CN115876919A - 一种适用于类蛇毒肽的hplc分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种适用于类蛇毒肽的HPLC分析方法，包括：第一步：设定液相色谱条件；第二步：配制分析用流动相，其中：流动相A为超纯水；流动相B为乙腈；第三步：设定分析程序为等度洗脱，洗脱浓度：流动相A：65～75％，流动相B：25～35％，流速：1mL/min；第四步：配制一个或多个待测类蛇毒肽样品的溶液，所述类蛇毒肽样品可以是单一种类蛇毒肽或包含类蛇毒肽的混合物；第五步：采用所述分析程序对其中一个待测类蛇毒肽样品的溶液进行测定，记录色谱图；等步骤。本发明的适用于类蛇毒肽的HPLC分析方法可以连续地分析多个类蛇毒肽样品以及可以连续地对多个未知浓度的类蛇毒肽样品进行浓度测定。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种适用于类蛇毒肽的高效液相色谱(HPLC)分析方法。
背景技术
类蛇毒肽，INCI名为：二肽二氨基丁酰苄基酰胺二乙酸盐，是一种模拟蛇毒毒素Waglerin 1活性的合成三肽。该三肽可拮抗性的与乙酰胆碱受体结合，局部阻断神经传递肌肉收缩信息，使脸部肌肉放松，以达到抚纹祛皱的目的。因此，类蛇毒肽在脸部、颈部和手部的美容护肤品中具有广泛的应用前景。
现有技术中，对于类蛇毒肽的HPLC分析方法已有报道。例如，在现有技术文件CN113720941 A中公开了护肤品原料或者护肤品中多肽的检测方法及多肽的高效液相色谱检测方法。然而，该方法为了改善色谱峰峰形和分离效果，在流动相里添加三氟乙酸。这样会导致最终产品中酸类或三氟乙酸有残留，使产品呈现酸性并能闻到明显的酸味，而一些肽类实际在酸性条件下并不稳定，影响其储存时间。再者，由于三氟乙酸是强酸，对色谱柱的耐受性有很高要求，一般色谱柱无法承受强酸，需采用强化型色谱柱。同时，该技术文件报道的类蛇毒肽的保留时间为14.7min，可分析的线性范围为0.008-0.42mg/mL，一次分析所用时间为36min。
此外，随着人们对产品性能和安全要求的提高，在进行各成分分离和分析时，对提高色谱柱分离效率和含量测定的准确性提出了更高的要求。而对类蛇毒肽进行分析时，很容易出现不能完全分离的情况，而导致无法准确计算类蛇毒肽的含量。同时在工业化生产上应尽可能的缩短分析时间从而提高生产效率。
理论塔板数是色谱的柱效参数之一，用于定量表示色谱柱的分离效率。目前对类蛇毒肽进行HPLC分析时，理论塔板数低是现有技术中存在着的主要问题。当色谱柱长度相同时，理论塔板数越大说明色谱柱的分离效率越高，峰形越好，相应地，可以获得更加准确的线性图形。从而为未知样品中类蛇毒肽的含量测定提供更加准确的标准曲线。
此外，现有技术中，在相同的HLPC分析测定条件下，类蛇毒肽的浓度测量范围比较窄，分析时间较长，需要对色谱条件例如流动相组成等进行调整。
因此，亟待研究探寻一种更加通用环保的高效液相色谱法，该方法采用不含酸类的流动相进行类蛇毒肽的HLPC分析，可以获得更高的理论塔板数，提高色谱柱的分离效率，获得更好的峰形，从而为未知浓度样品中类蛇毒肽的含量测定提供更加准确的标准曲线，进而可以实现更加精确地连续地对多个未知浓度样品中类蛇毒肽的含量进行测定，且测量范围更宽。
发明内容
发明要解决的问题
针对现有技术存在的问题，本发明的目的之一是解决在对类蛇毒肽样品进行HPLC方法分析测定时，需要在流动相中添加酸类如三氟乙酸等进行增强峰形，从而造成样品中酸类物质残留，影响产品储存时间，以及对色谱柱耐受性提出更高要求，增加色谱柱负担的问题。
本发明的再一目的是解决在对类蛇毒肽样品进行HPLC方法分析测定时，理论塔板数低，色谱柱的分离效率低，而导致在对未知浓度的含类蛇毒肽样品进行HPLC测定时，不能满足更高精度要求的技术问题。
本发明的又一目的是解决在使用相同HPLC色谱条件下，样品测量的浓度范围窄的技术问题。
本发明的再一目的是解决在利用HPLC对类蛇毒肽进行分析时，由于分析时间过长导致的生产效率低的问题。
用于解决问题的方案
本发明涉及：
1、一种适用于类蛇毒肽的HPLC分析方法，其特征在于：
第一步：设定液相色谱条件；
第二步：配制分析用流动相，其中；流动相A为超纯水；流动相B为乙腈；
第三步：设定分析程序为等度洗脱，洗脱浓度：流动相A：65～75％，流动相B：25～35％，流速：1mL/min；
第四步：配制一个或多个待测类蛇毒肽样品的溶液，所述类蛇毒肽样品可以是单一种类蛇毒肽或包含类蛇毒肽的混合物；
第五步：采用所述分析程序对其中一个待测类蛇毒肽样品的溶液进行测定，记录色谱图；
第六步：任选地根据标准曲线计算类蛇毒肽的含量；
第七步：采用流动相B清洗色谱柱1～5min；
第八步：重复第五步和第七步，对其他未测的待测类蛇毒肽样品依次进行测定。
2、根据项目1所述的适用于类蛇毒肽的HPLC分析方法，其特征在于：所述标准曲线通过配制类蛇毒肽的标准溶液，并采用所述第一步中的液相色谱条件进行测定而建立。
3、根据项目1所述的适用于类蛇毒肽的HPLC分析方法，其特征在于：波长范围为200～300nm。
4、根据项目1或2所述的适用于类蛇毒肽的HPLC分析方法，其特征在于：采用填料为C18的色谱柱。
5、根据项目1或2所述的适用于类蛇毒肽的HPLC分析方法，其特征在于：色谱柱柱温为室温，进样量为8～15μL，进样器温度为环境温度，待测样品采集时间为5～10min。
6、根据项目1或2所述的适用于类蛇毒肽的HPLC分析方法，其特征在于：所述类蛇毒肽样品的浓度为0.01～3mg/ml。
发明的效果
本发明发现了一种适用于类蛇毒肽的HPLC分析方法，能够准确分析不同浓度的类蛇毒肽样品并能够依据标准曲线对未知浓度样品进行准确定量。其次，本发明的适用于类蛇毒肽的HPLC分析方法，在实现对多个类蛇毒肽样品的连续分析测定的同时，在不添加三氟乙酸的情况下，改善了峰形，当色谱柱长度相同时，理论塔板数大幅提高，从而获得更加准确的线性图形，为未知样品中类蛇毒肽的含量测定提供更加准确的标准曲线，从而可以实现更加精确地连续对多个未知浓度的类蛇毒肽样品进行标定。
其次，本发明的适用于类蛇毒肽的HPLC分析方法，获得了更高的理论塔板数，提高色谱柱的分离效率，从而能够为未知样品中类蛇毒肽的含量测定提供更加准确的标准曲线，使得可以以更高精度连续地对多个未知浓度样品中类蛇毒肽的含量进行测量。
此外，本发明的适用于类蛇毒肽的HPLC分析方法，可以实现在使用相同HPLC分析条件下，拓宽了含类蛇毒肽样品的测量浓度范围。
再次，本发明的适用于类蛇毒肽的HPLC分析方法，可以缩短分析时间，从而大幅度提高生产效率。
本发明的适用于类蛇毒肽的HPLC分析方法操作简单，连续分析测定多个类蛇毒肽样品时，节约大量的时间成本和经济成本，大大简化了操作的复杂性。
附图说明
图1为实施例1中的不同浓度类蛇毒肽的HPLC图。
图2为实施例1中的不同浓度类蛇毒肽的标准曲线图。
图3为实施例2中的类蛇毒肽的HPLC图。
图4为比较例1中的类蛇毒肽的HPLC图。
图5为比较例2中的类蛇毒肽的HPLC图。
图6为比较例3中的类蛇毒肽的HPLC图。
图7为比较例4中的类蛇毒肽的HPLC图。
图8为比较例5中的类蛇毒肽的HPLC图。
图9为比较例6中的类蛇毒肽的HPLC图。
具体实施方式
类蛇毒肽因为其结构的特殊性，导致了一般肽的分析方法都对其不适用。但在分析其纯度时又必须要有一套适宜的分析方法,否则无法依据峰面积来计算纯度。为了获得准确的峰面积,就要求色谱峰形要标准,即目标峰与其他峰完全分离，半峰宽很窄，峰形很尖锐，基线很平稳，理论塔板数较高。本发明经过深入细致的研究，发现了一种适用于类蛇毒肽的HPLC分析方法，该方法可以准确地检测类蛇毒肽含量，具体如下：
本发明的适用于类蛇毒肽的HPLC分析方法，其中：
第一步：设定液相色谱条件；
第二步：配制分析用流动相，其中；流动相A为超纯水；流动相B为乙腈；
第三步：设定分析程序为等度洗脱，洗脱浓度：流动相A：65～75％，流动相B：25～35％，流速：1mL/min；
第四步：配制一个或多个待测类蛇毒肽样品的溶液，所述类蛇毒肽样品可以是单一种类蛇毒肽或包含类蛇毒肽的混合物；
第五步：采用所述分析程序对其中一个待测类蛇毒肽样品的溶液进行测定，记录色谱图；
第六步：任选地根据标准曲线计算类蛇毒肽的含量；
第七步：采用流动相B清洗色谱柱1～5min；
第八步：重复第五步和第七步，对其他未测的待测类蛇毒肽样品依次进行测定。
上述标准曲线通过配制不同浓度类蛇毒肽的标准溶液，并采用上述第一步中的液相色谱条件进行测定而建立。
流动相为:流动相A为超纯水；流动相B为乙腈。分析程序为等度洗脱，洗脱浓度：流动相A：65～75％，流动相B：25～35％，优选流动相A：70％，流动相B：30％。选择该范围能够获得最好分析效果。流动相流速为0.8～1.2mL/min，优选1mL/min。流速选择很关键，提高流速可以缩短分析周期，节省时间，然而如果流速选取不恰当，流速过快，则可能造成两个峰相隔很近甚至重叠，无法进行积分，流速过慢，可能导致少部分成分滞留损失，影响分析精度。
所述待测类蛇毒肽样品的浓度为0.01～3mg/ml。与现有技术相比，连续测量的浓度范围得到了大幅提高，并且在该测定范围内，为使目标肽的峰能够完全显现，肽浓度不宜过高，否则会导致目标峰封顶，从而即使在峰顶处有杂峰出现也无法判断；但浓度也不能太低，否则即使有杂峰出现时，由于峰高过低会被误判断为基线不平所致。所以待测类蛇毒肽样品的浓度为0.01～3mg/ml，更优选0.25～2mg/ml。
检测波长由待测的肽类本身性质所决定，不受分析条件影响。但优选波长范围为200～300nm，更优选210～230nm、260～280nm，特别优选215nm。原因是：对类蛇毒肽溶液进行全波长扫描，显示在215nm有最强的光吸收，故最优选215nm作为HPLC分析的检测波长。
色谱柱为常规使用的色谱柱，优选填料为C18的色谱柱，例如依利特ODS柱。
色谱柱填料的粒径没有特别限定，本领域技术人员根据分离目的，参考选择的色谱条件如色谱柱的长度、内径、对两种不同溶质的选择性、色谱柱的反压等因素而选择。
色谱柱柱温为25℃，进样量为10～15μL，优选10μL。
进样器温度为环境温度，待测样品采集时间为5～10min，优选5min。
下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述说明。
以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。但是，应理解，这些实施例仅仅是示例性的，并不意图限制本发明。如无特殊说明，本发明的实施例中所采用的原材料均为本领域常用的原材料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。
实施例
实施例1
仪器与条件：
采用Agilent1260InfinityII LC高效液相色谱仪及OpenLabCDS2软件系统；以依利特ODS柱为分离柱，柱温25℃；紫外检测波长为215nm。
实验步骤：
将类蛇毒肽以0.0025g、0.005g、0.01g、0.015g、0.02g的量称取五组样品。将称取的类蛇毒肽样品分别溶解于超纯水中至10mL，即得浓度分别为0.25g/L、0.5g/L、1g/L、1.5g/L和2g/L的类蛇毒肽溶液。流动相：A：超纯水；B：乙腈。
洗脱浓度：流动相A：70％，流动相B：30％。
流速：1.0mL/min。
温度:25℃。
进样量：10uL。
分析程序：等度洗脱；洗脱浓度：流动相A：70％，流动相B：30％。
按照上述色谱条件连续对各浓度的类蛇毒肽溶液进行高效液相色谱分析，记录色谱图，而在更换测试样品进行测试时，除了使用乙腈对色谱柱进行清洗之外，中间没有进行更换色谱柱、改变检测波长、改变色谱柱温度等操作，更无需进行重新配制流动相和重新进行脱气等操作。
浓度分别为0.25g/L、0.5g/L、1g/L、1.5g/L和2g/L的类蛇毒肽溶液的HPLC分析结果如图1所示，其线性标准曲线图如图2所示。各浓度的类蛇毒肽的保留时间和理论塔板数如下表所示，相对标准偏差(％RSD)为0.010。
类蛇毒肽的浓度-峰面积线性回归方程如下所示：
y＝ax+b
其中：y：峰面积
x:类蛇毒肽浓度
a:9780.81728
b:108.56559
实施例2
除了将类蛇毒肽水溶液的浓度变换为1.25g/L之外，以与实施例1相同的方式，对类蛇毒肽溶液进行了HPLC分析，结果如图3所示。
比较例1
除了将流动相A：70％，流动相B：30％调整为流动相A：90％，流动相B：10％之外，用以与实施例1相同的方式，对类蛇毒肽样品的1.0g/L的肽溶液进行了HPLC分析，结果如图4所示。
比较例2
除了将流动相A：70％，流动相B：30％调整为流动相A：80％，流动相B：20％之外，用以与实施例1相同的方式，对类蛇毒肽样品的1.0g/L的肽溶液进行了HPLC分析，结果如图5所示。
比较例3
除了将流动相A：70％，流动相B：30％调整为流动相A：50％，流动相B：50％之外，用以与实施例1相同的方式，对类蛇毒肽样品的1.0g/L的肽溶液进行了HPLC分析，结果如图6所示。
比较例4
除了将流动相A：超纯水，70％，流动相B：乙腈，30％变为流动相A：20mM乙酸铵水溶液，90％，流动相B：乙腈，10％为之外，用以与实施例1相同的方式，对类蛇毒肽样品的1.0g/L的肽溶液进行了HPLC分析，结果如图7所示。
比较例5
除了将分析程序由等度洗脱变更为以下分析程序之外，用以与实施例1相同的方式，对类蛇毒肽样品的1.0g/L的肽溶液进行了HPLC分析，结果如图8所示：
所述分析程序如下：
| 时间min | B相百分比 |
| 0.1 | 5 |
| 2.5 | 5 |
| 10 | 60 |
| 12.5 | 60 |
| 12.6 | 5 |
| 15 | 5 |
比较例6
除了将流动相A变为甲醇，流动相B变为0.1％TFA，并将分析程序由等度洗脱变更为以下分析程序之外，用以与实施例1相同的方式，对类蛇毒肽样品的1.0g/L的肽溶液进行了HPLC分析，结果如图9所示：
所述分析程序如下：
| 时间min | B相百分比 |
| 0 | 85 |
| 15 | 60 |
| 25 | 60 |
| 30 | 85 |
| 36 | 85 |
从附图1和3可以看出，实施例1和实施例2的峰形满足《化学分析中HPLC方法的选择》的典型峰形的定义，理论塔板数在规定的通常范围为4000～40000内，保留时间在规定的通常范围是1～30min内。
参见附图1、4～6，从实施例1和比较例1、比较例2、比较例3的比较结果可以看出，流动相配比对类蛇毒肽分析影响很大，高比例水相和低比例水相均不能获得很好的类蛇毒肽洗脱效果，因此将水相降低至65～75％范围内，特别是为70％，可以获得良好的类蛇毒肽洗脱效果，如实施例1所示的效果。
参见附图1、7，从实施例1和比较例4的比较结果可以看出，流动相中加入盐对类蛇毒肽的分析同样不能起到很好的效果。
参见附图1、8，从实施例1和比较例5的比较结果可以看出，分析程序对于峰形的影响也很大，采用梯度洗脱的分析程序出现两个吸收峰，对于计算类蛇毒肽浓度的精确性产生不利影响。这可能是由于在梯度洗脱过程中当B相的含量达到30％左右时，将类蛇毒肽洗脱出来，因此，出现两个峰，然而对于该结果，系统程序会误判为不纯，影响分析精度，同时也不能实现类蛇毒肽的充分洗脱。
比较例6中采用了CN202111101766专利中公开的分析程序，由附图9可以看出，比较例6尽管流动相中添加了TFA改善峰形并采用了梯度洗脱，虽然理论塔板数很可观，但拖尾因子过大，同时基线也是不平的，所以此峰形不如实施例1获得的峰形优越。
为了验证本发明的适用于类蛇毒肽的HPLC分析方法，实施例2采用了实验室配制的类蛇毒肽样品，其浓度为1.25g/L。通过本发明的HPLC分析方法进行HPLC分析测定，并通过由实施例1得到的线性图形进行计算得到计算后的类蛇毒肽的浓度1.187g/L，误差为：5.04％，分析精度得到很大提高。
综上可知，本发明的适用于类蛇毒肽的HPLC分析方法操作简单，连续分析测定多个类蛇毒肽样品时，节约大量的时间成本和经济成本，大大简化了操作的复杂性，同时提高了类蛇毒肽类的分析精度和拓宽了分析的浓度范围。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种适用于类蛇毒肽的HPLC分析方法，其特征在于：
第一步：设定液相色谱条件；
第二步：配制分析用流动相，其中；流动相A为超纯水；流动相B为乙腈；
第三步：设定分析程序为等度洗脱，洗脱浓度：流动相A：65～75％，流动相B：25～35％，流速：1mL/min；
第四步：配制一个或多个待测类蛇毒肽样品的溶液，所述类蛇毒肽样品可以是单一种类蛇毒肽或包含类蛇毒肽的混合物；
第五步：采用所述分析程序对其中一个待测类蛇毒肽样品的溶液进行测定，记录色谱图；
第六步：任选地根据标准曲线计算类蛇毒肽的含量；
第七步：采用流动相B清洗色谱柱1～5min；
第八步：重复第五步和第七步，对其他未测的待测类蛇毒肽样品依次进行测定。
2.根据权利要求1所述的适用于类蛇毒肽的HPLC分析方法，其特征在于：所述标准曲线通过配制类蛇毒肽的标准溶液，并采用所述第一步中的液相色谱条件进行测定而建立。
3.根据权利要求1所述的适用于类蛇毒肽的HPLC分析方法，其特征在于：波长范围为200～300nm。
4.根据权利要求1或2所述的适用于类蛇毒肽的HPLC分析方法，其特征在于：采用填料为C18的色谱柱。
5.根据权利要求1或2所述的适用于类蛇毒肽的HPLC分析方法，其特征在于：色谱柱柱温为室温，进样量为8～15μL，进样器温度为环境温度，待测样品采集时间为5～10min。
6.根据权利要求1或2所述的适用于类蛇毒肽的HPLC分析方法，其特征在于：所述类蛇毒肽样品的浓度为0.01～3mg/ml。
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| CN202211641285.8A CN115876919A (zh) | 2022-12-20 | 2022-12-20 | 一种适用于类蛇毒肽的hplc分析方法 |
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| US20220034853A1 (en) * | 2020-07-30 | 2022-02-03 | Shandong Institute For Food And Drug Control | Snake venom thrombin-like enzyme marker peptide of agkistrodon halys pallas and its application in the species identification of hemocoagulase for injection |
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-
2022
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