CN116183803A - 一种检测软咀嚼片中米尔贝肟和吡喹酮及杂质含量的方法 - Google Patents

一种检测软咀嚼片中米尔贝肟和吡喹酮及杂质含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测软咀嚼片中米尔贝肟、吡喹酮和杂质含量的方法，其中，杂质为吡喹酮杂质A、吡喹酮杂质B、吡喹酮杂质C、米尔贝肟杂质D和米尔贝肟杂质E。本发明采用反相高效液相色谱仪对米尔贝肟和吡喹酮的标准品以及供试品进行测定，根据标准曲线得出待测样品中各组分的含量。该方法能够准确测定软咀嚼片制剂中米尔贝肟和吡喹酮和杂质的含量，检测无干扰，方法可靠稳定，重复性好、准确度高、精密度高、回收率高。

Description

一种检测软咀嚼片中米尔贝肟和吡喹酮及杂质含量的方法
技术领域
本发明涉及药物分析领域，特别涉及一种检测软咀嚼片中米尔贝肟和吡喹酮及杂质含量的方法。
背景技术
米尔贝肟为大环内酯类广谱抗寄生虫药，对体内、外寄生虫特别是线虫和节肢动物均有良好驱杀作用。药物与靶虫细胞上的特异性高亲合力的位点结合，影响了细胞膜对Cl-的通透性，继而引起线虫的神经细胞及节肢动物的肌细胞抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)的释放增加，打开谷氨酸控制的Cl-通道，增强神经膜对Cl-的通透性，从而阻断神经信号的传递，最终神经麻痹，使肌肉细胞失去收缩能力，而导致虫体死亡。
作为药用活性物质，如何控制米尔贝肟中的非药用活性物质组分非常重要，尤其是后期纯化步骤难以去除的、与活性成分相似的含量较高的有关物质。截至目前，大部分发表的文献主要集中于以米尔贝霉素为基础的结构修饰，还没有发现从米尔贝肟样品角度出发，研究其有关杂质的文献见之于报道。欧洲药典于2013年1月发布了米尔贝肟专论草案，其中包含了9个杂质的结构信息，但是还需要更多的测试来评估是否这些杂质在米尔贝肟中存在的可能性，以及专论方法的适用性。因此，对企业样品中的杂质属性进行深入的研究，从而开发更加有效的控制方法就显得极为重要。
吡喹酮是一种光谱扛蠕虫药，主要用于治疗血吸虫病、华支睾吸虫病、绦虫病和肺吸虫病。吡喹酮的杂质结构在《美国药典》和《英国药典》中均已标示：分别为吡喹酮杂质A、吡喹酮杂质B、吡喹酮杂质C。为了保证米尔贝肟吡喹酮软咀嚼片制剂后续的研发和生产质量，需要对软咀嚼片制剂的质量进行检测和控制。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种检测软咀嚼片中米尔贝肟和吡喹酮及杂质含量的方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明提供一种检测软咀嚼片中米尔贝肟、吡喹酮及杂质含量的方法，包括如下步骤：
1)配制米尔贝肟、吡喹酮及杂质的标准品溶液，使用反相高效液相色谱仪测定并且绘制标准曲线；
2)配制供试品溶液，使用反相高效液相色谱仪测定供试品溶液；
3)根据步骤1的标准曲线确定步骤2的供试品溶液中米尔贝肟、吡喹酮与其他杂质的含量；
其中，杂质为吡喹酮杂质A、吡喹酮杂质B、吡喹酮杂质C、米尔贝肟杂质D和米尔贝肟杂质E。
在一些实例中，所述标准品溶液和供试品溶液的溶剂为体积浓度60～70％的乙腈水溶液。
在一些实例中，所述标准品溶液中米尔贝肟的浓度为0.3～1mg/mL。
在一些实例中，所述标准品溶液中吡喹酮的浓度为0.3～1mg/mL。
在一些实例中，所述反相高效液相色谱仪的检测条件为：流动相A为乙腈水溶液，流动相B为体积浓度为0.02％～0.04％的三氟乙酸溶液，进行梯度洗脱。
在一些实例中，，所述流动相A为体积浓度40％～60％的乙腈水溶液。
在一些实例中，所述反相高效液相色谱的流速为1.1～1.3mL/min。
在一些实例中，所述反相高效液相色谱的色谱柱温为25～35℃。
在一些实例中，所述反相高效液相色谱仪的进样量为15～25μL。
在一些实例中，所述米尔贝肟的紫外检测波长为205nm～215nm，吡喹酮的紫外检测波长为240nm～245nm。
本发明的有益效果是：本发明能够准确测定软咀嚼片制剂中米尔贝肟和吡喹酮的含量，检测无干扰方法可靠稳定，重复性好、准确度高、精密度高、回收率高。并且通过对杂质样本进行反高效液相色谱仪分析，来保证米尔贝肟杂质D和米尔贝肟杂质E杂质的灵敏度。
附图说明
图1和图2干扰实验测试中标准品溶液的反相高效液相色谱；
图3和图4是干扰实验测试中供试品溶液的反相高效液相色谱；
图5是线性关系试验中标准品溶液中吡喹酮的线性图；
图6是线性关系试验中标准品溶液中米尔贝肟的线性图；
图7是本发明对比例中供试品溶液的反相高效液相色谱。
具体实施方式
下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同方案。以下实施例对比例以及各试验中，如果不加以特别说明，反相高效液相色谱仪的测定条件为：
色谱柱：4.6mm×150mm，5μm；或效能相当的色谱柱；
流动相：流动相A为乙腈；流动相B为体积浓度为0.03％的三氟乙酸溶液；进行梯度洗脱，洗脱时间70min；
流速：1.2ml/min；
柱温：30℃；
进样量：20μL；
紫外检测器检测波长：米尔贝肟的检测波长为210nm、吡喹酮的检测波长为245nm；
梯度洗脱程序为：0.0min-10min，40％流动相A，60％流动相B；20min，65％流动相A，35％流动相B；25min-35min，75％流动相A，25％流动相B；40min，85％流动相A，15％流动相B；41min-55min，90％流动相A，10％流动相B；60min，65％流动相A，35％流动相B；62min-70min，40％流动相A，60％流动相B。
干扰实验测试
1)配制空白辅料溶液：
精密称取适量(约相当于米尔贝肟2mg)置10ml量瓶中，加溶剂约6ml，超声约15分钟使溶解，加溶剂稀释至刻度，摇匀，过滤，得到米尔贝肟辅料溶液。
然后精密称取适量(约相当于吡喹酮20mg)置10ml量瓶中，加溶剂约6ml，超声约15分钟使溶解，加溶剂稀释至刻度，摇匀，过滤，得到吡喹酮辅料溶液。
2)配制供试品溶液：取本品10片，精密称定，研细，精密称取530mg置10ml量瓶中，加适量溶剂，超声约15分钟使溶解，加溶剂稀释至刻度，摇匀，过滤。
3)测定：取空白溶液、空白辅料、供试品溶液精密量取各20μl，分别注入色谱仪，记录色谱图。
由图1、图2、图3和图4可知，米尔贝肟吡喹酮软咀嚼片的高效液相色谱图中米尔贝肟、吡喹酮的峰型良好，空白辅料并不干扰软咀嚼片杂质的检测；米尔贝肟A4色谱峰理论塔板数不低于30000，拖尾因子小于1.5；米尔贝肟A3和A4的色谱峰分离度应大于6.0；吡喹酮色谱峰理论塔板数大于3000理论塔板数，拖尾因子小于1.5；米尔贝肟A3与米尔贝肟A4峰面积之和和吡喹酮峰面积RSD小于2％。
系统适用性考察实验
包括如下步骤：
1)配制样品溶液：取米尔贝肟对照品适量和吡喹酮对照品15mg，精密称定，至50ml容量瓶中，加入适量的溶剂溶解并稀释至刻度，取1ml溶液置100ml容量瓶中，用溶剂稀释至刻度即得。
2)测定：取对照品溶液20μl，连续进样5针，记录色谱图，表1、表2为检测结果。
表1吡喹酮系统适用性实验结果
系统适用性 吡喹酮的峰面积
1 352307
2 351306
3 351511
4 352181
5 352814
RSD(％) 0.17
表2米尔贝肟系统适用性实验结果
系统适用性 峰面积
1 50667
2 50691
3 50716
4 50735
5 50829
RSD(％) 0.12
由表1和表2可知，重复进同一样品5次，米尔贝肟峰面积的RSD％为0.17％，吡喹酮峰面积的RSD％为0.17％；远小于药典中RSD％<2.0％的规定，这说明该方法系统适用性良好，试验可信度高。
线性关系试验
包括如下步骤：
1)配制样品溶液：
对照储备液：取米尔贝肟对照品10mg和吡喹酮对照品40mg，精密称定，置100ml量瓶，加入适量的溶剂，超声使溶解，用溶剂定容至刻度，精密量取2ml至20ml容量瓶，用溶剂定容至刻度。
对照线性1：取米尔贝肟和吡喹酮对照储备液0.5ml置50ml量瓶，用溶剂定容至刻度。
对照线性2：取米尔贝肟和吡喹酮对照储备液0.5ml置10ml量瓶，用溶剂定容至刻度。
对照线性3：取米尔贝肟和吡喹酮对照储备液1ml置10ml量瓶，用溶剂定容至刻度。
对照线性4：取米尔贝肟和吡喹酮对照储备液1.5ml置10ml量瓶，用溶剂定容至刻度。
对照线性5：取米尔贝肟和吡喹酮对照储备液2ml置10ml量瓶，用溶剂定容至刻度。
对照线性6：取米尔贝肟和吡喹酮对照储备液4ml置10ml量瓶，用溶剂定容至刻度。
杂质A、B、C、D、E对照储备液(混合杂质线性储备液)：精密量取已知质量浓度的杂质A、B、C、D的储备液各2ml、杂质E储备液2.5ml至25ml容量瓶，用溶剂定容至刻度。
杂质线性1：取各杂质A～E储备液0.5ml置50ml量瓶，用溶剂定容至刻度。
杂质线性2：取各杂质A～E储备液0.5ml置10ml量瓶，用溶剂定容至刻度。
杂质线性3：取各杂质A～E储备液0.8ml置10ml量瓶，用溶剂定容至刻度。
杂质线性4：取各杂质A～E储备液1.0ml置10ml量瓶，用溶剂定容至刻度。
杂质线性5：取各杂质A～E储备液1.2ml置10ml量瓶，用溶剂定容至刻度。
杂质线性6：取各杂质A～E储备液1.5ml置10ml量瓶，用溶剂定容至刻度。
2)测定：精密量取线性溶液各20μl，分别注入色谱仪，记录色谱图。表3～9为检测结果。
表3吡喹酮线性实验结果
浓度(μg/ml) 0.4090 2.0448 4.0897 6.1345 8.1794 16.3588
峰面积 36708 176949 344256 505655 681797 1362519
表4米尔贝肟线性实验结果
浓度(μg/ml) 0.0789 0.3947 0.7895 1.1842 1.5790 3.1580
峰面积 4927 24388 48438 71132 95817 191847
表5吡喹酮杂质A线性实验结果
浓度(μg/ml) 0.3971 1.9856 3.1770 3.9712 4.7654 5.9568
峰面积 38070 197043 313792 389084 467082 582544
表6吡喹酮杂质B线性实验结果
Figure BDA0004034527870000051
Figure BDA0004034527870000061
表7吡喹酮杂质C线性实验结果
浓度(μg/ml) 0.4206 2.1028 3.3644 4.2055 4.9558 6.3083
峰面积 41855 219389 349742 433089 520226 648367
表8米尔贝肟杂质D线性实验结果
浓度(μg/ml) 0.3964 1.982 3.1712 3.9641 4.7569 5.9461
峰面积 24114 112748 178887 241643 290519 361629
表9米尔贝肟杂质E线性实验结果
浓度(μg/ml) 0.0897 0.4487 0.7179 0.8974 1.0768 1.3460
峰面积 5260 26442 42045 52067 62633 78075
由图5和图6可知，吡喹酮和米尔贝肟的相关系数均为0.9999，结合表3到表9，拟合得到标准线性r2＝0.9998，符合药典规定r2≧0.99。
重复性试验
包括如下步骤：
配置对照品溶液：取米尔贝肟对照品10mg和吡喹酮对照品40mg，精密称定，置100ml量瓶，加入适量的溶剂，超声使溶剂，用溶剂定容至刻度。精密量取1mL置100ml量瓶，用溶剂稀释制成每1ml中约含有1μg米尔贝肟和4μg吡喹酮的溶液。
配置混合供试品溶液：精密称取530mg置10mL量瓶中，加适量溶剂，加入1ml混和杂质储备液，超声约15分钟使溶解，加溶剂稀释至刻度，摇匀，过滤。
然后取对照品溶液、混合溶液，精密量取20μL，分别注入色谱仪，记录色谱图。表10和表11为检测结果。
表10吡喹酮重复性试验的结果
Figure BDA0004034527870000062
Figure BDA0004034527870000071
表11米尔贝肟重复性试验的结果
重复性 米尔贝肟杂质D(％) 米尔贝肟杂质E(％)
1 2.036 0.456
2 2.003 0.451
3 2.035 0.456
4 2.033 0.457
5 2.025 0.455
6 2.031 0.453
均值 2.027 0.455
RSD(％) 0.61 0.47
由表10和表11结果可知，同一批样品重复6次检测表明，吡喹酮杂质A、杂质B、杂质C的RSD(％)分别为0.55、0.60、0.76；米尔贝肟中杂质E、米尔贝肟D的RSD(％)分别为0.47、0.61；各RSD(％)均<2.0％，表明该方法测定米尔贝肟吡喹酮软咀嚼片的重复性良好。
对比例：
1)配制米尔贝肟吡喹酮空白辅料溶液：
米尔贝肟辅料溶液：精密称取适量(约相当于米尔贝肟2mg)置10ml量瓶中，加溶剂约6ml，超声约15分钟使溶解，加溶剂稀释至刻度，摇匀，过滤。
吡喹酮辅料溶液：精密称取适量(约相当于吡喹酮20mg)置10ml量瓶中，加溶剂约6ml，超声约15分钟使溶解，加溶剂稀释至刻度，摇匀，过滤。
2)配制供试品溶液：取本品10片，精密称定，研细，精密称取530mg置10ml量瓶中，加适量溶剂，超声约15分钟使溶解，加溶剂稀释至刻度，摇匀，过滤。
3)色谱测定条件
色谱柱：4.6mm×150mm，3.5μm；或效能相当的色谱柱。
流动相：流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.03％三氟乙酸溶液，进行梯度洗脱，洗脱时间70min；
流速：1.2mL/min；
柱温：40℃
进样量：20μL
紫外检测器检测波长：米尔贝肟的检测波长为210nm、吡喹酮的检测波长为245nm；
梯度洗脱程序为：0.0min-10min，40％流动相A，60％流动相B；20min，65％流动相A，35％流动相B；25min-35min，75％流动相A，25％流动相B；40min，85％流动相A，15％流动相B；41min-55min，90％流动相A，10％流动相B；60min，65％流动相A，35％流动相B；62min-70min，40％流动相A，60％流动相B。
4)测定：取空白溶液、空白辅料、供试品溶液精密量取各20μl，分别注入色谱仪，记录色谱图。
如图7所示，由于改变了柱温，米尔贝肟吡喹酮主峰与前后杂质达不到基线分离，分离度小于1.5。导致峰面积定量不准，样品峰被隐藏在前后面峰的前沿处无法计算，从而影响各组分测定的含量，导致测定含量与实际含量出现偏差。
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测软咀嚼片中米尔贝肟和吡喹酮及杂质含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)配制米尔贝肟、吡喹酮及杂质的标准品溶液，使用反相高效液相色谱仪测定并且绘制标准曲线；
2)配制供试品溶液，使用反相高效液相色谱仪测定供试品溶液；
3)根据步骤1的标准曲线确定步骤2的供试品溶液中米尔贝肟、吡喹酮与其他杂质的含量；
其中，杂质为吡喹酮杂质A、吡喹酮杂质B、吡喹酮杂质C、米尔贝肟杂质D和米尔贝肟杂质E。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准品溶液和供试品溶液的溶剂为体积浓度60～70％的乙腈水溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准品溶液中米尔贝肟的浓度为0.3～1mg/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准品溶液中吡喹酮的浓度为0.3～1mg/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反相高效液相色谱仪的检测条件为：流动相A为乙腈水溶液，流动相B为体积浓度为0.02％～0.04％的三氟乙酸溶液，进行梯度洗脱。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述流动相A为体积浓度40％～60％的乙腈水溶液。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述反相高效液相色谱的流速为1.1～1.3mL/min。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述反相高效液相色谱的色谱柱温为25～35℃。
9.根据要权利求5所述的方法，其特征在于，所述反相高效液相色谱仪的进样量为15～25μL。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述米尔贝肟的紫外检测波长为205nm～215nm，吡喹酮的紫外检测波长为240nm～245nm。
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