CN1800208A

CN1800208A - 一种蛇毒多肽及其制备方法

Info

Publication number: CN1800208A
Application number: CN 200510120871
Authority: CN
Inventors: 吴少瑜; 徐伟; 李志琴; 张嘉杰; 万山河; 吴曙光
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2005-12-28
Filing date: 2005-12-28
Publication date: 2006-07-12
Anticipated expiration: 2025-12-28
Also published as: CN100335496C

Abstract

本发明蛇毒多肽及其制备方法属于生化与生物医药领域。本发明蛇毒多肽具有式(I)所示序列，分子量是7480Da。其制备方法是用蝮蛇粗毒在HPLC层析系统上用C18反相柱进行分离纯化，色谱条件是流动相0.1％的三氟乙酸和乙腈，流速为7ml/min，在梯度0～80％范围内进行梯度洗脱，洗脱时间为0～120min；检测波长为210nm，分离温度20～28℃。本发明蛇毒多肽具有很强的抗肿瘤活性，其制备方法简单方便。N－GEECDCGSPENPCCD (I)。

Description

一种蛇毒多肽及其制备方法

发明领域

本发明属于生化与生物医药领域，具体涉及蛇毒多肽及其制备方法。

背景技术

蛇毒是毒蛇蛇腺分泌的物质，具有镇痛、止血、抑制血栓形成和抗肿瘤等药理作用，并制成了一些蛇毒制剂应用于临床。但因为蛇毒是动物毒物中成分最复杂的一类，每一种蛇毒所含的活性成分，粗略估计至少有20种，主要包括各种毒素、酶以及活性多肽，大部分的活性组分直接进入体内都可能使机体产生严重的毒副作用，例如心脏毒性、神经毒性等，这些毒副作用是限制蛇毒制剂在临床治疗方面应用的主要原因。

随着生物化学、生物物理学和分子生物学等学科的迅速发展，对蛇毒的研究层次逐渐从粗毒水平向蛇毒组分分离纯化及其功能研究的水平深入，研究热点也逐渐从研究较为透彻的蛇毒对神经系统、血液系统的作用方面转为抗肿瘤作用及机制方面。目前，蛇毒中分离纯化了多种具有抗肿瘤作用的组分，这些组分主要是一些细胞毒素、磷脂酶A₂和解离素。

蝮蛇在我国分布广泛，从东北到华南十四个省的地区都有蝮蛇的分布，蝮蛇毒的来源丰富，价格相对便宜。根据文献报道，国内的学者只从蝮蛇毒中分离了一些神经生长因子、具有抗血小板聚集的多肽，国外的学者也只是从蝮蛇毒中分离出了一种具有细胞毒作用的神经毒素，而蝮蛇毒中抗肿瘤的高纯度的有效成分暂时没有得到。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤作用的蛇毒多肽。

本发明的另一目的在于提供一种具有抗肿瘤作用的蛇毒多肽的制备方法。

本发明蛇毒多肽具有如下序列：

N-GEECDCGSPENPCCD(SEQ ID NO.1)

上述式中字母为单字母符号的氨基酸序列缩写，所代表的氨基酸残基的定义如下：S为丝氨酸、E为谷氨酸、N为天冬酰胺、D为天冬氨酸、P为脯氨酸、G为甘氨酸、C为半胱氨酸，端头N表示氨基末端。

本发明蛇毒多肽，分子量为7480Da。

本发明所述的蛇毒多肽的制备方法，系将蝮蛇粗毒在HPLC层析系统上用C18反相柱进行分离纯化。

本发明所述的蛇毒多肽的制备方法，具体包括：蝮蛇粗毒充分溶于水，离心取上清液，在HPLC层析系统上用C18反相柱进行分离纯化，层析色谱条件是：流动相为0.1％的三氟乙酸和乙腈，流速为7ml/min，在梯度为0-80％范围内进行梯度洗脱，洗脱时间为120min；检测波长为210nm，分离温度为20-28℃。

本发明所述的高效液相色谱C18反相制备柱是用5μm，孔径为300的反相硅胶C18颗粒作为固定相充填剂制备得到。

为了更好的理解本发明，下面用本发明蛇毒多肽进行体外抑制肿瘤细胞增殖实验，其结果用来说明蛇毒多肽在肿瘤治疗药物领域中的用途。

采用人肝癌细胞株Hep3B为模型进行蛇毒多肽的抗肿瘤活性检测。具体方法如下所述。

实验方法

1)Hep3B细胞培养生长至指数生长期时，即以0.25％胰蛋白酶消化，1000×g离心3min，细胞沉淀以10％FBS的DMEM培养基调整至5×10⁴/ml，96孔培养板每孔接种200μl，置于37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下培养24小时。

2)每组设5个复孔，每孔中加入10μl蛇毒多肽，上述条件下继续培养6小时。实验重复3次。

3)细胞培养6小时后，每孔加入10μl的CCK-8(cell counting kit 8)试剂，37℃，5％CO₂及饱和湿度条件下继续培养4小时。

4)用酶标仪测定在波长为450nm处的吸光度值(0D)，600nm作为参考波长，细胞生长抑制率按公式：抑制率＝(对照孔OD值-实验孔OD值)/对照孔OD值)×100％计算。

结果见表1，形态学结果见图1、图2、图3。

表1 蛇毒多肽对Hep3B细胞增殖的影响

组别	1	2	3	4	5	均数±SD
组别	1	2	3	4	5	均数±SD	正常对照蛇毒多肽阳性对照	1.3791.0310.579	1.4071.0770.712	1.2461.0070.542	1.2651.1870.647	1.2681.2600.676	1.313±0.0661.112±0.1070.631±0.007

注：1、2、3、4、5为复孔。

正常培养Hep3B细胞呈单层生长，细胞密度均匀分布，细胞呈梭形生长良好。在培养细胞中加入蛇毒多肽一小时后，细胞与细胞之间开始出现空洞，随着时间延长，空洞变大，呈网状结构，细胞出现漂浮，至24小时以后，全部细胞漂浮。

本发明蛇毒多肽具有良好的抗肿瘤活性，小剂量就显示出较强的抑制肿瘤细胞生长的特性。本发明所述的制备蛇毒多肽所采用的一步分离法可以在上样量少、分离时间短、分离步骤少的情况下，得到高纯度的微量蛋白组分。

附图说明

图1无蛇毒多肽处理的对照Hep3B细胞形态学变化图。

图2蛇毒多肽处理6小时后引起的Hep3B细胞形态学变化图。

图3蛇毒多肽处理24小时后引起的Hep3B细胞形态学变化图。

图4蝮蛇粗毒的高效液相分离图谱，蝮蛇粗毒经C18反相高效液相色谱层析和梯度洗脱，箭头1所指为蛇毒多肽。

图5蛇毒多肽纯度检测的高效液相图，在洗脱时间为21min，蛇毒多肽为单一对称峰，纯度为95.67％。

图6蛇毒多肽质谱图。

图7蛇毒多肽的N端部份氨基酸序列测定图，其中从上至下，左侧是空白对照1，标准1，残基1G(Gly)；右侧是残基2E(Glu)，残基3E(Glu)，残基4C(Cys)。

图8蛇毒多肽的N端部份氨基酸序列测定图，其中从上至下，左侧是残基5D(Asp)，残基6C(Cys)，残基7G(Gly)；右侧是残基8S(Ser)，残基9P(Pro)，残基10E(Glu)。

图9蛇毒多肽的N端部份氨基酸序列测定图，其中从上至下，左侧是残基11N(Asn)，残基12P(Pro)，残基13C(Cys)；右侧是残基14C(Cys)，残基15D(Asp)。

具体实施方式

以下是本发明的实施例，参考实施例可更详细地说明本发明，而没有任何限制作用。

实施例1

1、分离纯化

1)蝮蛇粗毒20mg充分溶于500μl超纯水，4℃，5000rpm×5min离心，取上清进样。

2)用直径为5μm，孔径为300的反相硅胶C18颗粒作为固定相充填剂，制成高效液相色谱C18反相制备柱(20×300mm)，以0.1％三氟乙酸+乙腈为流动相，流速为7ml/min，检测波长为210nm，分离温度为20℃，在HPLC层析系统上，在0-80％范围内进行梯度洗脱，洗脱时间为120min。

4)自动收集器根据检测器的吸光度值按峰收集，收集后样品在冷冻干燥机进行冷冻干燥，冻干后在-20℃保存备用。结果如图4。

2、检测纯度：分离得到的组分用直径5μm，孔径300的C18反相分析色谱柱(4.6×250mm)对其纯度进行检测，流动相0.1％三氟乙酸(TFA)+乙腈；流速1ml/min；检测波长210nm，在0-40％的范围内进行梯度洗脱，洗脱时间是40min。纯度检测结果如图4、图5。

3、分子量测定：采用电喷雾质谱(Electrospray ionization mass spectrum，ESI-MS)测定抗肿瘤蛇毒多肽的分子量。分子量为7480Da。分子量如图6。

4、采用EDMAN降解法来测定抗肿瘤蛇毒多肽N端部份氨基酸序列。抗肿瘤蛇毒多肽N-端15个氨基酸序列依次为GEECDCGSPENPCCD(SEQ ID NO.1)。氨基酸序列测定结果如图7、图8、图9所示。

实施例2

1)蝮蛇粗毒40mg充分溶于500μl超纯水，4℃，6000rpm×5min离心，取上清进样。

2)用直径为5μm，孔径为300的反相硅胶C18颗粒作为固定相充填剂，制成高效液相色谱C18反相制备柱(20×300mm)。色谱流动相为0.1％三氟乙酸和乙腈，流速为7ml/min，检测波长为210nm，分离温度为25℃，在HPLC层析系统上，以0.1％三氟乙酸+乙腈为流动相，在0-80％范围内进行梯度洗脱，洗脱时间为120min。。

3)自动收集器根据检测器的吸光度值按峰收集，收集后样品在冷冻干燥机进行冷冻干燥，冻干后在-20℃保存备用。

实施例3

1)尖吻蝮蛇粗毒20mg充分溶于500μl超纯水，4℃，5000rpm×5min离心，去除不溶性物质，取上清液备用。

2)用直径为5μm，孔径为300的反相硅胶C18颗粒作为固定相充填剂，制成高效液相色谱C18反相制备柱(20×300mm)。色谱流动相为0.1％三氟乙酸和乙腈，流速为7ml/min，检测波长为210nm，在HPLC层析系统上，以0.1％三氟乙酸+乙腈为流动相，在0-80％范围内进行梯度洗脱，洗脱时间为120min，分离温度为28℃。

3)自动收集器根据检测器的吸光度值按峰收集，收集后样品在冷冻干燥机进行冷冻干燥，冻干后在-20℃保存2备用。

Claims

1、一种蛇毒多肽，其特征在于具有如下序列：

N-GEECDCGSPENPCCD(SEQ ID NO.1)，

式中S为丝氨酸、E为谷氨酸、N为天冬酰胺、D为天冬氨酸、P为脯氨酸、G为甘氨酸、C为半胱氨酸，端头N表示氨基末端。

2、权利要求1所述的蛇毒多肽，其特征是分子量为7480Da。

3、权利要求1或2所述的蛇毒多肽制备方法，将蝮蛇粗毒在HPLC层析系统上用C18反相柱进行分离纯化，其中层析色谱条件是流动相0.1％的三氟乙酸和乙腈，流速为7ml/min，在梯度为0-80％范围内进行梯度洗脱，洗脱时间120min；检测波长210nm，分离温度20～28℃。