CN113655136B - 一种清肺排毒颗粒特征图谱及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药领域，具体公开了一种清肺排毒颗粒特征图谱及其构建方法。本发明对特征图谱构建过程中的色谱条件进行探究与优化，确定色谱条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸为流动相B，检测波长为265nm，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱过程为：0‑50min内，流动相A和流动相B的体积比从16：84匀速渐变至21：79；50‑95min内，流动相A和流动相B的体积比从21：79匀速渐变至50：50；其中，以黄芩苷作为参照品。本发明针对清肺排毒颗粒建立的特征图谱，可以全面地反映清肺排毒颗粒中所含化学成分的种类与数量，弥补了单纯指标性成分在质控方面的不足，更具有科学性与全面性。

Description

一种清肺排毒颗粒特征图谱及其构建方法

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其涉及一种清肺排毒颗粒的特征图谱及质量控制方法。

背景技术

中药特征图谱能全面、综合的反映所含成分的相对关系，较好的体现中药成分的复杂性和相关性，具有特征明显、专属性强、重现性好等特点，随着中医中药的推广应用，特征图谱作为中草药及其提取物质量控制方法，目前已成为被国内外广泛接受的一种对中药质量进行评价的技术。

清肺排毒颗粒是一种基于“清肺排毒汤”复方研制而成的颗粒剂，该颗粒剂既保持了汤剂吸收快、作用迅速的优点，又克服了汤剂临用时煎煮不方便、服用量大、易霉变等缺点。

随着日后对清肺排毒颗粒的大规模生产及推广使用，对其质量品质的监督及控制将愈发重要与必要。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种清肺排毒颗粒特征图谱及其构建方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种清肺排毒颗粒特征图谱的构建方法，其特征在于，采用高效液相色谱法，其色谱条件包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸为流动相B，检测波长为265nm，进行梯度洗脱；

所述梯度洗脱过程为：0-50min内，流动相A和流动相B的体积比从16：84匀速渐变至21：79；50-95min内，流动相A和流动相B的体积比从21：79匀速渐变至50：50；

其中，以黄芩苷作为参照品。

进一步地，所述特征图谱的构建方法包括如下步骤：

(1)参照品溶液的制备：取黄芩苷参照品适量，精密称定，加 10％～100％甲醇或乙醇制成每1mL含0.1mg黄芩苷的参照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：取本品，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水20mL，超声处理20分钟，取出，放冷，离心，取上清液10mL，通过C18固相萃取小柱，以20mL 20％甲醇洗脱，弃去20％甲醇液，再以10mL30％～100％甲醇或乙醇洗脱，收集洗脱液，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(3)测定：分别精密吸取参照品溶液与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得清肺排毒颗粒的特征图谱；

以上步骤(1)和步骤(2)的顺序不分先后。

作为优选，所述超声处理的功率为250W，频率为40kHz。

作为优选，所述C18固相萃取小柱为C18:ODS，2mL，柱内径 1.5cm，高2cm，预先用水20mL洗脱。

第二方面，本发明提供一种清肺排毒颗粒标准特征图谱的构建方法，根据前文所述的构建方法，对清肺排毒颗粒样品进行测定，生成由12个共有峰构成的标准特征图谱；其中1号、2号、5号、6号、9 号、10号、11号峰分别为柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷、野鸢尾苷元和16-氧代泽泻醇A。

其中，以黄芩苷为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±7％之内，所述规定值为：0.60-峰 1、0.66-峰2、0.68-峰3、0.70-峰4、0.76-峰5、1.00-峰S、1.20-峰7、 1.28-峰8、1.33-峰9、1.48-峰10、1.65-峰11、1.68-峰12。

第三方面，本发明提供一种由前述方法构建而成的清肺排毒颗粒标准特征图谱(如图1所示)。

第四方面，本发明提供一种清肺排毒颗粒的质量检测方法，将待测样品按照前述特征图谱的构建方法操作，获得待测样品的特征图谱，以黄芩苷为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±7％之内，判定为质量合格产品；

所述规定值为：0.60-峰1、0.66-峰2、0.68-峰3、0.70-峰4、0.76- 峰5、1.00-峰S、1.20-峰7、1.28-峰8、1.33-峰9、1.48-峰10、1.65- 峰11、1.68-峰12。

第五方面，本发明提供一种清肺排毒颗粒的质控系统，包括数据采集单元、处理单元和显示单元；

所述数据采集单元对按相同的实验条件下测定的待测样品的色谱图进行采集，并将采集的色谱图输入至处理单元；

所述处理单元调取清肺排毒颗粒标准特征图谱与数据采集单元输入的色谱图进行比对分析，输入至比对分析结果至显示单元；

所述显示单元根据所述比对分析结果显示待测样品的质量状况。

本发明涉及到的参照品或其他试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

本发明针对清肺排毒颗粒建立了特征图谱，特征图谱的整体性与全面性符合中药质控的要求，可全面地反映清肺排毒颗粒中所含化学成分的种类与数量，弥补了单纯指标性成分在质控方面的不足，更具有科学性与全面性，保证了中药质量的均一性和稳定性，提高了在临床上的整体疗效。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明所述的清肺排毒颗粒的标准特征图谱；

图2为实验例1中供试品溶液全梯度测定色谱图；

图3为实验例1中以乙腈-水不同比例进行梯度洗脱预试的色谱图；

图4为实验例1中以甲醇-水不同比例进行梯度洗脱预试的色谱图；

图5为实验例1中以乙腈-0.1％甲酸水不同比例进行梯度洗脱预试的色谱图；

图6为实验例1中样品的HPLC色谱图(210nm)；

图7为实验例1中样品的HPLC色谱图(254nm)；

图8为实验例1中样品的HPLC色谱图(265nm)；

图9为实验例1中样品的HPLC色谱图(280nm)；

图10为实验例1中样品的HPLC色谱图(310nm)。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的仪器包括：

高效液相色谱仪:岛津LC-20AT，检测器：二极管阵列检测器；KQ-250B型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；分析天平:METTLER TOLEDO XA105梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

数据采集和分析采用Xcalibur，Metworks，Mass Frontier 7.0软件。ODS：SP-120-50-ODS-B Daisogel Made in Japan。

下述实施例中使用的黄芩苷购自中国药品生物制品检定所。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1测定参照品黄芩苷图谱

参照品溶液的制备：取黄芩苷参照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.1mg黄芩苷的参照品溶液。

色谱测定操作：取5μL参照品溶液向高效液相色谱仪进行进样，具体操作按高效液相色谱法(中国药典2020年版通则0512)测定。

其中，色谱条件包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱时间及流动相比例为：0-50min内，流动相A和流动相B的体积比从16： 84匀速渐变至21：79；50-95min内，流动相A和流动相B的体积比从21：79匀速渐变至50：50；检测波长为265nm，流速为1.0mL/min；柱温35℃，理论塔板数不低于10000。

实施例2测定清肺排毒颗粒标准特征图谱

1、标准特征图谱的构建

供试品溶液的制备：

浸提操作：取清肺排毒颗粒标准样品，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水20mL，超声处理(功率250W，频率 40kHz)20分钟，取出，放冷，离心，取上清液10mL，通过C18固相萃取小柱(C18:ODS，2mL，柱内径1.5cm，高2cm，预先用水20mL洗脱)，以20％甲醇20mL洗脱，弃去20％甲醇液，再以10mL甲醇洗脱，收集洗脱液，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

色谱测定操作：取5μL供试品溶液向高效液相色谱仪进行进样，具体操作按高效液相色谱法(中国药典2020年版通则0512)测定，得到标准清肺排毒颗粒的色谱图。

其中，色谱条件包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.2％磷酸为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱时间及流动相比例为：0-50min内，流动相A和流动相B的体积比从16： 84匀速渐变至21：79；50-95min内，流动相A和流动相B的体积比从21：79匀速渐变至50：50；检测波长为265nm，流速为1.0mL/min；柱温35℃，理论塔板数按黄芩苷计，应不低于10000。

标准特征图谱：通过测得的清肺排毒颗粒样品和黄芩苷参照品的色谱图进行比较，确定清肺排毒颗粒色谱图有12个共有特征峰，标号 1～12，其中6号色谱峰为黄芩苷的特征峰，设定6号峰的相对保留时间为1，计算其他峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±7％之内。规定值:0.60(峰1)、0.66(峰2)、0.68(峰3)、0.70(峰 4)、0.76(峰5)、1.00(峰6S)、1.20(峰7)、1.28(峰8)、1.33 (峰9)1.48(峰10)、1.65(峰11)、1.68(峰12)。

2、标准特征图谱的验证

取十五批清肺排毒颗粒标准样品，分别按照上述浸提操作制备得到15份供试品溶液作为进样液，标号A1～A15。

利用前述色谱条件对15批样品进行测定，生成特征图谱，并分析 15批样品中各峰的保留时间值，结果见表1。

表1. 15批样品中各峰的保留时间值分析结果

由表1可以看出，以上15批清肺排毒颗粒标准样品的特征峰保留时间均在标准特征图谱中各峰规定值的±7％之内，说明本发明所构建的标准特征图谱的适用性良好。

实验例1

本实验例用于说明色谱测定操作条件的筛选过程。

(1)供试品溶液全梯度测定

为在同一图谱中尽可能多的体现处方中药材信息，选定高效液相色谱法，使用二极管阵列检测器检测。我们采用十八烷基键合硅胶色谱柱，为尽可能反应复方中更多的化学成分信息，对制备的样品进行 0→100％乙腈梯度检查，经过预试发现，复方水提取后样品的成分信息极性较大，50％乙腈-100％乙腈浓度洗脱色谱柱未有色谱峰出现。样品检测色谱图，见图2。

(2)测定条件的选择

根据特征性成分的特点，先后尝试了乙腈-水、甲醇-水、乙腈 -0.1％磷酸水、乙腈-0.1％甲酸水不同梯度、多种比例不同梯度进行分离条件的探讨，结果见图3-图5。

由图3可以看出，以乙腈-水不同比例进行梯度洗脱预试，色谱图中的色谱峰数量较少。

由图4可以看出，以甲醇-水不同比例进行梯度预试，色谱图中的色谱峰数量稍多，但色谱峰分离度不好，色谱峰整体后移。

由图5可以看出，以乙腈-0.1％甲酸水不同比例进行梯度预试，色谱图中的色谱峰数量稍多，但色谱峰分离度不好。

经过反复摸索最终选定以乙腈(A)-0.2％磷酸溶液(B)梯度洗脱，梯度洗脱如下。

(3)测定波长的确定

对图谱进行分析，分别选择了波长210nm、254nm、265nm、 280nm、310nm分析比较，发现265nm波长下检视基线平稳，出峰的信息量较大，整体图谱色谱峰较多，体现的饮片信息最多，视图较好。因此，我们选定265nm作为检测波长。见图6-图10。

(4)特征峰的标定及指认

使用LC-MS-MS：对色谱图中的12个特征性成分进行一级质谱分子量以及二级质谱分子离子碎片峰与对照品及相关文献分析推断比对，结果显示：峰1：柚皮苷、峰2：橙皮苷、峰3：未知峰、峰4：未知峰、峰5：新橙皮苷、峰6(S)：黄芩苷、峰7：未知峰、峰8：未知峰、峰9：汉黄芩苷、峰10：野鸢尾苷元、峰11：16-氧代泽泻醇A、峰12：未知峰，相关信息见表2。

表2.样品中12个特征峰的详细信息

(5)方法学考察

①供试品溶液的制备

取本品，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水20mL，超声处理20分钟，取出，放冷，离心，取上清液10mL过 ODS小柱(柱直径1.5*2cm，先以水20mL预洗)，以20％甲醇20mL洗脱，弃去，再以甲醇10mL洗脱，收集甲醇液，摇匀，即得。

②精密度试验

取同样品制备过滤后，连续测定5次，进行精密度试验，结果见表3。

表3.精密度试验中12个特征峰保留时间数据

③稳定性试验

取同一批样品按前述方法制成供试品溶液，精密吸取同一供试品溶液10μL，分别于配制后0、4、8、24、48、72小时，依法测定，结果表明，供试品溶液在72小时内基本稳定。结果见下表4。

表4.稳定性试验中12个特征峰保留时间数据

④重现性试验

按前述方法，对同一批样品6份进行测定，在所确定的HPLC条件下，进行测定，结果见表5，相对标准偏差＜3％，说明方法重现性良好。

表5.重复性试验中12个特征峰保留时间数据

(6)结论

综合以上色谱测定操作条件的筛选结果，确定出最佳的色谱测定操作条件为：

高效液相色谱仪:岛津LC-20AT，色谱柱：Welch UItimate AQ-C18 250*4.6mm；(5um)；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；流动相：乙腈(A)-0.2％磷酸溶液(B)梯度洗脱，梯度洗脱如下。

时间(分钟)	A乙腈(％)	B 0.2％磷酸(％)
			0～50	16→21	84→79
50～95	21→50	79→50

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (6)

1.一种清肺排毒颗粒特征图谱的构建方法，其特征在于，采用高效液相色谱法，其色谱条件包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.2%磷酸为流动相B，检测波长为265 nm，进行梯度洗脱；

所述梯度洗脱过程为：0-50min内，流动相A和流动相B的体积比从16：84匀速渐变至21：79；50-95min内，流动相A和流动相B的体积比从21：79匀速渐变至50：50；

其中，以黄芩苷作为参照品；

（1）参照品溶液的制备：取黄芩苷参照品适量，精密称定，加10%～100%甲醇制成每1 mL含0.1 mg黄芩苷的参照品溶液；

（2）供试品溶液的制备：取本品，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水20 mL，超声处理20分钟，取出，放冷，离心，取上清液10 mL，通过C18固相萃取小柱，以20 mL20%甲醇洗脱，弃去20%甲醇液，再以10 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

（3）测定：分别精密吸取参照品溶液与供试品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得清肺排毒颗粒的特征图谱；

以上步骤（1）和步骤（2）的顺序不分先后。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述超声处理的功率为250W，频率为40kHz。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述C18固相萃取小柱为C18: ODS，2mL，柱内径1.5 cm，高2 cm，预先用水20 mL洗脱。

4.一种清肺排毒颗粒标准特征图谱的构建方法，其特征在于，根据权利要求1~3任一项所述的构建方法，对清肺排毒颗粒样品进行测定，生成由12个共有峰构成的标准特征图谱；其中1号、2号、5号、6号、9号、10号、11号峰分别为柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷、野鸢尾苷元和16-氧代泽泻醇A。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，以黄芩苷为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±7%之内，所述规定值为：0.60-峰1、0.66-峰2、0.68-峰3、0.70-峰4、0.76-峰5、1.00-峰S、1.20-峰7、1.28-峰8、1.33-峰9、1.48-峰10、1.65-峰11、1.68-峰12。

6.一种清肺排毒颗粒的质量检测方法，其特征在于，将待测样品按照权利要求1～3任一项所述的构建方法操作，获得待测样品的特征图谱，以黄芩苷为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±7%之内，判定为质量合格产品；

所述规定值为：0.60-峰1、0.66-峰2、0.68-峰3、0.70-峰4、0.76-峰5、1.00-峰S、1.20-峰7、1.28-峰8、1.33-峰9、1.48-峰10、1.65-峰11、1.68-峰12。