CN107459568B - 一种Musca domestica cecropin 衍生肽M27-39及其应用 - Google Patents
一种Musca domestica cecropin 衍生肽M27-39及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种Musca domestica cecropin衍生肽M27‑39及其应用，衍生肽M27‑39由Musca domestica cecropin的第27～39位而得，序列如SEQ ID NO：1所示。采用固相化学合成法获得Musca domesticacecropin M27‑39衍生肽粗品；使用反相高效液相色谱和电喷射质谱法对合成的多肽进行纯化和鉴定。根据本发明的衍生肽与天然Musca domestica cecropin相比，不仅在抗HBV和抗肝癌方面具有显著优异的生理活性，而且与天然Musca domesticacecropin相比具有明显简单的结构，因此更易进入细胞，生产成本更少的优点。因此，包含根据本发明的衍生肽作为活性成分的药物组合物对治疗HBV感染、肿瘤等有效，市场前景非常广阔。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种Musca domestica cecropin 衍生肽M27-39及其应用，具体应用在抗HBV和抗肝癌方面。
背景技术
乙型肝炎病毒 (Hepatitis B virus, HBV) 为嗜肝病毒，全球约20亿人有过HBV感染经历，3.5亿人为慢性HBV感染者，大约80%的患者有不同程度的肝细胞受损，并可能发展成肝硬化和肝癌。每年死于乙肝相关疾病(肝硬化、肝癌等)的人数高达100多万，WHO已将HBV感染列为全球十大最常见致死病因之一。我国属HBV高流行区，一般人群HBsAg携带率高达7.18%。肝癌是世界上发病率第二高的疾病，属于高度恶性肿瘤，是中国的多发病和重大疾病，尽管采取手术切除、放/化疗综合疗法，死亡率仍高居不下。2013年，世界卫生组织宣布原发性肝癌引发全球745517人死亡，我国每年约有38.3万人死于肝癌，占全球肝癌死亡病例数的51%。据调查，我国因慢性乙型肝炎及其相关疾病 (肝硬化、肝癌等) 每年造成的直接经济损失高达1122.8亿元人民币。这不仅严重影响人民身体健康，而且给国家带来了严重的社会和经济负担。因此针对HBV和肝癌的药物研究，对降低肝癌、HBV感染相关疾病的发病率和病死率具有重大的社会和经济意义。
抗菌肽（Antimicrobial peptides, AMP）是生物免疫系统产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子多肽，广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内，其中昆虫抗菌肽cecropin是人类发现最早的一类抗菌肽。抗菌肽具有一系列引人注目的生物学活性，包括抗菌、抗炎、抗病毒、抗寄生虫、抑制肿瘤细胞及免疫调节活性等。抗菌肽能够破坏细菌细胞膜或穿过细胞膜作用于胞内靶位点，作用机制独特，不易产生耐药性，对正常人体细胞毒、副作用小。因此在传统抗菌、抗病毒和抗肿瘤药物研发和临床效果不尽如人意的现今，抗菌肽的上述特点使其显示出了良好的应用开发前景。
Musca domestica cecropin 是广东药科大学/广东省生物活性药物研究重点实验室从家蝇幼虫脂肪体 cDNA 文库中克隆的一种昆虫抗菌肽，该基因的ORF 区全长为192bp，可编码 63 个氨基酸的前体蛋白，1～23 位氨基酸是以保守 4 肽结尾的信号肽，其成熟肽含有 40 个氨基酸，具有较强的抗菌效果和较广的抗菌谱。 Musca domesticacecropin 作用机制涉及通过破坏细菌的细胞膜，使菌细胞内容物外泄，胞内DNA 也可能是其作用靶点。
发明内容
本发明的目的在于对Musca domestica cecropin进行改造，获得一种效果更好、生产成本更低的Musca domestica cecropin 衍生肽M27-39。
本发明的另一个目的在于提供Musca domestica cecropin 衍生肽M27-39在制备抗HBV和/或抗肝癌药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种Musca domestica cecropin 衍生肽M27-39，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明研发设计的Musca domestica cecropin 衍生肽M27-39与天然 Musca domestica cecropin 相比，具有更显著的抗HBV活性和抗肝癌活性，取得了意想不到的技术效果。
作为优选实施方案，如上所述的Musca domestica cecropin 衍生肽M27-39的制备方法如下：
S1.取Musca domestica cecropin的第27～39位氨基酸序列；
S2.采用固相化学合成法，通过多肽合成仪合成多肽粗品；
S3.将合成的多肽使用反相高效液相色谱进行纯化，并利用电喷射质谱法对合成的多肽进行鉴定，完成多肽的制备。
如上所述的Musca domestica cecropin 衍生肽 M27-39在制备治疗HBV 感染和/或抗肝癌药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
通过本方法制备的Musca domestica cecropin 衍生肽 M27-39 的实验技术简单，对获得的 Musca domestica cecropin 衍生肽 M27-39 进行抗 HBV 和抗肝癌活性检测，发现Musca domestica cecropin 衍生肽 M27-39 与天然 Musca domestica cecropin相比，具有更显著的抗HBV活性和抗肝癌活性。
附图说明
图1为Musca domestica cecropin 衍生肽 M27-39的高效液相色谱图。
图2为Musca domestica cecropin 衍生肽M27-39的质谱图。
图3显示 Musca domestica cecropin 衍生肽M27-39与天然Musca domesticacecropin相比具有更显著的抗HBV活性。
图4 显示Musca domestica cecropin 衍生肽M27-39与天然Musca domesticacecropin相比具有更显著的抗肝癌活性。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
Musca domestica cecropin 衍生肽M27-39的设计：Musca domestica cecropin衍生肽M27-39的氨基酸序列为：VAQQAANVAATLK。通过截取Musca domestica cecropin第27～39位的氨基酸，设计得到Musca domestica cecropin 衍生肽M27-39，衍生肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，含有13个氨基酸，理论等电点为8.72，理论分子量为1325.54，推测半衰期为100小时，不稳定指数为17.52，GRAVY指数为0.469。
实施例2
固相化学合成法合成Musca domestica cecropin 衍生肽M27-39：Musca domestica cecropin 衍生肽 M27-39 的制备从 C 端到 N 端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X ( X是 Musca domestica cecropin 衍生肽 C 端的第一个氨基酸)接入到Wang 树脂，然后脱去 Fmoc 基团后得到X-Wang 树脂；再将 Fmoc-Y-Trt-OH (9- 芴甲氧羧基- 三甲基-Y，Y 为Musca domestica cecropin 衍生肽 C 端第二个氨基酸) ；按照这个程序依次从 C 端合成到 N 端，直至合成完毕，得到脱去 Fmoc 基团的侧链保护的树脂；在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃ 避光下反应 2 h，过滤；沉淀 TFA ( 三氟乙酸) 洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入 10 倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃ 沉淀 3 h，析出白色粉末物，以 2500 g 离心 10 min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由 TFA、水和 TIS ( 三异丙基氯硅烷)按照质量比 95:2.5:2.5 混合而成；使用 0.2 mol/L 硫酸钠 ( 磷酸调节至pH7.5) 进行柱平衡 30 min，用 90% 乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18 反相常压柱，采用梯度洗脱 ( 洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30 :70 ～ 70 :30 混合)，流速为1 mL/min，检测波为220 nm，收集主峰，冻干；再利用反相 C18 柱进一步纯化，洗脱液 A 为 0.1% TFA/水溶液；洗脱液 B 为 0.1% TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为 25% B ～ 40% B，洗脱时间为 12min，流速为1 mL/min，再同上收集主峰，冻干；将上述得到的抗菌肽经过反相高效液相色谱和电喷雾质谱法分析，反相高效液相色谱图如图 1 所示，质谱图如图 2 所示，结果显示Musca domestica cecropin 衍生肽 M27-39 的纯度大于95% ，分子量为 1327.16，与理论分子量基本一致。
实施例3
Musca domestica cecropin 衍生肽M27-39体外抗HBV活性测定：以HepG2.2.15细胞为模型，评价Musca domestica cecropin和Musca domestica cecropin 衍生肽 M27-39体外抗HBV活性。HepG2.2.15 细胞是将完整双拷贝的乙型肝炎病毒基因转染到人肝癌细胞株 HepG 2细胞中，经 G418 筛选得到的肝胚瘤细胞系。该细胞能稳定分泌 HBsAg、HBeAg及 Dane 颗粒，并可在细胞内检测到 cccDNA，是目前体外研究乙肝病毒的复制规律和筛选抗乙肝病毒药物的理想细胞模型。
HepG2.2.15细胞培养于含10% 小牛血清的DMEM培养液中， HepG2.2.15细胞用G418（200 mg/L）定期筛选。对数生长期细胞消化后接种于细胞培养板内，每组设4个平行孔，共设3组：① HepG2.2.15细胞对照组，② HepG2.2.15细胞Musca domestica cecropin组，
HepG2.2.15细胞Musca domestica cecropin 衍生肽 M27-39组，37℃、5% CO2培养24h后移除培养液，加入含有药物的培养液，对照组加不含药物的培养液，继续培养至第9天，收集各组细胞上清备用，所有实验均重复3次。
取上述各组细胞上清，按商品化HBV Real-time PCR检测试剂盒说明书 (中山大学达安基因有限公司) 提取细胞DNA，进行荧光定量PCR，同时设立标准品管，PCR程序为：93℃预变性2 min，（93℃ 45 s，55℃ 60 s）10个循环，（93℃ 30 s，55℃ 45 s）30个循环。Mini Opticon荧光定量PCR仪检测标准品（104-107copies/mL）和样品的Ct值，应用标准品的Ct值制作标准曲线，并根据标准曲线计算出样品的HBV-DNA浓度。结果显示Musca domestica cecropin和Musca domestica cecropin 衍生肽 M27-39对HepG2.2.15细胞上清HBV-DNA均有显著的抑制作用，但Musca domestica cecropin 衍生肽 M27-39活性明显强于Musca domestica cecropin（图3）。
实施例4
Musca domestica cecropin 衍生肽M27-39对肝癌细胞增殖的影响：采用MTT法评价Musca domestica cecropin和Musca domestica cecropin 衍生肽 M27-39对HepG2.2.15细胞增殖的影响，具体方法如下：
HepG2.2.15细胞于37℃饱和湿度的恒温箱中5% CO2传代培养，培养基为含10% 胎牛血清，100 U/ml氨苄青霉素和100 U/ml链霉素的DMEM，当细胞生长接近80% 融合度时，用0.25% 胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，准确计数。
调整细胞浓度为1×105 cell/ml，接种于96孔细胞培养板（分3组，每组3个复孔），培养24小时待细胞贴壁后，弃培养液，分别加入含Musca domestica cecropin和Musca domestica cecropin 衍生肽 M27-39的培养液，阴性对照组加不含药物的培养液。
第3天弃培养基，用PBS洗板后，每孔加入10 μl的5 mg/ml MTT溶液和100 μl培养基置于恒温培养箱内继续培养4 h。取出培养板，弃去上清，每孔加入100 μl DMSO，将培养板振摇30 min。待MTT氧化产生的结晶完全溶解之后使用酶标仪测定OD值，测定波长为570/630 nm，实验重复3次，取平均值。MTT结果显示Musca domestica cecropin和Musca domestica cecropin 衍生肽 M27-39均具有抗肿瘤细胞增殖活性，但Musca domesticacecropin 衍生肽 M27-39活性明显强于Musca domestica cecropin（图4）。
对比例1
参考实施例1的步骤，截取Musca domestica cecropin第9～21位的氨基酸，设计得到Musca domestica cecropin 衍生肽M9-21，衍生肽的氨基酸序列为：KIERVGQHTRDAT（如SEQ ID NO:2所示）。
按照实施例3和4的方法，测定Musca domestica cecropin 衍生肽M9-21的体外抗HBV活性和肝癌细胞增殖抑制作用。结果显示Musca domestica cecropin 衍生肽 M9-21对HepG2.2.15细胞上清HBV-DNA的抑制作用很小，明显低于Musca domestica cecropin的抑制作用（见图3）。另外，Musca domestica cecropin 衍生肽 M9-21的抗肿瘤细胞增殖活性也比较差，显著低于Musca domestica cecropin（见图4）。
序列表
<110> 广东药科大学
<120> 一种Musca domestica cecropin 衍生肽M27-39及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> M27-39(M27-39)
<400> 1
Val Ala Gln Gln Ala Ala Asn Val Ala Ala Thr Leu Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> M9-21(M9-21)
<400> 2
Lys Ile Glu Arg Val Gly Gln His Thr Arg Asp Ala Thr
1 5 10
Claims (2)
1.Musca domesticacecropin衍生肽M27-39，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1 所述的Musca domestica cecropin 衍生肽M27-39在制备抗HBV感染和/或抗肝癌药物中的应用。
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