CN112505226B - 一种尿多酸肽注射液中小分子多肽的分子量及分子量分布的检测方法 - Google Patents

一种尿多酸肽注射液中小分子多肽的分子量及分子量分布的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种尿多酸肽注射液中小分子多肽的分子量及分子量分布的检测方法，分别以细胞色素C、胰岛素、胸腺五肽和还原型谷胱甘肽作为对照品，采用高效液相色谱法和示差检测器进行检测，通过GPC软件计算回归方程，再将尿多酸肽注射液制成供试品溶液，按照相同的色谱条件进行测定，由GPC软件分析尿多酸肽注射液中小分子多肽的分子量及分子量分布，其色谱条件包括：色谱柱为Sepax Zenix SEC‑100；以乙腈、水和三氟乙酸的混合溶液作为混合流动，其中，乙腈、水和三氟乙酸的体积比为50～60:40～50:0.2。采用本发明的方法可以准确测定样品中分子量在5000D以下的小分子多肽，专属性好、分离度高。

Description

一种尿多酸肽注射液中小分子多肽的分子量及分子量分布的 检测方法
技术领域
本发明属于化学药物分析方法技术领域，具体涉及一种尿多酸肽注射液中小分子多肽的分子量及分子量分布的检测方法。
背景技术
尿多酸肽注射液(Uroacitides Injection)，本品规格为每瓶100ml，由合肥永生制药有限公司研制，于2016年批准上市，按照《药品注册管理办法》规定，属于未在国内外上市销售的一类新药。
尿多酸肽注射液从正常人尿中提取并经纯化制得，含有能够促进癌细胞走向良性分化的多组分混合物，主要为马尿酸、苯乙酸、吲哚乙酸、苯乙酰谷氨酰胺和小分子多肽，通过多组分的共同作用，发挥抗癌效果。目前主要用于非小细胞肺癌、原发性肝癌及乳腺癌的临床治疗。
尿多酸肽注射液中小分子多肽是诱导分化作用的主要物质，因此需要建立合适的分析方法对样品中分子量及分子量分布进行研究，达到对尿多酸肽注射液中小分子多肽准确、有效的检测和监控。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种尿多酸肽注射液中小分子多肽的分子量及分子量分布的检测方法，专属性好、分离度高，可以准确测定样品中分子量在5000D以下的小分子多肽。
本发明的技术方案如下：
一种尿多酸肽注射液中小分子多肽的分子量及分子量分布的检测方法，分别以细胞色素C、胰岛素、胸腺五肽和还原型谷胱甘肽作为对照品配制四种对照品溶液，采用高效液相色谱法和示差检测器进行检测，以对照品保留时间为横坐标，分子量的log值为纵坐标，通过GPC软件计算回归方程，再将尿多酸肽注射液配置成供试品溶液，按照相同的色谱条件进行测定，由GPC软件分析尿多酸肽注射液中小分子多肽的分子量及分子量分布，其色谱条件包括：以亲水性球型高聚物为填充剂，色谱柱为Sepax Zenix SEC-100；以乙腈、水和三氟乙酸的混合溶液作为混合流动相进行等度洗脱，其中，乙腈、水和三氟乙酸的体积比为50～60:40～50:0.2。
采用本发明的检测方法，在色谱分析的过程中，采用细胞色素C、胰岛素、胸腺五肽和还原型谷胱甘肽作为对照品。在一种优选方案中，四种对照品的重均分子量如下：细胞色素C的重均分子量为12384；胰岛素的重均分子量为5777；胸腺五肽的重均分子量为679；还原型谷胱甘肽的重均分子量为307。
采用本发明的检测方法，可以检测尿多酸肽注射液中分子量在5000D以下的小分子多肽，专属性好、分离度高。
对于本发明的检测方法而言，对色谱柱和混合流动相的要求比较高。在经历了大量的探索实验之后，本发明人最终确定以亲水性球型高聚物为填充剂，Sepax Zenix SEC-100作为色谱柱，以体积比为50～60:40～50:0.2的乙腈、水和三氟乙酸的混合溶液作为混合流动相，可以准确测定样品中分子量在5000D以下的小分子多肽，专属性好、分离度高。在相同的色谱条件下，采用其他色谱柱，例如，以TSK凝胶色谱柱(TSK-GEL G2000 SW色谱柱)进行检测时，样品溶液分离效果差，对照品溶液不成线性。
在相同的色谱条件下，即使流动相中均包含相同的组分，也需要严格控制流动相中乙腈、水和三氟乙酸的配比，否则，在色谱分析时，也会出现对照品不出峰或线性差，分离效果不佳的问题。
在一种优选方案中，乙腈、水和三氟乙酸的体积比为56～58:42～44:0.2。例如，体积比为57:43:0.2。
在一种优选方案中，该色谱柱的长度为300mm，直径为7.8mm，填料粒径为3μm。
本发明提到的高效液相色谱法的条件还包括：柱温为35～45℃，优选为40℃。
进一步地，流速为0.3～0.7ml/min，优选为0.5ml/min。
进一步地，进样量为5～20μl，优选为10μl。
本发明采用上述提及的色谱条件对尿多酸肽注射液进行色谱分析后，通过LabSolutions GPC软件进行三次方程回归，主要检测分子量在5000D以下的小分子多肽，所使用的小分子对照品包括以下物质，具体如下表1所示：
表1小分子对照品的种类及其分子量
对照品 分子量(M.W.) Log(M.W.)
细胞色素C 12384 4.09
胰岛素 5777 3.76
胸腺五肽 679 2.83
还原型谷胱甘肽 307 2.49
本发明提供检测方法的具体包括以下步骤：分别配制四种对照品溶液并进样，按照上述提及的色谱条件进行测定，以对照品保留时间为横坐标，分子量的log值(Log(M.W.))为纵坐标，由GPC专业软件计算回归方程。再将尿多酸肽注射液配置成供试品溶液并同法测定，用GPC软件算出供试品溶液中小分子多肽的重均分子量及分子量分布。
其中，对照品溶液的配制方法如下：将细胞色素C、胰岛素、胸腺五肽和还原型谷胱甘肽分别溶于混合流动相中(乙腈、水和三氟乙酸的体积比为50～60:40～50:0.2，优选为，57:43:0.2)，稀释并制成细胞色素C对照品溶液、胰岛素对照品溶液、胸腺五肽对照品溶液、还原型谷胱甘肽对照品溶液，其中，四种对照品溶液中的浓度均为5mg/ml。
供试品溶液的配制方法如下：取尿多酸肽注射液43ml，加57ml乙腈及0.2ml三氟乙酸，混匀。
本发明通过筛选合适的色谱柱及流动相并优化流动相中各组分的比例，配合其他色谱条件，对尿多酸肽注射液中小分子多肽的分子量及分子量分布进行色谱分析，确定了本发明分析方法，进行了专属性、线性、仪器精密度、溶液稳定性、重复性验证，确证方法的可行性。
采用本发明的技术方案，优势如下:
(1)本发明通过筛选合适的色谱柱及流动相并优化流动相中各组分的比例，通过GPC软件分析尿多酸肽注射液中小分子多肽的分子量及分子量分布，可以准确测定样品中分子量在5000D以下的小分子多肽，专属性好、分离度高。
(2)本发明的检测方法以不同分子量的细胞色素C、胰岛素、胸腺五肽以及还原型谷胱甘肽作为小分子对照品，以对照品保留时间为横坐标，分子量的log值(Log(M.W.))为纵坐标，通过LabSolutions GPC软件进行三次方程回归，线性良好，通过此线性回归方程，可以准确测定尿多酸肽注射液中分子量在5000D以下的小分子多肽。
附图说明
图1是实施例1中细胞色素C对照品溶液的高效液相色谱图；
图2是实施例1中胰岛素对照品溶液的高效液相色谱图；
图3是实施例1中胸腺五肽对照品溶液的高效液相色谱图；
图4是实施例1中还原型谷胱甘肽对照品溶液的高效液相色谱图；
图5是实施例1中混合对照品溶液的高效液相色谱图；
图6是实施例1中尿多酸肽注射液样品溶液的高效液相色谱图；
图7是图6中高效液相色谱图的局部放大图谱；
图8是实施例1中尿多酸肽注射液样品溶液的高效液相色谱图及GPC计算结果1；
图9是实施例1中尿多酸肽注射液样品溶液的高效液相色谱图及GPC计算结果2；
图10是实施例1中GPC软件计算对照品溶液线性图谱；
图11是对比例1中细胞色素C对照品溶液的高效液相色谱图；
图12是对比例1中胰岛素对照品溶液的高效液相色谱图；
图13是对比例1中胸腺五肽对照品溶液的高效液相色谱图；
图14是对比例1中尿多酸肽注射液样品溶液的高效液相色谱图；
图15是对比例2中细胞色素C对照品溶液的高效液相色谱图；
图16是对比例2中胰岛素对照品溶液的高效液相色谱图；
图17是对比例2中胸腺五肽对照品溶液的高效液相色谱图；
图18是对比例2中还原型谷胱甘肽对照品溶液的高效液相色谱图；
图19是对比例2中尿多酸肽注射液样品溶液的高效液相色谱图。
具体实施方式
通过以下实施例并结合附图对本发明的检测方法作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
对比例1：
高效液相色谱条件：
色谱柱为TSK凝胶色谱柱(TSK-GEL G2000 SW色谱柱，300mm×7.5mm,10μm)，以乙腈-水-三氟乙酸(体积比为10:90:0.1)为混合流动相进行等度洗脱，检测器为示差检测器，柱温为25℃，流速为0.5ml/min，进样量为10μl。
样品配制：
对照品溶液：分别取细胞色素C对照品、胰岛素对照品和胸腺五肽对照品约10mg置2ml容量瓶中，用混合流动相溶解定容，作为对照品溶液。
供试品溶液：取尿多酸肽注射液90ml，加10ml乙腈及0.05ml三氟乙酸，混匀，作为供试品溶液。
试验操作：取上述溶液10μl进样，记录色谱图，如图11～图14所示。
本对比例的结果发现，样品溶液分离度不好，对照品溶液不成线性。
对比例2：
高效液相色谱条件：
色谱柱为Sepax凝胶色谱柱(Sepax Zenix SEC-100，300mm×7.8mm,3μm)，以乙腈-水-三氟乙酸(体积比为30:70:0.1)为流动相进行等度洗脱，检测器为紫外-可见分光检测器，柱温为25℃，流速为0.5ml/min，进样量为10μl。
样品配制：
对照品溶液：分别取细胞色素C对照品、胰岛素对照品、胸腺五肽对照品和还原型谷胱甘肽对照品约10mg置2ml容量瓶中，用混合流动相溶解定容，作为对照品溶液。
供试品溶液：取尿多酸肽注射液70ml，加30ml乙腈及0.05ml三氟乙酸，混匀，作为供试品溶液。
试验操作：取上述溶液10μl进样，记录色谱图，如图15～图19所示。
本对比例的结果发现，样品溶液分离度明显提高，但是在该色谱条件下胰岛素出峰时间较胸腺五肽及还原型谷胱甘肽的出峰时间晚，原因为胰岛素本身结构导致其有疏水性，SEC色谱柱对疏水性的物质有非特异性吸附。
实施例1：
高效液相色谱条件：
色谱柱为Sepax凝胶色谱柱(Sepax Zenix SEC-100，300mm×7.8mm,3μm)，以乙腈-水-三氟乙酸(体积比为57:43:0.2)为流动相进行等度洗脱，检测器为示差检测器，柱温为40℃，流速为0.5ml/min，进样量为10μl，运行时间为60分钟。
样品配制：
对照品溶液：分别取细胞色素C对照品、胰岛素对照品、胸腺五肽对照品和还原型谷胱甘肽对照品约10mg置2ml容量瓶中，用混合流动相溶解定容，作为对照品溶液。
供试品溶液：取尿多酸肽注射液43ml，加57ml乙腈及0.2ml三氟乙酸，混匀，作为供试品溶液。
试验操作：取上述溶液10μl进样，记录色谱图，如图1、图2、图3、图4、图6和图7所示。
本实施例的结果发现，与对比例1和2相比，随着乙腈比例增高，胰岛素的保留时间趋于稳定，当三氟乙酸比例增加至0.2％时，胰岛素的疏水作用在逐渐减弱消失。且在本条件下对照品线性较好，样品分离度高，可用于本品分子量分布测定。通过对本发明进行专属性、线性、仪器精密度、溶液稳定性、重复性的验证，确证方法的可行性。
(1)专属性结果见表2。
取细胞色素C对照品、胰岛素对照品、胸腺五肽对照品、还原型谷胱甘肽对照品各约10mg分别置2ml容量瓶中，用混合流动相溶解定容，作为各对照品溶液。分别取上述四个对照品溶液各200μl，混匀，作为混合对照品溶液。取尿多酸肽注射液43ml，加57ml乙腈及0.2ml三氟乙酸，混匀，作为样品溶液。
分别取空白溶剂(混合流动相)及上述溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明空白溶剂对对照品及样品测定无干扰，各对照品分离度良好，实验结果见表2及附图1～7；以对照品保留时间为横坐标，分子量的log值(Log(M.W.))为纵坐标，由GPC专业软件计算回归方程，测得供试品溶液中小分子多肽的重均分子量及分子量分布，实验结果见附图8～9。
表2专属性试验
对照品名称 保留时间 分离度 理论板数 拖尾因子
细胞色素C 11.561 / 16303 1.356
胰岛素 13.692 5.777 21912 1.278
胸腺五肽 15.816 5.562 29729 1.051
还原型谷胱甘肽 17.534 4.808 32728 1.627
由表2中的结果表明，混合对照溶液中各对照分离度良好，样品溶液中各峰检测情况良好。
(2)本发明对尿多酸肽注射液各对照品的线性进行考察，结果见表3
取细胞色素C对照品、胰岛素对照品、胸腺五肽对照品、还原型谷胱甘肽对照品各约10mg分别置2ml容量瓶中，用混合流动相溶解定容，作为各对照品溶液。分别取上述四个对照品溶液各200μl，混匀，作为混合对照溶液。精密吸取混合对照溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品保留时间为横坐标，分子量的log值(Log(M.W.))为纵坐标，通过LabSolutions GPC软件进行三次方程回归，试验结果见表3及附图10。
表3 GPC校正曲线
项目 保留时间(min) 分子量(M.W.) Log(M.W.)
细胞色素C 11.561 12384 4.09
胰岛素 13.692 5777 3.76
胸腺五肽 15.816 679 2.83
还原型谷胱甘肽 17.534 307 2.49
结果表明：校正曲线方程为y＝-0.2871x+7.4999R＝0.98，可用于本品的分子量与分子量分布测定。
(3)本发明对尿多酸肽注射液对照品溶液进行仪器精密度考察
取线性项下混合对照溶液，连续进样6针，记录色谱图，以各对照品保留时间及峰面积考察进样精密度。结果见表4。
表4进样精密度
Figure GDA0003815431700000071
结论：对照品保留时间RSD(％)均小于2.0％，本测定方法进样精密度良好。
(4)本发明对对照品溶液及尿多酸肽注射液样品溶液稳定性进行了考察，结论如下：
取细胞色素C对照品、胰岛素对照品、胸腺五肽对照品、还原型谷胱甘肽对照品各约10mg分别置2ml容量瓶中，用混合流动相溶解定容，作为各对照品溶液。分别取上述四个对照品溶液各200μl，混匀，作为混合对照溶液。
样品溶液稳定性考察：取尿多酸肽注射液43ml，加57ml乙腈及0.2ml三氟乙酸，混匀，作为样品溶液。
将对照品溶液及样品溶液在2～8℃条件下放置，0h至10h时间内考察溶液稳定性，结果见表5～6。
表5对照品溶液稳定性试验
Figure GDA0003815431700000072
Figure GDA0003815431700000081
表6样品溶液稳定性
Figure GDA0003815431700000082
结果表明：对照品溶液及样品溶液在2～8℃条件下放置10小时溶液稳定性良好。
(5)本发明对尿多酸肽注射液样品溶液进行重复性考察，结论如下。
取尿多酸肽注射液六份，每份取43ml，分别加57ml乙腈及0.2ml三氟乙酸，混匀，作为样品溶液。将各样品溶液分别进样10μl，记录色谱图，分子量分布结果见表7。
表7重复性试验
Figure GDA0003815431700000083
Figure GDA0003815431700000091
结果表明：样品中分子量分布的RSD均小于2％，该方法重复性良好，适用于分子量及分子量分布检测。
(6)本发明对尿多酸肽注射液中分子量及分子量分布进行多批次考察，结果见表8。
经上述分子量与分子量分布方法学验证，验证结果均符合相关要求。照上述方法对本品十批样品进行检测，具体结果见表8。
表8十批样品分子量与分子量分布结果
Figure GDA0003815431700000092
Figure GDA0003815431700000101
结果表明：多批次样品分子量分布基本一致。分子量测定(重均分子量Mw)在700～1100之间；各批次分子量分布在270～4800之间；10％大分子部分重均分子量(Mw)在3300～4500之间，均未超过5000。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (7)

1.一种尿多酸肽注射液中小分子多肽的分子量及分子量分布的检测方法，其特征在于，分别以细胞色素C、胰岛素、胸腺五肽和还原型谷胱甘肽作为对照品配制四种对照品溶液，采用高效液相色谱法和示差检测器进行检测，以对照品保留时间为横坐标，分子量的log值为纵坐标，通过GPC软件计算回归方程，再将尿多酸肽注射液配置成供试品溶液，按照相同的色谱条件进行测定，由GPC软件分析尿多酸肽注射液中小分子多肽的分子量及分子量分布，其色谱条件包括：以亲水性球型高聚物为填充剂，色谱柱为Sepax Zenix SEC-100，长度为300mm，直径为7.8mm，填料粒径为3µm；以乙腈、水和三氟乙酸的混合溶液作为混合流动相进行等度洗脱，其中，乙腈、水和三氟乙酸的体积比为57: 43: 0.2；所述细胞色素C的重均分子量为12384；所述胰岛素的重均分子量为5777；所述胸腺五肽的重均分子量为679；所述还原型谷胱甘肽的重均分子量为307；所述小分子多肽的分子量在5000D以下；
所述四种对照品溶液的配制方法如下：将细胞色素C、胰岛素、胸腺五肽和还原型谷胱甘肽分别溶于所述混合流动相中，并稀释制成浓度分别为5mg/ml的溶液，作为四种对照品溶液；所述供试品溶液的配制方法如下：取尿多酸肽注射液43ml，依次加57ml乙腈和0.2ml三氟乙酸，混匀，作为供试品溶液。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：柱温为35~45℃。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：柱温为40℃。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：流速为0.3~0.7ml/min。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：流速为0.5ml/min。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：进样量为5~20μl。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：进样量为10μl。
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