CN109374774A - 一种hplc等度洗脱同时测定决明子中4种成分的含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种HPLC等度洗脱同时测定决明子中4种成分的含量测定方法。其特征：以样品处理时间仅为文献1/9、有机溶剂仅为15％的方法得到供试品溶液，采用普通的色谱仪、等度洗脱方式，以体积比为49∶7∶44的乙腈‑甲醇‑0.1％磷酸为流动相，在222±1nm处，同时测定了样品中的橙黄决明素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚含量，各波峰分离度符合要求，进样一针，35分钟出峰完毕。首次以普通的等度洗脱取代了一直实施的梯度洗脱；以无浓缩、萃取、蒸干的环保方法，取代了繁琐、费时、成本高、污染环境的报道方法；简便、快捷，精密度和准确度提升，实用范围扩大，测定成本降低，易于普及掌握。

Description

一种HPLC等度洗脱同时测定决明子中4种成分的含量测定 方法

技术领域

本发明涉及一种HPLC等度洗脱同时测定决明子中4种成分的含量测定方法。即，采用普通的高效液相色谱仪，以等度洗脱的方式，同时测定决明子药材中橙黄决明素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚4种成分。

背景技术

决明子是一种常用中药材，主含蒽醌类，有橙黄决明素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、美决明素、黄决明素、决明素、芦荟大黄素等多种蒽醌苷元和其与糖结合成的苷类。还有萘并吡咯酮类，脂肪酸类，氨基酸和无机元素等。具有清热明目，润肠通便的功效。用于目赤涩痛，羞明多泪，头痛眩晕，目暗不明，大便秘结。所以药典^【1】一部决明子药材项下是以橙黄决明素和大黄酚为检测指标，以乙腈为流动相A，0.1％的磷酸为流动相B，采用梯度洗脱，以284nm为检测波长，进行含量测定的，梯度运行时间表是 40分钟。从文献报道^【2】的液相图谱，在18-19分钟左右，橙黄决明素波峰呈现，32分钟左右大黄酚呈现，波峰分离不是太理想。而其供试品溶液的前处理方法极其繁琐复杂，需甲醇加热回流提取，取适量提取液蒸干、残渣再加稀盐酸水解，水解液用三氯甲烷萃取四次，萃取液再蒸干，用溶剂定容。粗略地计算一下，处理一批的样品就需要有机溶剂195ml，花费时间约5～6小时，方法费时费力，严重污染环境。

为此，拟对决明子药材的含量测定方法重新进行研究，目标是：将复杂的供试品溶液制备程序简单化，以普通的等度洗脱取代梯度洗脱，以求提高检测效率，降低检测成本，减少环境污染，实现一测多评的多指标质量控制愿望。

经过不同的前处理方法对比、流动相的重组与不同比例的探讨、检测波长的选择等多因素研究，发明了采用普通的高效液相仪，以等度洗脱方式，同时测定决明子药材中橙黄决明素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚4种成分的含量测定方法。

发明内容

以样品处理时间仅为文献^[1～5]1/9、有机溶剂仅为15％的方法得到供试品溶液，采用普通的色谱仪、等度洗脱方式，以体积比为49∶7∶44的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相，在222±1nm处，同时测定了样品中的橙黄决明素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚含量，各波峰分离度符合要求，进样一针，35分钟出峰完毕。首次以普通的等度洗脱取代了一直实施的梯度洗脱；以无浓缩、萃取、蒸干的环保方法，取代了繁琐、费时、成本高、污染环境的报道方法；并同时测定了4种成分，简便、快捷，精密度和准确度提升，实用范围扩大，测定成本降低，易于普及掌握。

通过方法学考察，首先确定了酸水解浓度为甲醇-盐酸(10∶1)；其次考察了酸水回流时间为30分钟；接着考察了四成分的线性范围，橙黄决明素进样量在0.02464～ 0.2464μg，与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y＝3396367.8X+770，r＝0.99999 (见表1、图1)；大黄素的进样量在0.074～0.174μg，与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y＝3822412.5X-3923，r＝0.99999(见表2、图2)；大黄酚的进样量在0.02956～ 0.2956μg，与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y＝5819232.8X-6655，r＝0.99999 (见表3、图3)；大黄素甲醚的进样量在0.016～0.16μg，与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y＝2929021.8X-7557，r＝0.99998(见表4、图4)。采用加样回收实验，结果表明其平均回收率(n＝6)：橙黄决明素的为99.41％，RSD为0.58％(见表5)；大黄素的为99.51％，RSD为0.82％(见表6)；大黄酚的为99.48％，RSD为0.95％(见表7)；大黄素甲醚的为99.24％，RSD为0.90％(见表8)。样品精密度(见表9)；样品稳定性(见表10)；重复性(见表11)等实验数据均符合方法学要求。适用于决明子药材中橙黄决明素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚四成分的同时HPLC定量测定。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：

A.色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为49∶7∶44的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；检测波长：222nm；柱温为30℃；理论板数按橙黄决明素峰计算不低于6000；

B.对照品溶液的制备 取在干燥器中干燥24小时的橙黄决明素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成原液，再取原液适量，加90％甲醇制成每1ml含橙黄决明素0.009mg、大黄素0.004mg大黄酚0.015mg和大黄素甲醚0.004 mg的混合溶液，作为对照品溶液；

C.供试品溶液的制备 取决明子药材细粉0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积比为10∶1的甲醇-盐酸溶液25ml，称定重量，置80℃的水浴中加热回流30 分钟，放冷，若瓶壁有黏附，超声去除，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液3ml，置10ml的量瓶中，加2％的氢氧化钠溶液1.5ml，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；

D.测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，分别计算四成分的含量。

本发明的原理如下：

从橙黄决明素(图5)、大黄素(图6)、大黄酚(图7)、大黄素甲醚(图8)的光谱扫描图谱得知，除橙黄决明素在222nm不是最大吸收外，其他三种成分都基本是最大吸收处，结合4种成分的含量高低，以222nm±1nm为共有检测波长，含量较高的橙黄决明素与大黄酚的波峰高度基本相当。只需一台普通的带紫外检测器的仪器，即可完成四成分测定。而且四成分的波峰面积，在一定的范围内，与进样量呈现良好的线性关系，而进行同时定量测定。

本发明的创新点及有益效果如下：

(1)文献收载的决明子药材供试品溶液的前处理方法是：取决明子粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流2小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，加稀盐酸30ml，置水浴中加热水解1小时，立即冷却，用三氯甲烷振摇提取4次，每次30ml，合并三氯甲烷液，回收溶剂至干，残渣用无水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)混合溶液使溶解，转移至25ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按该操作程序，粗略计算一下，一批供试品溶液的制备就要花费5～6小时、有机溶剂195ml，费时、费力、污染环境，不仅三氯甲烷的萃取，危害操作人员健康，还存在因萃取强度不同，影响测定结果的准确性的弊端。而本发明集甲醇提取、酸水解于一步，水解完成后，只需取一定量水解液，碱中和、稀释至刻度，即可。只需有机溶剂30ml、时间0.5小时，不仅效率高、成本低，还因去除了萃取、蒸干等步骤，方法的精密度、准确性和重现性提升，易于普及掌握。

(2)以样品处理时间仅为文献1/9、有机溶剂仅为15％的方法得到供试品溶液，采用普通的高效液相色谱仪、等度洗脱方式，以体积比为49∶7∶44的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相，在222±1nm处，同时测定了样品中的橙黄决明素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚含量，各波峰分离度符合要求，进样一针，35分钟出峰完毕。

(3)首次以普通的等度洗脱取代了一直实施的梯度洗脱，实现了一台普通液相色谱即可完成测定，比带梯度的高效液相成本降低十万元，普及推广范围扩大；以无浓缩、萃取、蒸干的环保方法，取代了繁琐、费时、成本高、污染环境的报道方法；工作效率提高、完成时间缩短、不再污染环境，利于人民身心健康。

(4)本发明与文献报道的等级别梯度洗脱相比，不仅运行时间缩短，而4种成分的波峰与相邻峰的分离度都达到1.5以上，其纯度都在0.99以上。在基线平稳，峰型对称，波峰重现性好等方面，等度洗脱是优于梯度洗脱的。

附图说明

图1为橙黄决明素线性关系图。

图2为大黄素线性关系图。

图3为大黄酚线性关系图。

图4为大黄素甲醚线性关系图。

图5为橙黄决明素光谱扫描图。

图6为大黄素光谱扫描图。

图7为大黄酚光谱扫描图。

图8为大黄素甲醚光谱扫描图。

图9为4种对照品的HPLC色谱图。

图10为决明子样品的HPLC色谱图。

图1、图2、图3、图4中，纵坐标为峰面积；横坐标为进样量(μg)。

图5、图6、图7、图8中，纵坐标为吸收强度(mAU)；横坐标为吸收波长(nm)。

图9、10中，横坐标为保留时间(分钟)，纵坐标为响应值(uV)，1.为橙黄决明素，2.为大黄素，3.为大黄酚、4.为大黄素甲醚。

本发明具体实施方式

实施例

A.色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为49∶7∶44的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；检测波长：222nm；柱温为30℃；理论板数按橙黄决明素峰计算不低于6000；

B.对照品溶液的制备 取在干燥器中干燥24小时的橙黄决明素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成原液，再取原液适量，加90％甲醇制成每1ml含橙黄决明素0.009mg、大黄素0.004mg 大黄酚0.015mg和大黄素甲醚0.004 mg的混合溶液，作为对照品溶液；

C.供试品溶液的制备 取决明子药材细粉0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积比为10∶1的甲醇-盐酸溶液25ml，称定重量，置80℃的水浴中加热回流30 分钟，放冷，若瓶壁有黏附，超声去除，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液3ml，置10ml的量瓶中，加2％的氢氧化钠溶液1.5ml，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；

D.测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，分别计算4种成分的含量。

表1 橙黄决明素进样量与峰面积

表2 大黄素进样量与峰面积

表3 大黄酚进样量与峰面积

表4 大黄素甲醚进样量与峰面积

表5 样品中橙黄决明素的回收率试验结果

表6 样品中大黄素的回收率试验结果

表7 样品中大黄酚的回收率试验结果

表8 样品中大黄素甲醚的回收率试验结果

表9 精密度实验结果

表10 稳定性实验结果

表11 重复性试验结果(mg/g)

表12 3批决明子药材中四成分的含量测定结果(mg/g，n＝2)

参考文献

【1】中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典2015年版(一部)[S].北京：中国医药科技出版社，2015.6月：145

【2】黄小平，钟国跃，张雪梅等，HPLC法测定决明子中大黄酚和橙黄决明素[J]中国中药杂志，2010，35(16)2065～2067

【3】王云霞，张鑫，变换波长HPLC同时测定决明子中橙黄决明素和大黄酚的含量[J] 陕西中医药，2016，39(8)1080～1081

【4】詹雁，阮佳，谭镭等，UPLC法同时测定决明子中橙黄决明素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量[J]中国测试，2013，39(2)56～58

【5】卫莹芳，谢达文，万丽等，HPLC梯度洗脱法同时测定决明子中橙黄决明素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量[J]世界科学技术-中医药现代化-中药研究，2009.11(6) 868～871

【6】王小凤，樊淑彦，何晓文等，山庄降脂片中橙黄决明素、大黄素、大黄酚的HPLC 测定[J]中国医药工业杂志，2009，40(10)770～772。

Claims (2)

1.一种HPLC等度洗脱同时测定决明子中4种成分的含量测定方法，其特征在于：

A.色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为49∶7∶44的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；检测波长：222nm；柱温为30℃；理论板数按橙黄决明素峰计算不低于6000；

B.对照品溶液的制备 取在干燥器中干燥24小时的橙黄决明素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成原液，再取原液适量，加90％甲醇制成每1ml含橙黄决明素0.009mg、大黄素0.004mg大黄酚0.015mg和大黄素甲醚0.004mg的混合溶液，作为对照品溶液；

C.供试品溶液的制备 取决明子药材细粉0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积比为10∶1的甲醇-盐酸溶液25ml，称定重量，置80℃的水浴中加热回流30分钟，放冷，若瓶壁有黏附，超声去除，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液3ml，置10ml的量瓶中，加2％的氢氧化钠溶液1.5ml，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；

D.测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，分别计算4种成分的含量。

2.根据权利要求1所述的一种HPLC等度洗脱同时测定决明子中4种成分的含量测定方法，其特征在于所述的4种成分是橙黄决明素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚。