CN101314617B

CN101314617B - 一种新的蛇毒多肽及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101314617B
Application number: CN2008100295483A
Authority: CN
Inventors: 王广发; 吴少瑜; 张嘉杰; 饶进军; 徐伟; 吕琳; 吴曙光
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2008-07-18
Filing date: 2008-07-18
Publication date: 2011-05-04
Anticipated expiration: 2028-07-18
Also published as: CN101314617A

Abstract

本发明提供了一种新的蛇毒多肽，该多肽是从蝮蛇粗毒里提取出来的，其分子量为7554Da，N端1-15个氨基酸的序列如式I所示，式中E为谷氨酸，A为丙氨酸，D为天冬氨酸，N为天冬酰胺，C为胱氨酸，N表示氨基末端。本发明所述的蛇毒多肽具有很强的抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤的药物。N-EAEEDEDDDAAAANC (I)

Description

一种新的蛇毒多肽及其制备方法和应用

发明领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及一种新的蛇毒多肽。

背景技术

蛇毒是毒蛇蛇腺分泌的物质，具有多种药理作用，例如镇痛、止血、抑制血栓形成和抗肿瘤等，目前已有一些蛇毒制剂应用于临床。蛇毒是成分最复杂的一类动物毒物，每一种蛇毒所含的活性成分，粗略估计至少有20种，主要包括各种酶类和毒蛋白，大部分的活性组分直接进入体内都可能使机体产生严重的毒副作用，例如心脏毒性、神经毒性等，这些毒副作用是限制蛇毒制剂在临床治疗方面应用的主要原因。

随着各种相关学科的迅速发展，对蛇毒的研究层次逐渐从粗毒水平向蛇毒组分分离纯化及其功能研究的水平深入，研究热点也逐渐从研究较为透彻的蛇毒对神经系统、血液系统的作用方面转为抗肿瘤作用及机制方面。目前，从蛇毒中分离纯化了多种具有抗肿瘤作用的组分，这些组分主要是一些细胞毒素、磷脂酶A2和解离素。

蝮蛇在我国分布广泛，蝮蛇毒的来源丰富，价格相对便宜。根据文献报道，国内的学者只从蝮蛇毒中分离了一些神经生长因子、具有抗血小板聚集的多肽，国外的学者也只是从蝮蛇毒中分离出了一种具有细胞毒作用的神经毒素，而蝮蛇毒中抗肿瘤的高纯度的有效成分暂时还比较少。

国知局于2006年7月12日授权公告了一项发明专利(CN1800208)，该专利公开了一种从蝮蛇粗毒中分离出来的具有抗肿瘤作用的蛇毒多肽，其氨基酸序列为N-GEECDCGSPENPCCD，式中字母为单字母符号的氨基酸序列缩写，所代表的氨基酸残基的定义如下：S为丝氨酸、E为谷氨酸、N为天冬酰胺、D为天冬氨酸、P为脯氨酸、G为甘氨酸、C为半胱氨酸，端头N表示氨基末端。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的蛇毒多肽。

本发明的另一目的在于提供一种蛇毒多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明实现上述目的的技术方案是：

一种蛇毒多肽，该多肽的N-端1～15个氨基酸为：N-EAEEDEDDDAAAANC(I)，分子量为7554Da，可由以下方法制备得到：

用水充分溶解蝮蛇粗毒，离心取上清液，在HPLC层析系统上用C18反相柱进行层析，最后冷冻干燥，得白色粉末状物质即可，其中所述的层析的过程是：以乙腈和0.1％的三氟乙酸为流动相，在温度为20～28℃下以7ml/min的流速按以下程序进行梯度洗脱120min∶0.1％三氟乙酸的洗脱梯度为100％～20％递减，乙腈的洗脱梯度为0～80％递增；洗脱到50～60分钟时收集OD_210nm为0.5～2.0的组分；

上述式(I)中字母为单字母符号的氨基酸序列缩写，所代表的氨基酸残基的定义如下：E为谷氨酸、A为丙氨酸、D为天冬氨酸、N为天冬酰胺、C为半胱氨酸，N表示氨基末端。

本发明蛇毒多肽须在-20℃下保存。

本发明所述的蛇毒多肽具有较好的抗肿瘤作用，可用于制备抗肿瘤的药物。

为了更好的理解本发明，下面用本发明蛇毒多肽进行体外抑制肿瘤细胞增殖实验，其结果用来说明本发明蛇毒多肽在肿瘤治疗药物领域中的用途。

采用人肝癌细胞株Hep3B为模型进行本发明蛇毒多肽的抗肿瘤活性检测。具体方法如下所述。

一、体外抑制肿瘤实验

1、实验分组

本发明蛇毒多肽治疗组：采用本发明蛇毒多肽处理，本发明蛇毒多肽制备方法见实施例1；

阳性对照组：采用蝮蛇粗毒处理；

正常对照组：正常培养，不给予任何药物干预。

2、实验方法

1)Hep3B细胞培养生长至指数生长期时，即以0.25％胰蛋白酶消化，1000×g离心3min，细胞沉淀以10％FBS的DMEM培养基调整至5×10⁴/ml，96孔培养板每孔接种200ul，置于37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下培养24小时。

2)每组设5个复孔，每孔中加入10μl本发明蛇毒多肽，上述条件下继续培养6小时；实验重复3次。

3)细胞培养6小时后，每孔加入10μl的CCK-8(cell counting kit 8)试剂，37℃，5％CO2及饱和湿度条件下继续培养2小时。

4)用酶标仪测定在波长为450nm处的吸光度值(OD)，600nm作为参考波长，光密度越低代表存活细胞越少。

本发明蛇毒多肽的形态学结果见图1、图2和图3。正常培养Hep3B细胞呈单层生长，细胞密度均匀分布，细胞呈梭形生长良好。在培养细胞中加入蛇毒多肽2小时后，细胞与细胞之间间隙变宽，随着时间增加，间隙变大，整体细胞呈网状结构，出现单个细胞漂浮，本发明蛇毒多肽作用24小时以后，全部细胞漂浮。本发明蛇毒多肽对肿瘤细胞增殖的影响(各组OD₄₅₀)见表1。

表1本发明蛇毒多肽对Hep3B细胞增殖的影响

组别	1	2	3	4	5	均数±SD
							正常对照组(OD₄₅₀)	1.379	1.407	1.246	1.265	1.268	1.313±0.066
本发明治疗组(OD₄₅₀)	1.102	0.927	0.924	0.794	0.944	0.938±0.110
							粗毒治疗组(OD₄₅₀)	0.579	0.712	0.542	0.647	0.676	0.631±0.007

注：1、2、3、4、5为复孔。

二、动物实验

1、将S180瘤源小鼠于传代接种后10天在无菌条件下从腹腔抽出瘤液，用无菌生理盐水调整瘤细胞数至5×10⁶个/ml，。

2、21只小鼠(18-22g/只)，分别接种上述瘤液0.2ml于右大腿皮下后被随机分为本发明蛇毒多肽组，阳性对照组(蝮蛇粗毒治疗)和空白对照组。除空白组外，其余各组接种次日同时灌胃给药，给药量0.2ml，每日给药一次，连续10天，停药次日称重，解剖后剥离皮下瘤体，称瘤重。按下式计算抑瘤率(％)＝(空白组平均瘤重-给药组平均瘤重)/空白组平均瘤重×100％。

表2本发明化合物对荷S180小鼠肿瘤大小的影响

组别	剂量	瘤质量(g)	抑瘤率(％)
				空白	0	1.28±0.11	0
粗毒	2mg/kg	0.70±0.33	45.31
				本发明蛇毒多肽	2mg/kg	0.76±0.09	40.52

结果如表2所示，说明本发明蛇毒多肽对肿瘤有较好的抑制作用。

附图说明

图1是无本发明蛇毒多肽处理的对照Hep3B细胞形态学变化图。

图2是本发明蛇毒多肽处理6小时后引起的Hep3B细胞形态学变化图。

图3是本发明蛇毒多肽处理24小时后引起的Hep3B细胞形态学变化图。

图4是蝮蛇粗毒的高效液相分离图谱，蝮蛇粗毒经C18反相高效液相色谱层析和梯度洗脱，图中箭头所指为本发明蛇毒多肽。

图5是本发明蛇毒多肽纯度检测的高效液相图。

图6是本发明蛇毒多肽质谱图。

图7是本发明蛇毒多肽的N端部份氨基酸序列测定结果，从上至下，左侧：空白对照1，标准1，残基1E(Glu)；右侧：残基2A(Ala)，残基3E(Glu)，残基4E(Glu)。

图8是A本发明蛇毒多肽的N端部份氨基酸序列测定结果，从上至下，左侧：残基5D(Asp)，残基6E(Glu)，残基7D(Asp)；右侧：残基8D(Asp)，残基9D(Asp)，残基10A(Ala)。

图9是本发明蛇毒多肽的N端部份氨基酸序列测定结果。从上至下，左侧：残基11A(Ala)，残基12A(Ala)，残基13A(Ala)；右侧：残基14N(Asn)，残基15C(Cys)。

具体实施方法

制备例

方法：

1)尖吻蝮蛇粗毒20mg充分溶于500μl超纯水，4℃，5000rpm×5min离心，去除不溶性物质，取上清液备用。

2)用直径为5μm，孔径为300

的反相硅胶C18颗粒作为固定相充填剂，制成高效液相色谱C18反相制备柱(20×300mm)。色谱流动相为0.1％三氟乙酸和乙腈，流速为7ml/min，检测波长为210nm，在HPLC层析系统上，以0.1％三氟乙酸+乙腈为流动相，其中0.1％三氟乙酸洗脱梯度从100％-20％，乙腈洗脱梯度从0-80％，洗脱时间为120min，分离温度为25℃，在洗脱时间53分钟收集吸光度为0.5-2.0的组分。

图4为蝮蛇粗毒经C18反相高效液相色谱层析和梯度洗脱后的分离图谱，红色箭头所指为所收集的物质的峰，即本发明蛇毒多肽。

纯度鉴定：

1)色谱分析条件：色谱分析柱(C18反相分析柱4.6×250mm，江苏汉邦科技有限公司)，色谱柱固定相为反相硅胶C18颗粒，直径5μm，孔径300

(德国Merck公司)，流动相为0.1％三氟乙酸(TFA)+乙腈；流速为1ml/min；检测波长210nm；用0.1％TFA+乙腈作流动相梯度洗脱40min，0.1％TFA的洗脱浓度从100％-20％递减，乙腈的洗脱浓度从0-80％递增。

2)进样：将冻干的本发明蛇毒多肽用纯水溶解后，以10ug/ml进样。

3)检测与分析：用高效液相色谱层析系统Waters 2695进行分析，在波长为210nm处检测，以面积归一化积分方法计算本发明蛇毒多肽的纯度。

结果表3和如图5所示，在洗脱时间22分钟左右，出现单一的对称性的峰，纯度计算为98％。

表3

保留时间(分钟)	面积(微伏*秒)	高度(微伏)	％面积	％高
					22.261	11337867	1491115	98％	97.93％

分子量鉴定：

采用电喷雾质谱(Electrospray ionization mass spectrum，ESI-MS)测定蛇毒蛋白组份的分子量。

1、仪器与试剂

MicromassZQ电喷雾质谱仪(美国Waters公司)，Milli-Q纯水器(美国Millipore公司)，甲醇为色谱纯(德国Merck公司)。

2、方法

质谱条件：电喷雾离子源，正离子检测方式，毛细管电压3KV，椎孔电压30V，离子源温度108℃，毛细管温度180℃，去溶剂温度180℃，毛细管和去溶剂气体(N2)，流速350L/hr。

样品的准备：经高效液相色谱层析系统Waters 2695检测本发明蛇毒多肽蛋白组分溶液，分别与甲醇配成1∶10(v/v)溶液，直接进样。

3、数据分析：采集的数据用masslynx4.0进行分析，计算分子量，结果如图6所示，测得分子量为7554Da。

N-端氨基酸序列的测定方法：

采用EDMAN降解法来测定本发明蛇毒多肽的N端部份氨基酸序列，本实验在北京大学实验中心进行。结果如图7、8和9所示，N-端1-15个氨基酸是N-EAEEDEDDDAAAANC。

应用例

【制剂处方】

本发明蛇毒多肽 20g

微晶纤维素 48g

可溶性淀粉 30g

滑石粉 2g

共制1000片，每片含该化合物100mg。

【制备方法】

称取本发明蛇毒多肽20g，加可溶性淀粉稀释成50g，混匀，再称取微晶纤维素48g，用95％乙醇制软材，过筛制粒，低温50℃干燥，整粒，加入滑石粉2g，混匀，压片(每0.1g)，质检、包装，即得。

【用法用量】

每次2-3片，每日3次。

【适用人群】

适用各种肿瘤患者。

Claims

1.一种新的蛇毒多肽，该多肽的N端1～15个氨基酸为N-EAEEDEDDDAAAANC(Ⅰ)，分子量为7554Da，由以下方法制备得到：

用超纯水充分溶解尖吻蝮蛇粗毒，离心取上清液，在HPLC层析系统上用C18反相柱进行层析，最后冷冻干燥，得白色粉末状物质即可，其中所述的层析的过程是：以乙腈和0.1％的三氟乙酸为流动相，在温度为20～28℃下以7ml/min的流速按以下程序进行梯度洗脱120min：0.1％三氟乙酸的洗脱梯度为100％～20％递减，乙腈的洗脱梯度为0～80％递增；洗脱到50～60分钟时收集OD_210nm为0.5～2.0的组分；

式(Ⅰ)中字母为单字母符号的氨基酸序列缩写，所代表的氨基酸残基的定义如下：E为谷氨酸，A为丙氨酸，D为天冬氨酸，N为天冬酰胺，C为半胱氨酸，N-表示氨基末端。

2.权利要求1所述的蛇毒多肽在制备抑制肝癌细胞株Hep3B增殖或抑制S180瘤源小鼠肿瘤的药物中的应用。