CN106404925A - 测定人全血中6种巴比妥类药物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属分析化学及司法鉴定技术领域，具体涉及一种测定人全血中6种巴比妥类药物的方法，其包括：血液样品预处理后，采用液相色谱－质谱联用法测定人全血中巴比妥类药物的浓度，本发明方法样品用量少，样品处理操作简单、快速，检测方法灵敏度高，能对样品中的6种巴比妥类药物如，巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥、硫喷妥和美索比妥进行定性和定量分析，结果准确、可靠，特异性强、线性范围宽，尤其可用于少量检材如100μL人全血中6种巴比妥类药物的定性和定量，并且操作简单、快速、提取溶剂用量少，能够满足司法鉴定任务紧迫、对检测时间要求高的需求。

Description

测定人全血中6种巴比妥类药物的方法

技术领域

本发明属分析化学及司法鉴定技术领域领域，具体涉及一种简便快速测定人全血中6种巴比妥类(巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥、硫喷妥和美索比妥)的方法。

背景技术

现有技术公开了巴比妥类化合物，包括巴比妥(barbital)、苯巴比妥(phenobarbital)、异戊巴比妥(amobarbital)、司可巴比妥(secobarbital)、硫喷妥(thiopental)以及美索比妥(methohexital)是一类作用于中枢神经系统的镇定剂，在临床上的应用范围广泛，该类化合物除镇静麻醉作用以外，还可以用作抗焦虑药、安眠药、抗痉挛药。研究实践显示，此类药物具有成瘾性，且其治疗剂量与中毒剂量较为接近，因此在临床上已逐渐被苯二氮卓类药物取代。但由于其应用广泛，较易获得，因此易被吸毒人员或犯罪分子不法使用，甚者导致自杀、他杀、过量服用中毒等刑事案件的发生。因此，巴比妥类药物在涉毒案例的鉴定中有着较高的检出率。生物检材中巴比妥类药物的定性和定量分析在临床毒物分析及法医毒物分析领域中也见有较多的应用与报道。

全血是法医毒物分析中最为重要的一种生物检材，尤其在涉及死亡的案例中，由于死后溶血现象的出现，常以全血作为生物检材，对药物的浓度水平进行分析与解释。因此，建立人全血中测定巴比妥类药物的方法具有重要意义。

目前，现有技术公开的测定血液中巴比妥类药物的方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法，和液相色谱-质谱联用法等，其中，薄层色谱法、高效液相色谱法和气相色谱法专属性较差，难以满足毒物分析特异性强、定性准确的要求，而气相色谱-质谱联用法检测巴比妥类药物需要衍生化，且灵敏度较低。液相色谱-质谱联用技术由于灵敏度高，分析范围广，分析时间短等特点，近年来在毒物分析领域中有着广泛的应用。目前已见有公开报道的血液中巴比妥类药物的液相色谱-质谱联用测定技术，然而，经实践证实，所述的报道的方法均存在灵敏度偏低，生物检材用量大，分析时间长等缺点，因此难以满足临床上及司法鉴定中对于此类药物的检测，要求灵敏、简单、快速、准确的分析需求。

鉴于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种灵敏、简便、快速而准确的能同时测定人全血中多种巴比妥类药物的方法，尤其是能同时测定人全血中6种包括巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥、硫喷妥和美索比妥巴比妥类药物的方法。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术存在的缺陷，提供提供一种灵敏、简便、快速而准确的能同时测定人全血中多种巴比妥类药物的方法，尤其是能同时测定人全血中6种包括巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥、硫喷妥和美索比妥巴比妥类药物的方法。

本发明方法中，采用液相色谱一质谱联用法同时对人全血中6种巴比妥类药物进行定性和定量分析，所述的6种巴比妥类药物是巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥、硫喷妥和美索比妥。

具体而言，本发明的测定人全血中6种巴比妥类药物的方法，其特征在于，其包括步骤：

(1)血液样品预处理

取人全血检材，加入内标烯丙异丙巴比妥溶液，加入盐酸溶液，再加入90/10正己烷-乙酸乙酯，涡旋混合，12000rpm离心，转移上层有机相，吹干，初始流动相复溶，取进样；

(2)采用液相色谱一质谱联用法测定人全血中巴比妥类药物的浓度，采用的色谱柱为ACQUITY BEH C18(Waters，2.1×100，1.7μm)，柱温40℃。

本发明方法中，样品用量少，样品处理操作简单、快速，检测方法灵敏度高，能对样品中的巴比妥类药物进行定性和定量分析，本发明的一个实施例中，对少量人全血100μL经过酸化处理后，加入有机溶剂(90/10正己烷-乙酸乙酯，400μL)进行液液萃取，转移上层萃取液，60℃空气流下吹干，残余物用100μL初始流动相复溶，进样量5μL，样品用量少，前处理过程简便、快速，易于操作和推广。

本发明方法中，所采用的人全血样品用量为100μL，显著地减少了已报道方法中采用的检材量；且前处理简单、快速；液相色谱-质谱联用法的灵敏度高，在检材量小的情况下，定量限仍可达2ng/mL；本发明的一个实施例中，尤其提供了首次建立美索比妥的定性和定量分析方法，且准确度和精密度均符合标准。

本发明采用超高效液相(UHPLC)色谱柱以及质谱检测器，测定人全血中6种巴比妥类药物的含量，检测的灵敏度高、准确度好。

本发明方法对人全血中6种巴比妥类药物进行定性和定量分析，结果准确、可靠，各化合物检测限均为0.5ng/mL(S/N＞3)，定量限为2ng/mL(S/N＞10)，线性范围2-2000ng/mL，线性相关系数r²值均大于0.99。提取回收率在59.2-88.4％范围内，准确度在87.3-111.1％范围内，批内精密度的RSD值不超过11.5％，批间精密度的RSD值不超过12.2％，本发明方法的检测目标物的色谱保留时间和质谱特征峰如表1所示，

表1检测目标物的色谱保留时间和质谱参数

注：粗体为定量离子对。

本发明方法与现有技术的方法相比较，具有以下明显优势：

(1)本方法的灵敏度超过已报道的其他方法，目前已有的气相色谱-质谱联用法测定巴比妥类药物的定量限在50ng/mL-20μg/mL范围内；液相色谱-质谱联用法测定巴比妥类药物的定量限在5ng/mL-50ng/mL范围内；而我国司法鉴定技术规范(SF/Z JD0107008-2010)中液相色谱-质谱联用法测定巴比妥类药物的检出限为100ng/mL，定量限虽未提及，但推算出应高于100ng/mL；而本发明方法的灵敏度高，6种巴比妥类药物的定量限均能达到2ng/mL。

(2)本方法使用的生物检材(全血)量少，现有技术的检测方法多采用1mL全血或1mL尿液作为检材，所用提取溶剂量常需4mL左右，有机溶剂的消耗量大，且吹干过程时间长，而本发明方法仅使用100μL全血，样品用量少，能够应对在实际检案中常出现的检材量极其有限的情况，并且提取溶剂用量400μL，消耗量少，吹干过程短。

(3)本方法所采用的前处理步骤快速、简单，本方法采用简单经济的液液萃取方法，现有技术的液液萃取方法，如我国司法鉴定技术规范(SF/ZJD0107008-2010)，常采用乙醚作为提取溶剂，乙醚的挥发性强，提取过程中易散发到空气中，造成待测物的损失；且易与血样中的水混溶，不仅会引入较多的杂质，而且难以吹干，造成测定时间增加；而本方法经多种提取溶剂的筛选，选定提取回收率相对最高的90/10正己烷-乙酸乙酯混合溶剂作为液液萃取溶剂，其优点是，由于检材用量少，提取溶剂用量相应减少，且易吹干，极大地节省了测定时间；另一方面，该混合溶剂对操作人员的身体危害较小，对环境比较友好。(4)现有技术中均未涉及到美索比妥的测定，本方法中的提取方法及分析条件能够准确对美索比妥进行定性和定量，准确度精密度均可以满足要求。

附图说明

图1是6种巴比妥类标准品的离子色谱图，其中，从上至下分别为：硫喷妥、巴比妥、司可巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥、美索比妥、内标。

图2是空白人全血的提取后进样的离子色谱图。

图3是实际检案中含巴比妥类样本的离子色谱图，其中，测得苯巴比妥6.6μg/mL。

具体实施方式

实施例1测定人全血中6种巴比妥类药物

设定色谱条件如下：

色谱柱：ACQUITY BEH C18(Waters，2.1×1001.7μm)柱温：40℃

流动相：乙腈(B相)∶水(A相)梯度洗脱(如表2所示)，流速0.3mL/min。

进样量：5μL

梯度洗脱条件如表2所示，

表2梯度洗脱条件

质谱条件为：

ESI(-)；喷雾电压：3kV；鞘气：35Arb；辅助气：10Arb；离子传输管温度：350℃；脱溶剂温度：300℃；

扫描方式：多反应监测(MRM)

检测目标物的色谱保留时间和质谱数据如表1所示；

样品处理：

取人全血检材100μL，加入内标(烯丙异丙巴比妥)溶液20μL，加入0.1mol/L盐酸溶液20μL混匀，再加入混合提取溶剂(90/10正己烷-乙酸乙酯)400μL，涡旋混合2min，12000rpm离心5min，转移上层有机相，60℃吹干，100μL初始流动相复溶，涡旋混合2min，12000rpm离心5min，取5μL进样；

线性试验：

取混合标准系列工作液，加入空白人全血，涡旋混匀，配成含待测物浓度分别为2、6、20、60、200、600、1600、2000ng/ml的人全血样品，按“样品处理”项下操作，制备标准曲线，并同时制备空白样品，记录色谱图。以待测物浓度为横坐标，待测物与内标的峰面积比值为纵坐标，用加权(W＝1/X²)最小二乘法进行回归运算，绘制标准曲线；

精密度和准确度试验：

取混合标准定量限、低、中、高浓度的质控工作液，加入空白人全血，涡旋混匀，配成含待测物浓度分别为2、6、100、1600ng/mL的人全血样品，每批每个浓度配制5份，共做3批，按“样品处理“项下操作，根据每批的线性回归方程计算其实测浓度，计算每个浓度的准确度、批内和批间精密度，精密度以相对标准偏差(RSD)表示；

提取回收率试验：

取低、中、高浓度的混合标准质控工作液配制成含待测物浓度分别为6、100、1600ng/mL的人全血样品5份，按“样品制备”项下操作，记录样品及内标峰面积并计算均值AS1，取一批精密度数据计算，另以空白人全血按“样品制备”项下操作所得空白基质液，加入混合标准工作液，配制3个相同浓度的对照溶液，每个浓度平行配制3份，记录样品及内标峰面积并计算均值AS2，以AS1/AS2×100％计算提取回收率。

表3为人全血中待测物的批内和批间精密度、准确度及提取回收率的数据。

表3

Claims (4)

1.测定人全血中6种巴比妥类药物的方法，其特征在于，采用液相色谱-质谱联用法对人全血中6种巴比妥类药物同时进行定性和定量分析，所述的6种巴比妥类药物是巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥、硫喷妥和美索比妥；

其包括步骤：

(1)血液样品预处理

取人全血检材，加入内标烯丙异丙巴比妥溶液，加入盐酸溶液，再加入90/10正己烷-乙酸乙酯，涡旋混合，12000rpm离心，转移上层有机相，吹干，初始流动相复溶，取进样；

(2)采用液相色谱-质谱联用法测定人全血中巴比妥类药物的浓度。

2.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(1)中所述的人全血检材用量为100μL。

3.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(2)中，

色谱条件如下：

色谱柱：ACQUITY BEH C18(Waters，2.1×1001.7μm)柱温：40℃

流动相：乙腈(B相)∶水(A相)梯度洗脱(如表2所示)，流速0.3mL/min。

进样量：5μL

梯度洗脱条件如表2所示，

表2 梯度洗脱条件

质谱条件为：

ESI(-)；喷雾电压：3kV；鞘气：35Arb；辅助气：10Arb；离子传输管温度：350℃；脱溶剂温度：300℃；

扫描方式：多反应监测(MRM)。

4.按权利要求书1所述的方法，其特征是，所述方法中还包括建立美索比妥的定性和定量分析方法。