CN116381123A - 一种测定左羟丙哌嗪原料、胶囊、片剂中所包含物质的方法 - Google Patents

一种测定左羟丙哌嗪原料、胶囊、片剂中所包含物质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种测定左羟丙哌嗪原料、胶囊、片剂中所包含物质的方法，所述方法包括：(1)以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；(2)吸取预定量的左羟丙哌嗪原料胶囊配置成待测品溶液；(3)供试品溶液与对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪；(4)以磷酸盐缓冲液为第一流动相A，甲醇为第二流动相B，加入到液相色谱仪中进行梯度洗脱；(5)利用液相色谱仪对供试品溶液与对照品溶液分别进行色谱检测。本发明方法通过对实验条件进行摸索优化，增强对小极性杂质的洗脱能力，实现对现有方法无法检出的小极性杂质的检验，主峰与相邻杂质分离最佳，峰形佳，检出杂质峰个数与杂质量均为最多。

Description

一种测定左羟丙哌嗪原料、胶囊、片剂中所包含物质的方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体而言，涉及一种用于分析左羟丙哌嗪胶囊/片/原料所含杂质的方法。
背景技术
《中国药典》2020年版二部、欧洲药典EP10.0版与韩国药典10版均有收载左羟丙哌嗪，比较发现三国药典均采用反向液相色谱法控制有关物质项。三国药典系统适用性要求基本相同，中国药典与欧洲药典色谱条件相同，有关物质控制已知杂质均为苯基哌嗪，杂质控制限度有差异，苯基哌嗪为0.1％～0.5％、其他单个杂质为0.1％、杂质总量为0.2％～0.6％；《中国药典》2020年版二部收载了左羟丙哌嗪片与左羟丙哌嗪胶囊，色谱条件与系统适用性要求均与其收载的左羟丙哌嗪一致，杂质控制限度为苯基哌嗪0.2％、其他单个杂质0.2％、杂质总量为0.5％。
按《中国药典》方法考察左羟丙哌嗪胶囊有关物质时发现，供试品色谱图中主成分8倍保留时间处存在未知杂质色谱峰，含量约为0.05％，但该检测方法仅要求记录至主成分3倍保留时间，存在漏检杂质的情况，详见图1。
按《中国药典》方法考察左羟丙哌嗪胶囊薄层鉴别时发现，薄层板中除主成分斑点于溶剂前沿有一明显杂质斑点，提示药品中存含量较高的杂质，详见图2。查阅相关文献几乎没有左羟丙哌嗪及制剂有关物质报道，发现现行药典方法无法检测出左羟丙哌嗪胶囊中部分杂质，不能有效的控制左羟丙哌嗪质量，用药安全不能保障。
鉴于左羟丙哌嗪的合成工艺特点与市售左羟丙哌嗪胶囊质量现状，为了保证对左羟丙哌嗪原料与制剂研发和生产质量的有效质量控制，保障药品安全有效，迫切需要提供一种测定左羟丙哌嗪原料药与制剂有关物质的方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的发明人进行了无数次检测实验，最终获得了一种测定左羟丙哌嗪原料药与制剂有关物质的方法，该检测方法检测精度高，可用于左羟丙哌嗪原料药与制剂的有关物质检测，准确可靠，专属性强，省时省力，易于操作，能够检测出现有检测方法无法检测出的杂质成分。
具体而言，本发明提供一种测定左羟丙哌嗪原料、胶囊、片剂中所包含物质的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
(2)吸取预定量的左羟丙哌嗪原料胶囊配置成待测品溶液；
(3)供试品溶液与对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪；
(4)以磷酸盐缓冲液为第一流动相A，甲醇为第二流动相B，加入到液相色谱仪中进行梯度洗脱；
(5)利用液相色谱仪对供试品溶液与对照品溶液分别进行色谱检测。
优选地，进行梯度洗脱时，流动相与洗脱时间的梯度变化如下：0-10分钟，流动相A-流动相B(80∶20)等度洗脱；10-35分钟，流动相A的比例从80％逐步降至40％、流动相B的比例从20％逐步增至60％；35-36分钟，流动相A的比例从40％逐步增至80％、流动相B的比例从60％逐步降至20％；36-50分钟，流动相A-流动相B(80∶20)等度洗脱。
优选地，进行梯度洗脱时，磷酸盐缓冲液中磷酸二氢钾的浓度0.034％。
优选地，进行梯度洗脱时，磷酸盐缓冲液用磷酸调pH值至2.5。
优选地，检测波长选取为241nm。
优选地，液相色谱检测时，流速为0.7ml/min，柱温：40℃。
有益效果
本发明方法采用高效液相反相色谱技术测定左羟丙哌嗪原料药与制剂有关物质，弥补现行药典的不足，在左羟丙哌嗪胶囊中检测出按现行药典未检测出且含量较高的杂质，保障了用药安全。本发明方法在检测左羟丙哌嗪杂质方面具有准确可靠，周期短、操作简单等优点。
附图说明
图1为：采用中国药典方法对左羟丙哌嗪胶囊进行检测时，其中有关物质供试品溶液的典型液相色谱图；
图2为：采用中国药典方法对左羟丙哌嗪胶囊进行检测时的鉴别薄层色谱图；
图3为：采用本发明方法对左羟丙哌嗪胶囊进行检测时，有关物质供试品溶液的典型液相色谱图；
图4为：左羟丙哌嗪胶囊中杂质2的高分辨质谱图；
图5为：左羟丙哌嗪胶囊中杂质2的结构式及基本信息；
图6为：左羟丙哌嗪胶囊中杂质3的高分辨质谱图；
图7为：左羟丙哌嗪胶囊中杂质3的HNMR、CNMR图；
图8为：左羟丙哌嗪胶囊中杂质3的DEPT90、CNMR(DEPT135)图；
图9为：左羟丙哌嗪胶囊中杂质3的HH-COSY、CH-HSQC、CH-HMBC图；
图10为：左羟丙哌嗪胶囊中杂质3的红外光谱图；
图11为：左羟丙哌嗪胶囊中杂质3的推测结构及基本信息；
图12为：左羟丙哌嗪胶囊中杂质4的高分辨质谱图；
图13为：左羟丙哌嗪胶囊中杂质4的结构及基本信息。
具体实施方式
以下结合附图及其实施例对本发明进行详细说明，但并不因此将本发明的保护范围限制在实施例描述的范围之中。
1、原料准备
1.1、供试品溶液的制备方法
取本品内容物适量，研细，精密称取细粉适量(约相当于左羟丙哌嗪25mg)置50ml量瓶中，加入混合溶剂(甲醇和水体积比为20∶80)超声15分钟溶解并稀释至刻度，使左羟丙哌嗪溶解并定量稀释制成每1ml中约含左羟丙哌嗪0.5mg的溶液，摇匀，滤过，取续滤液。
1.2、对照品溶液的制备
精密称定苯基哌嗪对照品25mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，精密量取5ml，置50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，精密量取1ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
1.3、系统适用性溶液的制备
取苯基哌嗪和左羟丙哌嗪各适量，加甲醇适量使溶解后，用溶剂稀释制成每1ml中分别约含10μg与100μg的溶液。
2、检测条件
填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶(CAPCELL PAK C18 MGII 4.6mm×150mm，3μm或效能相当色谱柱)；
流动相B：甲醇；
流动相A磷酸盐浓度的选择：采用中国药典方法检测左羟丙哌嗪胶囊/片的有关物质过程中发现有杂质漏检，通过加大有机相(甲醇)比例以增加对极性小的杂质的洗脱能力，但结果发现随着甲醇比例增加流动相中磷酸盐析出，堵塞管路，不能通过调整原方法中水相与有机相的比列达到满意结果。通过多次试验，将流动相磷酸缓冲液中磷酸二氢钾的浓度由0.681％调整至0.034％，方可满足本品有关物质检测需求。
流动相A的pH值选择：以磷酸盐缓冲液(称取磷酸二氢钾0.34g，加水1000ml溶解，用磷酸调pH值至2.5)为流动相A。进行反复摸索优化，考察了以pH值为2.5，3.0，4.0，7.5的磷酸盐缓冲液(称取磷酸二氢钾0.34g，加水1000ml溶解，用磷酸或氢氧化钾溶液调pH值至相应值)为流动相A的洗脱情况，结果pH2.5主峰与相邻杂质分离最佳，峰形佳，检出杂质峰个数与杂质量均为最多，故确定流动相A的pH值为2.5。
流动相梯度的选择：将左羟丙哌嗪胶囊薄层鉴别检出的杂质斑点用适宜的方法提取，得到薄层杂质斑点溶液，用不同比列的磷酸盐缓冲液(称取磷酸二氢钾0.34g，加水1000ml溶解，用磷酸调pH值至2.5)-甲醇为流动相进行洗脱，但发现主峰与其相邻杂质分离则薄层杂质检测不出，可检出薄层杂质则主峰后有未分离杂质。故采用梯度洗脱的方法，经多次试验确定梯度洗脱的方式为：0-10分钟，流动相A-流动相B(80∶20)等度洗脱；10-35分钟，流动相A的比例从80％逐步降至40％、流动相B的比例从20％逐步增至60％；35-36分钟，流动相A的比例从40％逐步增至80％、流动相B的比例从60％逐步降至20％；36-50分钟，流动相A-流动相B(80∶20)等度洗脱。采用上述方式洗脱，则左羟丙哌嗪与相邻的杂质、杂质间均能较好的分离，薄层杂质有适宜的保留时间与良好的峰形。梯度洗脱按下表；
Figure BDA0004218378700000041
Figure BDA0004218378700000051
表1
检测波长的选择：考虑到本发明主要检测的目的是考察药品中杂质含量情况，由于本发明后续证实所检测出的杂质1、杂质2、杂质3与杂质4紫外最大吸收波长分别为239nm、240nm、241nm与242nm，而的苯基哌嗪最大吸收波长为239nm，故选取最大杂质(杂质3)的最大吸收波长241nm作为检测波长。
流速：0.7ml/min；
柱温：40℃；
系统适用性要求系统适用性溶液色谱图中，理论板数按左羟丙哌嗪峰计算不低于2000，左羟丙哌嗪与苯基哌嗪的分离度应符合规定。
限度供试品溶液中如有与苯基哌嗪保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，不得过0.2％；其他单个杂质，以对照品溶液主峰面积为对照，按外标法以峰面积计算，不得过0.2％,其他杂质总最不得过0.5％,小于对照品溶液主峰面积0.1倍的峰忽略不计。
3、测定过程
(1)选用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
(2)吸取预定量的左羟丙哌嗪原料胶囊配置成待测品溶液；
(3)供试品溶液与对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪；
(4)以磷酸盐缓冲液为第一流动相A，甲醇为第二流动相B，加入到液相色谱仪中进行梯度洗脱；
(5)利用液相色谱仪对供试品溶液与对照品溶液分别进行色谱检测。
4.方法验证
由于按现行药典未在左羟丙哌嗪胶囊中检测出含量较高的杂质，如在背景技术中所介绍的，无法保障药品使用的安全性。
本发明的研究团队在研究过程中，对实验条件进行反复摸索优化，以找到最合适的色谱方法：①流动相A浓度；②流动相梯度；③流动相A的pH值；④检测波长。通过这些因素的优化，增加对极性小的杂质的洗脱能力，左羟丙哌嗪与相邻的杂质、杂质间均能较好的分离，主峰与相邻杂质分离最佳，峰形佳，检出杂质峰个数与杂质量均为最多，薄层杂质有适宜的保留时间。
本发明的研究团队在研究过程中，对实验条件和结果修整进行反复摸索优化，以找到最合适的实验方法。
4.1线性与校正因子
取苯基哌嗪、杂质3、左羟丙哌嗪对照品适量，精密称定，分别加甲醇溶解并稀释制成各对照品储备液；分别从各对照品储备液中分别精密移取5ml置同一100ml量瓶中，用溶剂(水-甲醇(80∶20))稀释至刻度，摇匀，制成线性贮备液。精密量取线性贮备液0.05ml，0.1ml，,05ml，1ml，1.5ml，2ml，2.5ml，3ml，5ml置10ml量瓶中，用溶剂定容至刻度，作为各梯度浓度溶液，依次精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以各峰面积A为纵坐标，对应浓度C为横坐标，绘制各成分标准曲线，计算回归方程，结果见表1，按照下述提供的公式计算杂质3的校正因子F，结果见表2
Figure BDA0004218378700000061
表2左羟丙哌嗪及已知杂质的线性回归
Figure BDA0004218378700000062
杂质3含量计算公式为：
Figure BDA0004218378700000063
其中CR：苯基哌嗪对照品浓度；AR：苯基哌嗪对照品峰面积；AX：供试品峰面积；F：杂质3校正因子。
4.2杂质2、杂质3与杂质4结构确认
杂质1含量低，因此，本发明主要对杂质2、3、4进行了结构确认研究。
采用二维液相-高分辨质谱对杂质2进行分析，见图4，杂质的分子离子峰为m/z＝265.1912，杂质2结构式及基本信息见图5。
杂质3在部分批次样品中含量较高，最高可达1.4％，故采用制备液相纯化分离得到杂质3的单体。采用二维液相-高分辨质谱(如图6中杂质3高分辨质谱图所示)、核磁共振(参见图7中的杂质3HNMR、CNMR图、图8中的杂质3DEPT90、CNMR(DEPT135)图、图9中的杂质3HH-COSY、CH-HSQC、CH-HMBC图)与红外分光光度法(图10中的杂质3红外光谱图)对杂质3进行分析，得到杂质3的结构式与基本信息，详见图11杂质3结构及基本信息。将图2波层色谱中主斑点前的杂质斑点洗脱提取得到斑点杂质，经液相色谱与二维液相-高分辨质谱确认，该杂质即为杂质3，说明本发明方法能有效检出波层色谱中检出的杂质斑点。
采用二维液相-高分辨质谱对杂质4进行分析，如图12杂质4高分辨质谱图，杂质的分子离子峰为m/z＝425.255506，杂质4结构及基本信息见图13。
4.3重复性考察
取本品适量，照有关物质的试验方法测定本品的杂质含量，重复测定6次，考察方法的精密度。结果见下表3。
表3左羟丙哌嗪供试品溶液重复性结果
1 2 3 4 5 6 平均 RSD
苯基哌嗪(％) 0.0038 0.0044 0.0044 0.0044 0.0036 0.0038 0.004 9.4
杂质1(％) 0.017 0.0161 0.0181 0.0147 0.0169 0.0188 0.0169 8.6
杂质2(％) 0.0727 0.0731 0.0747 0.072 0.0732 0.0712 0.0728 1.7
杂质3(％) 1.4065 1.455 1.4414 1.4069 1.4414 1.4555 1.4344 1.6
杂质4(％) 0.0132 0.014 0.0142 0.0156 0.016 0.0162 0.0148 8.4
其他单杂(％) 0 0 0 0 0 0 0 -
总杂％(％) 1.5132 1.5626 1.5528 1.5136 1.5511 1.5655 1.5431 1.6
实验结果表明，重复测定6次，各杂质含量及总杂质含量的测定偏差均小于10％，方法的精密性较好。
具体实施例1
采用本发明方法考察了市售的三家左羟丙哌嗪胶囊生产企业(湖南九典、黑龙江乌苏里江与江苏正大丰海)共55批药品与一家左羟丙哌嗪片(昆明源瑞)2批药品，结果见表4；1家生产企业左羟丙哌嗪原料药19批，结果见表5。
有关物质 照高效液相色谱法(通则0512)测定。
溶剂 甲醇-水(20:80)
供试品溶液 取本品内容物适量，研细，精密称取细粉适量加溶剂超声使左羟丙哌嗪溶解并定量稀释制成每1ml中约含左羟丙哌嗪0.5mg的溶液，滤过，取续滤液。
对照品溶液 取苯基哌嗪对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含50μg的溶液。精密量取1ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
系统适用性溶液 取苯基哌嗪和左羟丙哌嗪各适量，加甲醇适量使溶解后，用溶剂稀释制成每1ml中分别约含10μg与100μg的溶液。
色谱条件用 十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液(称取磷酸二氢钾0.34g，加水1000ml溶解，用磷酸调pH值至2.5)为流动相A，甲醇为流动相B，按下表梯度洗脱；柱温为40℃，流速为0.7ml/min，检测波长为241nm。
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 80 20
10 80 20
35 40 60
36 80 20
50 80 20
系统适用性要求 系统适用性溶液色谱图中，理论板数按左羟丙哌嗪峰计算不低于2000，左羟丙哌嗪与苯基哌嗪的分离度应符合规定。
测定法 精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
限度 供试品溶液中如有与苯基哌嗪保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算；其他杂质,以对照品溶液主峰面积为对照，按外标法以峰面积计算。
Figure BDA0004218378700000081
Figure BDA0004218378700000091
Figure BDA0004218378700000101
表4左羟丙哌嗪胶囊有关物质检查结果
Figure BDA0004218378700000102
Figure BDA0004218378700000111
表5左羟丙哌嗪有关物质检查结果
采用中国药典方法与本发明方法有关物质测定结果，有关物质杂质检出的个数与含量显著增加，详见表6。本发明方法检出的杂质3，最大达1.178％，远超过《中国药典》左羟丙哌嗪其他单个杂质0.1％的限度与左羟丙哌嗪片/胶囊其他单个杂质0.2％的限度，详见表7。
Figure BDA0004218378700000112
表6左羟丙哌嗪胶囊/片有关物质测定结果比较表
相对保留时间 杂质量(％) 检出批次(批) 检出率(％)
苯基哌嗪 1.24 0～0.009 52 91.2
杂质1 1.88 0.001～0.036 57 100.0
杂质2 4.15 0.005～0.055 57 100.0
杂质3 6.02 0.003～1.178 57 100.0
杂质4 6.04 0～0.121 24 43.6
表7左羟丙哌嗪胶囊/片有关物质测定结果表
从上表中可以看出，本发明提供的一种测定左羟丙哌嗪原料药与制剂有关物质的方法，可用于左羟丙哌嗪原料药与制剂的有关物质检测，不但弥补了现有检测技术的遗漏，而且准确可靠，专属性强，省时省力，易于操作。
如表8所示，经方法学研究，本发明的物质测定方法，有良好的专属性、准确度、精密度，适宜于左羟丙哌嗪的有关物质测定。
Figure BDA0004218378700000121
表8本发明的物质测定方法学验证总结
虽然上面结合本发明的优选实施例对本发明的原理进行了详细的描述，本领域技术人员应该理解，上述实施例仅仅是对本发明的示意性实现方式的解释，并非对本发明包含范围的限定。实施例中的细节并不构成对本发明范围的限制，在不背离本发明的精神和范围的情况下，任何基于本发明技术方案的等效变换、简单替换等显而易见的改变，均落在本发明保护范围之内。

Claims (6)

1.一种测定左羟丙哌嗪原料、胶囊、片剂中所包含物质的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
(2)吸取预定量的左羟丙哌嗪原料胶囊配置成待测品溶液；
(3)供试品溶液与对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪；
(4)以磷酸盐缓冲液为第一流动相A，甲醇为第二流动相B，加入到液相色谱仪中进行梯度洗脱；
(5)利用液相色谱仪对供试品溶液与对照品溶液分别进行色谱检测。
2.根据权利要求1所述的测定左羟丙哌嗪原料、胶囊、片剂中所包含物质的方法，其特征在于，进行梯度洗脱时，流动相与洗脱时间的梯度变化如下：0-10分钟，流动相A-流动相B(80∶20)等度洗脱；10-35分钟，流动相A的比例从80％逐步降至40％、流动相B的比例从20％逐步增至60％；35-36分钟，流动相A的比例从40％逐步增至80％、流动相B的比例从60％逐步降至20％；36-50分钟，流动相A-流动相B(80∶20)等度洗脱。
3.根据权利要求1所述的测定左羟丙哌嗪原料、胶囊、片剂中所包含物质的方法，其特征在于，进行梯度洗脱时，磷酸盐缓冲液中磷酸二氢钾的浓度0.034％。
4.根据权利要求1所述的测定左羟丙哌嗪原料、胶囊、片剂中所包含物质的方法，其特征在于，进行梯度洗脱时，磷酸盐缓冲液用磷酸调pH值至2.5。
5.根据权利要求1所述的测定左羟丙哌嗪原料、胶囊、片剂中所包含物质的方法，其特征在于，检测波长选取为241nm。
6.根据权利要求1所述的测定左羟丙哌嗪原料、胶囊、片剂中所包含物质的方法，其特征在于，液相色谱检测时，流速为0.7ml/min，柱温：40℃。
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