CN112697948A - 基于指纹图谱模型建立的清肺排毒汤的质量检测方法 - Google Patents

基于指纹图谱模型建立的清肺排毒汤的质量检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112697948A
CN112697948A CN202011406131.1A CN202011406131A CN112697948A CN 112697948 A CN112697948 A CN 112697948A CN 202011406131 A CN202011406131 A CN 202011406131A CN 112697948 A CN112697948 A CN 112697948A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
fingerprint
sample
peak
test
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011406131.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112697948B (zh
Inventor
龙飞
陆锡傍
杨亮
赵留栓
方铁铮
廖嘉媛
罗莉妮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Yipiantian Pharmaceutical Group Pharmaceutical Co ltd
Guangdong Zhidao Medicine Technology Co ltd
Original Assignee
Guangdong Yipiantian Pharmaceutical Group Pharmaceutical Co ltd
Guangdong Zhidao Medicine Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Yipiantian Pharmaceutical Group Pharmaceutical Co ltd, Guangdong Zhidao Medicine Technology Co ltd filed Critical Guangdong Yipiantian Pharmaceutical Group Pharmaceutical Co ltd
Priority to CN202011406131.1A priority Critical patent/CN112697948B/zh
Publication of CN112697948A publication Critical patent/CN112697948A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112697948B publication Critical patent/CN112697948B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/90—Plate chromatography, e.g. thin layer or paper chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
    • G01N30/8679—Target compound analysis, i.e. whereby a limited number of peaks is analysed
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
    • G01N30/8686—Fingerprinting, e.g. without prior knowledge of the sample components

Landscapes

  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Library & Information Science (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明提供了一种基于指纹图谱模型建立的清肺排毒汤的质量检测方法，包括预先使用标准供试品摸索具有最佳色谱参数的指纹图谱系统，然后用该色谱系统测试单味药的标准对照样品，一次性摸索和确定少量特定组分的指纹峰，从而建立简化的定性和定量指纹图谱模型；该简化的指纹图谱模型能初步定性筛选不合格质量的清肺排毒汤产品，并能对合格产品进行定量分析，随后联合更全面的薄层色谱鉴别法对合格质量产品进行全面分析。本发明具有简化质量检测工艺、保留精确定量分析的效果、提高检测效率的技术效果。

Description

基于指纹图谱模型建立的清肺排毒汤的质量检测方法
技术领域
本发明涉及清肺排毒汤的制备工艺的质量控制方法，具体是通过指纹图谱方法为制备“清 肺排毒汤”的工艺和制剂提供所涉及中药材的鉴别、工艺参数的控制、成品质量分析的质量控 制方法，以及涉及根据该质量控制方法所生产清肺排毒汤的方法。
背景技术
清肺排毒汤来源于中医经典方剂组合，包括麻杏石甘汤、射干麻黄汤、小柴胡汤、五苓 散，性味平和。该方的主要药物组成是：麻黄9g、炙甘草6g、杏仁9g、生石膏15～30g(先煎)、桂枝9g、泽泻9g、猪苓9g、白术9g、茯苓15g、柴胡16g、黄芩6g、姜半夏9g、 生姜9g、紫菀9g、冬花9g、射干9g、细辛6g、山药12g、枳实6g、陈皮6g、藿香9g。
为了对中药组分进行有效地质量监控，必须对原料成分进行鉴别和有效含量的测定。其 中，薄层鉴别法是药物质量标准建立中常用的方法，鉴别时将适宜的固定相涂抹在玻璃板、 塑料或铝片上，从而形成均匀的薄层，展开后根据比移值(Rf)与适宜的对照物按同法所得 的色谱图的比移值(Rf)进行对比，从而完成药品的鉴别、含量的测定。
近年来，利用指纹图谱技术来检测中药组分成为高效便捷的质量检测或监控的方法。所 谓指纹图谱技术，是利用高效液相色谱(HPLC)对中药提取溶液进行液相色谱分析，通过图谱 中表征中药特定组分的图谱特定峰线及其组合，以形成该中药特有的指纹图谱，从而完成对 中药制剂的质量检测或监控。
例如，郑如文(小柴胡颗粒的高效液相指纹图谱研究，《中国医院用药评价与分析》2017 年第17卷第8期)报道了利用HPLC对小柴胡颗粒与其组成的7味中药(党参、甘草、 大枣、生姜、柴胡、黄芩、半夏)的指纹图谱进行对比分析，并研究了小柴胡颗粒指纹图谱 共有模式中35个共有峰中的26个峰在7味中药中的分布情况；而根据每味药材所对应 的共有峰特点，可在一定程度上反应出小柴胡颗粒中药材的使用情况，从药材角度辨别出产 品质量。然而，该方法需要通过大量试验测试共有的特征峰，同时所检测的指纹峰多达26个， 这对于建立指纹图谱的过程带来繁琐和不便。
魏惠珍(麻杏石甘汤多波长切换指纹图谱研究，《时珍国医国药》2012年第23卷第1期)报道了利用Agilent1100-DAD检测器，流动相:乙腈-0.1％磷酸，梯度洗脱，检测波 长:0-32min:215nm；32-40min:350nm；40-50min:254nm；进样量10μl，柱温:25℃，流速:1 ml/min，确定了麻杏石甘汤中12个共有指纹峰，从而建立HPLC指纹图谱模型。该方法可在 一定程度上反应出麻杏石甘汤中药材的使用情况，从药材角度辨别出产品质量。然而，该方 法需要通过大量试验测试共有的特征峰，同时所检测的指纹峰多达12个，这对于建立指纹图谱的过程带来繁琐和不便。
中国授权发明专利CN201510597933.8、发明名称“一种麻杏石甘汤配方颗粒的检测方法” 公开了包括红外指纹图谱、薄层定性鉴别及HPLC含量测定来检测麻杏石甘汤的质量的方法， 其中以盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷作为特征峰，建立HPLC指纹图谱模型，取得 较好的检测效果。然而，该方法需要预先进行红外指纹图谱和薄层分层分析进行初筛，才能 得到较少的3个特征指纹峰，整个过程对于建立指纹图谱的过程也带来繁琐和不便。
申请人和发明人在先申请的发明专利CN201711009683.7、发明名称“一种中药制剂的制 备工艺”公开一种结合HPLC指纹图谱检测的小柴胡汤制剂的制备方法，该方法包括对于制备 的小柴胡汤颗粒提取液，根据柴胡、黄芩、人参、制半夏、炙甘草、生姜、大枣的所有HPLC 质谱峰选择特征指纹图谱，从而为7种成分分别建立各自的特征指纹图谱，取得较好的检测 效果。该发明基于该检测方法，还建立了小柴胡汤制剂的新制备方法。然而，其需要通过大 量试验测试7种药味的各自的指纹特征峰，这对于建立指纹图谱的过程带来繁琐和不便。
此外，目前暂时没有关于五苓散和射干麻黄汤的建立指纹图谱来检测质量的相关现有技 术的报道。
由此可见，现有技术中，对于通过指纹图谱来完成中药的质量检测或监控，以及通过该 方法所建立的中药制备方法，普遍存在需要摸索和建立多个药味的特征指纹峰。然而，清肺 排毒汤是由4种古方合并调整而成，其中药材成分多达20余种，而可检出的活性成分可能达 到上百种。如果对于成品的颗粒中的不同活性成分进行逐一鉴别，并进行确定特征指纹峰， 则需要相当大的筛选工作。同时，由于暂时没有关于五苓散和射干麻黄汤的建立指纹图谱来 检测质量的相关现有技术的报道，因此对建立清肺排毒汤的指纹图谱检测方法带来更多的技 术障碍。
此外，由于清肺排毒汤属于新近摸索确定的药方，暂时没有统一的生产标准，因此各个 厂家根据实际情况进行生产，导致生产工艺各不相同，这可能对于中药制剂的标准化生产和 抗击疫情带来一定的不利影响。
因此，目前需要一种通过指纹图谱法对清肺排毒汤的产品质量进行质量监控的方法，以 及需要基于该质量监控方法所带来的规范化生产方法。
发明内容
本发明第一目的是提供一种用于对清肺排毒汤制剂进行指纹图谱质量初筛的快速检测方 法，步骤包括：
(1)建立简化的定性指纹图谱质谱模型，包括：
①取药：清肺排毒汤药物组成是：麻黄9g、炙甘草6g、杏仁9g、生石膏15～30g(先煎)、 桂枝9g、泽泻9g、猪苓9g、白术9g、茯苓15g、柴胡16g、黄芩6g、姜半夏9g、生姜 9g、紫菀9g、冬花9g、射干9g、细辛6g、山药12g、枳实6g、陈皮6g、藿香9g；按比 例称取适量的黄芩、枳实、款冬花、甘草和射干的单味标准对照药材，分别加水煎煮30min， 过滤，取续滤液即得单味对照药材溶液；
②将单味药材溶液进样20μl进行检测，得到色谱图；
③分析5种单味药的指纹参数，并建立简化的指纹图谱模型，其中黄芩指纹峰的出峰时 间是约27min、29min、33min、78min、86min、88min、104min；枳实的指纹峰的出峰时间是 约42min、47min、53min、61min；款冬花的指纹峰的出峰时间是约46min、65min；甘草的指纹峰的出峰时间是约82min；射干的指纹峰的出峰时间是约95min；
(2)取供试品颗粒1.0g，精密称定，置50ml容量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，滤过，取续滤液；
(3)将供试品溶液进样20μl进行检测，得到色谱图；
(4)比较供试品溶液和上述定性指纹图谱模型在出峰时间25-105min流出的色谱峰是否 一致，如果一致则进行下一步检测，如果不一致直接判定待测样品不合格；
(5)分别将供试品溶液和柚皮苷对照品、橙皮苷对照品、新橙皮苷对照品、黄芩苷对照 品、汉黄芩苷对照品进样10μl进行检测，得到色谱图；
(6)比较供试品溶液和上述对照品溶液在45-90min流出的色谱峰以及mAU值是否一 致，如果一致则判定待测样品符合初级质量标准，如果不一致直接判定待测样品不合格；
(7)比较步骤(6)中供试品溶液和对照品溶液的峰值强度差异，并根据对照品溶液的 标准浓度，确定供试品溶液中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷的含量；
其中，上述任一步骤中，所述色谱参数为：柱温：30℃，进样量：20μl，流速：1ml/min， 检测波长：278nm，流动相：
Figure BDA0002814250200000041
在一个实施方案中，所述液相色谱仪选自Agilent 1100高效液相色谱仪，所述色谱柱选 自Agela Venusil MP C18(4.6×250mm，5m)。
在上述任一实施方案中，其中步骤(5)，取柚皮苷对照品、橙皮苷对照品、新橙皮苷对 照品、黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含柚皮苷40μg、 橙皮苷40μg、新橙皮苷40μg、汉黄芩苷40μg、黄芩苷100μg的溶液，即得对照品溶液；
在上述任一实施方案中，其中步骤(5)和步骤(6)用于建立定量的指纹图谱色谱模型， 所述待测柚皮苷的指纹峰的出峰时间是约47min；待测橙皮苷的指纹峰的出峰时间是约 52min；待测新橙皮苷的指纹峰的出峰时间是约60min；待测黄芩苷(S)的指纹峰的出峰时 间是约77min；待测汉黄芩苷的指纹峰的出峰时间是约87min。
在上述任一实施方案中，其中步骤(6)中的判定一致的过程包括：将黄芩苷参照物峰相 应的峰为S峰，计算各主要峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积；其中供试品指纹图谱与 对照指纹图谱的相似度不得低于0.90，且相对保留时间及相对峰面积在规定值的±10％之内， 表明待测样品符合初级质量标准，如果未达到上述标准直接判定待测样品不合格。
在上述任一实施方案中，在进行指纹图谱质量初筛的检测方法之前，还包括用于测量色 谱条件与系统适用性的预试验，包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相 A，以0.1％磷酸为流动相B，按如下参数进行梯度洗脱；
Figure BDA0002814250200000042
其中，检测波长为278nm；柱温30℃；流速1.0ml/min，理论板数按黄芩苷峰计算应均 不低于5000。
本发明第二目的是提供一种联合指纹图谱和薄层色谱法来对清肺排毒汤制剂进行快速检 测方法，步骤包括：
上述检测步骤(1)-(7)，以及对通过质量初筛的待测样品进行分组展开剂的薄层色谱 检测方法，包括：
(8)取待测样品滤液，加入萃取剂进行萃取，合并萃取液；
(9)将萃取液水浴蒸干，残渣用甲醇溶解作为供试品溶液；另用相同方法平行制备阳性 对照和阴性对照溶液；
(10)分别吸取供试品溶液、阳性对照和阴性对照溶液，分别置于同一硅胶G薄层板上， 在薄层鉴别展开剂上展开，取出；
(11)加入显色溶液，用热风加热至斑点显色清晰，并置于阳光或紫外光下检视；
(12)比较供试品、阳性对照、阴性对照的斑点，如果供试品和阳性对照在相应位置上 出现相同颜色斑点，且阴性无干扰斑点，则判断供试品中含有预期与阳性对照质量相同或相 近的药物成分；其中，
对于麻黄和枳实，以正丁醇-冰醋酸-水(4：1：5)上层溶液为展开剂；
对于黄芩和生姜，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10：3：1：2)为展开剂；
对于细辛、射干、桂枝、款冬花、陈皮和紫菀，以乙酸乙酯-甲醇-水(100：17：13)为展开剂进行第一次展开后，而后以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20：10：1：1)的上层溶液为展开剂进行第二次展开；
对于泽泻，以氯仿-乙酸乙酯-甲酸(6：3.5：0.5)为展开剂；
对于柴胡和甘草，以三氯甲烷-甲醇-水(13：6：1)为展开剂。
在一个实施方案中，对于麻黄和枳实，步骤(8)和(9)加入氨水和用正丁醇萃取2次， 合并萃取液，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解作为供试品溶液。在另一另一实施方案中，步骤(11) 中喷以0.5％茚三酮乙醇溶液，105℃烘至斑点清晰。在一个具体实施方案中，所述步骤(8) 是取成品颗粒2g，加20ml水溶解，加入1ml氨水，用正丁醇萃取2次，每次10ml，合并萃 取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为供试品溶液；所述步骤(9)是另取阳性和阴性对 照药材各0.5g，分别加水适量，回流提取60分钟，放冷，滤过，滤液浓缩至20ml，分别加入1ml氨水，用正丁醇萃取2次，每次15ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶 解作为对照药材溶液。
在一个实施方案中，对于黄芩和生姜，步骤(8)和(9)加入盐酸后，用乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解作为供试品溶液。在另一实施方案中，步骤(11)中喷以2％香草醛硫酸溶液，105℃烘至斑点清晰。在一个具体实施方案中，所述步骤(8)是取成品颗粒2g，加20ml水溶解，加入1ml盐酸，用乙酸乙酯萃取2次，每次10ml， 合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为供试品溶液；所述步骤(9)是另取阳性和 阴性对照药材各0.3g，加乙酸乙酯20ml，超声波处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣用1ml， 残渣用1ml甲醇溶解作为对照药材溶液。
在一个实施方案中，对于细辛、射干、桂枝、款冬花、陈皮和紫菀，步骤(8)和(9) 加入乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解作为供试品溶液。在另一 实施方案中，步骤(12)中在于对照药材色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点，喷以三氯 化铝试液，置紫外光灯下检视。在一个具体实施方案中，所述步骤(8)是取成品颗粒2g， 加20ml水溶解，乙酸乙酯萃取2次，每次10ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇 溶解作为供试品溶液；所述步骤(9)是另取阳性和阴性对照药材各0.5g，分别加水适量，回 流提取60分钟，放冷，滤过，滤液浓缩至20ml，分别用乙酸乙酯萃取2次，每次20ml，合 并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为对照药材溶液。
在一个实施方案中，对于泽泻，步骤(8)和(9)加入石油醚(60～90℃)萃取2次，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解作为供试品溶液。在另一实施方案中，步骤(11)中 喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外光下检视。在一个具体实施 方案中，所述步骤(8)是取成品颗粒2g，加20ml水溶解，用石油醚(60～90℃)萃取2次， 每次20ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为供试品溶液；所述步骤(9) 是另取阳性和阴性对照药材各0.5g，分别加水适量，回流提取60分钟，放冷，滤过，滤液浓 缩至20ml，用石油醚(60～90℃)萃取2次，每次20ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml 甲醇溶解作为对照药材溶液。
在一个实施方案中，对于柴胡和甘草，步骤(8)和(9)加入乙酸乙酯或正丁醇萃取2次，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解作为供试品溶液。在另一实施方案中，步骤(11)中喷以1％对二甲氨基苯甲醛的10％硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰，分别在日光和紫外光下检视。在一个具体实施方案中，所述步骤(9)中取甘草对照药材0.5g，加水适量，回流提取60分钟，放冷，滤过，滤液浓缩至20ml，用乙酸乙酯萃取2次，每次20ml，合并 萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为对照药材溶液。在另一具体实施方案中，取柴 胡对照药材1.0g，加水适量，回流提取60分钟，放冷，滤过，滤液浓缩至20ml，用正丁醇 萃取2次，每次20ml，合并萃取液，用氨试液洗涤2次，弃去，收集正丁醇层，水浴蒸干， 残渣用1ml甲醇溶解作为柴胡对照药材溶液。
在上述任一实施方案中，所述硅胶G薄层板选自德国Merck硅胶G板或青岛海洋化工硅 胶G板。在一个优选实施方案中，所述硅胶G薄层板选自德国Merck硅胶G板。
本发明第三个目的是提供一种清肺排毒汤制剂的制备方法，包括将二十一味药加水煎煮 两次，滤过，合并煎液，滤液减压浓缩至清膏，加入麦芽糊精适量，干燥或粉碎，制成清肺 排毒汤颗粒，对所制备的颗粒进行质量监控，并根据质量监控结果指导产品规范化生产，其 中该质量监控或检测步骤的特征包括：
上述步骤(1)-(7)、或(8)-(12)、或(1)-(12)。
在上述任一制备方法中，其中包括，称取以下重量份的中药组分：
Figure BDA0002814250200000071
加水煎煮两次，每次1小时，滤过，合并煎液，滤液减压浓缩至相对密度1.03～1.05(70℃) 的清膏，加入麦芽糊精适量，干燥，或粉碎，制成颗粒1000g。
在一个具体实施方案中，其中第一次加10倍量水，浸泡0.5小时，煎煮1.0小时；第二 次加10倍量水，煎煮1.0小时，合并煎液，滤过；
在上述任一具体实施方案中，其中将滤液75℃±5℃减压浓缩，至密度为1.03～1.05(70℃) 的清膏，10000rpm/min离心；
在上述任一具体实施方案中，取上述离心后的清膏,加入适量麦芽糊精(每个处方量制成 总量为40g，离心后的清膏含固量约为处方量10.5％)，溶解，混匀，喷雾干燥，得浸膏粉；
在上述任一具体实施方案中，取浸膏粉，加适量粘合剂(水)，沸腾制粒，整粒，制成颗 粒1000g；
在上述任一具体实施方案中，将颗粒分装成10g/袋，复合膜包装。
在上述任一技术方案中，所谓质量监控包括对产品的质量进行检测和评价，并判断产品 质量是否合格，从而确定是否继续或中断产品的生产过程，并指导产品规范化生产。在具体 的实施方案中，在完成整粒工序后，随机抽取样品，使用前述展开剂组进行薄层层析鉴别， 以确定是否继续或中断产品的生产过程。
本发明原理在于：本发明打破了“对中药组合物中多组分需要进行反复摸索和筛选适宜的 指纹峰，才可建立足以表征各种特定药材的指纹图谱模型”的传统研究方式，首次提出了：预 先使用标准供试品摸索具有最佳色谱参数的指纹图谱系统，然后用该色谱系统测试单味药的 标准对照样品，一次性摸索和确定少量特定组分的指纹峰，从而建立简化的定性和定量指纹 图谱模型。该简化的指纹图谱模型能初步定性筛选不合格质量的清肺排毒汤产品，并能对合 格产品进行定量分析。随后联合更全面的薄层层析鉴别法对合格质量产品进行全面分析，从 而具有简化质量检测工艺、保留精确定量分析的效果、提高检测效率的技术效果。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
现有的指纹图谱法需要确定中药中多种成分的特征图谱。而本发明属于4种古方的合方 发明，相应的药材多至21种，可作为特征图谱的成分指纹峰多达上百种，因此需要通过指纹 图谱来完成药材的鉴定存在极大的技术困难。本发明创造性：预先摸索具有最佳质谱参数的 指纹质谱系统，然后通过确定的指纹图谱系统来选择5种代表药味中的5种成分，一次性摸 索和确定少量特定组分的指纹峰，从而建立简化的指纹图谱模型。该方法具有初筛检测的作 用，符合的再进行综合的薄层色谱法，不符合的直接淘汰。这种发明构思，既可以避免需要 综合摸索四个古方的指纹图谱的繁琐建立过程，同时又避免了直接进行综合性薄层色谱分析 的精确质量检测所带来的不必要的浪费。具体而言，
1、本发明通过两步法建立指纹图谱模型，其中第一步，选取色谱中区分度好、不易干扰 的五种药材，以建立定性的初筛质谱模型；第二步，在以上基础上，选取5种分度好、不易 干扰的苷类成分作为参照来建立进行定量的初筛质谱模型，通过比较对应峰强度，从而确定 待测产品的对应苷类成分的含量。
2、本发明克服现有技术没有报道五苓散和射干麻黄汤的指纹图谱的影响，首先摸索优化 质谱参数后，再尝试使用单一的药味确定可以作为指纹峰的特征成分，从而建立稳定和高效 的色谱初筛系统，该初筛系统能够对于产品进行快速简单的定性和定量分析。
3、为了进一步提高质谱初筛系统的检测稳定性，本发明在进行指纹图谱质量初筛的检测 方法之前，还引入用于测量色谱条件与系统适用性的预试验，以确定使用的色谱系统是可靠 有效。
4、为了进一步检测组合物中是否包含所有药味，在以上基础上，将该初筛系统进一步联 合预先确定的更全面TLC检测方法，对合格的药物组合物再次进行定性和定量分析，从而确 定是否包含所有符合质量要求的药味。具体而言，
(1)本发明方法所包括的TLC检测方法，参考《中国药典》收载的处方中主要药材的标准、相关中药制剂的有关标准以及文献资料，进行大胆摸索尝试，舍去不需要或对产品质量影响较小的部分成分的质量监控，选取不同于《中国药典》推荐的标准方法，针对主要的麻黄、苦杏仁、炙甘草、桂枝、泽泻、白术、柴胡、黄芩、生姜、紫菀、款冬花、射干、细 辛、枳实、陈皮、藿香等成分的各种展开剂，进行组合测试，以实现少数鉴别展开剂组即可 同时检测多种中药成分，在保证鉴定效果的基础上以优化和简便质量监控的过程。
(2)目前没有任何关于该复杂的合方的TLC法检测质量的相关报道，因此本发明是国 内首次进行系统性的TLC检测质量的发明研究。
(3)TLC法检测中药质量是较为成熟的方法，检测手段较为常规，但面对待检药味数量 如此多，且短时间内急需重大研究突破的质控方法，本发明仍然付出了大量时间、物质，并 创造性进行了分组薄层层析法测试，因此具有很高的技术前瞻性。
(4)本发明通过大量的试验数据证明，《中国药典》的标准方法并不适于检测这种多组 分的组合物的薄层分析，因此需要逐一摸索和验证。因此，发明人采用以下的研究思路进行 大量试验筛选：
(5)对于个别药味仍然使用已有的展开剂，但本发明创造性将该药味(例如黄岑)与其 他药味进行组合，通过研究模式，筛选得到使用同一展开剂能够同时区分多种药味的技术效 果；
(6)对于细辛、射干、桂枝、款冬花、陈皮和紫菀的多组分，本发明通过大量试验摸索， 出乎意料地发现可以选用二次展开剂系统来清晰的检测以上成分。试验发现，该二次展开剂 系统能一次分析检测6种成分，且各成分彼此不干扰，有效地节省了检测时间和成本；
(7)对于成分相近难以在同一展开剂进行分析的某些组分，本发明通过试验，或是在不 增加额外展开剂组合的情况下，将这些组分分别适用不同的展开剂进行层析鉴定(如陈皮和 枳实)，或是通过试验证明这些组分具有同分异构体的高度相似性，从而只需选择分离效果最 好的一种(例如紫菀和白术)即能完成鉴定；
(8)对于泽泻等具有中国药典推荐的展开剂和层析方法，本发明通过试验，发现选用不 同的展开剂，配合改良的供试品，能取得更好的检测效果。
(9)通过以上创造性的筛选思路，并通过大量的对比试验，本发明能够舍去不必要的层 析分离的组分，并能实现全组分的精确定量定性分析。该展开剂系统重复性好，在高温、低 温环境下稳定性高，检测质量高，节省了检测成本和时间，同时能获得稳定的质量检测效果。
(10)应当指出的是，本发明舍弃了石膏的检测，以及白术、藿香、杏仁等成分，并提出仅有5种展开剂组，即可对于13种成分进行质量监控和评价，并建立了足以评价清肺排毒汤20种成分的质量标准监控方法，有效地提高了生产过程。
5、此外，本发明的质量检测方法中，涉及大量具体的检测数据点值，虽然导致保护范围 较为狭窄，但是通过各种具体检测数据点值，排除了效果较差或不足的不合格产品，这非常 适合于建立稳定的质量控制标准，符合中药生产的需要。
附图说明
图1-图12,：实施例3中对现有展开剂系统进行摸索确定的展开结果图；
图13-图21：实施例4中对摸索的展开剂系统进行供试品和对照的验证结果图；
图22-图28：实施例5对确定的展开剂系统分析低温因子的影响的结果图；
图29-图35：实施例6对确定的展开剂系统分析高湿因子的影响的结果图；
图36-图42：实施例7对确定的展开剂系统分析低湿因子的影响的结果图；
图43-图47：实施例8中确定最佳指纹图谱参数的过程图；
图48-图50：实施例9中建立清肺排毒汤初筛的定性指纹图谱质谱模型的附图；
图51-图55：实施例10中对待测样品进行定性和定量检测的指纹图谱；
图56：实施例11涉及质量检测的制备清肺排毒汤的流程示意图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限 于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点 都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试 剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明 没有特别限制内容。
实施例1、试验设备和原料
1.仪器与试药
1.1仪器
薄层自动成像仪(CAMAG TLC VISUALIZER2，瑞士CAMAG公司)、薄层板加热板(CAMAG TLC PLATE HEATERⅢ，瑞士CAMAG公司)、电子天平(METTLER ME2002E， 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)、电子天平(METTLER MS 204TS，梅特勒-托利多仪 器(上海)有限公司)、超声波清洗器(KQ-300DE，昆山市超声仪器有限公司)、医用离心机 (湘仪H1850湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)、恒温水浴锅(HWS-26型)、平面色谱点 样仪(SPDY-1A，南京迈科理特科学仪器有限公司)、硅胶G薄层预制板(青岛海洋化工厂)、 硅胶G薄层预制板(德国Merck)
1.2试药与试剂
黄芩对照药材(批号：120955-201309)、6-姜辣素对照品(批号：111833-201806)、枳实 对照药材(批号：120936-201606)、麻黄对照药材(批号：121051-201606)、苦杏仁对照药 材(批号：121554-201804)、细辛对照药材(批号：121204-201606)、桂枝对照药材(批号：121191-201605)、款冬花对照药材(批号：121449-201816)、射干对照药材(批号： 120994-201801)、陈皮对照药材(批号：120969-201510)、紫菀对照药材(批号：120956-200505)、 柴胡对照药材(批号：120992-201509)、炙甘草对照药材(批号：120904-201519)及泽泻对 照药材(批号：121081-201803)均采购于中国药品生物制品鉴定研究院，其余试剂均为分析纯。
清肺排毒汤颗粒(批号：2020033001、2020033002、2020033003)由广东志道医药科技 有限公司提供。
2.溶液制备
2.1供试品溶液制备
(1)取“清肺排毒汤”颗粒2g，加20ml水溶解，加入1ml氨水，用正丁醇萃取2次，每次20ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为麻黄和枳实供试品溶液。
(2)取“清肺排毒汤”颗粒2g，加20ml水溶解，加入1ml盐酸，用乙酸乙酯萃取2次，每次20ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为黄芩和生姜供试品溶液。
(3)取“清肺排毒汤”颗粒2g，加20ml水溶解，用乙酸乙酯萃取2次，每次20ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为细辛、射干、桂枝、款冬花、陈皮和紫菀的供 试品溶液。
(4)取“清肺排毒汤”颗粒2g，加20ml水溶解，用石油醚(60～90℃)萃取2次，每次20ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为泽泻的供试品溶液。
(5)取“清肺排毒汤”颗粒2g，加20ml水溶解，用乙酸乙酯或正丁醇萃取2次，每次20ml， 合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为柴胡和甘草的供试品溶液
2.2对照药材、对照品溶液制备
(1)取麻黄、枳实和柴胡对照药材各0.5g，分别加水适量，回流提取60分钟，放冷，滤过，滤液浓缩至20ml，分别加入1ml氨水，用正丁醇萃取2次，每次20ml，合并萃取液， 水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为麻黄和枳实对照药材溶液。
(2)取甘草、细辛、射干、桂枝、款冬花、陈皮、紫菀和黄芩等对照药材各0.5g，分别加水适量，回流提取60分钟，放冷，滤过，滤液浓缩至20ml，用乙酸乙酯萃取2次，每次 20ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为细辛、射干、桂枝、款冬花、陈皮、 紫菀和黄芩对照药材溶液。
(3)取泽泻对照药材0.5g，分别加水适量，回流提取60分钟，放冷，滤过，滤液浓缩至20ml，用石油醚(60～90℃)萃取2次，每次20ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml 甲醇溶解作为泽泻对照药材溶液。
(4)取6-姜辣素对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
(5)取柴胡和甘草对照药材各0.5g，分别加水适量，用正丁醇萃取2次，每次20ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为泽泻对照药材溶液。
2.3阴性对照药材溶液制备
按照处方比例，称取缺少麻黄、枳实、黄芩、生姜、炙甘草、桂枝、细辛、射干、柴胡、泽泻及款冬花等药味的处方，按标准的制法煎煮，按上述供试品制备方法，分别制备缺麻黄、 枳实、黄芩、生姜、炙甘草、桂枝、细辛、射干、柴胡及款冬花等药味的阴性对照溶液，缺陈皮、枳实双阴性(按陈皮供试品制备方法)以及缺紫菀、白术双阴性对照溶液(按紫菀供试品制备方法)。
实施例2、根据《中国药典》，摸索和筛选不同的提取溶剂(即萃取剂)：
参考《中国药典》2015年版一部“甘草”、“黄芩”、“干姜”、“枳实”、“射干”、 “细辛”、“陈皮”、“广藿香”以及“小柴胡胶囊”等鉴别项下方法，考察用乙酸乙酯、 正丁醇萃取以及不同处理方法处理清肺排毒汤颗粒。
1、供试品溶液制备方法
(1)取颗粒供试品(批号：2020033001)加水20ml溶解，加乙酸乙酯萃取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯萃取液，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，得供试品溶液1。
(2)取上述剩余水层，加正丁醇萃取2次，每次20ml，合并正丁醇萃取液，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，得供试品溶液2。
(3)取颗粒供试品(批号：2020033001)加水20ml溶解，加正丁醇萃取2次，每次20ml， 合并正丁醇萃取液，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，得供试品溶液3。
(4)取颗粒供试品(批号：2020033001)加水20ml溶解，加HCl 1ml，用乙酸乙酯萃取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯萃取液，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，得供试品溶液 4。
(5)取颗粒供试品(批号：2020033001)加水20ml溶解，用正丁醇萃取2次，每次20ml， 合并正丁醇萃取液，用氨试液洗涤2次，每次20ml，合并正丁醇层，水浴蒸干，残渣加甲醇 1ml溶解，得供试品溶液5。
2、药材对照溶液制备
按处方量，取处方中麻黄9g、炙甘草6g、桂枝9g、泽泻9g、白术9g、柴胡16g、黄芩6g、生姜9g、紫菀9g、款冬花9g、射干9g、细辛6g、枳实6g、陈皮6g、藿香9g，分别加 1000ml水，煎煮1小时，滤过。滤液浓缩至400ml备用。
(1)麻黄药材对照溶液：取上述麻黄煎煮液20ml，用乙酸乙酯萃取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯萃取液，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，得麻黄药材对照溶液1；剩余水层，加氨水2ml，用正丁醇萃取2次，每次20ml，合并正丁醇液，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml使 溶解，作为麻黄药材对照溶液2。
(2)取其余药材煎煮液20ml，分别用乙酸乙酯萃取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯萃取液，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，分别得各自药材对照溶液1；剩余水层，用正丁醇 萃取2次，每次20ml，合并正丁醇液，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为各自药材对 照溶液2。
实施例3、分析摸索不同的薄层鉴别展开剂：
参考《中国药典》2015年版一部“甘草”、“黄芩”、“干姜”、“枳实”、“苦杏仁”、 “射干”、“细辛”、“陈皮”、“广藿香”以及“小柴胡胶囊”等鉴别项下方法，对以下 已有的展开剂进行研究模式：
(1)“甘草”鉴别展开剂：乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15：1：1：2)；
(2)“黄芩”鉴别展开剂：甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10：3：1：2)；
(3)“干姜”鉴别展开剂：石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯(2：1：1)；
(4)“枳实”鉴别展开剂：正丁醇-冰醋酸-水(4：1：5)；
(5)“射干”鉴别展开剂：三氯甲烷-丁酮-甲醇(3：1：1)；
(6)“细辛”鉴别展开剂：石油醚(Ⅱ)-乙酸乙酯(3：1)；
(7)“陈皮”鉴别展开剂：乙酸乙酯-甲醇-水(100：17：13)为展开剂，展至3cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20：10：1：1)的上层溶液为展开剂，二次展开， 展至约8cm；
(8)“广藿香”鉴别展开剂：石油醚(Ⅰ)-乙酸乙酯-冰醋酸(95：5：0.2)；
(9)“小柴胡胶囊”鉴别展开剂：氯仿-甲醇-水(13：6：1)。
分组实施例：
实施例3.1以“甘草”鉴别展开剂，分别选取各测试样品和供试品，以乙酸乙酯-甲酸- 冰醋酸-水(15：1：1：2)展开：
在Merck预制板的展开结果如图1显示，其中A为未显色365nm下检视；B为10％硫酸乙醇显色365nm下检视；C为10％硫酸乙醇显色自然光下检视，T：25℃，RH：60％。
各条带示意：
1.桂枝 2.陈皮 3.细辛 4.射干 5.甘草 6.白术 7.黄芩 8.苦杏仁 9.泽泻 10.紫菀
11.款冬花 12.藿香 13.枳实 14.麻黄 15.生姜 16.柴胡 17.供试液418.供试液5
分析表明：
①365nm紫外下显色前白术、紫菀、枳实亮蓝色荧光斑点相互有干扰，枳实、麻黄各有 一个蓝色荧光斑点无干扰。
②该展开剂在硫酸乙醇自然光显色条件下，各成分出现严重的拖尾干扰带，同时365nm 紫外下显色后甘草、白术、紫菀、枳实亮蓝色荧光斑点相互有干扰，枳实有1个蓝色荧光斑 点无干扰，甘草有2个黄虑色荧光斑点无干扰。
综上，现有的甘草鉴别展开剂用于既不能用于TLC分析甘草成分之外，也不能用于TLC 分析甘草成分之外的其他药味，因此不适宜作为联合检测之用的展开剂。
实施例3.2以“生姜”鉴别展开剂，石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯(2：1：1)展开：
在Merck预制板的展开结果如图2所示，其中A为未显色254nm下检视；B为未显色365nm下检视；C为5％香草醛硫酸显色。
条带示意：
1.桂枝 2.陈皮 3.细辛 4.射干 5.甘草 6.白术 7.黄芩 8.苦杏仁 9.泽泻 10.紫菀
11.款冬花 12.藿香 13.枳实 14.麻黄 15.生姜 16.柴胡 17.供试液418.供试液5
分析表明：
①射干在254nm下有一个斑点，没有干扰，供试液应选用供试液1，其他药材均不可鉴 别。
②生姜在254nm、365nm下未显示任何结果，仅仅在香草醛显色较为清晰。
③黄岑在254nm、365nm下显示较为明显的单一带，且在香草醛显色条件下能清晰分离 多条无拖尾的干扰带。
综上，虽然该展开剂在香草醛显色条件下可以鉴别生姜，在254nm、365nm下未显示任 何结果，这对于最终的香草醛显示没有指示作用。同时，其他药味或是有重带，或是单带不 突出。
然而，出乎意料的是，该展开剂在香草醛显色条件下能同时鉴别生姜和黄岑，是否预示 着该两种成分可以使用同一展开剂。
实施例3.3以“黄芩”鉴别展开剂，甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10：3：1：2)展开：
根据实施例(2)和图2的结果，选用黄芩鉴别展开剂检测黄岑和生姜，同时检测陈皮、 苦杏仁和藿香成分。在Merck预制板的展开结果如图3所示，其中A为未显色254nm下检视；B为未显色365nm下检视；C为5％香草醛硫酸显色日光下检视，T：25℃RH，60％。
条带示意：
1.黄芩药材对照 2.生姜药材对照 3.陈皮药材对照 4.供试品溶液1
5.供试品溶液2 6.苦杏仁药材对照 7.藿香药材对照；
分析表明：
①黄芩、生姜可以鉴别，基本可以分离，其中生姜在5％香草醛硫酸显色日光显示清晰的 单一条带。
②供试品背景干扰较大，供试品处理需要进一步优化。
③陈皮、苦杏仁和藿香存在大量的拖尾干扰带，无法采用这个展开系统。
因此，综合考虑到实施例(2)-(3)的展开剂对于生姜和黄岑的展开效果更好，更符合 减少展开剂组合的发明构思，因此确定生姜的展开剂不使用药典推荐的展开剂，而使用黄岑 的展开剂。
实施例3.4以“枳实”鉴别展开剂：正丁醇-冰醋酸-水(4：1：5)展开：
16种药味和两种供试液的层析结果如图4-1所示，其中A为未显色254nm下检视；B为 未显色365nm下检视，T：25℃，RH：60％。
各条带示意：
1.桂枝 2.陈皮 3.细辛 4.射干 5.甘草 6.白术 7.黄芩 8.苦杏仁 9.泽泻 10.紫菀
11.款冬花 12.藿香 13.枳实 14.麻黄 15.生姜 16.柴胡 17.供试液418.供试液5
分析表明：
①254nm下检视，枳实和黄岑较为清晰，干扰带少，但其他药味成分较为模糊，且难以 分离
②365nm下检视，意味发现麻黄条带非常清晰，且没有干扰带，但枳实的干扰带较多， 同时黄岑带拖尾严重，预示不适合该展开剂。
因此，需要对枳实进行茚三酮乙醇显色复核，同时分析麻黄成分的复核效果。
结果如图4-2显示，其中A为未显色254nm下检视；B为0.5％茚三酮乙醇显色自然光下 检视，T：25℃，RH：60％。
各条带示意：
1.枳实1(加氨水正丁醇萃取)； 2.枳实2(加氨水乙酸乙酯萃取)；
3.麻黄1(加氨水正丁醇萃取)； 4.麻黄2(加氨水乙酸乙酯萃取)；
5.供试品(加氨水氯仿萃取)； 6.供试品(加氨水乙酸乙酯萃取)；
7.供试品2； 8.供试品(加氨水正丁醇萃取)；
分析表明：
①茚三酮乙醇显色，相比于加氨水乙酸乙酯萃取，加氨水正丁醇萃取的枳实、麻黄的层 析结果更为清晰，结果均优于加氨水乙酸乙酯或氨水正丁醇萃取的供试品对照结果
②麻黄的茚三酮乙醇显色结果出乎意料地优于枳实的茚三酮乙醇显色结果。
因此，可以选用枳实的展开剂，同时对麻黄进行展开分析，并且推荐选用茚三酮乙醇显 色作为最终的层析分析手段。
实施例3.5“射干”鉴别展开剂：三氯甲烷-丁酮-甲醇(3：1：1)：
结果如图5所示，其中A为未显色254nm下检视；B为未显色365nm下检视，T：25℃，RH：60％。
各条带示意：
1.桂枝 2.陈皮 3.细辛 4.射干 5.甘草 6.白术 7.黄芩 8.苦杏仁 9.泽泻 10.紫菀
11.款冬花 12.藿香 13.枳实 14.麻黄 15.生姜 16.柴胡 17.供试液118.供试液2
分析表明：
①在254nm下，仅仅可检测射干和枳实，其他成分或是干扰严重，或是不能显示。
②在365nm下，仅可检测白术和紫菀，但其缺乏254nm下的印证结果。
综上考虑，该射干的展开剂不符合减少展开剂组合的发明构思，因此确定射干的展开剂 不使用药典推荐的展开剂。
实施例3.6“细辛”鉴别展开剂：石油醚(Ⅱ)-乙酸乙酯(3：1)：
结果如图6所示，其中A为未显色254nm下检视；B为365nm下检视；C为香草醛显色，T：25℃，RH：60％。
1.供试液1 2.桂枝 3.陈皮 4.细辛 5.射干 6.白术 7.供试液1
8.泽泻 9.紫菀 10.款冬花 11.藿香 12.枳实 13.供试液1；
分析表明：
①在254nm下，仅仅可检测细辛，其他成分或是干扰严重，或是聚集一起没有向前分离 形成独立条带。
②在365nm下，细辛、桂枝、供试液1和紫菀出现分离的独立条带，但其他成分或是干 扰严重，或是聚集一起没有向前分离形成独立条带。
③在香草醛显示条件下，细辛的分离条带不清晰，但其他成分几乎无可见的分离条带。
综上考虑，该细辛的展开剂不符合减少展开剂组合的发明构思，因此确定细辛的展开剂 不使用药典推荐的展开剂。
实施例3.7针对剩余未确定展开剂的成分，选用“陈皮”鉴别展开剂：乙酸乙酯-甲醇- 水(100：17：13)为展开剂，展至3cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20：10：1：1)的上层溶液为展开剂，二次展开，展至约8cm；
结果如图7-1所示，其中A为未显色254nm下检视；B为365nm下检视，T：25℃，RH：60％。
1.供试液1 2.桂枝 3.陈皮 4.细辛 5.射干 6.白术 7.供试液1
8.泽泻 9.紫菀 10.款冬花 11.藿香 12.枳实 13.供试液1
分析表明：
①254nm下细辛、射干及款冬花显示比较清楚，基本没有干扰。
②365nm下细辛、款冬花以及桂枝显示比较清楚，基本没有干扰，可以作为鉴别方法。
综上，先用乙酸乙酯-甲醇-水(10：17：13)进行首次展开，能够区分细辛、射干、款冬花、桂枝，这初步预示找到符合减少展开剂组合的层析方式。
因此考虑进行二次展开。
结果如图7-2所示，其中，A为未显色254nm下检视；B为未显色365nm下检视；C为 三氯化铝试液显色365nm下检视，T：25℃，RH：60％。
条带示意：
1.供试液1 2.桂枝 3.陈皮 4.细辛 5.射干 6.白术 7.供试液1
8.泽泻 9.紫菀 10.款冬花 11.藿香 12.枳实 13.供试液1
分析表明：
①在二次展开剂的条件下，作为对照试验的图8-2A和2-B，结果同8-1A和1-B，说明二 次展开剂在254nm和365nm下的展开效果同首次展开剂。
②图7-2C中，在三氯化铝试液显色365nm下检视条件下，紫菀条带虽有一定拖尾，但 主带非常突出分离且无拖尾，非常适于该二次展开剂。
③图7-2C中，桂枝、陈皮、细辛、射干无拖尾的干扰带，分离效果好。虽然款冬花虽有 一定拖尾，但主带非常突出分离且无拖尾，非常适于该二次展开剂。
④图7-2C中，虽然白术有清晰的分离带，但其与紫菀的结果相近，易于造成干扰，需要 分析二者的干扰成分的薄层色谱行为。
⑤图7-2B和7-2C中，陈皮和枳实由于橙皮苷等成分相同，因此二者结果相近，不易使 用同一展开剂。但在该展开剂中，陈皮的相比于枳实，条带分离清晰且无拖尾的干扰带，因 此预示着可以选用该展开剂分析陈皮。
实施例3.8紫菀与白术干扰成分色谱行为考察：
根据实施例(7)的结果，分析紫菀和白术的干扰成分色谱行为，并确定合适的展开剂和 待检成分。
结果如图8所示，其中8-A为石油醚(Ⅱ)-乙酸乙酯(3：1)；8-B为乙酸乙酯-甲醇-水(100：17：13)；8-C为甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20：10：1：1)(二次展开)；8-D三氯甲 烷-丁酮-甲醇(3：1：1)。
分析表明：选取4种薄层展开条件，紫菀与白术的主要斑点在Rf0.1～0.3、Rf0.4～0.6及 Rf0.7～0.9三个范围中均重合，但两者荧光强度不同，考虑可能是同分异构体，
因此，不能同一展开剂体系来同时检测紫菀和白术。
结合实施例(7)和图7的结果，由于紫菀的条带相比于白术更加突出和分离性，因此确 定选用紫菀适用于二次展开剂系统。
综上，确定对于细辛、射干、桂枝、款冬花、陈皮和紫菀，以乙酸乙酯-甲醇-水(100：17：13)为展开剂进行第一次展开后，而后以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20：10：1：1)的上 层溶液为展开剂进行第二次展开
实施例3.9“广藿香”鉴别展开剂：石油醚(Ⅰ)-乙酸乙酯-冰醋酸(95：5：0.2)：
结果如图9所示，其中A为未显色365nm下检视；B为三氯化铁显色日光下下检视，T：25℃，RH：60％。
条带示意：
1.供试液1 2.桂枝 3.陈皮 4.细辛 5.射干 6.白术 7.供试液1
8.泽泻 9.紫菀 10.款冬花 11.广藿香 12.枳实 13.供试液1
分析表明：
①365nm下，仅有桂枝、供试液1呈现清晰的分离条带，其余成分均团聚一起无法分离， 因此只能检出桂枝，无法检出其他药材成分；
②三氯化铁显色后，藿香药材对照以及供试品成分均团聚一起无法分离，因此未能检出 任何呈现分离的斑点。
综上，由于本品生产工艺系水煎煮，并未另外提取挥发油，因此有可能藿香无法检出， 不能鉴别。同时，该展开剂系统不能用于层析分析其他成分。
实施例3.10“小柴胡胶囊”鉴别展开剂：氯仿-甲醇-水(13：6：1)：
结果如图10所示，其中A为未显色254nm下检视；B为未显色365nm下检视；C为二 甲氨基苯甲醛硫酸乙醇显色365nm下检视；D为二甲氨基苯甲醛硫酸乙醇显色日光下检视， T：25℃，RH：60％。
条带示意：
1.柴胡 2.供试液5 3.甘草 4.供试液3 5.射干 6.供试液1；
分析表明：
①柴胡、甘草在四种显示条件下均呈现清晰的分离条带，且主要条带互相不干扰；
②射干在二甲氨基苯甲醛硫酸乙醇显色显示条件下，虽然也能清晰分离，但显色效果不 如柴胡、甘草。
结论：该展开剂可以分离柴胡和甘草、射干。但由于柴胡和甘草、射干的可分离成分较 多，为避免射干的成分干扰检测结果，同时考虑到射干已经可以被纳入二次展开剂的检测组， 因此推荐使用该展开剂检测柴胡和甘草。
实施例3.11使用不同于中国药典中鉴别泽泻的展开剂：氯仿-乙酸乙酯-甲酸(6：3.5：0.5)：
中国药典2015关于泽泻薄层分析：以环己烷-乙酸乙酯(1:1)为展开剂；
结果如图11所示，其中A为未显色254nm下检视；B为未显色365nm下检视；C为10％硫酸乙醇显色365nm下检视，T：25℃，RH：60％。
条带示意：
1.供试液5 2.桂枝 3.陈皮 4.细辛 5.射干 6.甘草 7.白术 8.黄芩 9.苦杏仁 10.泽泻
11.紫菀 12.款冬花 13.藿香 14.枳实 15.麻黄 16.生姜 17.柴胡 18.供试液3；
分析表明：
①在254nm和365nm显示条件下，射干、黄岑、款冬花能显示分离的斑点，但泽泻未能显示分离的斑点，仅有对照显示多个斑点；
②在10％硫酸乙醇365nm显色条件下，泽泻药材出现多个分离的斑点，虽然对照也出现 多个斑点，但拖尾干扰带较严重，需要调换供试液1进一步验证。
结论：该展开剂可以分离射干、黄岑、款冬花。但由于射干、黄岑、款冬花的可分离成 分较多，为避免这些成分干扰检测结果，同时考虑到其已经可以被纳入前文已经确定展开剂 的检测组，因此推荐使用该展开剂进一步验证泽泻。
实施例3.12泽泻供试品制备验证：
结果如图12所示，其中A为采用供试品1进行验证；B为改进供试品制备方法后，T：25℃，RH：60％。
条带示意：
1.供试品1 2.药材对照 3.阴性对照
分析表明：
①经上述试验结果，采用供试品1进行验证，结果显示不能鉴别。
②根据蔡玉荣(活络通口服液质量标准的研究，中国医药科学2015，5(7):50)报道的方 法，取颗粒供试品(批号：2020033001)加水20ml溶解，加石油醚(60～90℃)萃取2次，每次20ml，合并萃取液，蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，得供试品溶液Ym。对照药材、阴性 对照同法制备，结果显示可以鉴别。
综上，对于泽泻，推荐使用改良的展开剂，同时需要采用改良的供试品溶液Ym，能取 得良好的检测效果。
实施例4、对清肺排毒汤验证优化的展开剂组的重复验证：
综上所述，本发明测试了麻黄、炙甘草、桂枝、泽泻、柴胡、黄芩、生姜、紫菀、款冬花、射干、细辛、枳实、陈皮的五组展开剂。
至于未确定展开剂的药材成分，或是与其他成分属于同分异构体，不易于进行区分，因 此不便进行分析(例如白术和紫菀)；
或是由于制备工艺的原因，导致未提取有效的药材成分(例如广藿香)；
或是属于不可鉴定分析的无机物质(例如生石膏)；
或是属于佐药成分，不属于重点检测的主药(例如山药)；
或是属于成分和药效相近，难以在同一展开剂系统中进行分析(例如茯苓和猪苓)。
按照上述确定的展开剂组合，对清肺排毒汤进行测试品和阴阳性对照的重复性验证试验。
实施例4.1验证麻黄和枳实的展开剂：正丁醇-冰醋酸-水(4：1：5)上层溶液：
取本品颗粒2g，加20ml水溶解，加入1ml氨水，用正丁醇萃取2次，每次10ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为供试品溶液。另取麻黄和枳实对照药材各0.5g，分别加水适量，回流提取60分钟，放冷，滤过，滤液浓缩至20ml，分别加入1ml氨水，用 正丁醇萃取2次，每次15ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为麻黄和枳实 对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述三种 溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(4：1：5)上层溶液为展 开剂，预饱和30分钟，展开，取出，晾干，喷以0.5％茚三酮乙醇溶液，105℃烘至斑点清晰， 供试品色谱在与麻黄对照药材和枳实对照药材色谱相应的位置上。
结果如图13所示，T：25℃，RH：64％。
其中条带示意：
1.麻黄阴性对照 2.麻黄药材对照 3.供试品(批号：2020033001)
4.供试品(批号：2020033002) 5.供试品(批号：2020033003) 6.枳实药材对照
7.枳实阴性对照
分析表明：
①在该展开剂的分析下，阳性对照主带突出，无任何干扰带。阴性对照无干扰，说明系 统无检测误差；
②麻黄、枳实供试品虽然有一定拖尾，但阴性对照相比无干扰，并且主带与阳性对照相 比，具有相同的突出主带。
结论：三种供试品均可使用该展开剂同时检测麻黄、枳实药材成分，且检测结果准确， 能清晰区分阴性对照的干扰带。
实施例4.2、验证黄芩和生姜的展开剂：甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10：3：1：2)：
取本品颗粒2g，加20ml水溶解，加入1ml盐酸，用乙酸乙酯萃取2次，每次10ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为供试品溶液。取黄芩对照药材粉末0.3g，加乙酸乙酯20ml，超声波处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为对照药材溶液。另取6-姜辣素对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色 谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品溶液及对照药材溶液各 2μl，6-姜辣素对照品溶液4μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10：3：1：2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，供试品 色谱中，在与黄芩对照药材色谱相应的位置上，显相同的斑点，喷以2％香草醛硫酸溶液，在 105℃加热至斑点显色清晰。
结果如图14所示，T：25℃，RH：64％。
其中条带示意：
1.黄芩阴性对照 2.黄芩药材对照 3.供试品(批号：2020033001)
4.供试品(批号：2020033002) 5.供试品(批号：2020033003) 6.生姜阴性对照
7. 6-姜辣素
分析表明：
①在紫外光灯(254nm)下检视，阳性对照主带突出，无任何干扰带。阴性对照无干扰， 说明系统无检测误差；
②在紫外光灯(254nm)下检视，三种供试品的条带分型相同，但与黄岑阳性对照相比， 多了一条清晰突出的主带；
③在2％香草醛硫酸溶液105℃加热后显示，三种供试品的条带分型相同，并且前述多出 的清晰突出的主带，与6-姜辣素阳性对照完全相同。
结论：三种供试品均可使用该展开剂同时检测黄岑、生姜药材成分，且检测结果准确， 尤其对于生姜成分能准确鉴定。
实施例4.3、验证细辛、射干、桂枝、款冬花、陈皮和紫菀的展开剂：
取本品颗粒2g，加20ml水溶解，用乙酸乙酯萃取2次，每次20ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为供试品溶液。另取细辛、射干、桂枝、款冬花、陈皮和紫菀 等对照药材各0.5g，分别加水适量，回流提取60分钟，放冷，滤过，滤液浓缩至20ml，分 别用乙酸乙酯萃取2次，每次20ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为对照 药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述溶液各2～5μl， 分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(100：17：13)为展开剂，展至约 3cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20：10：1：1)的上层溶液为展开剂，二 次展至约8cm，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，供试品色谱中，在与射干和款 冬花对照药材色谱相应的位置上，显相同的斑点，置紫外光灯(365nm)下检视，供试品色 谱中，在与桂枝、细辛、款冬花、陈皮和紫菀等对照药材色谱相应的位置上，显相同的荧光 斑点，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯(365nm)下检视。结果如图15-图19所示。
陈皮鉴别的结果如图15所示，其中A为显色前365nm检视；B为三氯化铝显色后365nm 检视。
条带示意：
1.陈皮双阴性对照 2.陈皮药材对照 3.供试品(批号：2020033001)
4.供试品(批号：2020033002) 5.供试品(批号：2020033003)
分析表明：
①阴性和阳性对照条带分型多，但彼此无干扰，说明可用于比对分析供试品。
②与阳性对照相比，在下方的相同位置，供试品也呈现相同颜色和大小的条带，说明供 试品中含有预期的药材成分。
③与阴性对照相比，在上方的相同位置，供试品出现多条相同亮度和大小的条带，说明 供试品中含有一些与阴性对照相同的成分。
结论：该联合展开剂可检测陈皮药材成分，但供试品中含有多达21种药材成分，出现的 条带分型较多，需要仔细比对阳性、阴性对照即可鉴别陈皮。
紫菀的鉴别结果如图16所示，其中A为显色前365nm检视；B为三氯化铝显色后365nm 检视，T：25℃，RH：64％。
条带示意：
1.紫菀双阴性对照 2.紫菀药材对照 3.供试品(批号：2020033001)
4.供试品(批号：2020033002) 5.供试品(批号：2020033003)
分析表明：
①阴性和阳性对照条带分型多，但彼此无干扰，说明可用于比对分析供试品。
②与阳性对照相比，在上方的相同位置，供试品也呈现相同大小的条带，说明供试品中 含有预期的药材成分。
③与阴性对照相比，在下方的相同位置，供试品出现多条相同颜色和大小的条带，说明 供试品中含有一些与阴性对照相同的成分。
结论：该联合展开剂可检测陈皮药材成分，但需要仔细比对阳性、阴性对照。
射干、细辛鉴别结果如图17所示，其中A为254nm检视射干鉴别薄层图谱；B为365nm检视细辛鉴别薄层图谱，T：25℃，RH：64％。
条带示意：
1.射干阴性对照 2.射干药材对照 3.供试品(批号：2020033001)
4.供试品(批号：2020033002) 5.供试品(批号：2020033003) 6.细辛阴性对照
7.细辛药材对照
分析表明：
①射干阳性对照条带远小于阴性对照，且上方、下方各有一个突出的主带，与阴性对照 无干扰，说明可用于比对分析供试品；细辛阳性对照条带远小于阴性对照，且下方各有一个 突出的主带，与阴性对照无干扰，说明可用于比对分析供试品；
②与射干阳性对照相比，在上方、下方的相同位置，供试品也呈现相同大小的条带，说 明供试品中含有预期的药材成分；与细辛阳性对照相比，在下方的相同位置，供试品也呈现 相同大小的条带，说明供试品中含有预期的药材成分；
③与射干阴性对照相比，在最下方的相同位置，供试品出现多条相同亮度和大小的条带， 说明供试品中含有一些与阴性对照相同的成分；与细辛阴性对照相比，在上方的相同位置， 供试品出现多条相同亮度和大小的条带，说明供试品中含有一些与阴性对照相同的成分
结论：该联合展开剂可检测射干、细辛药材成分，但需要仔细比对阳性、阴性对照。
桂枝鉴别的结果如图18所示。
条带示意：
1.桂枝阴性对照 2.桂枝药材对照 3.供试品(批号：2020033001)
4.供试品(批号：2020033002) 5.供试品(批号：2020033003)
分析表明：
①阴性对照条带分型多，但阳性对照在最上方仅有1条主带，彼此无干扰，说明可用于 比对分析供试品。
②与阳性对照相比，在最上方的相同位置，供试品也呈现相同颜色和大小的条带，说明 供试品中含有预期的药材成分。
③与阴性对照相比，在除最上方之外的相同位置，供试品出现多条相同亮度和大小的条 带，说明供试品中含有大量与阴性对照相同的成分。
结论：该联合展开剂可检测桂枝药材成分，结合阳性对照，能够准群鉴别桂枝成分。
款冬花鉴别的结果如图19所示，其中A为三氯化铝显色前254nm检视；B为三氯化铝显色后365nm检视，T：25℃，RH：64％。
条带示意：
1.款冬花阴性对照 2.款冬花药材对照 3.供试品(批号：2020033001)
4.供试品(批号：2020033002) 5.供试品(批号：2020033003)
分析表明：
①阴性对照条带分型多，但阳性对照仅在中部和下方有1条主带，彼此无干扰，说明可 用于比对分析供试品。
②与阳性对照相比，在中部和下方的相同位置，供试品也呈现相同颜色和大小的条带， 说明供试品中含有预期的药材成分。
③与阴性对照相比，在除了以上之外的相同位置，供试品出现多条相同亮度和大小的条 带，说明供试品中含有大量与阴性对照相同的成分。
结论：该联合展开剂可检测桂枝药材成分，结合阳性对照，能够准群鉴别桂枝成分。
实施例4.4、验证泽泻的展开剂：氯仿-乙酸乙酯-甲酸(6：3.5：0.5)：
取本品颗粒2g，加20ml水溶解，用石油醚(60～90℃)萃取2次，每次20ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为供试品溶液。另取泽泻对照药材0.5g，分别加水适量，回流提取60分钟，放冷，滤过，滤液浓缩至20ml，用石油醚(60～90℃)萃取2次，每 次20ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述供试品溶液和对照药材溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲酸(6：3.5：0.5)为展开剂，展开，取出， 喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外光(365nm)下检视，供试品 色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰。
泽泻鉴别的结果如图20所示.
条带示意：
1.泽泻阴性对照 2.泽泻药材对照 3.供试品(批号：2020033001)
4.供试品(批号：2020033002) 5.供试品(批号：2020033003)
分析表明：
①阴性和阳性对照条带分型多，但彼此无干扰，说明可用于比对分析供试品。
②与阳性对照相比，在下方的相同位置，供试品也呈现相同颜色和大小的条带，说明供 试品中含有预期的药材成分。
③与阴性对照相比，在除了以上之外的相同位置，供试品出现多条相同亮度和大小的条 带，说明供试品中含有大量与阴性对照相同的成分。
结论：该联合展开剂可检测泽泻药材成分，但供试品中含有多达21种药材成分，出现的 条带分型较多，需要仔细比对阳性、阴性对照即可鉴别。
实施例4.5、验证柴胡和甘草的展开剂：三氯甲烷-甲醇-水(13：6：1)：
取甘草对照药材0.5g，加水适量，回流提取60分钟，放冷，滤过，滤液浓缩至20ml，用乙酸乙酯萃取2次，每次20ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为甘草对 照药材溶液。另取柴胡对照药材1.0g，加水适量，回流提取60分钟，放冷，滤过，滤液浓缩 至20ml，用正丁醇萃取2次，每次20ml，合并萃取液，用氨试液洗涤2次，弃去，收集正丁 醇层，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为柴胡对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》 2015年版四部通则0502)试验，分别吸取鉴别(1)、(2)项下供试品溶液、柴胡对照药材以 及甘草对照药材溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13：6：1) 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％对二甲氨基苯甲醛的10％硫酸乙醇溶液，热风吹至 斑点显色清晰，分别在日光和紫外光(365nm)下检视，供试品(1)色谱中，在与柴胡对照 药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；供试品(2)色谱中，在与甘草对照药材色谱相 应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。
甘草、柴胡鉴别的结果如图21所示，其中T：25℃，RH：64％。
条带示意：
1.甘草阴性对照 2.甘草药材对照 3.供试品(批号：2020033001)
4.供试品(批号：2020033002) 5.供试品(批号：2020033003) 6.柴胡阴性对照
7.柴胡药材对照 8.供试品(批号：2020033001) 9.供试品(批号：2020033002)
10.供试品(批号：2020033003)
分析表明：
①甘草阳性对照条带远小于阴性对照，且上方、中部各有一个突出的主带，与阴性对照 无干扰，说明可用于比对分析供试品；柴胡阳性阴性对照条带分型多，但彼此无干扰，说明 可用于比对分析供试品。；
②与甘草阳性对照相比，在中部的相同位置，供试品也呈现2条相同大小的条带，说明 供试品中含有预期的药材成分；与柴胡阳性对照相比，在中部的相同位置，供试品也呈现多 条相同大小的条带，说明供试品中含有预期的药材成分；
③与甘草阴性对照相比，供试品基本上没有相同位置的条带，说明二者成分相差很大； 与柴胡阴性对照相比，在上方和下方的相同位置，供试品各出现1条相同亮度和大小的条带， 说明供试品中含有一些与阴性对照相同的成分。
结论：该联合展开剂可检测甘草、柴胡药材成分，并且其与阴性对照的相同成分较少， 利于甘草和柴胡的鉴别。
实施例5、对上述监控方法进行温度因子的稳定性测定：
5.1 低温下麻黄、枳实鉴别试验：
按照实施例4的相同方法和湿度，测试在4℃环境下温度因子对上述麻黄、枳实展开剂 组合的鉴别效果的影响。
结果如图22所示，其中条带示意：
1.麻黄对照药材 2.供试品(批号：2020033001) 3.供试品(批号：2020033002)
4.供试品(批号：2020033003) 5.枳实对照药材
分析表明：与实施例4.1相比，阳性、阴性对照的以及供试品的条带保持一致，没有明 显差异。
5.2 低温下黄芩、生姜鉴别试验：
按照实施例4的相同方法和湿度，测试在4℃环境下温度因子对上述黄芩、生姜展开剂 组合的鉴别效果的影响。
结果如图23所示，其中A为显色前365nm检视；B为显色后365nm下检视。
条带示意：
1.黄芩对照药材 2.供试品(批号：2020033001) 3.供试品(批号：2020033002)
4.供试品(批号：2020033003) 5.6-姜辣素对照品
分析表明：与实施例4.2相比，姜辣素在显色前365nm检视未有可见斑点。黄岑在显色 后365nm检视出现可见斑点，其余阳性、阴性对照的以及供试品的条带保持一致，没有明显 差异。
5.3 低温下桂枝、紫菀鉴别试验：
按照实施例4的相同方法和湿度，测试在4℃环境下温度因子对上述桂枝、紫菀展开剂 组合的鉴别效果的影响。
结果如图24所示，其中A为显色前365nm检视；B为三氯化铝试液显色后365nm下 检视。
条带示意：
1.桂枝对照药材 2.供试品(批号：2020033001) 3.供试品(批号：2020033002)
4.供试品(批号：2020033003) 5.紫菀对照药材
分析表明：与实施例4.3相比，阳性、阴性对照的以及供试品的条带保持一致，没有明 显差异。
5.4 低温下射干、款冬花鉴别试验：
按照实施例4的相同方法和湿度，测试在4℃环境下温度因子对上述射干、款冬花展开 剂组合的鉴别效果的影响。
结果如图25所示，其中显色前254nm检视；B为显色前365nm下检视；C为三氯化铝试液显色后365nm下检视。
条带示意：
1.射干对照药材 2.供试品(批号：2020033001) 3.供试品(批号：2020033002)
4.供试品(批号：2020033003) 5.款冬花对照药材
分析表明：与实施例4.3相比，阳性、阴性对照的以及供试品的条带保持一致，没有明 显差异。
5.5 低温下陈皮、细辛鉴别试验：
按照实施例4的相同方法和湿度，测试在4℃环境下温度因子对上陈皮、细辛展开剂组 合的鉴别效果的影响。
结果如图26所示。
其中条带示意：
1.陈皮对照药材 2.供试品(批号：2020033001) 3.供试品(批号：2020033002)
4.供试品(批号：2020033003) 5.细辛对照药材
分析表明：与实施例4.3相比，阳性、阴性对照的以及供试品的条带保持一致，没有明 显差异。
5.6 低温下泽泻鉴别试验：
按照实施例4的相同方法和湿度，测试在4℃环境下温度因子对泽泻展开剂组合的鉴别 效果的影响。
结果如图27所示，其中条带示意：
1.泽泻对照药材 2.供试品(批号：2020033001)
3.供试品(批号：2020033002) 4.供试品(批号：2020033003)
分析表明：与实施例4.4相比，与阳性对照相比，在下方的相同位置，供试品也呈现相 同颜色和大小的条带，说明与阳性对照的条带保持一致，没有明显差异。
5.7 低温下甘草、柴胡鉴别试验：
按照实施例4的相同方法和湿度，测试在4℃环境下温度因子对甘草、柴胡展开剂组合 的鉴别效果的影响。
结果如图27所示，其中A为显色后日光下检视；B为显色后365nm下检视。
条带示意：
1.甘草对照药材 2.供试品(批号：2020033001) 3.供试品(批号：2020033002)
4.供试品(批号：2020033003) 5.柴胡对照药材 6.供试品(批号：2020033001)
7.供试品(批号：2020033002) 8.供试品(批号：2020033003)
分析表明：与实施例4.5相比，阳性、阴性对照的以及供试品的条带保持一致，没有明 显差异。
实施例6、对上述监控方法进行高湿因子的稳定性测定：
6.1 高湿因子下麻黄、枳实鉴别试验：
按照实施例4的相同方法和湿度，测试在RH：88％环境下湿度因子对上述麻黄、枳实展 开剂组合的鉴别效果的影响。
结果如图29所示，其中条带示意：
1.麻黄对照药材 2.供试品(批号：2020033001) 3.供试品(批号：2020033002)
4.供试品(批号：2020033003) 5.枳实对照药材
分析表明：与实施例4.1相比，阳性、阴性对照的以及供试品的条带保持一致，没有明 显差异。
6.2 高湿因子下黄芩、生姜鉴别试验：
按照实施例4的相同方法和湿度，测试在RH：88％环境下湿度因子对上述黄芩、生姜展 开剂组合的鉴别效果的影响。
结果如图30所示，其中A为显色前365nm检视；B为显色后365nm下检视。
条带示意：
1.黄芩对照药材 2.供试品(批号：2020033001) 3.供试品(批号：2020033002)
4.供试品(批号：2020033003) 5.6-姜辣素对照品
分析表明：与实施例4相比，阳性、阴性对照的以及供试品的条带保持一致，没有明显 差异。
6.3 高湿因子下桂枝、紫菀鉴别试验：
按照实施例4的相同方法和湿度，测试在RH：88％环境下湿度因子对上述桂枝、紫菀展 开剂组合的鉴别效果的影响。
结果如图31所示，其中A为显色前365nm检视；B为三氯化铝试液显色后365nm下检视。
条带示意：
1.桂枝对照药材 2.供试品(批号：2020033001) 3.供试品(批号：2020033002)
4.供试品(批号：2020033003) 5.紫菀对照药材
分析表明：与实施例4相比，阳性、阴性对照的以及供试品的条带保持一致，没有明显 差异。
6.4 高湿因子下射干、款冬花鉴别试验：
按照实施例4的相同方法和湿度，测试在RH：88％环境下湿度因子对上述射干、款冬花 展开剂组合的鉴别效果的影响。
结果如图32所示，其中A为显色前254nm检视；B为显色前365nm下检视；C为三氯 化铝试液显色后365nm下检视。
条带示意：
1.射干对照药材 2.供试品(批号：2020033001) 3.供试品(批号：2020033002)
4.供试品(批号：2020033003) 5.款冬花对照药材
分析表明：与实施例4相比，阳性、阴性对照的以及供试品的条带保持一致，没有明显 差异。
6.5 高湿因子下陈皮、细辛鉴别试验：
按照实施例4的相同方法和湿度，测试在RH：88％环境下湿度因子对上述陈皮、细辛展 开剂组合的鉴别效果的影响。
结果如图33所示。
条带示意：
1.陈皮对照药材 2.供试品(批号：2020033001) 3.供试品(批号：2020033002)
4.供试品(批号：2020033003) 5.细辛对照药材
分析表明：与实施例4相比，阳性、阴性对照的以及供试品的条带保持一致，没有明显 差异。
6.6 高湿因子下泽泻鉴别试验：
按照实施例4的相同方法和湿度，测试在RH：88％环境下湿度因子对上述泽泻展开剂组 合的鉴别效果的影响。
结果如图34所示。
条带示意：
1.泽泻对照药材 2.供试品(批号：2020033001)
3.供试品(批号：2020033002) 4.供试品(批号：2020033003)
分析表明：与实施例4相比，阳性、阴性对照的以及供试品的条带保持一致，没有明显 差异。
6.7 高湿因子下甘草、柴胡鉴别试验：
按照实施例4的相同方法和湿度，测试在RH：88％环境下湿度因子对上述甘草、柴胡展 开剂组合的鉴别效果的影响。
结果如图34所示，其中A为显色后日光下检视；B为显色后365nm下检视。
条带示意：
1.甘草对照药材 2.供试品(批号：2020033001) 3.供试品(批号：2020033002)
4.供试品(批号：2020033003) 5.柴胡对照药材 6.供试品(批号：2020033001)
7.供试品(批号：2020033002) 8.供试品(批号：2020033003)
分析表明：与实施例4相比，阳性、阴性对照的以及供试品的条带保持一致，没有明显 差异。
实施例7、对上述监控方法进行低湿因子的稳定性测定：
7.1 低湿因子下麻黄、枳实鉴别试验：
按照实施例4的相同方法和温度，测试在RH：32％环境下湿度因子对上述麻黄、枳实展 开剂组合的鉴别效果的影响。
结果如图36所示，其中条带示意：
1.麻黄对照药材 2.供试品(批号：2020033001) 3.供试品(批号：2020033002)
4.供试品(批号：2020033003) 5.枳实对照药材
分析表明：与实施例4相比，阳性、阴性对照的以及供试品的条带保持一致，没有明显 差异。
7.2 低湿因子下黄芩、生姜鉴别试验：
按照实施例4的相同方法和温度，测试在RH：32％环境下湿度因子对上述黄芩、生姜展 开剂组合的鉴别效果的影响
结果如图37所示，其中A为显色前365nm检视；B为显色后365nm下检视。
条带示意：
1.黄芩对照药材 2.供试品(批号：2020033001) 3.供试品(批号：2020033002)
4.供试品(批号：2020033003) 5.6-姜辣素对照品
分析表明：与实施例4相比，阳性、阴性对照的以及供试品的条带保持一致，没有明显 差异。
7.3 低湿因子下桂枝、紫菀鉴别试验：
按照实施例4的相同方法和温度，测试在RH：32％环境下湿度因子对上述桂枝、紫菀展 开剂组合的鉴别效果的影响。
结果如图38所示，其中A为显色前365nm检视；B为三氯化铝试液显色后365nm下检视。
条带示意：
1.桂枝对照药材 2.供试品(批号：2020033001) 3.供试品(批号：2020033002)
4.供试品(批号：2020033003) 5.紫菀对照药材
分析表明：与实施例4相比，阳性、阴性对照的以及供试品的条带保持一致，没有明显 差异。
7.4 低湿因子下射干、款冬花鉴别试验：
按照实施例4的相同方法和温度，测试在RH：32％环境下湿度因子对上述射干、款冬花 展开剂组合的鉴别效果的影响。
结果如图39所示，其中A为显色前254nm检视；B为显色前365nm下检视；C为三氯 化铝试液显色后365nm下检视。
条带示意：
1.射干对照药材 2.供试品(批号：2020033001) 3.供试品(批号：2020033002)
4.供试品(批号：2020033003) 5款冬花对照药材
分析表明：与实施例4相比，阳性、阴性对照的以及供试品的条带保持一致，没有明显 差异。
7.5 低湿因子下陈皮、细辛鉴别试验：
按照实施例4的相同方法和温度，测试在RH：32％环境下湿度因子对上述陈皮、细辛展 开剂组合的鉴别效果的影响。
结果如图40所示。
条带示意：
1.陈皮对照药材 2.供试品(批号：2020033001) 3.供试品(批号：2020033002)
4.供试品(批号：2020033003) 5.细辛对照药材
分析表明：与实施例4相比，阳性、阴性对照的以及供试品的条带保持一致，没有明显 差异。
7.6 低湿因子下泽泻鉴别试验：
按照实施例4的相同方法和温度，测试在RH：32％环境下湿度因子对上述泽泻展开剂组 合的鉴别效果的影响。
结果如图41所示。
条带示意：
1.泽泻对照药材 2.供试品(批号：2020033001)
3.供试品(批号：2020033002) 4.供试品(批号：2020033003)
分析表明：与实施例4相比，阳性、阴性对照的以及供试品的条带保持一致，没有明显 差异。
7.7 低湿因子下甘草、柴胡鉴别试验：
按照实施例4的相同方法和温度，测试在RH：32％环境下湿度因子对上述甘草、柴胡展 开剂组合的鉴别效果的影响。
结果如图42所示，其中A为显色后日光下检视；B为显色后365nm下检视。
条带示意：
1.甘草对照药材 2.供试品(批号：2020033001) 3.供试品(批号：2020033002)
4.供试品(批号：2020033003) 5.柴胡对照药材 6.供试品(批号：2020033001)
7.供试品(批号：2020033002) 8.供试品(批号：2020033003)
分析表明：与实施例4相比，阳性、阴性对照的以及供试品的条带保持一致，没有明显 差异。
综合实施例6和实施例7的结果显示：常温低湿与常温高湿条件下，均能有效分离，不 影响相应药材的鉴别，温度对试验无影响。
实施例8、指纹图谱色谱的优化条件的确定：
分组实验8.1：色谱条件与系统适用性预试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按下 表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为278nm；柱温30℃；流速1.0ml/min。理论板数按黄 芩苷峰计算应均不低于5000。
Figure BDA0002814250200000321
分组实验8.2：流动相体系的选择
8.2.1. 乙腈-0.1％磷酸体系
8.2.1.1 仪器条件
液相色谱仪：Agilent 1100高效液相色谱仪
色谱柱：Agela Venusil MP C18(4.6×250mm，5m)
柱温：30℃
进样量：20μl
流速：1ml/min
检测波长：278nm
流动相：
Figure BDA0002814250200000331
8.2.1.2 标准供试品制备方法
取标准供试品1.0g，精密称定，置50ml容量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，滤过，取续 滤液，即得。
8.2.1.3 结果
供试品色谱峰于45min基本出完，可以继续调整流动相，见图43：乙腈-0.1％磷酸体系 的色谱图
8.3.2 甲醇-0.1％磷酸体系
8.3.2.1 仪器条件
液相色谱仪：Agilent 1100高效液相色谱仪
色谱柱：Agela Venusil MP C18(4.6×250mm，5m)
柱温：30℃
进样量：20μl
流速：1ml/min
检测波长：278nm
流动相：
Figure BDA0002814250200000332
8.3.2.2 标准供试品制备方法
取供试品1.0g，精密称定，置50ml容量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，滤过，取续滤液， 即得。
8.3.2.3 结果
供试品色谱峰于70min基本出完，柱压偏大，调整流动相比例不便，见图44：甲醇-0.1％ 磷酸体系的色谱图
8.3.3 结论
根据上述实验结果，考虑到色谱峰需要进一步调整，故选择乙腈-0.1％磷酸体系作为流动 相的组成。
分组实验8.4流动相梯度的考察
确定了流动相的组成为乙腈-0.1％磷酸后，考察不同的流动相梯度，比较色谱峰的分离效 果。
8.4.1 仪器条件
液相色谱仪：Agilent 1100高效液相色谱仪
色谱柱：Agela Venusil MP C18(4.6×250mm，5m)
柱温：30℃
进样量：20μl
流速：1ml/min
检测波长：278nm
流动相：
Figure BDA0002814250200000341
8.4.2 标准供试品制备方法
取供试品1.0g，精密称定，置50ml容量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，滤过，取续滤液， 即得。
8.4.3 结果：
根据各个流动相梯度条件下的色谱图(如图45：不同流动相梯度下的指纹图谱)，得到 最好的条件为方法五，故将此梯度条件作为清肺排毒汤指纹图谱的检测条件。
分组实验8.5检测波长的确定：
根据确定好的流动相梯度条件，对供试品溶液的检测波长进行比较，分别比较了供试品 主要色谱峰中的最大吸收波长210nm、250nm、278nm、325nm。
8.5.1 仪器条件
液相色谱仪：Agilent 1100高效液相色谱仪
色谱柱：Agela Venusil MP C18(4.6×250mm，5m)
柱温：30℃
进样量：20μl
流速：1ml/min
检测波长：278nm
流动相：
Figure BDA0002814250200000351
8.5.2 标准供试品制备方法
取供试品1.0g，精密称定，置50ml容量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，滤过，取续滤液， 即得。
8.5.3 结果
根据不同检测波长条件下的色谱图(如图46不同检测波长下的指纹图谱)，得到最好的 检测波长为278nm，故将此278nm作为清肺排毒汤指纹图谱的检测波长。
8.6 指纹图谱方法的最终优化参数
根据上述实验得到最佳的指纹图谱条件如下，标准指纹图谱见(图47清肺排毒汤标准 指纹图谱)。
液相色谱仪：Agilent 1100高效液相色谱仪
色谱柱：Agela Venusil MP C18(4.6×250mm，5m)
柱温：30℃
进样量：20μl
流速：1ml/min
检测波长：278nm
流动相：
Figure BDA0002814250200000352
实施例9：确定标准指纹图谱模型
9.1 色谱指纹峰的药材归属
9.1.1 色谱条件
液相色谱仪：Agilent 1100高效液相色谱仪
色谱柱：Agela Venusil MP C18(4.6×250mm，5m)
柱温：30℃
进样量：20μl
流速：1ml/min
检测波长：278nm
流动相：
Figure BDA0002814250200000361
9.1.2 供试品溶液的配制
取供试品1.0g，精密称定，置50ml容量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，滤过，取续滤液， 即得。
9.1.3 单味药材溶液的配置
分别按处方比例取适量的药材，分别加水煎煮30min，过滤，取续滤液即得单味药材溶 液。
其中，根据实施例1-7所确定的最适合的TLC的药味，单味药材选自黄芩对照药材(批 号：120955-201309)、6-姜辣素对照品(批号：111833-201806)、枳实对照药材(批号：120936-201606)、麻黄对照药材(批号：121051-201606)、细辛对照药材(批号：121204-201606)、 桂枝对照药材(批号：121191-201605)、款冬花对照药材(批号：121449-201816)、射干对照 药材(批号：120994-201801)、陈皮对照药材(批号：120969-201510)、紫菀对照药材(批 号：120956-200505)、柴胡对照药材(批号：120992-201509)、炙甘草对照药材(批号：120904-201519)及泽泻对照药材(批号：121081-201803)均采购于中国药品生物制品鉴定研究院，其余试剂均为分析纯。
9.1.4 色谱指纹峰的药材归属
分别将供试品溶液和单味药材溶液进样20μl进行检测，得到色谱图，将供试品色谱图和 单味药材色谱图上保留时间相近、光谱图相似的色谱进行归属，结果见(图48清肺排毒汤 初筛的定性指纹图谱质谱模型)。结果显示，来自黄芩、枳实、款冬花、甘草和射干具有更好 的区分度，且指纹峰突出，相互干扰性小，因此可以选定来建立对清肺排毒汤进行质量初筛 的定性指纹图谱质谱模型。
9.2 色谱指纹峰图片模型中的成分确定
9.2.1 色谱条件
液相色谱仪：Agilent 1100高效液相色谱仪
色谱柱：Agela Venusil MP C18(4.6×250mm，5m)
柱温：30℃
进样量：20μl
流速：1ml/min
检测波长：278nm
流动相：
Figure BDA0002814250200000371
9.2.2 供试品溶液的配制
取供试品1.0g，精密称定，置50ml容量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，滤过，取续滤液， 即得。
9.2.3 对照品溶液的配制
取柚皮苷对照品、橙皮苷对照品、新橙皮苷对照品、黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品适 量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含柚皮苷40μg、橙皮苷40μg、新橙皮苷40μg、汉黄芩苷40μg、黄芩苷100μg的溶液，即得。。
9.2.4 色谱峰的成分指认
分别将供试品溶液和对照品溶液进样10μl进行检测，得到色谱图，将供试品色谱图和对 照品色谱图进行比较，结果见(图49参照溶液图谱)和(图50清肺排毒汤指纹图谱)。结 果五个对照品的峰均能在供试品色谱图中找到。图中所示：6：柚皮苷；7：橙皮苷；8：新橙皮苷；9：黄芩苷(S)；12：汉黄芩苷
实施例10：利用确定的标准指纹图谱模型，对待测产品进行检测
10.1 对不同中药颗粒进行指纹图谱模型的定性初筛检测
对于清肺排毒汤颗粒、小柴胡汤颗粒、葛根汤颗粒、甘草泻心汤颗粒、当归四逆汤颗粒， 分别盲选编号为测试品1、测试品2、测试品3、测试品4、测试品5。
对于以上5种未知测试品，分别称取1g颗粒后，精密称定，置50ml容量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
根据以下参数，进样10μl进行色谱图检测：
液相色谱仪：Agilent 1100高效液相色谱仪
色谱柱：Agela Venusil MP C18(4.6×250mm，5m)
柱温：30℃
进样量：20μl
流速：1ml/min
检测波长：278nm
流动相：
Figure BDA0002814250200000381
按照实施例8-9的方法，得到5个未知的待测样品的指纹图谱(图51-55)。
按照确认的指纹图谱方法进行检测，导出图谱，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2004A版本)计算与实施例9所建立的定性指纹图谱模型的相似度，结果如下所示。
名称 待测样品1 待测样品2 待测样品3 待测样品4 待测样品5
相似度 0.563 0.991 0.291 0.581 0.201
其中，待测样品2的指纹图谱相似度超过0.90，其余样品均远远低于0.90，因此判定待测 样品2为清肺排毒汤。
经过核对预知的样品名称，确定待测样品1-5(图51-55)分别是小柴胡汤颗粒、清肺排 毒汤颗粒、葛根汤颗粒、甘草泻心汤颗粒、当归四逆汤颗粒。
结果表明，实施例9所建立的定性质谱模型可以鉴定清肺排毒汤。
10.2 对不同批次清肺排毒汤颗粒进行指纹图谱模型的定性初筛检测
根据实施例10.1的方法，分别按拟定的指纹图谱方法测定10批清肺排毒汤颗粒，导出 图谱，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版本)计算相似度，结果如下所示。
Figure BDA0002814250200000382
Figure BDA0002814250200000391
结果表明，不同批次的清肺排毒汤颗粒，其指纹图谱的相似度均大于0.93，故设定其相 似度不得低于0.90。
10.3 对某批次清肺排毒汤颗粒进行指纹图谱模型的定量初筛检测
取柚皮苷对照品、橙皮苷对照品、新橙皮苷对照品、黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品适 量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含柚皮苷40μg、橙皮苷40μg、新橙皮苷40μg、汉黄芩苷40μg、黄芩苷100μg的溶液，即得。
根据实施例9的方法，将供试品溶液(批号20200330)和柚皮苷对照品、橙皮苷对照品、 新橙皮苷对照品、黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品进样10μl进行检测，得到色谱图。
比较供试品溶液和对照品溶液的峰值强度差异，并根据对照品溶液的标准浓度，确定供 试品溶液中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷的含量，结果如下所示：
Figure BDA0002814250200000392
实施例11：涉及质量监控过程的清肺排毒汤的制备方法
实施例11.1提取工艺的优化研究：
采用正交实验，以黄芩苷转移率、出膏率为考察指标，筛选最优工艺提取条件。
选择影响提取效果的煎煮时间、煎煮次数、加水量作为主要考察因素，进行4因素3水 平正交优化试验，试验方案如表1所示。
按照处方比例称取饮片共100g，平行9份，按表2进行提取，提取液过滤，滤液量取体 积，记录。计算提取液出膏率、指标性成分含量，结果见表
表1：正交实验因素水平表
Figure BDA0002814250200000401
表2：正交实验表
Figure BDA0002814250200000402
表3：正交实验结果
Figure BDA0002814250200000403
Figure BDA0002814250200000411
将表3中各结果进行方差分析，结果见表4。
表4：方差分析表
Figure BDA0002814250200000412
注：F0.05(2,2)＝19.00，F0.01(2,2)＝99.00；*：P＜0.05，**：P＜0.01；
根据极差分析和方差分析可知，三个因素对出膏率均有显著性影响，优选的方案为 A2B2C3；三个因素对黄芩苷转移率均有显著性影响,优选的方案为也A2B2C3，为节约成本， 减低能源消耗，选择A2B2C2为最优工艺，也即是煎煮2次，每次加10倍水，每次煎煮1 小时。
实施例11.2浓缩温度的筛选研究：
拟考察60℃、75℃和90℃下，将提取液浓缩后，检测其指标性成分，以评价在不同浓缩 温度条件下的稳定性。
(1)样品制备
按照处方比例称取饮片共100g，照确定的清肺排毒汤提取方法制备样品，取制备所得提 取液，分取3份，每份250ml，分别于60℃、75℃和90℃下减压浓缩至50ml，再将样品稀释 至250ml，即得三个考察样品。
(2)检测分析
对浓缩后再重新稀释的3份样品进行黄芩苷含量测定，比较浓缩前后的差异。
(3)实验结果
表5：不同浓缩温度条件下样品指标性成分
黄芩苷含量(mg/g)
未浓缩样品 1.21
60℃浓缩 1.20
75℃浓缩 1.19
90℃浓缩 1.21
由以上结果看出，在60℃、75℃和90℃条件下进行浓缩，不同浓缩温度对甘草泻汤煎液 中的指标性成分黄芩苷含量未见影响，结果表明，在60℃～90℃条件下对样品进行浓缩，样 品保持稳定。
实施例11.3除杂方式的筛选研究：
提取液除杂方式常规有2种，分别为筛网过滤和离心除杂，拟对2种除杂方式进行比较。
(1)除杂方式
除杂方式 参数
筛网过滤 300目
高速离心 10000rpm/min
(2)样品
按照处方比例称取饮片共100g，照确定的清肺排毒汤提取方法制备样品，取提取液2份， 分别采用300目筛网过滤和10000rpm/min离心5分钟的方式，将除杂后的样品进行检测。
(3)检测分析
按清肺排毒汤中黄芩苷含量测定方法，对2份样品进行检测。
(4)实验结果
表6： 2种除杂方式的外观性状
Figure BDA0002814250200000421
Figure BDA0002814250200000431
表7：2种除杂方式的指标性成分比较
除杂方式 黄芩苷含量(mg/g)
离心 1.19
过滤 1.20
由以上结果看出，采用离心方式和300目筛网过滤方式进行除杂，2种除杂方式药液中 的黄芩苷含量未见显著差异，但过滤方法的样品外观浑浊，放置过程有沉淀产生，而离心样 品不存在浑浊及产生沉淀问题，说明离心除杂方式优于300目筛网过滤方式，选择离心作为 除杂方式。
实施例11.4干燥方式的筛选研究：
拟喷雾干燥和减压干燥两种干燥方式，以选择合适的干燥方式。
(1)样品制备
按照处方比例称取饮片共100g，平行2份，按照提取工艺制备提取液，减压浓缩(65℃)， 加入麦芽糊精，干燥。考察真空干燥与喷雾干燥对提取液指标含量的影响。
(2)检测分析
按清肺排毒汤中黄芩苷含量测定方法，对2份样品进行检测。
(3)实验结果
表8：不同干燥方式结果
干燥方式 黄芩苷总量(mg/g)
喷雾干燥(165℃-175℃) 1.53
减压干燥(75℃) 1.48
由以上结果可以看出，喷雾干燥方式的样品中黄芩苷含量略高于减压方式的样品，原因 为喷雾干燥为瞬时高温干燥，样品受热时间短，成分受热影响小，因此，选择喷雾干燥作为 干燥方式。
实施例11.5辅料筛选研究：
中药颗粒剂常用的辅料包括可溶性淀粉、麦芽糊精、乳糖等，辅料的种类会影响成品的 成型性，稳定性和制成总量，有必要对辅料种类进行考察。拟按照生药量50g制成颗粒10g， 采用沸腾制粒方式的条件下，考察辅料对制粒工艺的影响。
表9：辅料对制粒工艺的影响
Figure BDA0002814250200000432
Figure BDA0002814250200000441
由以上结果看出，三种辅料均能制备出符合要求的产品，成品收率无显著差异。鉴于可 溶性淀粉溶解性略差，成品溶液澄明度较其余两种差；乳糖易吸潮，成本价格较高，因此， 选择麦芽糊精作为辅料。
综上所述，如图56所示，确定清肺排毒汤的制备工艺如下：
加水煎煮两次，每次1小时，滤过，合并煎液，滤液减压浓缩至相对密度1.03～1.05(70℃) 的清膏，加入麦芽糊精适量，干燥，或粉碎，制成颗粒1000g。
在一个具体实施方案中，其中第一次加10倍量水，浸泡0.5小时，煎煮1.0小时；第二 次加10倍量水，煎煮1.0小时，合并煎液，滤过；
在上述任一具体实施方案中，其中将滤液75℃±5℃减压浓缩，至密度为1.03～1.05(70℃) 的清膏，10000rpm/min离心；
在上述任一具体实施方案中，取上述离心后的清膏,加入适量麦芽糊精(每个处方量制成 总量为40g，离心后的清膏含固量约为处方量10.5％)，溶解，混匀，喷雾干燥，得浸膏粉；
在上述任一具体实施方案中，取浸膏粉，加适量粘合剂(水)，沸腾制粒，整粒，制成颗 粒1000g；
在上述任一具体实施方案中，将颗粒分装成10g/袋，复合膜包装。
其中，在完成整粒工序后，随机抽取样品，按照实施例4的确定的5种展开剂组合，对 麻黄、苦杏仁、炙甘草、桂枝、泽泻、白术、柴胡、黄芩、生姜、紫菀、款冬花、射干、细 辛、枳实、陈皮、藿香进行薄层层析鉴别。
根据鉴别结果，确定产品是否符合《中国药典》的质量标准。如果根据薄层层析结果判 定质量合格，则进行总混等后续工序。如果根据薄层层析结果判定不合格，则停止生产。检 查所有原料和生产工序。

Claims (10)

1.一种基于指纹图谱模型建立的清肺排毒汤的质量检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)建立简化的定性指纹图谱质谱模型，包括：
①取药：清肺排毒汤药物组成是：麻黄9g、炙甘草6g、杏仁9g、生石膏15～30g(先煎)、桂枝9g、泽泻9g、猪苓9g、白术9g、茯苓15g、柴胡16g、黄芩6g、姜半夏9g、生姜9g、紫菀9g、冬花9g、射干9g、细辛6g、山药12g、枳实6g、陈皮6g、藿香9g；按比例称取适量的黄芩、枳实、款冬花、甘草和射干的单味标准对照药材，分别加水煎煮30min，过滤，取续滤液，即得单味对照药材溶液；
②将单味药材溶液进样20μl进行检测，得到色谱图；
③分析5种单味药的指纹参数，并建立简化的指纹图谱模型，其中黄芩指纹峰的出峰时间是约27min、29min、33min、78min、86min、88min、104min；枳实的指纹峰的出峰时间是约42min、47min、53min、61min；款冬花的指纹峰的出峰时间是约46min、65min；甘草的指纹峰的出峰时间是约82min；射干的指纹峰的出峰时间是约95min；
(2)取供试品颗粒1.0g，精密称定，置50ml容量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，滤过，取续滤液；
(3)将供试品溶液进样20μl进行检测，得到色谱图；
(4)比较供试品溶液和上述定性指纹图谱模型在出峰时间25-105min流出的色谱峰是否一致，如果一致则进行下一步检测，如果不一致直接判定待测样品不合格；
(5)分别将供试品溶液和柚皮苷对照品、橙皮苷对照品、新橙皮苷对照品、黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品进样10μl进行检测，得到色谱图；
(6)比较供试品溶液和上述对照品溶液在45-90min流出的色谱峰以及mAU值是否一致，如果一致则判定待测样品符合初级质量标准，如果不一致直接判定待测样品不合格；
(7)比较步骤(6)中供试品溶液和对照品溶液的峰值强度差异，并根据对照品溶液的标准浓度，确定供试品溶液中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷的含量；
其中，上述任一步骤中，所述色谱参数为：柱温：30℃，进样量：20μl，流速：1ml/min，检测波长：278nm，流动相：
Figure FDA0002814250190000011
以及，所述液相色谱仪选自Agilent 1100高效液相色谱仪，所述色谱柱选自AgelaVenusil MP C18(4.6×250mm，5m)。
2.根据权利要求1所述的基于指纹图谱模型建立的清肺排毒汤的质量检测方法，其特征在于：
其中步骤(5)，取柚皮苷对照品、橙皮苷对照品、新橙皮苷对照品、黄芩苷对照品、汉黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含柚皮苷40μg、橙皮苷40μg、新橙皮苷40μg、汉黄芩苷40μg、黄芩苷100μg的溶液，即得对照品溶液。
3.根据权利要求1或2所述的基于指纹图谱模型建立的清肺排毒汤的质量检测方法，其特征在于：
其中步骤(5)和步骤(6)用于建立定量的指纹图谱色谱模型，所述待测柚皮苷的指纹峰的出峰时间是约47min；待测橙皮苷的指纹峰的出峰时间是约52min；待测新橙皮苷的指纹峰的出峰时间是约60min；待测黄芩苷(S)的指纹峰的出峰时间是约77min；待测汉黄芩苷的指纹峰的出峰时间是约87min。
4.根据权利要求1或3所述的基于指纹图谱模型建立的清肺排毒汤的质量检测方法，其特征在于：
其中步骤(6)中的判定一致的过程包括：将黄芩苷参照物峰相应的峰为S峰，计算各主要峰与S峰的相对保留时间和相对峰面积；其中供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.90，且相对保留时间及相对峰面积在规定值的±10％之内，表明待测样品符合初级质量标准，如果未达到上述标准直接判定待测样品不合格。
5.根据权利要求1所述的基于指纹图谱模型建立的清肺排毒汤的质量检测方法，其特征在于：
其中在进行指纹图谱质量初筛的检测方法之前，还包括用于测量色谱条件与系统适用性的预试验，包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按如下参数进行梯度洗脱；
Figure FDA0002814250190000021
其中，检测波长为278nm；柱温30℃；流速1.0ml/min，理论板数按黄芩苷峰计算应均不低于5000。
6.一种联合指纹图谱模型和薄层色谱法来对清肺排毒汤制剂进行快速检测方法，其特征在于：包括如下步骤：上述权利要求1-5任一所述的检测步骤(1)-(7)，以及，
对通过质量初筛的待测样品进行分组展开剂的薄层色谱检测方法，包括：
(8)取待测样品滤液，加入萃取剂进行萃取，合并萃取液；
(9)将萃取液水浴蒸干，残渣用甲醇溶解作为供试品溶液；另用相同方法平行制备阳性对照和阴性对照溶液；
(10)分别吸取供试品溶液、阳性对照和阴性对照溶液，分别置于同一硅胶G薄层板上，在薄层鉴别展开剂上展开，取出；
(11)加入显色溶液，用热风加热至斑点显色清晰，并置于阳光或紫外光下检视；
(12)比较供试品、阳性对照、阴性对照的斑点，如果供试品和阳性对照在相应位置上出现相同颜色斑点，且阴性无干扰斑点，则判断供试品中含有预期与阳性对照质量相同或相近的药物成分；其中，
对于麻黄和枳实，以正丁醇：冰醋酸：水的体积比为4：1：5的溶液的上层溶液为展开剂；
对于黄芩和生姜，以甲苯：乙酸乙酯：甲醇：甲酸的体积比为10：3：1：2的溶液为展开剂；
对于细辛、射干、桂枝、款冬花、陈皮和紫菀，以乙酸乙酯：甲醇：水的体积比为100：17：13的溶液为展开剂进行第一次展开后，而后以甲苯：乙酸乙酯：甲酸：水的体积比为20：10：1：1的溶液的上层溶液为展开剂进行第二次展开；
对于泽泻，以氯仿：乙酸乙酯：甲酸的体积比为6：3.5：0.5的溶液为展开剂；
对于柴胡和甘草，以三氯甲烷：甲醇：水的体积比为13：6：1的溶液为展开剂。
7.根据权利要求6所述的联合指纹图谱模型和薄层色谱法来对清肺排毒汤制剂进行快速检测方法，其特征在于：
其中对于麻黄和枳实，所述步骤(9)是另取阳性和阴性对照药材各0.5g，分别加水适量，回流提取60分钟，放冷，滤过，滤液浓缩至20ml，分别加入1ml氨水，用正丁醇萃取2次，每次15ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为对照药材溶液；所述步骤(8)是取成品颗粒2g，加20ml水溶解，加入1ml氨水，用正丁醇萃取2次，每次10ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为供试品溶液；步骤(11)中喷以0.5％茚三酮乙醇溶液，105℃烘至斑点清晰；和/或，
对于黄芩和生姜，其中所述步骤(8)是取成品颗粒2g，加20ml水溶解，加入1ml盐酸，用乙酸乙酯萃取2次，每次10ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为供试品溶液；所述步骤(9)是另取阳性和阴性对照药材各0.3g，加乙酸乙酯20ml，超声波处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣用1ml，残渣用1ml甲醇溶解作为对照药材溶液；步骤(11)中喷以2％香草醛硫酸溶液，105℃烘至斑点清晰。
8.根据权利要求6或7所述的联合指纹图谱模型和薄层色谱法来对清肺排毒汤制剂进行快速检测方法，其特征在于：
其中对于细辛、射干、桂枝、款冬花、陈皮和紫菀，所述步骤(8)是取成品颗粒2g，加20ml水溶解，乙酸乙酯萃取2次，每次10ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为供试品溶液；所述步骤(9)是另取阳性和阴性对照药材各0.5g，分别加水适量，回流提取60分钟，放冷，滤过，滤液浓缩至20ml，分别用乙酸乙酯萃取2次，每次20ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为对照药材溶液；步骤(12)中在于对照药材色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯下检视。
9.根据权利要求6-8所述的联合指纹图谱模型和薄层色谱法来对清肺排毒汤制剂进行快速检测方法，其特征在于：
其中对于泽泻，所述步骤(8)是取成品颗粒2g，加20ml水溶解，用60～90℃石油醚萃取2次，每次20ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为供试品溶液；所述步骤(9)是另取阳性和阴性对照药材各0.5g，分别加水适量，回流提取60分钟，放冷，滤过，滤液浓缩至20ml，用60～90℃石油醚萃取2次，每次20ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为对照药材溶液；步骤(11)中喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外光下检视。
10.根据权利要求6-9所述的联合指纹图谱模型和薄层色谱法来对清肺排毒汤制剂进行快速检测方法，其特征在于：
其中对于柴胡和甘草，所述步骤(9)中取甘草对照药材0.5g，加水适量，回流提取60分钟，放冷，滤过，滤液浓缩至20ml，用乙酸乙酯萃取2次，每次20ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为对照药材溶液；取柴胡对照药材1.0g，加水适量，回流提取60分钟，放冷，滤过，滤液浓缩至20ml，用正丁醇萃取2次，每次20ml，合并萃取液，用氨试液洗涤2次，弃去，收集正丁醇层，水浴蒸干，残渣用1ml甲醇溶解作为柴胡对照药材溶液；步骤(11)中喷以1％对二甲氨基苯甲醛的10％硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰，分别在日光和紫外光下检视。
CN202011406131.1A 2020-12-03 2020-12-03 基于指纹图谱模型建立的清肺排毒汤的质量检测方法 Active CN112697948B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011406131.1A CN112697948B (zh) 2020-12-03 2020-12-03 基于指纹图谱模型建立的清肺排毒汤的质量检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011406131.1A CN112697948B (zh) 2020-12-03 2020-12-03 基于指纹图谱模型建立的清肺排毒汤的质量检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112697948A true CN112697948A (zh) 2021-04-23
CN112697948B CN112697948B (zh) 2022-07-01

Family

ID=75506851

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011406131.1A Active CN112697948B (zh) 2020-12-03 2020-12-03 基于指纹图谱模型建立的清肺排毒汤的质量检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112697948B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113514581A (zh) * 2021-07-08 2021-10-19 中国中医科学院中医临床基础医学研究所 清肺排毒颗粒的质控方法
CN113655136A (zh) * 2021-07-08 2021-11-16 中国中医科学院中医临床基础医学研究所 一种清肺排毒颗粒特征图谱及其构建方法
CN113917001A (zh) * 2021-07-08 2022-01-11 中国中医科学院中医临床基础医学研究所 清肺排毒颗粒中黄芩有效成分的检测方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100009970A1 (en) * 2008-03-19 2010-01-14 Combinatorx (Singapore) Pte. Ltd. Compositions and methods for treatment of viral diseases
CN103575821A (zh) * 2012-08-08 2014-02-12 天士力制药集团股份有限公司 一种糖敏灵制剂中14种化学成分的检测方法
CN109900829A (zh) * 2019-03-28 2019-06-18 漳州片仔癀药业股份有限公司 一种清热止咳颗粒的质量控制方法
JP2020063477A (ja) * 2018-10-17 2020-04-23 上村工業株式会社 電解Ｓｎ合金めっき液
CN111735896A (zh) * 2020-08-19 2020-10-02 广东一方制药有限公司 化湿败毒组合物特征图谱的构建方法
CN111751472A (zh) * 2020-07-14 2020-10-09 山东省食品药品检验研究院 一种槐芩软膏的质量评价方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100009970A1 (en) * 2008-03-19 2010-01-14 Combinatorx (Singapore) Pte. Ltd. Compositions and methods for treatment of viral diseases
CN103575821A (zh) * 2012-08-08 2014-02-12 天士力制药集团股份有限公司 一种糖敏灵制剂中14种化学成分的检测方法
JP2020063477A (ja) * 2018-10-17 2020-04-23 上村工業株式会社 電解Ｓｎ合金めっき液
CN109900829A (zh) * 2019-03-28 2019-06-18 漳州片仔癀药业股份有限公司 一种清热止咳颗粒的质量控制方法
CN111751472A (zh) * 2020-07-14 2020-10-09 山东省食品药品检验研究院 一种槐芩软膏的质量评价方法
CN111735896A (zh) * 2020-08-19 2020-10-02 广东一方制药有限公司 化湿败毒组合物特征图谱的构建方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RUOCONG YANG等: "Chemical composition and pharmacological mechanism of Qingfei Paidu Decoction and Ma Xing Shi Gan Decoction against Coronavirus Disease 2019 (COVID-19): In silico and experimental study", 《PHARMACOLOGICAL RESEARCH》 *
严宝飞等: "基于UPLC法和网络药理学的黄芩茎叶防治新型冠状病毒肺炎潜在作用机制研究", 《药物评价研究》 *
黄锐等: "正交试验优选清肺排毒合剂(新冠1号)制备工艺", 《云南中医中药杂志》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113514581A (zh) * 2021-07-08 2021-10-19 中国中医科学院中医临床基础医学研究所 清肺排毒颗粒的质控方法
CN113655136A (zh) * 2021-07-08 2021-11-16 中国中医科学院中医临床基础医学研究所 一种清肺排毒颗粒特征图谱及其构建方法
CN113917001A (zh) * 2021-07-08 2022-01-11 中国中医科学院中医临床基础医学研究所 清肺排毒颗粒中黄芩有效成分的检测方法
CN113655136B (zh) * 2021-07-08 2023-08-08 中国中医科学院中医临床基础医学研究所 一种清肺排毒颗粒特征图谱及其构建方法
CN113514581B (zh) * 2021-07-08 2023-08-08 中国中医科学院中医临床基础医学研究所 清肺排毒颗粒的质控方法
CN113917001B (zh) * 2021-07-08 2024-03-22 中国中医科学院中医临床基础医学研究所 清肺排毒颗粒中黄芩有效成分的检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112697948B (zh) 2022-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112666268B (zh) 一种中药组合物中多种成分鉴别及含量的测定方法
CN112697948B (zh) 基于指纹图谱模型建立的清肺排毒汤的质量检测方法
CN103197027A (zh) 芪蛭通络胶囊的质量控制方法
CN113759017B (zh) 一种当归六黄汤的制备工艺及其评价方法
CN101028388B (zh) 一种治疗眼疾近视及视疲劳中药制剂的质量检测方法
CN112697951B (zh) 基于薄层鉴别法建立的清肺排毒汤的质量检测方法
CN103285306B (zh) 益气补肾的中药组合物的制备方法及检测方法
CN103245733A (zh) 一种藿香正气滴丸鉴定方法
CN110118834B (zh) 一种用于痰喘药物组合物的质量检测方法
CN108169403A (zh) 一种八珍汤配方颗粒的质量检测方法
CN112666281B (zh) 基于指纹图谱模型建立的清肺排毒汤的生产方法
CN111413443B (zh) 一种当归及其饮片的特征图谱、构建方法和鉴别方法
CN112834684B (zh) 基于薄层鉴别法建立的清肺排毒汤的生产方法
CN115837063B (zh) 一种肺力咳药物组合物的制备及检测方法
CN114994220B (zh) 一种七清败毒颗粒的指纹图谱的构建方法和其成分含量的测定方法及应用
CN114544852B (zh) 一种改进的癃清胶囊质量检测方法
CN113514581B (zh) 清肺排毒颗粒的质控方法
CN113049702B (zh) 基于指纹图谱建立的葛根汤的质量检测方法及其生产方法
CN109521122B (zh) 一种治疗功能性消化不良的中药制剂的指纹图谱的制备方法
CN112763639A (zh) 刺五加对照提取物的制备工艺及其质量控制方法
CN101703728B (zh) 一种温胃舒胶囊的检测方法
CN114894952B (zh) 一种当归建中汤全方六药味的薄层鉴别方法
CN114924021B (zh) 一种桃红四物汤方剂的检测方法
CN117571899B (zh) 一种包含当归的中药组合物中的质量控制方法及其应用
CN114965842B (zh) 口炎清整体质量检测方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant