂量,每日一次,连续给药30天。实验结束时,取血清测定ALT、AST和TP,同时解剖取出肝脏,取部分左肝固定,作切片进行HE和Masson染色,显微镜下观察记录肝纤维增生程度。剩余肝组织于-20℃冻存,用于测定羟脯氨酸含量。
病理组织切片结果见附图7。病理结果显示,Δ23-M和Δ23S79-M二种二硫键变构体均能逆转动物已形成肝纤维化,且Δ23S79-M更优于Δ23-M,而Δ23突变体与模型组相比,仅轻度减轻肝纤维化程度。羟脯氨酸含量测定结果同样证明变构体可减轻并逆转肝纤维化。同时Δ23-M和Δ23S79-M具有降低转氨酶和提高血总蛋白(TP)的作用。从下表中可见该两组中转氨酶ALT和AST、羟脯氨酸含量均显著低于模型组。
实施例十一:博莱霉素诱导的SD大鼠急性肺纤维化模型实验
取SD大鼠(180g-240g)50只,随机分为5组,每组10只,分别为正常对照组、模型对照组、Δ23突变体组、Δ23-M变构体组和Δ23S79-M变构体组。除正常对照组外,其余各组于实验第1天手术游离大鼠气管,气管内一次性注入等容积博莱霉素(Bleomycin,BLMA5,剂量为5mg/kg体重),注药后将动物直立并旋转,使药物在肺内均匀分布。
手术后第5天,各药物组分别皮下注射相应药物(2mg/kg/d),正常对照组和模型对照组皮下注射相同体积的生理盐水。每日给药一次,连续15天后,处死动物,完整分离出气管和肺,称重;观察肺纤维化形成的病理变化;取左肺固定于10%中性甲醛液,常规石蜡包埋,作HE和Masson染色,显微镜下观察,记录肺纤维增生程度。病理组织切片结果见附图8,病理结果显示,Δ23-M和Δ23S79-M二硫键变构体组的的肺组织中肺泡结构基本完整,无明显炎症细胞浸润和肺水肿,肺间质中无明显的纤维增生和增厚。而模型组肺组织中有明显炎症细胞浸润、水肿和充血,肺间质变厚和纤维增生。结果证明,Δ23-M和Δ23S79-M变构体组除了对肺组织损伤有保护作用外,尚有抑制肺纤维的显著作用。Δ23突变体组纤维化程度比模型组略轻,但明显差于Δ23-M和Δ23S79-M变构体组。
实施例十二:鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验
选用6日龄鸡胚50只,随机分为5组,每组10只,分别为生理盐水对照组、bFGF阳性对照组、Δ23突变体组、Δ23-M变构体组和Δ23S79-M变构体组。除去气室顶端蛋壳,加3~5滴无菌生理盐水在蛋壳膜上,暴露出CAM。无菌条件下分别加入浸有相应药物(10μg/ml)或生理盐水的1.5mm×1.5mm的滤纸片,然后将蛋壳用无菌胶布封口,继续在37℃孵化3天后,取下覆盖物,暴露出CAM,解剖显微镜下照相。用CMIASII图像分析软件进行滤纸片周围血管计数,计算每组的平均血管数。实验照片结果见附图9,实验结果见下表。
结果显示,Δ23-M和Δ23S79-M二硫键变构体组可显著抑制鸡胚CAM的新生血管生长,同时bFGF具有明显促进新生血管增生的作用,而Δ23突变体组对新生血管作用不明显。