CN112014480A

CN112014480A - 一种uplc-ms/ms检测降脂宁颗粒中有效成分含量的方法

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Publication number: CN112014480A
Application number: CN201910452118.0A
Authority: CN
Inventors: 刘慢; 司玉冰; 陈昱安; 余文洁; 赵阗
Original assignee: Huanghe Science and Technology College
Current assignee: Huanghe Science and Technology College
Priority date: 2019-05-28
Filing date: 2019-05-28
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2039-05-28
Also published as: CN112014480B

Abstract

本发明公开了一种UPLC‑MS/MS检测降脂宁颗粒中有效成分含量的方法，所述有效成分为金丝桃苷、二苯乙烯苷、荷叶碱和橙黄决明素中的一种或两种以上，用C18色谱柱，流动相是0.05%甲酸水和0.05%甲酸乙腈，电喷雾质谱ESI离子源，正离子扫描，多反应监测模式。对该方法的线性范围，精密度，稳定性以及加标回收率进行了考察：四种有效成分的线性范围分别是：10‑2000ng/ml、15‑3000ng/ml、10‑2000ng/ml、10‑2000ng/ml，且r分别为：0.9989、0.9991、0.9936、0.9991。该方法简便高效，能够同时快速测定药物中的四种有效成分的含量。

Description

一种UPLC-MS/MS检测降脂宁颗粒中有效成分含量的方法

技术领域

本发明属于药物检测领域，具体涉及一种UPLC-MS/MS检测降脂宁颗粒中有效成分含量的方法。

背景技术

随着目前人们生活水平的日益提升，高脂血症也开始逐渐呈现出了低龄化、高发病率的趋势，药物治疗也在不断地进行更深层的研究，但是有些西药经过临床实验表明在治疗疾病时具有肝脏毒性，这就使得药物容易对患者产生不良反应。而中药复方制剂的副作用就相对较少、更加的安全，进而在临床应用更易于被患者接受。故本文将降脂宁颗粒作为降脂类的复方制剂的研究对象展开研究。

降脂宁颗粒是由山楂(去核)、决明子、荷叶、制首乌等四味中草药构成的中草药复方制剂，收录在《部颁标准中药成方制剂第十三册》，能够起到降低血脂的作用，因而临床主要用在治疗抗心律不齐和高脂血症。有文献记载该药物的主要有效成分为山楂中的金丝桃苷，又名槲皮素-3-O-β-D吡喃半乳糖苷，具有抗肝损伤、抗炎症和抗血栓的作用，制首乌中的有效物质为二苯乙烯苷，具有有益于肝肾、降低血脂的药理作用，荷叶中的荷叶碱能起到抗氧化、抗动脉粥样硬化，而决明子中的橙黄决明素能够促进肠道的蠕动，减少胆固醇在肠道的停留。这四种有效成分对于高血脂症均有一定的作用，同时还能起到保护肝脏的功效。

目前常用的有关含量测定的检测方案也有很多比如：潘林梅等采用HPLC法测定降脂通脉片中的2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷的含量研究。王东艳等采用的双波长HPLC法同时测定降脂宁片中4中活性成分的含量以及刘燕等采用薄层扫描法测定丹田降脂丸中丹参素的含量。但HPLC法易因干扰较大，灵敏度低，检测时间较长，所需要的样品的量也比较多。薄层色谱法存在着定量时准确度不高、存在人为误差的缺点。而UPLC-MS/MS法则是将液相的强大的分离性和质谱的结构测定性能联系了起来，为复杂成分的中草药成分的分析及其含量测定提供了更加高效、简便的分析方法，因UPLC-MS/MS所特有的高通量、高灵敏度、不易受到干扰物的影响而成为目前常用的用于微量残留成分检测的技术手段，能够在较短的时间对于多组分进行一次性的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种UPLC-MS/MS检测降脂宁颗粒中有效成分含量的方法。

基于上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种UPLC-MS/MS检测降脂宁颗粒中有效成分含量的方法，所述有效成分为金丝桃苷、二苯乙烯苷、荷叶碱和橙黄决明素中的一种或两种以上，检测过程包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备：分别取待测成分的标准品，以75v％的甲醇为溶剂，配制对照品溶液，使对照品溶液中有效成分的浓度分别为金丝桃苷2μg/mL，二苯乙烯苷3μg/mL，荷叶碱2μg/mL，橙黄决明素2μg/mL；

(2)供试品溶液的制备：

称取降脂宁颗粒，研制成粉末状，精密称取100.0mg转移到20mL的棕色样品瓶中，再加入75v％的甲醇5mL，准确称其质量，随后超声5min，冷却，再用75v％甲醇补足减少的重量，静置10-20min，随后用0.45μm的微孔滤膜进行过滤，滤液即为供试品溶液；

(3)标准曲线的绘制：

取对照品溶液，用75v％甲醇稀释，稀释成具有浓度梯度的对照品溶液，以超高效液相色谱-串联质谱联用仪为检测仪器进行检测，色谱条件：Agilent Eclipse Plus C182.1×50mm，1.7μm色谱柱，以0.05v％甲酸的水作为流动相A，以0.05v％甲酸的乙腈作为流动相B进行梯度洗脱，流速0.3mL/min，进样量5μL，柱温箱40℃；

质谱条件：电喷雾离子源ESI，采用正离子扫描，多反应监测模式(MRM)，碰撞气是氮气，离子化温度为345℃，气体的流速为120L/min，

再以有效成分标准品的浓度为横坐标，该有效成分的定量离子的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到每个有效成分的标准曲线和标准曲线线性方程；

(4)待测品的检测：

将供试品溶液按照步骤(3)的色谱和质谱条件进行测定，记录每个有效成分的定量离子的峰面积，代入对应有效成分的标准曲线线性方程中即得降脂宁颗粒中相应有效成分的浓度。

进一步地，步骤(2)中对照品溶液的具体配制过程如下：取待测成分的标准品2.0mg于10mL的容量瓶中，用75v％的甲醇溶液进行溶解并定容，摇匀，即可得0.2mg/mL的标准溶液；再分别精确移取0.2mg/mL的标准溶液于容量瓶中，其中，金丝桃苷，二苯乙烯苷，荷叶碱，橙黄决明素标准溶液的体积分别为0.5mL，0.75mL，0.5mL，0.5mL；用75v％的甲醇溶液定容，摇匀，可制得对照品溶液。

进一步地，以步骤(3)中对照品溶液为200％，依次稀释为160％，120％，100％，50％，20％，10％，1％作为系列浓度梯度。

进一步地，梯度程序为：

进一步地，选择正离子扫描时，每个有效成分的保留时间、定量离子对、碎裂电压和碰撞能量如下表所示：

进一步地，步骤(3)中每个有效成分的标准曲线线性方程为：金丝桃苷：Y＝88.34X-1250；二苯乙烯苷：Y＝34.61X+774.34；荷叶碱：Y＝1423.3X+153724；橙黄决明素：Y＝69.95X+1892.9。

本发明方法的线性范围，精密度，稳定性以及加标回收率进行了考察，其结果显示：四种有效成分的线性范围分别是：10-2000ng/mL、15-3000ng/mL、10-2000ng/mL、10-2000ng/mL，且r分别为：0.9989、0.9991、0.9936、0.9991，证明在该范围内线性关系良好。四种化合物的检测限分别为：3.95ng/mL，2.16ng/mL，0.15ng/mL，1.0ng/mL，定量限分别为：13.1ng/mL，7.2ng/mL，0.5ng/mL，2.6ng/mL。精密度的RSD分别为：0.26％、0.41％、0.16％、0.19％。稳定性的RSD分别为：3.73％、3.99％、1.88％、3.01％。重复性的RSD分别为：0.6％、1.3％、1.9％、1.8％。四种有效成分的加标回收率(n＝6)为：金丝桃苷127％、二苯乙烯苷98％、荷叶碱101％、橙黄决明素101％。结论：该方法简便高效、专属性高，能够同时快速测定药物中的四种有效成分的含量。

附图说明

图1是本发明四个有效成分标准品的多反应监测提取离子流。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此。下述实施例中以同时检测降脂宁颗粒中金丝桃苷、二苯乙烯苷、荷叶碱和橙黄决明素四种有效成分为例。FA表示甲酸。

仪器与药品

Agilent 1290/6420超高效液相色谱-串联质谱联用仪，色谱柱，移液枪(RAININ)，SQP十万分之一电子分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；XJ220A电子天平(上海天美天平仪器有限公司)；甲醇、乙腈(质谱纯，Thermofisher公司)，甲酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，ULC-MS，99％)水为超纯水(科尔顿(中国)有限公司)，

标准品：金丝桃苷(批号：O0807AS)二苯乙烯苷(批号：N1103AS)，均购于大连美仑生物技术有限公司，荷叶碱(批号：H-042-170222)购于成都瑞芬思生物科技有限公司，橙黄决明素(批号：PS000217)，购于成都普思生物科技有限公司，各纯度都>98％，降脂宁颗粒样品购于郑州市各个药店，四个样品来自于四个不同的生产厂家，样品详细信息见表1。

表1样品信息

实施例1

一种UPLC-MS/MS检测降脂宁颗粒中四种有效成分含量的方法，包括如下步骤：

(1)对照品溶液

分别取金丝桃苷、二苯乙烯苷、荷叶碱、橙黄决明素标准品2.0mg于10mL的容量瓶中，用75v％的甲醇溶液进行溶解并定容，摇匀，即可得0.2mg/mL的标准溶液。再分别精确移取0.2mg/mL的金丝桃苷，二苯乙烯苷，荷叶碱，橙黄决明素标准溶液0.5mL，0.75mL，0.5mL，0.5mL于50mL的容量瓶中，用75％的甲醇溶液定容，摇匀，可制得混合对照品溶液，储备液应注意全程避光。其中四种有效成分的浓度分别为金丝桃苷2μg/mL，二苯乙烯苷3μg/mL，荷叶碱2μg/mL，橙黄决明素2μg/mL。

(2)供试品溶液

称取降脂宁颗粒5.0g，用研钵研制成粉末状，精密称取100.0mg转移到20mL的棕色样品瓶中，再加入75％的甲醇5mL，准确称其质量，随后超声5min，冷却，再用75％甲醇补足减少的重量，静置10-20min，随后用0.45μm的微孔滤膜进行过滤，滤液即为供试品溶液，供试品溶液也要注意全程避光。

(3)分析条件

色谱条件：Agilent Eclipse Plus C18(2.1×50mm,1.7μm)色谱柱，流动相A(0.05％FA水)，B(0.05％FA乙腈)，梯度洗脱：0-0.2min，流动相B10％；0.2-3.2min流动相B10％-90％；3.2-4.2min，流动相B90％；4.2-4.5min，流动相B90％-10％，4.5-5.0min流动相B10％，流速0.3ml/min，进样量5μl，柱温箱40℃。

质谱条件：DAD检测器，电喷雾离子源(ESI)，采用正离子扫描，多反应监测模式(MRM，Multiple Reaction Monitorring)，碰撞气是氮气，离子化温度为345℃，气体的流速为120L/min。

(4)标准曲线的绘制：

取混合对照品溶液，用75％甲醇稀释，以步骤(3)中对照品溶液为200％，以此梯度稀释为160％，120％，100％，50％，20％，10％，1％。按照步骤(3)的条件进行检测。得到每个化合物的定量离子对和标准曲线线性方程

表2四个分析物的MS/MS检测参数

表3线性回归方程与线性关系

精密度试验

取混合对照品中100％的样品，按照步骤(3)条件连续进样6次，计算四个化合物的定量离子的峰面积的RSD(n＝6)。最终的结果显示金丝桃苷、二苯乙烯苷、荷叶碱、橙黄决明素的峰面积RSD分别为0.26％，0.41％，0.16％，1.9％，数据则表明仪器精密度良好。

重复性试验

取同一批次的样品(批号：20180502)按照步骤(2)的方法制备6份供试品，再按照步骤(3)的条件进行检测。实验结果显示：金丝桃苷、二苯乙烯苷、荷叶碱、橙黄决明素含量的RSD分别为0.6％、1.3％、1.9％、1.8％，数据表明该方法的重复性良好。

稳定性试验

取相同批次的样品(批号：20180502)，按步骤(2)的方法制备供试品溶液，分别于2h，4h，6h，8h，12h，24h(n＝6)进样进行测定，进样量为5μL，按超步骤(3)条件测定，则金丝桃苷、二苯乙烯苷、荷叶碱、橙黄决明素等稳定性的RSD分别为3.73％、3.99％、1.88％、3.01％。表明样品的稳定性较好。

加标回收率试验

取同一批次的样品(批号：20180502)6份，约100.0mg，精密称定，按步骤(2)方法制备样品6份，再向样品中均加入500ng/mL的对照品溶液，按照步骤(3)条件测定，计算金丝桃苷、二苯乙烯苷、荷叶碱、橙黄决明素的回收率，结果见表2。

表2加标回收率的结果(ng)

由表4可知，金丝桃苷、二苯乙烯苷、荷叶碱、橙黄决明素的加标回收率分别为：127％、98％、101％、101％，RSD分别为：2.4％、1.5％、0.3％、1.2％。数据表明该实验的加样回收率良好。

(5)样品的测定

取4个不同批次的样品100.0mg各3份，精密称定，按照步骤(2)制备供试品溶液，再按照步骤(3)条件进行检测，算出样品中各成分的含量。如下表3：

表3样品含量测定结果(n＝3，μg/g)

对比例1

与实施例1的不同之处在于配制的混标样品，在自然光中暴露2h后，按照步骤(2)的条件检测，结果显示在色谱中会出现新的峰，该化合物和二苯乙烯苷分子离子峰和碎片峰相同，且极性变大进一步确认二苯乙烯苷在光照的条件下不稳定，故该实验中的储备液和样品均需要避光保存。

对比例2

采用HPLC-UV检测，金丝桃苷和二苯乙烯苷的极性比较相近，分离度达不到要求，灵敏度比较低，且样品中干扰比较大，故选择专一性比较强，灵敏度比较高的LC-MS/MS的MRM模式进行定量检测。

对该检测方法的质谱条件进行优化，通过对比发现金丝桃苷，二苯乙烯苷，荷叶碱和橙黄决明素都在正离子的模式下，质谱信号较强。通过Product ion模式寻找每个化合物的碎片离子，并优化了MRM检测模式下每个化合物的碎裂电压(Fragmentor)和碰撞电压(Collison Energy)，保证被检测化合物都有最高的质谱相应信号。

对比例3

在处理样品时，分别从溶剂的比例、溶剂的体积以及超声的时间上进行优化。分别用50％，75％的甲醇水溶液和甲醇对样品溶解处理，检测结果显示：75％的甲醇做溶剂时，四个化合物的峰面积达到最大值。再以75％的溶剂处理样品，设置超声时间分别为5min，10min，20min，30min，40min，结果显示：不同的超声时间，四个化合物的峰面积几乎没有变化。再分别用75％的甲醇2mL、5mL、10mL、15mL筛选溶剂的用量，检测结果显示：当100.0mg粉末样品，用5mL以上的75％的甲醇溶解，色谱峰面积均无明显变化。

本发明采用了超高效液相色谱串联质谱联用仪(LC-MS/MS)检测降脂宁颗粒中的金丝桃苷，二苯乙烯苷，橙黄决明素和荷叶碱的含量，该方法具有灵敏度高、专一性强、快速、高效等优点，且线性关系、精密度和加标回收率都比较好。从样品的检测结果分析，不同厂家的降脂宁颗粒的主要成分的含量差别比较大，该方法可以为降脂宁颗粒的生产的质量控制提供参考。

Claims

1.一种UPLC-MS/MS检测降脂宁颗粒中有效成分含量的方法，其特征在于，所述有效成分为金丝桃苷、二苯乙烯苷、荷叶碱和橙黄决明素中的一种或两种以上，检测过程包括如下步骤：

（1）对照品溶液的制备：取待检测成分的标准品，以75v%的甲醇为溶剂，配制对照品溶液，使对照品溶液中有效成分的浓度分别为：金丝桃苷2 μg/mL，二苯乙烯苷3 μg/mL，荷叶碱2 μg/mL，橙黄决明素2μg/mL；

（2）供试品溶液的制备：

称取降脂宁颗粒，研制成粉末状，精密称取100.0 mg转移到棕色样品瓶中，再加入75v%的甲醇5mL，超声溶解，冷却，静置10~20min，随后用0.45μm的微孔滤膜进行过滤，滤液即为供试品溶液；

（3）标准曲线的绘制：

取对照品溶液，用75v%甲醇稀释，稀释成具有浓度梯度的对照品溶液，以超高效液相色谱-串联质谱联用仪为检测仪器进行检测，色谱条件：Agilent Eclipse Plus C18 2.1×50mm，1.7μm色谱柱，以0.05v%甲酸的水作为流动相A，以0.05v% 甲酸的乙腈作为流动相B进行梯度洗脱，流速0.3 mL/min，进样量5μL，柱温箱40℃；

质谱条件：电喷雾离子源ESI，采用正离子扫描，多反应监测模式，碰撞气是氮气，离子化温度为345℃，气体的流速为120 L/min，

再以有效成分标准品的浓度为横坐标、该有效成分的定量离子的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到每个有效成分的标准曲线和标准曲线线性方程；

（4）待测品的检测：

将供试品溶液按照步骤（3）的色谱和质谱条件进行测定，记录每个有效成分的定量离子的峰面积，代入对应有效成分的标准曲线线性方程中即得降脂宁颗粒中相应有效成分的浓度。

2. 根据权利要求1所述UPLC-MS/MS检测降脂宁颗粒中有效成分含量的方法，其特征在于，步骤（2）中对照品溶液的具体配制过程如下：取待测成分的标准品2.0 mg 于10 mL的容量瓶中，用75%的甲醇溶液进行溶解并定容，摇匀，即可得0.2mg/mL的标准溶液；再分别精确移取0.2mg/mL的标准溶液于容量瓶中，其中，金丝桃苷，二苯乙烯苷，荷叶碱，橙黄决明素标准溶液的体积分别为0.5mL，0.75mL，0.5mL，0.5mL；用75v%的甲醇溶液定容，摇匀，可制得对照品溶液。

3.根据权利要求1所述UPLC-MS/MS检测降脂宁颗粒中有效成分含量的方法，其特征在于，以步骤（3）中对照品溶液为200%，并依次稀释为160%，120%，100%，50%，20%，10%，1%作为系列浓度梯度。

4. 根据权利要求1所述UPLC-MS/MS检测降脂宁颗粒中有效成分含量的方法，其特征在于，分析仪器：超高效液相色谱质谱联用仪，梯度洗脱的具体过程为：0-0.2min，流动相B10%；0.2-3.2min流动相B 10%-90%；3.2-4.2min，流动相B90%；4.2-4.5min，流动相B 90%-10%，4.5-5.0min流动相B 10%。

5.根据权利要求1所述UPLC-MS/MS检测降脂宁颗粒中有效成分含量的方法，其特征在于，选择正离子扫描，多重反应监测模式时，每个有效成分的保留时间、定量离子对、碎裂电压和碰撞能量如下表所示：

。

6.根据权利要求1所述UPLC-MS/MS检测降脂宁颗粒中有效成分含量的方法，其特征在于，步骤（3）中每个有效成分的标准曲线线性方程为：金丝桃苷：Y=88.34X-1250；二苯乙烯苷：Y=34.61X+774.34；荷叶碱：Y=1423.3X+153724；橙黄决明素：Y=69.95X+1892.9。