CN113092656A - 一种注射用维库溴铵药物中有关物质的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种注射用维库溴铵药物中有关物质的检测方法，所述检测方法包括：采用反相高效液相色谱法，以亚乙基桥杂化颗粒为基质的三键键合硅胶为色谱柱填料，采用紫外检测器；流动相为高氯酸水溶液与水溶性非质子有机溶剂所形成的混合体系；以所述流动相进行洗脱，检测注射用维库溴铵药物中杂质含量。相比于现有技术，本发明的检测方法具有更高的专属性和灵敏度，有效地检出主要降解杂质及可能存在的工艺杂质；更能适用于注射用维库溴铵有关物质控制，具有更优越的精密度、准确度和耐用性。

Description

一种注射用维库溴铵药物中有关物质的检测方法

技术领域

本发明涉及但不限于药物分析技术领域，尤其涉及但不限于一种注射用维库溴铵药物中有关物质的检测方法。

背景技术

注射用维库溴铵是冻干粉针剂，主要作为全身麻醉辅助用药，临床主要用于全麻时的气管插管及手术中的肌肉松弛。

维库溴铵化学名为：溴化1-[3α-17β-二乙酰氧基2-β(1-哌啶基)-5α-雄甾烷-16β-基]-1-甲基哌啶，结构式如下。

英国药典公开了注射用维库溴铵中有关物质的测定方法，欧洲药典公开了维库溴铵原料中有关物质的测定方法，均采用Hypersil十八烷基键合硅胶色谱柱结合高效液相色谱系统进行分离检测。

美国药典公开了维库溴铵原料中有关物质的测定方法，采用的是离子色谱系统进行分离。

中国药典收载的注射用维库溴铵质量标准中无有关物质检查项。

英国药典和欧洲药典色谱系统中使用了离子化试剂，方法重现性差；制剂成分比原料复杂，美国药典的离子色谱法不适合于注射用维库溴铵有关物质检测。因此，新建立一种可靠的注射用维库溴铵有关物质的检测方法，对其质量控制具有重要意义。

发明内容

以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。

本申请的发明人开发了一种注射用维库溴铵药物中有关物质的分析检测方法，该方法专属性好，能将有效检测工艺杂质、降解杂质，该方法灵敏度高、重复性好、准确度高、耐用性好，可用于检测维库溴铵原料药或其制剂中的有关物质含量，有效控制产品的质量。

本发明提供了一种维库溴铵药物中有关物质的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

采用反相高效液相色谱法，以亚乙基桥杂化颗粒为基质的三键键合硅胶为色谱柱填料，采用紫外检测器；流动相为高氯酸水溶液、水溶性非质子有机溶剂所形成的混合体系；以所述流动相进行梯度洗脱，检测维库溴铵药物中的有关物质含量。

在本申请的实施方案中，所述维库溴铵药物为维库溴铵原料药、或者维库溴铵注射剂，优选地，所述维库溴铵注射剂为冻干粉针即注射用维库溴铵。

在本申请的一些实施方案中，所述流动相中水溶性非质子有机溶剂选自乙腈、四氢呋喃和二甲基甲酰胺中的一种，优选地，为乙腈。

在本申请的一些实施方案中，所述流动相中高氯酸水溶液包括pH调节剂，所述pH调节剂选自氨水和三乙胺中的一种；优选地，为氨水(例如市售的氨水商品，浓度可以为25.0质量％-28.0质量％)。

在本申请的上述实施方案中，所述流动相中高氯酸水溶液的pH调节范围为9.0～10.5，优选地，为10.0。

在本申请的上述实施方案中，所述流动相中高氯酸水溶液的高氯酸浓度为1体积％～5体积％，优选地，为3体积％。

在本申请的一些实施方案中，所述流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为3体积％高氯酸水溶液(用氨水调节pH值为10.0)与乙腈以体积比90:10所形成的混合体系；流动相B为乙腈；

任选地，所述洗脱为梯度洗脱；洗脱梯度如下：

0min时流动相为：50体积％A相+50体积％B相；

5min时流动相为：50体积％A相+50体积％B相；

15min时流动相为：40体积％A相+60体积％B相；

25min时流动相为：25体积％A相+75体积％B相；

35min时流动相为：25体积％A相+75体积％B相；

55min时流动相为：15体积％A相+85体积％B相；

56min时流动相为：50体积％A相+50体积％B相；

60min时流动相为：50体积％A相+50体积％B相。

在本申请的上述实施方案中，所述反相高效液相色谱法的色谱条件还包括：

流速为1.4～1.6ml/min，优选为1.5ml/min；

柱温为38℃～42℃，优选为40℃；

检测波长为210nm～230nm，优选为220nm；

进样量为10μl～100μl，优选为50μl；

进样盘控温为2℃～10℃，优选为8℃。

在本申请的一些实例中，所述反相高效液相色谱法的色谱条件还包括：色谱柱为XBridge C18，规格为4.6×250mm，3.5μm。

在本申请的上述实施方案中，所述的检测方法还包括：

制备系统适用性溶液：称取杂质A、B、C、E、F各约10mg，精密称定，置25ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度摇匀，得各杂质贮备液1，精密量取1ml置10ml量瓶中，得各杂质贮备液2；称取维库溴铵对照品约20mg，精密称定，置10ml容量瓶中；再精密移取杂质A、B、C、E贮备液2各1ml、杂质F贮备液1 0.5ml，置该10ml容量瓶中，稀释剂溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得；

制备供试品溶液：取注射用维库溴铵药物5瓶(例如，规格：4mg)，用适量稀释剂溶解并转移至10ml量瓶中，定容，摇匀；这里，所述的稀释剂为盐酸水溶液，优选地，盐酸水溶液浓度为0.01mol/L；

制备对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，至100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀；

制备灵敏度溶液：精密量取对照溶液1ml，至10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀；

取溶液分别注入色谱仪，记录色谱图，以主成分自身对照法测定有关物质的含量。

在本发明的上述实施方案中，本发明提供的一种维库溴铵有关物质的检测方法，其中，在计算有关物质含量时，采用主成分自身对照法进行准确定量。

在本申请的上述实施方案中，所述的检测方法，其中，有关物质检测的杂质包括但不限以下已知杂质，杂质化学结构如下：

经系统适用性试验、单个杂质定位试验、定量限检测限试验、线性试验和准确度试验对本发明的方法进行了方法学验证，证明本发明提供的维库溴铵药物中有关物质的检测方法具有下述优点：

(1)本方法系统适用性良好。

(2)有关物质与主峰及各杂质峰之间均能达到良好分离。

(3)本方法灵敏度高，能够有效检测的有关物质浓度均低于报告限。

(4)本方法准确度高。

(5)有关物质在一定浓度范围内，呈现良好线性关系。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

附图说明

附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本发明的技术方案，并不构成对本发明技术方案的限制。

图1表示的是根据2020版英国药典的注射用维库溴铵质量标准中有关物质的测定方法应用于注射用维库溴铵，出现主峰峰型异常的检测色谱图；

图2表示的是根据2020版中国药典注射用维库溴铵质量标准中含量的测定方法应用于注射用维库溴铵有关物质检测，出现主峰和杂质B无法有效分离的检测色谱图；

图3为本申请实施例2的杂质分离色谱图(维库溴铵对照品与已知杂质混合溶液)；

图4为本申请实施例5的杂质分离色谱图(100％水平供试品溶液)；

图5为本申请实施例6的注射用维库溴铵稳定性样品有关物质检测色谱图。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。

实施例1

维库溴铵的有关物质系统适用性试验

仪器(Agilent HPLC 1260)及色谱条件：

色谱柱：沃特世XBridge C18 4.6×250mm，3.5μm

流动相A：3体积％高氯酸水溶液(用氨水调整pH10.0)-乙腈(体积比为90:10)

流动相B：乙腈

洗脱梯度：

时间(min)	流动相A(体积％)	流动相B(体积％)
			0	50	50
5	50	50
			15	40	60
25	25	75
			35	25	75
55	15	85
			56	50	50
60	50	50

稀释剂：0.01mol/L盐酸溶液，在下面的实例中如无特别说明，所用稀释剂同实施例1；

流速：1.5ml/min，柱温：40℃，检测波长：220nm，进样量：50μl，进样盘控温8℃。

取下述溶液分别注入色谱仪，记录色谱图，以主成分自身对照法计算有关物质的含量。

实验步骤：

溶液配制：

制备系统适用性溶液：称取杂质A、B、C、E、F各约10mg，精密称定，置25ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度摇匀，得各杂质贮备液1，精密量取1ml置10ml量瓶中，得各杂质贮备液2。称取维库溴铵对照品约20mg，精密称定，置10ml容量瓶中；再精密移取杂质A、B、C、E贮备液2各1ml、杂质F贮备液1 0.5ml，置该10ml容量瓶中，稀释剂溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。

制备供试品溶液：取注射用维库溴铵5瓶(规格：4mg；批号：20082621；扬子江药业集团有限公司)，用适量稀释剂溶解并转移至10ml量瓶中，定容，摇匀；这里，所述的稀释剂为盐酸水溶液，优选地，盐酸水溶液浓度为0.01mol/L。

制备对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，至100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。

制备灵敏度溶液：精密量取对照溶液1ml，至10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。

系统适用性中维库溴铵的保留时间及峰面积结果见下表：

空白溶液对有关物质检测无干扰；灵敏度溶液中维库溴铵的信噪比(S/N)为53.60，分离度溶液中主峰与杂质B的分离度为1.49；6针对照溶液中维库溴铵峰面积的RSD为0.51％，保留时间的RSD为0.32％，系统适用性良好。

实施例2已知杂质定位试验

色谱条件同实施例1

实验步骤：

空白辅料溶液：取冻干空白辅料(甘露醇、磷酸氢二钠和枸橼酸，来源：扬子江药业集团有限公司)1瓶，精密加入2ml稀释剂，振摇使溶解，混匀。

各杂质定位溶液：称取杂质A、B、C、E、F各约10mg，精密称定，分别置不同的25ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，精密量取0.5ml置不同的10ml容量瓶中，加稀释剂稀释并定容至刻度，摇匀，即得。

维库溴铵定位溶液：取维库溴铵对照品约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，稀释剂溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。

溴离子定位溶液：取溴化钾约37.32mg，精密称定，置100ml量瓶中，稀释剂溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。

系统适用性溶液：称取杂质A、B、C、E、F各约10mg，精密称定，置25ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度摇匀，得各杂质贮备液1，精密量取1ml置10ml量瓶中，得各杂质贮备液2。称取维库溴铵对照品约20mg，精密称定，置10ml容量瓶中；再精密移取杂质A、B、C、E贮备液2各1ml、杂质F贮备液1 0.5ml，置该10ml容量瓶中，稀释剂溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。

取上述空白辅料溶液、各杂质定位溶液、维库溴铵定位溶液和溴离子定位溶液、系统适用性溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图(分离情况见图3)。各杂质保留时间见下表：

结果显示：空白辅料及溴离子出峰均不干扰有关物质的检测，系统适用性溶液中主峰与杂质B的分离度大于1.0，达到基线分离。

实施例3检测限与定量限试验

色谱条件同实施例1

实验步骤：

杂质贮备液：称取杂质A、B、C、E、F各约10mg，精密称定，置25ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度摇匀，得各杂质贮备液1，精密量取1ml置10ml量瓶中，得各杂质贮备液2。

维库溴铵贮备液：取维库溴铵对照品约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，稀释剂溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml置20ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

LOQ(定量限)溶液：精密量取杂质C、F贮备液2 4ml置100ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取杂质A、B贮备液2 3ml置100ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取杂质E贮备液21.5ml置100ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取维库溴铵贮备液1ml置100ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

LOD(检测限)溶液：精密量取5ml LOQ溶液置10ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

取上述溶液分别进样，定量限溶液中信噪比(S/N)大于10；检测限溶液信噪比(S/N)约为3。

数据结果如下表：

结果显示：各杂质定量限浓度水平均小于供试品的0.1重量％(报告限)，能够准确控制有关物质的含量。

实施例4线性试验

色谱条件同实施例1

实验步骤：取维库溴铵对照品约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，稀释剂溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得；精密量取2ml，置10ml量瓶中，稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

杂质A、B、C、E线性溶液按下表配制：

线性水平	移取各杂质贮备液2体积(ml)	量瓶体积(ml)	各杂质浓度(μg/ml)
				L1(LOQ)	--	--	--
L2(50％)	5.0	100	2
				L3(80％)	2.0	25	3.2
L4(100％)	1.0	10	4
				L5(200％)	2.0	10	8

杂质F和维库溴铵对照品线性溶液按下表配制：

取上述溶液分别进样并记录色谱图，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作线性回收方程。

线性结果如下：

结果显示：杂质A在1.23μg/ml(LOQ)～8.28μg/ml(200％限度水平)浓度范围内，呈现良好的线性。

杂质B在1.23μg/ml(LOQ)～8.17μg/ml(200％限度水平)浓度范围内，呈现良好的线性。

杂质C在1.66μg/ml(LOQ)～8.28μg/ml(200％限度水平)浓度范围内，呈现良好的线性。

杂质E在0.62μg/ml(LOQ)～8.23μg/ml(200％限度水平)浓度范围内，呈现良好的线性。

杂质F在1.59μg/ml(LOQ)～39.76μg/ml(200％限度水平)浓度范围内，呈现良好的线性。

维库溴铵在1.01μg/ml(LOQ)～40.56μg/ml(200％限度水平)浓度范围内，呈现良好的线性。

实施例5准确度试验

色谱条件同实施例1

实验步骤：

供试品溶液：取注射用维库溴铵(规格：4mg；批号：20082621；扬子江药业集团有限公司)5瓶，每瓶精密加入2ml稀释剂，振摇使溶解，转移至10ml量瓶中，混匀，即得；平行配制3份。

1体积％对照溶液：精密移取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

杂质贮备液：称取杂质A、B、C、E、F各约10mg，精密称定，置25ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度摇匀，得各杂质贮备液1，精密量取1ml置10ml量瓶中，得各杂质贮备液2。

杂质对照品混合溶液：精密移取杂质A、B、C、E贮备液2各1ml，置10ml容量瓶中；再精密加入1ml杂质F贮备液1，置该10ml容量瓶中，稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

LOQ水平杂质混合溶液：精密量取杂质A、B贮备液1各3ml、杂质C、F贮备液1各4ml、杂质E贮备液1 1.5ml，置100ml容量瓶中，稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

配制各水平回收率试验溶液如下：

杂质混合贮备液(A、B、C、E)：精密量取杂质A、B、C、E贮备液1各2ml，置10ml容量瓶中，稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

LOQ水平供试品溶液：取本品5瓶，每瓶精密加入1ml稀释剂，振摇使溶解，全部转移至10ml量瓶中，再精密加入LOQ水平杂质混合溶液1ml，取适量稀释剂润洗样品瓶，转移至该10ml容量瓶中，稀释剂稀释至刻度，混匀，即得；平行配制3份。

100％水平供试品溶液：取本品5瓶，每瓶精密加入1ml稀释剂，振摇使溶解，全部转移至10ml量瓶中，再精密加入0.5ml杂质混合贮备液和0.5ml杂质F贮备液1，取适量稀释剂润洗样品瓶，转移至该10ml容量瓶中，稀释剂稀释至刻度，混匀，即得；平行配制3份。

200％水平供试品溶液：取本品5瓶，每瓶精密加入1ml稀释剂，振摇使溶解，全部转移至10ml量瓶中，再精密加入1ml杂质混合贮备液和1ml杂质F贮备液1，取适量稀释剂润洗样品瓶，转移至该10ml容量瓶中，稀释剂稀释至刻度，混匀，即得；平行配制3份。

分别进样并记录色谱图，计算回收率，结果如下表：

结果表明：各杂质定量限水平回收率在70.0％～130.0％之间，100％、200％测试水平的回收率在80.0％～120.0％之间，本法的准确度良好。

实施例6稳定性样品检测

根据中国药典2020版四部通则要求，对制剂样品进行稳定性留样并进行有关物质检测。

色谱条件同实施例1

实验步骤：

供试品溶液：取注射用维库溴铵(规格：4mg；批号：20082621；扬子江药业集团有限公司)5瓶，每瓶精密加入2ml稀释剂，振摇使溶解，转移至10ml量瓶中，摇匀，即得。

对照溶液：精密移取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

杂质对照品混合溶液：称取杂质A、B、C、E、F各约10mg，精密称定，置25ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度摇匀，得各杂质贮备液1，精密量取1ml置10ml量瓶中，得各杂质贮备液2。精密移取杂质A、B、C、E贮备液2各1ml，置10ml容量瓶中；再精密加入1ml杂质F贮备液1，置该10ml容量瓶中，稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

在进样盘控温8℃条件下分别进样并记录色谱图，结果显示杂质对照品混合溶液、对照溶液56小时内稳定，制剂供试品溶液34小时内稳定。

虽然本申请所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本申请而采用的实施方式，并非用以限定本申请。任何本申请所属领域内的技术人员，在不脱离本申请所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本申请的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。

Claims (9)

1.一种注射用维库溴铵药物中有关物质的检测方法，包括如下步骤：

采用反相高效液相色谱法，以亚乙基桥杂化颗粒为基质的三键键合硅胶为色谱柱填料，采用紫外检测器；流动相为高氯酸水溶液与水溶性非质子有机溶剂所形成的混合体系；以所述流动相进行洗脱，检测注射用维库溴铵药物中的杂质含量。

2.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述注射用维库溴铵药物为维库溴铵注射剂，优选地，所述维库溴铵注射剂为冻干粉针即注射用维库溴铵。

3.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述流动相中水溶性非质子有机溶剂选自乙腈、四氢呋喃和二甲基甲酰胺中的一种，优选地，为乙腈。

4.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述流动相中高氯酸水溶液还包含pH调节剂，所述pH调节剂选自氨水和三乙胺中的一种；优选地，为氨水。

5.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述流动相中高氯酸水溶液pH调节范围为9.0～10.5，优选地，为10.0。

6.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述流动相中高氯酸水溶液浓度为1体积％～5体积％，优选地，为3体积％。

7.如权利要求6所述的检测方法，其中，所述流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为3体积％高氯酸水溶液与乙腈以体积比90:10所形成的混合体系；所述流动相B为乙腈；其中，所述3体积％高氯酸水溶液用氨水调节pH值为10.0；

任选地，所述洗脱为梯度洗脱；洗脱梯度如下：

0min时流动相为：50体积％A相+50体积％B相；

5min时流动相为：50体积％A相+50体积％B相；

15min时流动相为：40体积％A相+60体积％B相；

25min时流动相为：25体积％A相+75体积％B相；

35min时流动相为：25体积％A相+75体积％B相；

55min时流动相为：15体积％A相+85体积％B相；

56min时流动相为：50体积％A相+50体积％B相；

60min时流动相为：50体积％A相+50体积％B相。

8.如权利要求1至7中任一项所述的检测方法，所述反相高效液相色谱法的色谱条件还包括：

流速为1.4～1.6mL/min，优选为1.5mL/min；

柱温为38℃～42℃，优选为40℃；

检测波长为210～230nm，优选为220nm；

进样量为10～100μl，优选为50μl；

进样盘控温为2℃～10℃，优选为8℃。

9.如权利要求1至7中任一项所述的检测方法，还包括：

制备系统适用性溶液：称取维库溴铵对照品约20mg，精密称定，置10ml容量瓶中；再精密移取杂质A、B、C、E贮备液2各1ml、杂质F贮备液1 0.5ml，置该10ml容量瓶中，稀释剂溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得；

制备供试品溶液：取注射用维库溴铵药物5瓶，用适量稀释剂溶解并转移至10ml量瓶中，定容，摇匀；

制备对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，至100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀；

制备灵敏度溶液：精密量取对照溶液1ml，至10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀；

取溶液分别注入色谱仪，记录色谱图，以主成分自身对照法测定有关物质的含量；

这里，所述杂质贮备液1和贮备液2的制备为：称取杂质A、B、C、E、F各约10mg，精密称定，置25ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度摇匀，得各杂质贮备液1，精密量取1ml置10ml量瓶中，得各杂质贮备液2；

所述的稀释剂为盐酸水溶液，优选地，盐酸水溶液浓度为0.01mol/L。

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