CN113720941A - 护肤品原料或者护肤品中多肽的检测方法及多肽的高效液相色谱检测方法 - Google Patents

护肤品原料或者护肤品中多肽的检测方法及多肽的高效液相色谱检测方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及成分分析领域，具体而言，涉及一种护肤品原料或者护肤品中多肽的检测方法及多肽的高效液相色谱检测方法。一种多肽的高效液相色谱检测方法，用于检测乙酰基六肽‑8、乙酰基四肽‑2和类蛇毒三肽中的至少一种，通过本申请的色谱条件可以实现三种肽的有效分离，以通过该方法准确测定出乙酰基六肽‑8、乙酰基四肽‑2和类蛇毒三肽的含量，且可以三者同时检测，不会互相干扰，检测数据准确，为三者的使用量提供指导，减小误差，节约成本，操作简单。

Description

护肤品原料或者护肤品中多肽的检测方法及多肽的高效液相 色谱检测方法
技术领域
本申请涉及成分分析领域，具体而言，涉及一种护肤品原料或者护肤品中多肽的检测方法及多肽的高效液相色谱检测方法。
背景技术
乙酰基六肽-8，别名阿基瑞林，是一种优质的祛皱化妆品原料,其抗皱活性高,副作用小，已在各化妆品系列中应用。它能局部阻断神经传递肌肉收缩讯息，影响皮囊神经传导，使脸部肌肉放松，达到平抚动态纹、静态纹及细纹；有效重新组织胶原弹力，可以增加弹力蛋白的活性，使脸部线条放松，皱纹抚平改善松弛。可用于化妆品内，作为抗皱成分，且效果极佳。
乙酰基四肽-2(也称为Thymulen 4)是由胸腺产生的细胞成熟因子的仿生物。催产素局部作用于角质形成细胞，诱导旁分泌和自体分泌介质的胞内合成。催产素随后刺激角质形成细胞产生GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)。该细胞因子不仅刺激角质形成细胞更新，而且刺激朗格汉斯细胞成熟，并改善表皮特征并刺激皮肤免疫系统。它可以增强皮肤自身的防御能力，并有助于再生表皮。
类蛇毒肽又被称为类蛇毒三肽，学名为二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐。类蛇毒肽是一种模拟蛇毒毒素Waglerin I活性的小肽，临床试验表明蛇毒肽能够通过抑制肌肉收缩而减少皱纹的产生，具有优秀的光滑和迅速祛皱作用。
准确测量类蛇毒肽、乙酰基四肽-2以及乙酰基六肽-8对其使用具有较佳的指导意义。
发明内容
本申请实施例的目的在于提供一种护肤品原料或者护肤品中多肽的检测方法及多肽的高效液相色谱检测方法，其旨在准确测量多肽中类蛇毒肽、乙酰基四肽-2以及乙酰基六肽-8的含量。
本申请提供一种技术方案：
一种多肽的高效液相色谱检测方法，用于检测乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2和类蛇毒三肽中的至少一种，其色谱条件为：
色谱柱：ZORBAX XDB-C18，4.6×250mm，5μm；
流动相：A相为甲醇，B相为0.05vol％～0.15vol％的三氟乙酸水溶液；梯度洗脱程序为：0～15min，15％A→40％A；15～25min，40％A；25～30min，40％A→15％A；30～36min，15％A；
柱温：22-28℃；
检测波长：215nm。
上述色谱条件可以实现三种肽的有效分离，以通过该方法准确测定出乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2和类蛇毒三肽的含量，且可以三者同时检测，不会互相干扰，检测数据准确，为三者的使用量提供指导，减小误差，节约成本，操作简单。
在本申请的一些实施例中，流动相B相为0.10vol％的三氟乙酸水溶液。
在本申请的一些实施例中，流动相的流速为0.8-1.2mL/min。
在本申请的一些实施例中，进样体积为5μL。
在本申请的一些实施例中，流动相在使用前均采用0.45μm滤膜过滤。
本申请还提供一种护肤品原料或者护肤品中多肽的检测方法，用于检测乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2和类蛇毒三肽中的至少一种；检测方法包括：
配置乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2和类蛇毒三肽的标准溶液并建立标准曲线；
制备护肤品原料的水溶液或者护肤品的水溶液为样品液；
将样品液注入高效液相色谱仪进行色谱分离，记录色谱图，计算乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2和类蛇毒三肽的含量；
色谱条件如下：
色谱柱：ZORBAX XDB-C18，4.6×250mm，5μm；
流动相：A相为甲醇，B相为0.05vol％～0.15vol％的三氟乙酸水溶液；梯度洗脱程序为：0～15min，15％A→40％A；15～25min，40％A；25～30min，40％A→15％A；30～36min，15％A；
柱温：22-28℃；
检测波长：215nm。
在本申请的一些实施例中，流动相B相为0.10vol％的三氟乙酸水溶液。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为含有乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2和类蛇毒三肽的标准混合溶液的HPLC图。
图2为乙酰基六肽-8标准溶液HPLC图。
图3为乙酰基四肽-2标准溶液HPLC图。
图4为类蛇毒三肽标准溶液HPLC图。
图5为乙酰基六肽-8的浓度—峰面积的线性图。
图6为乙酰基四肽-2的浓度—峰面积的线性图。
图7为类蛇毒三肽的浓度—峰面积的线性图。
图8示出了实施例1中某化妆品样品的HPLC图。
图9示出了对比例1获取的标准混合溶液的HPLC图。
图10示出了对比例2获取的标准混合溶液的HPLC图。
图11示出了对比例3获取的标准混合溶液的HPLC图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本申请实施例的护肤品原料或者护肤品中多肽的检测方法及多肽的高效液相色谱检测方法进行具体说明。
乙酰基六肽-8是一种有机物，化学式为C34H60N14O12S。
乙酰基四肽-2，英文名：ACETYL TETRAPEPTIDE-2，别名：四胜肽。
类蛇毒三肽，英文名称:
(2S)-beta-Alanyl-L-prolyl-2,4-diamino-N-(phenylmethyl)butanamideacetate。
在护肤品中，会出现上述三种成分同时被配置在同一个产品中的情况，例如，某种原料同时含有乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2和类蛇毒三肽。或者，某种护肤品产品中同时含有乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2和类蛇毒三肽。在三者均存在的情况下，会由于三者之间互相干扰而不能被准确检测。
基于上述原因，本申请提供一种多肽的高效液相色谱检测方法，用于检测乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2和类蛇毒三肽。
其色谱条件为：
色谱柱：ZORBAX XDB-C18，4.6×250mm，5μm；
流动相：A相为甲醇，B相为0.05vol％～0.15vol％的三氟乙酸水溶液；梯度洗脱程序为：0～15min，15％A→40％A；15～25min，40％A；25～30min，40％A→15％A；30～36min，15％A；
柱温：22-28℃；
检测波长：215nm。
作为示例性地，在本申请的实施例中，流动相B相可以为0.05vol％～0.15vol％的三氟乙酸水溶液，例如，三氟乙酸水溶液的浓度可以为0.05vol％、0.06vol％、0.07vol％、0.08vol％、0.09vol％、0.10vol％、0.11vol％、0.12vol％、0.13vol％、0.14vol％、0.15vol％等等。
作为示例性地，流动相的流速为0.8-1.2mL/min。例如可以为0.8mL/min、0.9mL/min、1.0mL/min、1.1mL/min、1.2mL/min。
作为示例性地，进样体积为5μl，可以理解的是，在本申请的其他实施例中，进样体积可以为其他数值，例如可以为6μL、7μL等等。
在本申请的一些实施例中流动相在使用前均采用0.45μm滤膜过滤。换言之，流动相A相在使用前使用0.45μm滤膜过滤，然后取滤液；流动相B相在使用前使用0.45μm滤膜过滤，然后取滤液。
上述的高效液相色谱检测方法可以用于检测任何均含有乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2和类蛇毒三肽的物质，在上述三种物质均存在的情况下，采用上述高效液相色谱检测方法可以对其一一检测，检测结果较准确。
本申请还提供一种护肤品原料或者护肤品中多肽的检测方法，用于检测乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2和类蛇毒三肽中的至少一种；换言之，该检测方法可以仅仅检测护肤品原料或者护肤品中的乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2和类蛇毒三肽中的一种；该检测方法也可以用于检测上述三种中的两种或者两种以上。
检测方法包括：
配置乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2和类蛇毒三肽的标准溶液并建立标准曲线；
制备护肤品原料的水溶液或者护肤品的水溶液为样品液；
将样品液注入高效液相色谱仪进行色谱分离，记录色谱图，计算乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2和类蛇毒三肽的含量；
色谱条件如下：
色谱柱：ZORBAX XDB-C18，4.6×250mm，5μm；
流动相：A相为甲醇，B相为0.05vol％～0.15vol％的三氟乙酸水溶液；梯度洗脱程序为：0～15min，15％A→40％A；15～25min，40％A；25～30min，40％A→15％A；30～36min，15％A；
柱温：22-28℃；
检测波长：215nm。
作为示例性地，准确称量乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2和类蛇毒三肽；溶解，然后分别配置梯度浓度的乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2和类蛇毒三肽；将已知浓度的乙酰基六肽-8溶液、乙酰基四肽-2溶液和类蛇毒三肽溶液混合，然后建立标准曲线。
准确称量护肤品原料或者护肤品，将护肤品原料或者护肤品溶解，过滤，去除滤渣取滤液；将样品液注入高效液相色谱仪进行色谱分离，记录色谱图。
其色谱条件请参阅上述多肽的高效液相色谱检测方法中的色谱条件，此处不再进行赘述。
根据标准曲线计算乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2和类蛇毒三肽的含量。
本申请实施例提供的多肽的高效液相色谱检测方法或者护肤品原料或者护肤品中多肽的检测方法至少具有下列优点：
本申请提供的方法可以避免乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2和类蛇毒三肽之间的相互干扰，在同时存在前述三种多肽的情况下，可以对每一种多肽进行精准检测；为后期的实验或者使用提供较佳的指导意义。
以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种化妆品中乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2和类蛇毒三肽的检测方法，主要包括以下步骤：
1)混合标准溶液配制
分别精密称取乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2和类蛇毒肽标准品，用水溶解，配制500μg/mL乙酰基六肽-8、400μg/mL乙酰基六肽-8、1000μg/mL乙酰基六肽-8的混合标准溶液母液。
精密量取上述标准溶液母液，加水稀释，配制乙酰基六肽-8浓度为5-500μg/mL，乙酰基四肽-2浓度为10-1000μg/mL，类蛇毒肽浓度为10-500μg/mL的混合标准溶液。
精密称取乙酰基六肽-8标准品，用水溶解，配制100μg/mL乙酰基六肽-8标准溶液。
精密称取乙酰基四肽-2标准品，用水溶解，配制100μg/mL乙酰基四肽-2标准溶液。
精密称取类蛇毒肽标准品，用水溶解，配制200μg/mL类蛇毒肽标准溶液。
2)进样检测
色谱条件如下：
色谱系统：Agilent 1260；色谱柱：ZORBAX XDB-C18(4.6×250mm，5μm)；柱温25℃。
流动相：A为甲醇，B为0.10vol％三氟乙酸-水溶液；流速1.0mL/min。流动相使用前均经0.45μm滤膜过滤。
梯度洗脱程序0～15min，15％A→40％A；15～25min，40％A；25～30min，40％A→15％A；30～36min，15％A。进样量：5μL。紫外检测器检测波长：215nm。
数据处理：样品积分需扣除样品空白积分，排除梯度洗脱导致的基线不稳的影响。
含有乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2和类蛇毒三肽的标准混合溶液HPLC图如图1所示。
乙酰基六肽-8标准溶液HPLC图如图2所示。
乙酰基四肽-2标准溶液HPLC图如图3所示。
类蛇毒肽标准溶液HPLC图如图4所示。
绘制三种多肽的浓度—峰面积的线性图，如图5-图7所示。
三种胜肽的浓度-响应面线性回归方程如表1所示。
表1
Figure BDA0003271199480000081
3)待测试样品溶液制备
称取某市售化妆品样品置于洁净的离心管中，加水溶解、混匀、涡旋、离心，取上清液适量，过滤膜，所得滤液为样品溶液。
采用前述标准样品的色谱条件对样品溶液进行检测，获取色谱图。图8示出了某化妆品样品的HPLC图。
实施例2
以市售的三种化妆品基质作为测试对象，分别加标5μg/g、12.5μg/g和25μg/g的三种多肽，采用实施例1的色谱条件检测，同时做平行试验(n＝6)，测定回收率和RSD见表2。结果显示在高、中、低加标浓度条件下三种肽的回收率范围在92.89％～100.51％范围内，相对偏差RSD(n＝6)在0.92％～5.75％。
表2
Figure BDA0003271199480000091
从表2中说明本申请的检测方法回收率结果良好。
对比例1
采用实施例1相同的方法获取混合标准溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
色谱条件如下：
色谱系统：Agilent 1260；色谱柱：ZORBAX SB-C18(4.6×250mm，5μm)；柱温25℃。
流动相：A为甲醇，B为0.10vol％三氟乙酸-水溶液；流速1.0mL/min。流动相使用前均经0.45μm滤膜过滤。
梯度洗脱程序0～15min，15％A→40％A；15～25min，40％A；25～30min，40％A→15％A；30～36min，15％A。进样量：5μL。紫外检测器检测波长：215nm。
图9示出了对比例1获取的色谱图。
对比例2
采用实施例1相同的方法获取混合标准溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
色谱条件如下：
色谱系统：Agilent 1260；色谱柱：ZORBAX XDB-C18(4.6×250mm，5μm)；柱温25℃。
流动相：A相为0.10vol％三氟乙酸-甲醇溶液，通过量取1.0mL三氟乙酸加甲醇1000mL，混匀制得；B相为0.10vol％三氟乙酸-水溶液；通过量取1.0mL三氟乙酸加纯水1000mL，混匀制得；流速1.0mL/min。流动相使用前均经0.45μm滤膜过滤。
梯度洗脱程序0～15min，15％A→40％A；15～25min，40％A；25～30min，40％A→15％A；30～36min，15％A。进样量：5μL。紫外检测器检测波长：215nm。
图10示出了对比例2获取的色谱图。
对比例3
采用实施例1相同的方法获取混合标准溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
色谱条件如下：
色谱系统：Agilent 1260；色谱柱：ZORBAX XDB-C18(4.6×250mm，5μm)；柱温25℃。
流动相：A相为甲醇；B相为0.10vol％三氟乙酸-水溶液：通过量取1.0mL三氟乙酸加纯水1000mL，混匀制得；流速1.0mL/min。流动相使用前均经0.45μm滤膜过滤。
梯度洗脱程序0～10min，20％A；10～18min，20％A→70％A；18～24min，70％A；24～29min，70％A→20％A；29-32min，20％A。进样量：5μL。紫外检测器检测波长：215nm。
图11示出了对比例3获取的色谱图。
从实施例1-2、对比例1-3可以看出：对于标准样品而言，对比例1-3相比实施例1采用不同色谱柱、流动相、洗脱程序均不能实现三种肽的有效分离；实施例1提供的色谱条件可以对标准品实现三种肽的有效分离，且用于检测某化妆品也可以将三种肽进行有效分离；且本申请的检测方法回收率结果良好。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种多肽的高效液相色谱检测方法，其特征在于，用于检测乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2和类蛇毒三肽中的至少一种，其色谱条件为：
色谱柱：ZORBAX XDB-C18，4.6×250mm，5μm；
流动相：A相为甲醇，B相为0.05vol％～0.15vol％的三氟乙酸水溶液；梯度洗脱程序为：0～15min，15％A→40％A；15～25min，40％A；25～30min，40％A→15％A；30～36min，15％A；
柱温：22-28℃；
检测波长：215nm。
2.根据权利要求1所述的多肽的高效液相色谱检测方法，其特征在于，流动相B相为0.10vol％的三氟乙酸水溶液。
3.根据权利要求1所述的多肽的高效液相色谱检测方法，其特征在于，流动相的流速为0.8-1.2mL/min。
4.根据权利要求1所述的多肽的高效液相色谱检测方法，其特征在于，进样体积为5μL。
5.根据权利要求1所述的多肽的高效液相色谱检测方法，其特征在于，流动相在使用前均采用0.45μm滤膜过滤。
6.一种护肤品原料或者护肤品中多肽的检测方法，其特征在于，用于检测乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2和类蛇毒三肽中的至少一种；检测方法包括：
配置乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2和类蛇毒三肽的标准溶液并建立标准曲线；
制备护肤品原料的水溶液或者护肤品的水溶液为样品液；
将样品液注入高效液相色谱仪进行色谱分离，记录色谱图，计算乙酰基六肽-8、乙酰基四肽-2和类蛇毒三肽的含量；
色谱条件如下：
色谱柱：ZORBAX XDB-C18，4.6×250mm，5μm；
流动相：A相为甲醇，B相为0.05vol％～0.15vol％的三氟乙酸水溶液；梯度洗脱程序为：0～15min，15％A→40％A；15～25min，40％A；25～30min，40％A→15％A；30～36min，15％A；
柱温：22-28℃；
检测波长：215nm。
7.根据权利要求6所述的护肤品原料或者护肤品中多肽的检测方法，其特征在于，流动相B相为0.10vol％的三氟乙酸水溶液。
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