CN113214375B - 一种抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂及其纯化方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂及其纯化方法和应用，抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂N端前10个氨基酸序列如SEQ NO：1所示，氨基酸全序列如SEQ NO：2所示，DNA序列如SEQ NO：3所示。将僵蚕水煎液冻干粉溶于缓冲溶液中，经硫酸铵分步盐析法获得硫酸铵沉淀物，采用以家蚕溶茧酶为配体的亲和色谱进行分离获得初步纯化的僵蚕溶茧酶抑制剂，经凝胶过滤色谱分离获得更高纯度的僵蚕溶茧酶抑制剂，经快速蛋白液相色谱分离获得高纯度僵蚕溶茧酶抑制剂。本发明首次从僵蚕水煎液中分离纯化出僵蚕溶茧酶抑制剂，解决了僵蚕水煎液成分复杂，抗肝癌药效物质及其含量不明确，无法适应现代临床注射或局部穿刺给药的缺陷，具有显著抑肝癌细胞增殖活性。

Description

一种抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂及其纯化方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种活性蛋白，特别地，涉及一种抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂及其纯化方法和应用。

背景技术

原发性肝癌恶性程度高、预后差、发病率与死亡率高，已上升为我国第二位癌症杀手，研发有效治疗肝癌的新药始终是生物医学技术领域需要迫切解决的问题。中药僵蚕是蚕蛾科昆虫家蚕（Bombyxmori Linnaeus）4～5龄的幼虫感染白僵菌（Beauveriabassiana(Bals.) Vuillant）而致死的干燥体，被列入中国药典，具有息风止痉，祛风止痛，化痰散结等功效。僵蚕单独或与其它中药配伍用于治疗多种肿瘤性疾病。在中国的一些地区僵蚕作为一种民间药用于治疗癌症。关于僵蚕的抗肿瘤作用已有一些文献报道。僵蚕乙醇提物对体外培养的Hela细胞增殖具显著抑制作用。僵蚕中麦角甾醇、β-谷甾醇、棕榈酸3 种成分具有抗小鼠黑素瘤细胞B16-F10和人黑色素瘤细胞A375增殖活性。僵蚕水煎煮提取物对小鼠肉瘤细胞S180、小鼠艾氏腹水瘤细胞，以及人肝癌细胞体外增殖有抑制作用（Cho HD, MinHJ, Won YS, et al. Solid state fermentation process with Aspergilluskawachiienhances the cancer-suppressive potential of silkworm larva in hepatocellularcarcinoma cells[J]. BMC Complement Altern Med, 2019, 19(1): 241.）；以僵蚕水煎剂灌胃，制备大鼠含药血清，该血清能抑制肝癌细胞Hepa1-6 体外增殖与侵袭（Yuan L,Bing Z, Han J, et al. Study on the anti-tumor mechanism related to immunemicroenvironment of BombyxBatryticatus on viral and non-viral infections ofhepatocellular carcinoma[J]. Biomed Pharmacother, 2020, 124: 109838.）。

综上，僵蚕水煎液及其制备的含药血清对人肝癌细胞体外增殖有抑制作用。但是，僵蚕水煎液成分复杂，抗肝癌药效物质及其含量不明确，无法适应现代临床注射或局部穿刺给药的应用要求，特别是有关僵蚕抗肿瘤活性小分子量蛋白组分的研究未见报道。

因此，从僵蚕水煎液中提取或分离具有抗肝癌细胞活性蛋白组分具有重要意义。

发明内容

针对现有技术中存在的僵蚕水煎液成分复杂，抗肝癌药效物质及其含量不明确的问题，本发明提供了一种活性蛋白，特别地，涉及一种抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂及其纯化方法和应用，提取纯化的抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂具有体内、外抑制SMCC-7721人肝癌细胞增殖活性，解决了现有技术中抗肝癌候选药物发现的技术难题。

本发明通过以下技术方案实现：

一种抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂，所述的抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂N端前10个氨基酸序列如SEQ NO：1所示，应用飞行时间质谱法测得的分子量为13973.63Da，应用Edman降解法测得的其N端前10个氨基酸序列，抑制活性动力学分析结果表明，它是溶茧酶的非竞争性抑制剂，Km值在76.50左右，对家蚕溶茧酶活性的摩尔抑制比近似为1：1；根据僵蚕溶茧酶抑制剂的分子量大小、N端前10个氨基酸序列，以及应用Blastp程序对nr数据库和家蚕基因组数据库的检索结果，确定僵蚕溶茧酶抑制剂是家蚕基因组数据库中的一种蛋白水解酶抑制剂的截短蛋白，其氨基酸全序列如SEQ NO：2所示，其编码DNA的全序列为SEQ NO：3所示。

本发明中，所述的抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂的提纯方法，包括以下步骤：

（1）将僵蚕水煎液的冻干粉溶于缓冲溶液中，经硫酸铵分步盐析法获得的硫酸铵沉淀物，沉淀物采用以家蚕溶茧酶为配体的亲和色谱进行分离，获得初步纯化的僵蚕溶茧酶抑制剂；

（2）步骤（1）中的初步纯化的僵蚕溶茧酶抑制剂溶于缓冲溶液中，经凝胶过滤色谱柱，分离获得更高纯度的僵蚕溶茧酶抑制，进一步经快速蛋白液相色谱分离，获得高纯度僵蚕溶茧酶抑制剂。

进一步地，步骤（1）中所述的硫酸铵沉淀物为85%饱和度的硫酸铵沉淀。

进一步地，步骤（1）中所述的家蚕溶茧酶是家蚕蛹羽化成蛾后由蚕蛾的下颚合成分泌的一种丝氨酸蛋白酶。

进一步地，步骤（1）所述的以家蚕溶茧酶为配体的亲和色谱是将溴化氰活化的Sepharose CL-4B葡聚糖凝胶与适量的溶茧酶偶联，制成亲和载体，以之作为色谱填料填充于色谱柱中制成亲和色谱柱。

进一步地，步骤（2）所述的凝胶过滤色谱为Sephadex G-50凝胶过滤色谱；所述的蛋白液相色谱分离柱为Superdex 75蛋白液相色谱分离柱。

进一步地，步骤（1）和（2）中所述的缓冲溶液为50.00 mmol·L^-1，pH 8.0，Tris-HCl缓冲液。

本发明中，所述的抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂在丝氨酸蛋白酶抑制剂中的应用。

本发明中，所述的抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂在抗肿瘤药物中的应用。

进一步地，所述的抗肿瘤药物为抗肝癌药物，在体外条件下，该抑制剂对体外培养的SMCC-7721人肝癌细胞增殖具有显著抑制作用，抑制活性呈现浓度依赖效应；在体内条件下，该抑制剂能够明显抑制裸鼠SMCC-7721移植瘤细胞的生长，抑制活性呈现剂量依赖性，抑制剂可以单独给药，或者以各种组合形式给药，可以根据需要制备成各种剂型，使用途径及使用剂量不受限制。

尽管从家蚕基因组数据库中检索到一种内含本发明涉及的僵蚕溶茧酶抑制编码序列的蛋白水解酶抑制剂，但是该蛋白水解酶抑制剂是大规模基因组测序的分析结果，未有真实分离纯化出该种蛋白的技术研究报道，这种蛋白的来源、分量子大小以及其N端氨基酸序列特征，与本发明涉及的僵蚕溶茧酶抑制剂完全不同。本发明从僵蚕中分离纯化出的具有抗肝癌活性的溶茧酶抑制剂属原始创新发现。

人肝癌细胞膜上存在丝氨酸蛋白酶抑制剂受体，抑制剂与之结合能够调节基质丝氨酸蛋白酶的活性，抑制蛋白酶对基质蛋白的分解作用，修复细胞屏障，阻断肝癌细胞的浸润和转移。家蚕溶茧酶是家蚕蛹羽化成蛾后由蚕蛾的下颚合成分泌的一种丝氨酸蛋白酶，用于溶解茧丝，在封闭的茧壳上形成羽化孔，以帮助蚕蛾脱茧而出。家蚕蛾溶茧酶[GenBank: BAJ46146.1 ]已实现成功分离纯化和基因的克隆与表达（本专利第一发明人的研究成果）。本专利应用以家蚕蛾溶茧酶为配体的亲和色谱技术作为主要分离手段，从僵蚕水提取物中分离纯化出一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，研究了该抑制剂的理化性质、酶学特性，及其体内、外抑制SMCC-7721人肝癌细胞增殖活性，分析了它的丝氨酸蛋白酶抑制活性与抗肿瘤活性的关系与机制，为白僵蚕在中医临床上用于肿瘤性疾病的治疗，以及应用僵蚕溶茧酶抑制剂研发治疗肝癌的新药奠定基础。

有益效果

（1）本发明依次应用以家蚕溶茧酶为配体的亲和色谱、Sephadex G-50凝胶过滤色谱、Superdex 75快速蛋白液相色谱，首次从僵蚕水煎煮液的硫酸铵沉淀物中分离纯化出僵蚕溶茧酶抑制剂，解决了僵蚕水煎液成分复杂，抗肝癌药效物质及其含量不明确，无法适应现代临床注射或局部穿刺给药的应用要求的缺陷；

（2）本发明首次发现僵蚕溶茧酶抑制剂具有显著抑肝癌细胞体外增殖与体内荷瘤裸鼠的肿瘤生长的活性，为治疗肝癌的新药研发提供了新的候选药物。

附图说明

图1. 僵蚕溶茧酶抑制剂纯化过程的亲和色谱（A）与Sephadex G50凝胶过滤色谱（B）层积图；

图2. 僵蚕溶茧酶抑制剂纯化过程的Superdex 75快速蛋白液相色谱图；

图3. 僵蚕溶茧酶抑制剂纯化过程的12% SDS-PAGE电泳鉴定图谱；

图4. 僵蚕溶茧酶抑制剂的飞行时间质谱图；

图5. 僵蚕溶茧酶抑制剂的N端10个氨基酸的Edman降解法测序图谱；

图6. 僵蚕溶茧酶抑制剂与其他6种含相似序列蛋白的系统发育树；

图7. 僵蚕溶茧酶抑制剂残留活力曲线图；

图8. 僵蚕溶茧酶抑制剂抑制活性动力学分析曲线；

图9. 僵蚕溶茧酶抑制剂给药36h对SMCC-7721细胞增殖与外部形态的影响（放大倍数，×100）。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是进一步说明本发明的特征及优点，而不是对本发明进行限制。

以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，本发明中的实验操作通常是按照常规实验条件进行，如Sambrook等人著，分子克隆：实验室指南（New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989）中所述条件，试剂使用可按照制造厂商所附说明使用。

实施例1

僵蚕溶茧酶抑制剂的提取、分离与纯化：

（1）僵蚕溶茧酶抑制剂的提取：称取适量的符合中国药典一部（2020版）质量标准的白僵蚕，适当粉碎后加入适量水煎煮，煎煮液经过滤除渣后，滤液冷冻干燥，加入10倍体积的提取缓冲液（50.00 mmol·L^-1，pH 8.0，Tris-HCl缓冲液），匀浆提取，离心（10,464×g，10min），收集上清液，沉淀物重复提取2次，合并3次上清液，冷冻干燥，得白僵蚕粗蛋白冻干粉；

（2）僵蚕溶茧酶抑制剂的硫酸铵分步盐析法分离：取适量上述白僵蚕冻干粉溶于适量的提取缓冲溶液中，离心（10,464×g，10min），收集上清液，缓慢加入硫酸铵调节饱和度至25%，25℃下温和搅拌30min，离心（10,464×g，10min），收集沉淀物，得25%饱和度的硫酸铵沉淀，上清液重复以上操作，得55%、85%饱和度的硫酸铵沉淀，其中85%饱和度的硫酸铵沉淀物于4 ℃下透析36 h，离心（10,464×g，10min），上清液冷冻干燥，冻干粉即为粗僵蚕溶茧酶抑制剂（僵蚕溶茧酶抑制剂粗蛋白盐析分离及其溶茧酶抑制活性检测结果如表1所示）；

（3）僵蚕溶茧酶抑制剂的亲和色谱：选择家蚕溶茧酶（溶茧酶是家蚕蛾在羽化的过程中分泌的一种丝氨酸蛋白水解酶，用于水解蚕茧先端形成羽化孔，使蚕蛾脱茧而出）作为亲和色谱的配体；将CNBr活化的Sepharose CL-4B与适量的溶茧酶偶联，制成亲和载体，将适量粗僵蚕溶茧酶抑制剂溶于适量平衡缓冲溶液（50.00 mmol/L，pH8.0，Tris-HCl）中，4℃离心（10,464×g，10min），上清液加样于亲和色谱柱（1.60×20.00 cm，柱体积约35.00mL，柱床高17.00cm），37℃保温1h，依次用含1.00mol·L^-1NaCl的平衡缓冲液、蒸馏水、氯化氢溶液（pH2.4）洗柱，收集洗脱液，用Tris碱（2.00 mol.L^-1）中和，重复加样，合并Tris碱中和液，透析，冻干，获得基本纯化的僵蚕溶茧酶抑制剂（僵蚕溶茧酶抑制剂纯化过程的亲和色谱图如图1（A）所示）；

（4） 僵蚕溶茧酶抑制剂的凝胶过滤色谱：将适量亲和色谱冻干粉以适量洗脱液（50.00 mmol·L^-1Tris-HCl缓冲液，pH8.0）溶解，加样于Sephadex G-50凝胶过滤色谱柱（1.60×60.00 cm，柱体积约114.00 mL，柱床高56.00 cm），洗脱液流速1.00 mL.min^-1，检测各洗脱峰的溶茧酶抑制活性，收集具有溶茧酶抑制活性的蛋白峰组分，收集液经透析和冻干后，获得更高纯度的僵蚕溶茧酶抑制剂（僵蚕溶茧酶抑制剂纯化过程的Sephadex G50凝胶过滤色谱图如图1（B）所示）。

（5）僵蚕溶茧酶抑制剂的快速蛋白质液相色谱：将以上僵蚕溶茧酶抑制剂活性蛋白峰进一步做Superdex 75 Increase 10/300 G L FPLC分析，用2倍体积的50 mmol·L^-1pH8.0 TrisHCl缓冲液平衡色谱柱，上样后收集1.2倍柱体积的洗脱液，每管1 mL，流速0.50mL·min^-1，检测280 nm的紫外吸收值，蛋白峰用Ultra-46K浓缩，检测各洗脱峰溶茧酶抑制活性，收集具有溶茧酶抑制活性的蛋白峰，收集液经透析和冻干后，获得高度纯化的僵蚕溶茧酶抑制剂（僵蚕溶茧酶抑制剂纯化过程的Superdex 75快速蛋白液相色谱图如图2所示），冻干粉用SDS-PAGE检测蛋白纯度（僵蚕溶茧酶抑制剂12% SDS-PAGE电泳鉴定图谱如图3所示），纯化的僵蚕溶茧酶抑制剂-20 ℃保存。

僵蚕溶茧酶抑制剂的纯化过程中蛋白含量及抑制活性分析如表2所示。

表1 僵蚕溶茧酶抑制剂粗蛋白盐析分离及其溶茧酶抑制活性检测

表2 僵蚕溶茧酶抑制剂的纯化过程蛋白含量及抑制活性分析

。

实施例2

僵蚕溶茧酶抑制剂的序列分析

僵蚕溶茧酶抑制剂样品经PAGE电泳后转膜，剪下主带，；采用飞行时间质谱法测定僵蚕溶茧酶抑制剂的分子量（僵蚕溶茧酶抑制剂的飞行时间质朴图如图4所示），测得其分子量为13973.63Da。应用ABI 491A氨基酸测序仪以Edman降解法测定僵蚕溶茧酶抑制剂的N端10个氨基酸序列SEQ NO：1（僵蚕溶茧酶抑制剂的N端10个氨基酸的Edman降解法测序图谱如图5所示）；根据僵蚕溶茧酶抑制剂的分子量大小、N端前10个氨基酸序列，以及应用Blastp程序对nr数据库和家蚕基因组数据库的检索结果，确定僵蚕溶茧酶抑制剂是家蚕基因组数据库中的一种蛋白水解酶抑制剂的截短蛋白，其氨基酸全序列为SEQ NO：2，其编码DNA的全序列为SEQ NO：3；应用BLASTp程序检索nr数据库，设定E值范围为0-100，共检索到6个100 %相似度蛋白（僵蚕溶茧酶抑制剂的N端氨基酸序列BLASTp相似度检索结果如表3所示），以Grishin(protein)为距离采用Fast Minimum Evolution方法建立系统发育树（僵蚕溶茧酶抑制剂与其他6种含相似序列蛋白的系统发育树如图6所示），由此发现僵蚕溶茧酶抑制剂与一种家蚕蛾蛋白酶抑制剂（NP_001040294.1）、一种野桑蚕未表征蛋白（XP_028028609.1）、一种黄杆菌BFFFF2蛋白高度同源，但4者分子量不同，不是同种蛋白，本发明从中药僵蚕中分离纯化出僵蚕溶茧酶抑制剂属首次报道。特别说明的是，尽管从家蚕基因组数据库中检索到一种内含本发明涉及的僵蚕溶茧酶抑制编码序列的蛋白水解酶抑制剂，但是该蛋白水解酶抑制剂是大规模基因组测序的分析结果，未有真实分离纯化出该种蛋白的技术研究报道，这种蛋白的来源、分量子大小以及其N端氨基酸序列特征，与本发明涉及的僵蚕溶茧酶抑制剂完全不同，本发明从僵蚕中分离纯化出的具有抗肝癌活性的溶茧酶抑制剂属原始创新发现。

表3 僵蚕溶茧酶抑制剂的N端氨基酸序列BLASTp相似度检索结果汇总表（E值0-100）

。

实施例3

僵蚕溶茧酶抑制剂的抑制活性动力学分析

配制2.00 nmol·mL^-1（28.00μg·mL^-1）和3.00 nmol·mL^-1（42.00μg·mL^-1）的僵蚕溶茧酶抑制剂溶液，各取1.00 mL分别与2.00 mL 60.00μg·mL^-1的溶茧酶溶液（相当于2.50nmol·mL^-1）混合，分别加入2.00，4.00，6.00，8.00，10.00，12.00，14.00，16.00和18.00μL的底物BApNA溶液（10.00 mmol·L^-1），保温5 min后用0.50 mL 33 %的乙酸溶液终止反应，测A₄₁₀值，应用Origin 2018 64bit软件中抑制剂动力学分析子程序，直接以MichaelisMenten模型作图，计算K_m、V_max、Ki值；僵蚕溶茧酶抑制剂残留活力曲线图如图7所示，结果显示：在含5 nM溶茧酶的反应体系中，僵蚕溶茧酶抑制剂在0.00-5.00nM范围内对溶茧酶抑制活性线性相关，二者摩尔抑制比约为1：1，质量抑制比约为1：1.71，在3种僵蚕溶茧酶抑制剂浓度（0.00、2.00、3.00 nM）反应体系的K_m值相近，分别为：76.76，76.40，76.35，而V_max值则随僵蚕溶茧酶抑制剂含量增加而下降，分别为：46.50，27.76，18.53，僵蚕溶茧酶抑制剂抑制活性动力学分析曲线如图8所示，结果显示：僵蚕溶茧酶抑制剂为溶茧酶的非竞争性抑制剂。

实施例4

僵蚕溶茧酶抑制剂的对人肝癌细胞（SMCC-7721）体外增殖抑制作用

取对数生长期SMCC-7721细胞接种到96孔细胞培养板，接种密度为1×10⁵cells·mL^-1，每孔100.00μL，培养24h后给药，僵蚕溶茧酶抑制剂浓度分别为：500.00，250.00，100.00μg·mL^-1，每个剂量设置6个复孔，给药36 h后，加入10.00μL 5.00 g·L^-1的MTT，继续培养4 h，吸除各培养孔上清后，加入150.00μL DMSO充分溶解，用酶标仪测定各培养孔490 nm吸光度值；计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率（%）=（1-给药组平均吸光度值/对照组平均吸光度值）×100%；应用SPSS13.0软件计算僵蚕溶茧酶抑制剂的IC₅₀，僵蚕溶茧酶抑制剂对SMCC-7721细胞体外增殖的抑制作用如表4所示，结果显示僵蚕溶茧酶抑制剂对SMCC-7721增殖具有显著抑制作用，抑制活性呈现浓度依赖效应，应用逻辑回归求得僵蚕溶茧酶抑制剂在给药36 h后的IC₅₀为260.52 μg/mL；

表4 僵蚕溶茧酶抑制剂对SMCC-7721细胞体外增殖的抑制作用

研究僵蚕溶茧酶抑制剂给药36h对SMCC-7721细胞增殖与外部形态的影响，结果如图9所示，500μg·mL^-1僵蚕溶茧酶抑制剂剂量组给药36h的细胞形态显示：给药组细胞贴壁面积收缩减少，细胞核固缩，细胞质粗糙，核分裂较少，细胞数量与对照相比显著减少，大量细胞悬浮死亡，而对照组细胞外部形态正常，贴壁生长良好。

实施例5

僵蚕溶茧酶抑制剂对人肝癌细胞（SMCC-7721）体内增殖抑制作用

用DMEM调配对数生长期的SMCC-7721的细胞密度为5.00×10⁶ /mL。取0.10 mL的细胞悬液于背部皮下注射6只BALB/C裸鼠，根据肿瘤生长状况饲养约20d后处死小鼠，选择生长良好的肿瘤组织，切成小块（重约～40.00 mg），加入0.20 mL生理盐水,用穿刺针移植于裸鼠左侧腋窝，约1周后将肿瘤生长良好的荷瘤裸鼠随机分为5组，每组6只；阴性对照组于瘤周皮下注射0.20 ml生理盐水（10.00 mL·kg^-1），每天一次；阳性对照组于瘤周皮下注射16.00μL的5-Fu注射液原液（25.00 mg·mL^-1），隔天一次，注射剂量为20.00 mg·kg^-1；处理组分作低、中、高3个僵蚕溶茧酶抑制剂剂量组，分别于瘤周皮下注射0.20 mL用生理盐水溶解的僵蚕溶茧酶抑制剂药液，每天1次，注射剂量分别为50.00、25.00、12.50 mg·kg^-1。连续给药14d后，比较各组肿瘤重量，计算肿瘤抑制率。各组裸鼠处死前称重，处死后无菌采集各组裸鼠脾脏称重，计算脾脏指数：脾脏指数=10×脾脏重量（mg）/体重（g）；僵蚕溶茧酶抑制剂处理组间差异比较应用SPSS软件做均匀方差分析与t检验，实验数据用平均数±标准差表示，p<0.05示试验结果有统计学显著差异；僵蚕溶茧酶抑制剂对SMCC-7721荷瘤裸鼠瘤重和脾脏指数的影响如表5所示，结果显示：僵蚕溶茧酶抑制剂能够明显抑制SMCC-7721移植瘤细胞生长，抑制活性呈现剂量依赖性；与对照组相比，僵蚕溶茧酶抑制剂低剂量组的抑瘤率有所降低，但无差异显著性，僵蚕溶茧酶抑制剂中、高剂量组和阳性药物组的抑瘤率显著高于对照组；僵蚕溶茧酶抑制剂中剂量组与5-Fu组相比抑瘤率无显著差异，但僵蚕溶茧酶抑制剂高剂量组的抑瘤率显著高于5-Fu组。僵蚕溶茧酶抑制剂各剂量组对裸鼠脾脏指数影响差异不显著。

表5 僵蚕溶茧酶抑制剂对SMCC-7721荷瘤裸鼠瘤重和脾脏指数的影响

。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明的实施，对于本领域的研究人员来说，本发明可以有各种更改。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、改进、组合等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>山东中医药大学

<120>一种抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂及其纯化方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213>僵蚕(Bombyx Batryticatus)

<400> 1

Val Arg Asn Lys Arg Gln Ser Asn Asp Asp

1 5 10

<210> 2

<211> 128

<212> PRT

<213>僵蚕(Bombyx Batryticatus)

<400> 2

Val Arg Asn Lys Arg Gln Ser Asn Asp Asp Asp Asp Val Leu Asp Asp

1 5 10 15

Arg Tyr Gly Trp Glu Leu Thr Thr Arg Pro Pro Arg Gln Phe Pro Gly

20 25 30

Gln Gly Phe Phe Pro Gly Leu Phe Pro Gly Gln Gly Gln Phe Pro Gly

35 40 45

Gln Gln Gln Arg Leu Thr Thr Thr Arg Ala Pro Asn Asn Leu Gly Thr

50 55 60

Thr Thr Met Ser Pro Ala Ile Gln Gln Cys Ile Arg Ser Cys Pro Val

65 70 75 80

Thr Ala Glu Tyr Asn Pro Val Cys Gly Thr Asp Asn Ile Thr Tyr Asn

85 90 95

Asn Pro Gly Arg Leu Thr Cys Ala Gln Ala Cys Gly Ile Asn Val Ser

100 105 110

Val Leu Arg Ser Leu Pro Cys Pro Thr Ala Thr Gln Ala Pro Thr Ser

115 120 125

<210> 3

<211> 387

<212> DNA

<213>僵蚕(Bombyx Batryticatus)

<400> 3

gtaaggaaca agcgtcagtc gaatgatgat gatgacgttc tcgatgaccg ctatggctgg 60

gagcttacca cccggcctcc aaggcagttc cctgggcaag gatttttccc cggtctattc 120

cccggccagg gtcagttccc aggacaacag caacgtttaa ctacgactcg ggctcccaac 180

aatctgggca ccaccacaat gtcgcctgca attcaacaat gcattcgtag ctgcccagta 240

accgctgagt acaatccagt ttgtggcact gataatataa cttacaataa ccctggaagg 300

ttgacgtgtg ctcaggcgtg tggaatcaat gtcagcgttc tccgatccct gccttgcccc 360

actgctacac aagctcctac cagctaa 387

Claims (4)

1.一种抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂，其特征在于，所述的抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂N端前10个氨基酸序列如SEQ NO：1所示；所述的抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂氨基酸全序列如SEQNO：2所示；所述的抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂DNA序列如SEQ NO：3所示。

2.一种权利要求1所述的抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂的提纯方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）僵蚕溶茧酶抑制剂的提取：白僵蚕粉碎后加入水煎煮，过滤除渣，滤液冷冻干燥，加入10倍体积的缓冲液，匀浆提取，离心收集上清液，沉淀物重复提取2次，合并上清液，冷冻干燥，得白僵蚕粗蛋白冻干粉；

（2）僵蚕溶茧酶抑制剂的硫酸铵分步盐析法分离：取步骤（1）中的白僵蚕冻干粉溶于缓冲液中，离心收集上清液，缓慢加入硫酸铵调节饱和度至25%，25℃下温和搅拌30min，离心收集沉淀物，得25%饱和度的硫酸铵沉淀，上清液重复以上操作，得55%、85%饱和度的硫酸铵沉淀，85%饱和度的硫酸铵沉淀物于4 ℃下透析36 h，离心，上清液冷冻干燥，得粗僵蚕溶茧酶抑制剂；

（3）僵蚕溶茧酶抑制剂的亲和色谱：选择家蚕溶茧酶作为亲和色谱的配体，将CNBr活化的Sepharose CL-4B与家蚕溶茧酶偶联，制成亲和载体，将步骤（2）中的粗僵蚕溶茧酶抑制剂溶于缓冲液中，4℃离心，上清液加样于亲和色谱柱，37℃保温1h，依次用含1.00mol·L^-1NaCl的平衡缓冲液、蒸馏水、pH2.4氯化氢溶液洗柱，收集洗脱液，用2.00 mol .L^-1Tris碱中和，重复加样，合并Tris碱中和液，透析，冻干，获得基本纯化的僵蚕溶茧酶抑制剂；

（4）僵蚕溶茧酶抑制剂的凝胶过滤色谱：将步骤（3）中基本纯化的僵蚕溶茧酶抑制剂溶于缓冲液中，加样于Sephadex G-50凝胶过滤色谱柱，流速1.00 mL .min^-1，检测各洗脱峰的溶茧酶抑制活性，收集具有溶茧酶抑制活性的蛋白峰组分，收集液经透析和冻干后，获得更高纯度的僵蚕溶茧酶抑制剂；

（5）僵蚕溶茧酶抑制剂的快速蛋白质液相色谱：步骤（4）中更高纯度的僵蚕溶茧酶抑制剂

进一步做Superdex 75 Increase 10/300 G L FPLC分离，用2倍体积的缓冲液平衡色谱柱上样后收集1.2倍柱体积的洗脱液，每管1 mL，流速0 .50mL·min-1，检测各洗脱峰溶茧酶抑制活性，收集具有溶茧酶抑制活性的蛋白峰，收集液经透析和冻干后，获得高度纯化的僵蚕溶茧酶抑制剂；

步骤（3）中所述的家蚕溶茧酶是家蚕蛹羽化成蛾后由蚕蛾的下颚合成分泌的一种丝氨酸蛋白酶；

所述的缓冲溶液为50.00 mmol·L^-1，pH 8.0，Tris-HCl缓冲液。

3.一种权利要求1所述的抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂在制备丝氨酸蛋白酶抑制剂中的应用。

4.一种权利要求1所述的抗肿瘤僵蚕溶茧酶抑制剂在制备抗肝癌药物中的应用。

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